DE69729489T2

DE69729489T2 - Herstellung von transgenen leguminosen die exogene sna enthalten

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Publication number: DE69729489T2
Application number: DE69729489T
Authority: DE
Inventors: Leopoldo Elibio RECH FILHO; Jose Francisco LIMA ARAGAO
Original assignee: EMBRAPA PESQUISA AGROPECUARIA; Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Current assignee: EMBRAPA PESQUISA AGROPECUARIA; Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1997-10-07
Publication date: 2005-06-30
Anticipated expiration: 2017-10-08
Also published as: AU4545497A; MXPA00003380A; BR9714887A; WO1999018223A1; US6753458B1; ZA992218B; DK1019516T3; US20040268444A1; CA2305576A1; ATE268821T1; EP1019516B1; ES2223082T3; DE69729489D1; CN1191364C; PT1019516E; CN1276015A; CA2305576C; MX229419B; EP1019516A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung der Bioballistik zur Einführung exogener Gene in ein pflanzliches Gewebe und die Gewinnung transgener Leguminosen durch Regenerieren des transformierten Gewebes.
Hintergrund der Erfindung
Die Anwendung der Gentechnik zur Einführung von Genen, die für agronomische Merkmale von Interesse verantwortlich sind, könnte die Entwicklung neuer Leguminosae-Abarten erleichtern. Die Gewinnung einer transgenen Pflanze erfordert Methoden zur Einführung der exogenen DNA in das pflanzliche Gewebe und die Regenerierung der ganzen Pflanze aus einem solchen transformierten Gewebe. Je nach zu transformierender Spezies werden verschiedene Gewebearten zur Einführung einer exogenen DNA verwendet, wobei vorzugsweise das Meristem-Gewebe – hauptsächlich wegen der leichten Regeneration einer Pflanze aus diesem Gewebetyp – bei den verschiedenen Transformationsverfahren eingesetzt wird. Es wurden verschiedene Verfahren zur Einführung exogener Gene in Apikalmeristemzellen von Leguminosae vorgeschlagen, wobei hier auf die folgenden hingewiesen sei: a) das Agrobacterium-System; b) ein System, das die Gewebe-Elektroporation betrifft, und c) das bioballistische System. Die Einführung und Integration exogener DNA in Leguminosae-Zellen wurde von etlichen Wissenschaftlern belegt und in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben, z. B. Aragao F. J. L., Grosside-Sa M. F., Almeida E. R., Gander E. S., Rech E. L. (1992): Particle bombardment mediated expression of a Brazil nut methionine-rich albumin in bean (Phaseolus vulgaris L.), Plant Molecular Biology 20, 357–359; Lewis, M. F. & Bliss, F. A. (1994): Tumor formation and beta-glucuronidase expres sion in Phaseolus vulgaris L. inoculated with Agrobacterium tumefaciens, Journal of the American Society for Horticultural Science, 119, 361–366; Dillen W., Engler G., Van Montagu M. & Angenon G. (1995): Electroporation-mediated DNA delivery to seedling tissues of: Phaseolus vulgaris L. (common bean), Plant Cell Reports, 15, 119–124.
Die geringe Frequenz bei der Gewinnung genetisch transformierten Gewebes, die mangelhafte Fähigkeit zur Regenerierung einer fruchtbaren Pflanze aus dem transformierten Gewebe, wie auch der Einsatz von Transformationsverfahren, deren Effizienz vom Genotyp abhängt, machten die Gewinnung transgener Leguminosen schwierig (Brasileiro A. C. M., Aragao F. J. L., Rossi S., Dussi D. M. A., Barros L. M. G. & Rech E. L. (1996): Susceptibility of common and tepary beans to Agrobacterium ssp. strains and improvement of Agrobacterium-mediated transformation using microprojectile bombardment, J. Amer. Soc. Hort. Sci. 12, 810–815; und Dillen W., Van Montagu M. & Angenon G. (1995): Electroporation-mediated DNA delivery to seedling tissues of Phaseolus vulgaris L. (common bean), Plant Cell Reports 15, 119–124).
Mit der Entwicklung des bioballistischen Verfahrens zur direkten Einführung von Genen in Pflanzenzellen gegen Ende der 80er Jahre (Sanford J. C., Klein T. M., Wolf E. D. & Allen N. (1987): Delivery of substances into cell tissues using a particle bombardment process, Journal of Particle Science and Technology, 5, 27–37) wurden transgene Pflanzen mehrerer Spezies in großer Zahl erhalten, darunter solche Spezies, die sich einer Transformation mit Hilfe anderer Verfahren als nicht zugänglich erwiesen. Dies liegt daran, daß es nunmehr möglich ist, exogene Gene in jegliche Art pflanzlichen Gewebes einzuführen und zu exprimieren. Somit ist jeder Gewebetyp mit der potentiellen Fähigkeit zur Regenerierung einer ganzen fruchtbaren Pflanze für die Transformation geeignet.
Das bioballistische Verfahren wurde von Sanford im Hinblick auf die Einführung genetischen Materials in das Kerngenom höherer Pflanzen vorgeschlagen. Seitdem wurde seine universelle Anwendbarkeit abgeschätzt, und es erwies sich gemäß den von Sanford J. C., Smith F. D. & Russel J. A. (1993): Optimizing the bioballistic process for different biological application, Methods in Enzymology, 217, 413–510; beobachteten Ergebnissen als wirksames und einfaches Verfahren zur Einführung von Genen in Bakterien, Protozoen, Pilze, Algen, Insekten, pflanzliche und tierische Gewebe und in isolierte Organellen wie Chloroplasten und Mitochondrien – und deren Expression. In der speziellen Literatur gibt es mehrere andere Beispiele für die Anwendung des bioballistischen Verfahrens zur Gewinnung transgener Organismen wie z. B. unter anderem die US-Patente 5 563 346, 5 489 520 und WO 96/04392.
Bei bioballistischen Verfahren werden auf hohe Geschwindigkeit beschleunigte Mikroprojektile dazu verwendet, Nucleinsäuren und andere Substanzen zu transportieren und in vivo in Gewebe einzuführen (Rech E. L. & Aragao F. J. L. (1997): The ballistics process, in: Brasileiro A. C. M. & Carneiro V. T. C. (Hrsg.), Manual of genetic transformation of plants: EMBRAPA/Cenargen). Dieses Verfahren wird unter anderem auch als Verfahren zur Beschießung mit Mikroprojektilen, als "Genkanonen"-Verfahren und Teilchenbeschleunigungsverfahren bezeichnet. Es wurden andere Systeme entwickelt und konstruiert, die mit Nucleinsäure-Sequenzen beschichtete Mikroteilchen (bestehend aus Wolfram oder Gold) auf Geschwindigkeiten von mehr als 1500 km/h beschleunigen können. All diese Systeme beruhen auf der Erzeugung einer Schockwelle ausreichender Energie zur Verschiebung einer tragenden Membran, die die mit DNA beschichteten Mikroteilchen enthält. Die Schockwelle kann erzeugt werden mit Hilfe einer chemischen Explosion (trockenes Schießpulver), einer Entladung von Helium-Gas unter hohem Druck, durch Verdampfung eines Wassertropfens mittels elektrischer Entladung bei hoher Spannung und niedriger Kapazität oder bei niedriger Spannung und hoher Kapazität.
Die Systeme, bei denen Helium-Gas unter hohem Druck und eine elektrische Entladung angewandt wird, zeigen ein breites Anwendungsspektrum. Die beschleunigten Teilchen durchdringen Zellwand und Membran in nichttödlicher Art und Weise und finden sich statistisch verteilt in den Zellorganellen. Die DNA dissoziiert dann durch die Wirkung der Zellflüssigkeit von den Mikroteilchen ab, und der Vorgang der Integration der exogenen DNA in das Genom des zu modifizierenden Organismus läuft ab (Yamashita T., Iada, A. & Morikawa H. (1991): Evidence that more than 90% of β-glucuronidase-expressing cells after particle bombardment directly receive the foreign gene in their nucleus, Plant Physiol. 97, 829–831).
Trotz der Effizienz und universellen Anwendbarkeit des bioballistischen Verfahrens hängt es von der Optimierung verschiedener physikalischer und biologischer Parameter ab, die für die wirksame Einführung heterologer Gene in pflanzliches Gewebe grundlegend ist.
Zur Gewinnung transgener Pflanzen aus der Apikalregion der Embryonalachse gibt es zwei essentielle Forderungen, nämlich: 1) Einführung exogener Gene mit hoher Frequenz in die Zellen der Apikalregionen und Integration der exogenen Gene in das Pflanzengenom, und 2) Regeneration und Produktion fruchtbarer transgener Pflanzen aus den resultierenden transformierten Zellen.
Mit der Entwicklung des bioballistischen Verfahrens ist die direkte in situ-Transformation von Zellen des Apikalmeristems nunmehr möglich. Die Entwicklung und weitere Produktion fruchtbarer transgener Pflanzen erfordert aller dings die Regeneration und Produktion der Pflanze aus den transformierten Zellen.
Während der letzten Jahrzehnte wurden mehrere Versuche unternommen, die Regeneration fruchtbarer Pflanzen der kommerziell wichtigen Leguminosae zu erreichen. Zwar wurden zahlreiche Fortschritte erzielt, doch wurden noch keine wirklich positiven Ergebnisse erhalten. Zum Beispiel wurden einige Methoden zur Mehrfachsproßbildung von Apikal- und Lateralmeristemen von Embryonen bei verschiedenen Leguminosae entwickelt. Allerdings zeigen sich bei diesen Systemen noch schwerwiegende Nachteile.
Bei anderen Regenerationssystemen, die für bestimmte Leguminosae wie Erdnüsse und Sojabohnen entwickelt wurden, wird die somatische Embryogenese aus reifen und unreifen, mit hohen Dosen 2,4-D kultivierten Embryonen induziert. Die praktische Anwendung dieses Systems ist jedoch begrenzt, da es auf bestimmte Abarten beschränkt ist, abgesehen von der Tatsache, daß auch unerwünschte genetische Variationen (somaklonale Variation) auftreten, mit der Folge, daß transgene Pflanzen produziert werden, deren inhärente agronomische Merkmale verändert sind.
Somit zeigen die bereits bekannten Systeme zur Gewinnung transgener Leguminosae-Pflanzen auf der Grundlage der Transformation von Meristemzellen der Apikalregion mit Hilfe des bioballistischen Verfahrens die Nachteile, daß es unmöglich ist, die transformierten Zellen zu selektionieren, daß die Produktionsfrequenzen der transgenen Pflanzen niedrig sind und die Frequenz von Chimären (Pflanzen mit einem Organ oder Gruppen aus einigen transgenen Zellen und anderen nichttransgenen Zellen) hoch ist.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens mit hoher Produktionsfrequenz zur Ge winnung transgener, eine exogene DNA enthaltender Leguminosen, das die Selektion der transformierten Zellen ermöglicht, wobei die letzteren die agronomischen Merkmale der Pflanzen beibehalten, aus denen sie entstanden sind.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Leguminosen, die exogene DNA enthalten, umfassend die Schritte:

a) Einbringen exogener Gene in Apikalmeristemzellen der Embryonalachse von Leguminosen mit Hilfe des bioballistischen Verfahrens;
b) Induzieren der Mehrfachsprossung der Zellen in der in Schritt a) modifizierten Apikalmeristemregion durch Kultivieren der Embryonalachse in einem Medium, das einen Induktor für die Mehrfachsprossung enthält; und
c) Selektionieren der wie in Schritt (b) erhaltenen Meristemzellen der Apikalregion durch Weiterkultivieren der Embryonalachse in einem Medium, das ein Molekül enthält, das sich in der Apikalmeristemregion der Leguminosen-Embryonen anreichert.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es wurde nun überraschend gefunden, daß mit einem bioballistischen Verfahren zur Transformation von Leguminosen durch Einführen einer exogenen DNA in deren Apikalmeristemregion, verbunden mit weiteren Schritten der Mehrfachsprossung und anschließender Selektion der transformierten Pflanzen durch spezifische Verwendung der Embryonalachse der Zellen für diesen Zweck, die Regeneration und Produktion transgener Pflanzen mit einer Produktionsfrequenz in der Größenordnung von 10% möglich ist. Dieser Wert stellt eine Größenordnung dar, die etwa 200mal so groß ist wie die Frequenzen, die mit den heute bekannten Verfahren erhalten werden, die in der Größenordnung von 0,03% bis 0,05% liegen. Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ermöglicht des weiteren die Gewinnung transgener Pflanzen in einer Zeitspanne, die kürzer ist als die im Stand der Technik beschriebene.
Das jetzt beanspruchte Verfahren ist zur Transformation, Regeneration und Selektion jeder Leguminose wie etwa Sojabohne, Bohne, Kuherbse und Erdnuß geeignet.
Gemäß vorliegender Erfindung wird die Embryonalachse der Apikalmeristemzellen der zu transformierenden Leguminosen in Laboratorien in der üblichen Weise für das Verfahren der Beschießung (Bioballistik) vorbereitet. Natürlich richten sich die für die Beschießung verwendeten Gene nach dem speziellen Ziel des jeweiligen Verfahrens, das heißt, sie werden gemäß der neuen Eigenschaft ausgewählt, die man der transformierten Pflanze verleihen will. Ist es zum Beispiel Ziel des Verfahrens, herbizidresistente Pflanzen zu erhalten, so werden Gene eingesetzt, die ebendiese Herbizidresistenz verleihen.
Nach der Beschießung werden die Embryonalachsen mit einem Kulturmedium zusammengebracht, das einen Induktor für die Mehrfachsprossung enthält, und sollten in diesem Medium über einen ausreichenden Zeitraum gehalten werden, um die gewünschte Induktion sicherzustellen, vorzugsweise über einen Zeitraum von 16 bis 120 Stunden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Cytokinine, nämlich 6-Benzylaminopurin (BAP) oder Tidiazuron (TDZ), als Mehrfachsprossung induzierende Mittel verwendet. Ein zusätzlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das jetzt beanspruchte Verfahren ermöglicht, die Mehrfachsprossung in einer relativ kurzen Zeitspanne abzuschließen und so das Auftreten genetischer Variationen, die bei anderen bekannten Verfahren üblich sind, zu vermeiden.
Nach der Zeit der Induktion der Mehrfachsprossung sollten die Embryonalachsen in ein weiteres Kulturmedium überführt werden, das das Mittel enthält, das die Selektion der transformierten Zellen fördert. Wie beim Beschießungsvorgang wird das Selektionsmittel gemäß dem Endziel des Verfahrens ausgewählt. Im Falle transgener Pflanzen, die mit Genen transformiert wurden, die Herbizidresistenz verleihen, ist das Selektionsmittel das Herbizid, gegen das die Pflanze Resistenz entwickelt haben sollte. Zu den Beispielen für Herbizide, die beim erfindungsgemäßen Verfahren besonders brauchbar sind, zählen das Herbizid Glyphosat (vertrieben durch Monsanto Company und bezeichnet als "Round Up") und die aus der Familie der Imidazolinone ausgewählten Herbizide wie etwa Imazapyr (vertrieben durch American Cyanamide Company). Während des Schritts zur Selektion der transformierten Zellen wird ein Molekül, das sich in der Apikalmeristemregion von Leguminosen-Embryonen anreichert, wie beispielsweise die vorstehend erwähnten Herbizide, durch das Gefäßsystem der Embryonalachse transportiert und reichert sich dann in der Apikalmeristemregion an. Auf diese Weise kann die Selektion der Zellen ohne schädliche Wirkungen auf die Embryonalachse durchgeführt werden.
Die Erfindung läßt sich besser verstehen anhand der nachstehend gegebenen Beispiele, die lediglich der Erläuterung dienen, und die beschriebenen Parameter und Bedingungen sollten nicht als Einschränkung der Erfindung angesehen werden.
Beispiele
Präparation der Embryonalachsen für die Beschießung (Bioballistik)
Reife Samen von Leguminosae, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sojabohnen, Bohnen und Erdnüsse, wurden 1 Minute in 70% Ethanol und 20–30 Minuten in 1,0% Natriumhypochlorit desinfiziert. Die desinfizierten Samen wurden mit sterilem destillierten Wasser gewaschen und 16–18 Stunden in sterilem destillierten Wasser bei Raumtemperatur inkubiert.
Dann wurden zur Entfernung der Embryonalachsen die Samen geöffnet. Die Primärblätter wurden eingeschnitten, um die Region des Apikalmeristems freizulegen. Bei den Bohnen wurde auch der Keimwurzelteil eingeschnitten, während bei den anderen Leguminosae kein Einschnitt im Keimwurzelteil erforderlich war.
Die Apikalmeristemregionen der Embryonalachsen der Leguminosae Schwarze Bohnen und Sojabohnen sind in den 1 bzw. 2 gezeigt. 1A zeigt speziell die Apikalmeristemregion, während 1B den Vorgang der Explantation für die Beschießung zeigt, mit Entfernung der Primärblätter, um das Apikalmeristem freizulegen und die Entfernung der Keimwurzel zu ermöglichen.
Die Achsen der Embryonen wurden 10 Minuten in 0,1% Natriumhypochlorit desinfiziert und 3mal in sterilem destillierten Wasser gewaschen. Dann wurden die Embryonalachsen in Kulturplatten mit dem Beschießungsmedium verbracht (10–15 Achsen/Platte), wobei dieses Beschießungsmedium (hierin im folgenden als BM bezeichnet) aus einem Medium von Murashig und Skoog (1962) bestand, hier als MS bezeichnet, das ergänzt war mit 3% Sucrose, 0,7% Phytagel, pH 5,7. Die Achsen wurden in einem Kreis in gleichem Abstand von 6 bis 12 mm vom Mittelpunkt der Platte und mit der Region des Apikalmeristems nach oben gerichtet angeordnet.
Nach Positionierung der Embryonalachsen war unter dem Stereomikroskop zu beobachten, daß die Meristemregion mit einem Flüssigkeitsfilm bedeckt war, und daher wurde die Abdeckung der Platte 1 bis 2 Minuten unmittelbar vor der Beschießung unter laminarer Strömung geöffnet, um zu verhindern, daß der Flüssigkeitsfilm auf der Meristemoberfläche das Eindringen der Mikroteilchen und in der Folge den Grad der Expression des eingebrachten Gens verringert.
Sobald das zu transformierende Material auf der Platte mit dem Beschießungsmedium BM positioniert war, wurde es mit dem fraglichen Gen beschossen. In diesem Falle wurden verschiedene Vektoren verwendet, die Gene enthielten, die Resistenz gegen die Herbizide Glyphosat und Imazapyr erzeugen.
Präparation der Mikroteilchen
Die Mikroteilchen, die die exogene DNA in die Zellen transportieren sollten, wurden sterilisiert und gewaschen. 60 mg Mikroteilchen aus Wolfram M 10 (Sylvania) oder Gold (Aldrich, 32,658-5) wurden abgewogen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das mit 1,0 ml 70% Ethanol versetzt wurde. Die Mischung wurde kräftig gerührt und bei der niedrigsten Geschwindigkeit des Rührers 15 Minuten weitergerührt. Es wurde 5 Minuten lang mit 15,000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde mit Hilfe einer 1000 μl-Mikropipette entfernt und verworfen. Es wurde 1 ml steriles destilliertes Wasser zugesetzt und wie im vorhergehenden Schritt in einem Rührer kräftig gemischt und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und der Waschvorgang wurde noch zweimal wiederholt.
Nach der letzten Wäsche wurde der Überstand verworfen, und die Mikroteilchen wurden in 1 ml 50% Glycerin (Vol./Vol.) resuspendiert. Gleiche Teile Glycerin und destilliertes Wasser wurden gemischt, die Mischung wurde im Autoklaven behandelt und bei Raumtemperatur gehalten.
Dann wurde die exogene DNA auf den Mikroteilchen ausgefällt, und zu diesem Zweck wurde ein aliquoter Teil von 50 μl der Mikroteilchen-Suspension (60 mg/ml) in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Es wurden 5 bis 8 ml DNA (1 mg/μl) zugegeben. Die Mischung wurde rasch homogenisiert (3–5 Sekunden), indem der äußere Teil des Röhrchens mit Fingerhilfe gerührt wurde. Es wurden 50 μl 2,5 M CaCl₂ zugesetzt, es wurde rasch homogenisiert und mit 20 μl 0,1 M Spermidin (Sigma S-0266) versetzt – ein äußerst hygroskopischer und oxidierbarer Reaktionspartner.
Die resultierende Mischung wurde unter langsamem Rühren 10 Minuten inkubiert, 10 Sekunden zentrifugiert, und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Es wurden 150 μl absolutes Ethanol zugesetzt, und dann wurde der äußere Teil des Röhrchens erneut mit Fingerhilfe gerührt. Die resultierende Mischung wurde 10 Sekunden bei 15.000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Der vorherige Schritt wurde wiederholt, wobei 24 μl absolutes Ethanol zugegeben wurden und kräftig homogenisiert und 1–2 Sekunden lang beschallt wurde.
Dann wurden 3,2 μl-Proben der Lösung im mittleren Bereich der jeweiligen Trägermembran verteilt, die vorher auf einen Membranträger aufgesetzt worden war. Der jeweilige Niederschlag war ausreichend zur Präparation von 6 Trägermembranen, die mit der fraglichen DNA bedeckte Mikroteilchen enthielten. Die Scheiben, die die mit der fraglichen DNA bedeckten Mikroteilchen enthielten, wurden unverzüglich auf einer Platte gestapelt, die ein Trocknungsmaterial (Kieselgel) enthielt, und in einen Exsikkator gestellt.
Die Beschießung der Apikalmeristemregion der Embryonalachsen der Leguminosen wurde mit einem Mikroteilchenbeschleuniger unter Anwendung von Hochdruck-Heliumgas durchgeführt wie bei Aragao et al., 1996, beschrieben.
Beispiel 1
Gewinnung transgener Pflanzen der Sojabohne (Glycine max. (L.) Merril) durch Selektion mit dem Herbizid Imazapyr
Unmittelbar nach der Beschießung der Embryonalachsen mit Mikroteilchen, die mit einer exogenen, Resistenz gegen Imazapyr verleihenden DNA bedeckt waren, wurden die Embryonalachsen vom Beschießungsmedium (BM) auf Kulturplatten überführt, die ein Mehrfachsprossung induzierendes Medium enthielten (IM) (MS-Medium, ergänzt mit 22,2 μl BAP, 3% Sucrose, 0,6% Agar, pH 5,7). Die beschossenen Embryonalachsen blieben 16 bis 24 Stunden in der Dunkelheit bei 27°C in IM eingetaucht, um so die Mehrfachsprossung zu induzieren. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonalachsen auf Platten mit Herbizid enthaltendem Kulturmedium überführt (CMH) (SM-Medium, 3% Sucrose, 500–1000 nM Imazapyr, 0,7% Agar, pH 5,7) und in einer Wachstumskammer bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bis zur Induktion der Mehrfachsprossung gehalten.
Die Sprosse, die 2 bis 4 cm Länge erreicht hatten, wurden in ein Kulturmedium MS1S überführt (MS, 1% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bei 27°C, so daß die Jungpflanzen wachsen und wurzeln konnten. Ein Abschnitt von 1 mm wurde an der Basis von Stiel und Blatt für die Analyse der Expression des exogenen Gens entnommen. Die Sprosse, die die exogene DNA exprimierten, wurden einzeln registriert und in einen neuen Kulturkolben überführt. Sobald die Jungpflanzen gewurzelt hatten, wurden sie in Gefäße überführt, die eine 1 : 1-Mischung aus Autoklaven-behandelter Erde/Vermiculit enthielten.
Die Jungpflanzen wurden 7 Tage lang mit einem Kunststoffbeutel bedeckt, der mit einem elastischen Band verschlossen war. Das elastische Band wurde entfernt, und nach 6–7 Tagen wurde auch der Kunststoffbeutel entfernt. Die Jungpflanzen wurden zur Produktion von Samen in Erde enthaltende Gefäße überführt.
Beispiel 2
Gewinnung transgener Pflanzen der Sojabohne (Glycine max. (L.) Merril) mit dem Herbizid Glyphosat
Unmittelbar nach der Beschießung der Embryonalachsen mit den Mikroteilchen, die mit einer exogenen, Resistenz gegen Glyphosat verleihenden DNA bedeckt waren, wurden die Embryonalachsen vom Beschießungsmedium (BM) auf Kulturplatten überführt, die ein Mehrfachsprossung induzierendes Medium enthielten (IM) (MS-Medium, ergänzt mit 22,2 μl BAP, 3% Sucrose, 0,6% Agar, pH 5,7). Die beschossenen Embryonalachsen blieben 16 bis 24 Stunden in der Dunkelheit bei 27°C in IM eingetaucht, um so die Mehrfachsprossung zu induzieren. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonalachsen auf Platten mit Herbizid enthaltendem Kulturmedium überführt (CMH) (SM-Medium, 3% Sucrose, 300–1000 nM Glyphosat, 0,7% Agar, pH 5,7) und in einer Wachstumskammer bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bis zur Induktion der Mehrfachsprossung gehalten.
Die Sprosse, die 2 bis 4 cm Länge erreicht hatten, wurden in ein Kulturmedium MS1S überführt (MS, 1% Sucrose, 0,8% A gar, pH 5,7), mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bei 27°C, so daß die Jungpflanzen wachsen und wurzeln konnten. Ein Abschnitt von 1 mm wurde an der Basis von Stiel und Blatt für die Analyse der Expression des exogenen Gens entnommen. Die Sprosse, die die exogene DNA exprimierten, wurden einzeln registriert und in einen neuen Kulturkolben überführt. Sobald die Jungpflanzen gewurzelt hatten, wurden sie in Gefäße überführt, die eine 1 : 1-Mischung aus Autoklaven-behandelter Erde/Vermiculit enthielten.
Die Jungpflanzen wurden 7 Tage lang mit einem Kunststoffbeutel bedeckt, der mit einem elastischen Band verschlossen war. Das elastische Band wurde entfernt, und nach 6–7 Tagen wurde auch der Kunststoffbeutel entfernt. Die Jungpflanzen wurden zur Produktion von Samen in Erde enthaltende Gefäße überführt.
Beispiel 3
Gewinnung transgener Pflanzen der Bohne (Phaseolus vulgaris L.) durch Selektion mit dem Herbizid Imazapyr
Unmittelbar nach der Beschießung der Embryonalachsen mit Mikroteilchen, die mit einer exogenen, Resistenz gegen Imazapyr verleihenden DNA bedeckt waren, wurden die Embryonalachsen zur Induzierung der Mehrfachsprossung 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C im gleichen Kulturmedium (BM) mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonalachsen, die gekeimt hatten, in eine Box vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MSBH enthielt (MS-Medium, ergänzt mit 44,2 μM BAP, 3% Sucrose, 100–500 nM Imazapyr, 0,8% Agar, pH 5,7), und dann 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Gesamtzahl der Mehrfachsprosse zu verringern. Dann wurden die Embryonalachsen abermals in die Kulturbox vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MS3S enthielt (SM, ergänzt mit 44,2 μM BAP, 3% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), und bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Verlängerung der Mehrfachsprosse zu ermöglichen. Nach zwei Wochen begannen die Embryonalachsen mit dem Austreiben der Sprosse.
Die Sprosse, die 2 bis 4 cm Länge erreicht hatten, wurden in ein Kulturmedium MS1S überführt (MS, 1% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bei 27°C, so daß die Jungpflanzen wachsen und wurzeln konnten. Ein Abschnitt von 1 mm wurde an der Basis von Stiel und Blatt für die Analyse der Expression des exogenen Gens entnommen. Die Sprosse, die die exogene DNA exprimierten, wurden dann einzeln registriert und in einen neuen Kulturkolben überführt. Sobald die Jungpflanzen gewurzelt hatten, wurden sie in Gefäße überführt, die eine 1 : 1-Mischung aus Autoklaven-behandelter Erde/Vermiculit enthielten.
Die Jungpflanzen wurden 7 Tage lang mit einem Kunststoffbeutel bedeckt, der mit einem elastischen Band verschlossen war. Das elastische Band wurde entfernt, und nach 6–7 Tagen wurde auch der Kunststoffbeutel entfernt. Die Jungpflanzen wurden zur Produktion von Samen in Erde enthaltende Gefäße überführt.
Beispiel 4
Gewinnung transgener Pflanzen der Bohne (Phaseolus vulgaris L.) durch Selektion mit dem Herbizid Glyphosat
Unmittelbar nach der Beschießung der Embryonalachsen mit den Mikroteilchen, die mit einer exogenen, Resistenz gegen Glyphosat verleihenden DNA bedeckt waren, wurden die Embryonalachsen zur Induzierung der Mehrfachsprosse 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C im gleichen Kulturmedium (BM) mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonalachsen, die gekeimt hatten, in eine Box vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MSBH enthielt (MS-Medium, ergänzt mit 44,2 μM BAP, 3% Sucrose, 200–1000 nM Glyphosat, 0,8% Agar, pH 5,7), und dann 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Gesamtzahl der Mehrfachsprosse zu verringern. Dann wurden die Embryonalachsen abermals in die Kulturbox vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MS3S enthielt (SM, ergänzt mit 44,2 μM BAP, 3% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), und bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Verlängerung der Mehrfachsprosse zu ermöglichen. Nach zwei Wochen begannen die Embryonalachsen mit dem Austreiben der Sprosse.
Die Sprosse, die 2 bis 4 cm Länge erreicht hatten, wurden in ein Kulturmedium MS1S überführt (MS, 1% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bei 27°C, so daß die Jungpflanzen wachsen und wurzeln konnten. Ein Abschnitt von 1 mm wurde an der Basis von Stiel und Blatt für die Analyse der Expression des exogenen Gens entnommen. Die Sprosse, die die exogene DNA exprimierten, wurden dann einzeln registriert und in einen neuen Kulturkolben überführt. Sobald die Jungpflanzen gewurzelt hatten, wurden sie in Gefäße überführt, die eine 1 : 1-Mischung aus Autoklaven-behandelter Erde/Vermiculit enthielten.
Die Jungpflanzen wurden 7 Tage lang mit einem Kunststoffbeutel bedeckt, der mit einem elastischen Band verschlossen war. Das elastische Band wurde entfernt, und nach 6–7 Tagen wurde auch der Kunststoffbeutel entfernt. Die Jungpflanzen wurden zur Produktion von Samen in Erde enthaltende Gefäße überführt.
Beispiel 5
Gewinnung transgener Pflanzen der Kuherbse (Vignia unguiculata) durch Selektion mit dem Herbizid Imazapyr
Unmittelbar nach der Beschießung der Embryonalachsen mit den Mikroteilchen, die mit einer exogenen, Resistenz gegen Imazapyr verleihenden DNA bedeckt waren, wurden die Embryonalachsen zur Induzierung der Mehrfachsprosse 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C im gleichen Kulturmedium (BM) mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonalachsen, die gekeimt hatten, in eine Box vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MSBH enthielt (MS-Medium, ergänzt mit 5–50 μM BAP, 3% Sucrose, 100–500 nM Imazapyr, 0,8% Agar, pH 5,7), und dann 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Gesamtzahl der Mehrfachsprosse zu verringern. Dann wurden die Embryonalachsen abermals in die Kulturbox vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MS3S enthielt (MS, ergänzt mit 20–50 μM BAP, 3% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), und bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Verlängerung der Mehrfachsprosse zu ermöglichen. Nach zwei Wochen begannen die Embryonalachsen mit dem Austreiben der Sprosse.
Die Sprosse, die 2 bis 4 cm Länge erreicht hatten, wurden in ein Kulturmedium MS1S überführt (MS, 1% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bei 27°C, so daß die Jungpflanzen wachsen und wurzeln konnten. Ein Abschnitt von 1 mm wurde an der Basis von Stiel und Blatt für die Analyse der Expression des exogenen Gens entnommen. Die Sprosse, die die exogene DNA exprimierten, wurden dann einzeln registriert und in einen neuen Kulturkolben überführt. Sobald die Jungpflanzen gewurzelt hatten, wurden sie in Gefäße überführt, die eine 1 : 1-Mischung aus Autoklaven-behandelter Erde/Vermiculit enthielten.
Die Jungpflanzen wurden 7 Tage lang mit einem Kunststoffbeutel bedeckt, der mit einem elastischen Band verschlossen war. Das elastische Band wurde entfernt, und nach 6–7 Tagen wurde auch der Kunststoffbeutel entfernt. Die Jungpflanzen wurden zur Produktion von Samen in Erde enthaltende Gefäße überführt.
Beispiel 6
Gewinnung transgener Pflanzen der Kuherbse (Vignia unguiculata) durch Selektion mit dem Herbizid Glyphosat
Unmittelbar nach der Beschießung der Embryonalachsen mit den Mikroteilchen, die mit einer exogenen, Resistenz gegen Glyphosat verleihenden DNA bedeckt waren, wurden die Embryonalachsen zur Induzierung der Mehrfachsprossung 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C im gleichen Kulturmedium (BM) mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonalachsen, die gekeimt hatten, in eine Box vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MSBH enthielt (MS-Medium, ergänzt mit 5–50 μM BAP, 3% Sucrose, 200–1000 nM Glyphosat, 0,8% Agar, pH 5,7), und dann 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Gesamtzahl der Mehrfachsprosse zu verringern. Dann wurden die Embryonalachsen abermals in die Kulturbox vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MS3S enthielt (SM, ergänzt mit 20–50 μM BAP, 3% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), und bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Verlängerung der Mehrfachsprosse zu ermöglichen. Nach zwei Wochen begannen die Embryonalachsen mit dem Austreiben der Sprosse.
Die Sprosse, die 2 bis 4 cm Länge erreicht hatten, wurden in ein Kulturmedium MS1S überführt (MS, 1% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bei 27°C, so daß die Jungpflanzen wachsen und wurzeln konnten. Ein Abschnitt von 1 mm wurde an der Basis von Stiel und Blatt für die Analyse der Expression des exogenen Gens entnommen. Die Sprosse, die die exogene DNA exprimierten, wurden dann einzeln registriert und in einen neuen Kulturkolben überführt. Sobald die Jungpflanzen gewurzelt hatten, wurden sie in Gefäße überführt, die eine 1 : 1-Mischung aus Autoklaven-behandelter Erde/Vermiculit enthielten.
Die Jungpflanzen wurden 7 Tage lang mit einem Kunststoffbeutel bedeckt, der mit einem elastischen Band verschlossen war. Das elastische Band wurde entfernt, und nach 6–7 Tagen wurde auch der Kunststoffbeutel entfernt. Die Jungpflanzen wurden zur Produktion von Samen in Erde enthaltende Gefäße überführt.
Beispiel 7
Gewinnung transgener Pflanzen der Erdnuß (Arachis hypogea L. durch Selektion mit dem Herbizid Imazapyr
Unmittelbar nach der Beschießung der Embryonalachsen mit den Mikroteilchen, die mit einer exogenen, Resistenz gegen Imazapyr verleihenden DNA bedeckt waren, wurden die Embryonalachsen zur Induzierung der Mehrfachsprossung 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C im gleichen Kulturmedium (BM) mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonalachsen, die gekeimt hatten, in eine Box vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MSBH enthielt (MS-Medium, ergänzt mit 5–50 μM BAP, 3% Sucrose, 100–500 nM Imazapyr, 0,8% Agar, pH 5,7), und dann 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Gesamtzahl der Mehrfachsprosse zu verringern. Dann wurden die Embryonalachsen abermals in die Kulturbox vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MS3S enthielt (MS, ergänzt mit 44,3 μM BAP, 3% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), und bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Verlängerung der Mehrfachsprosse zu ermöglichen. Nach zwei Wochen begannen die Embryonalachsen mit dem Austreiben der Sprosse.
Die Sprosse, die 2 bis 4 cm Länge erreicht hatten, wurden in ein Kulturmedium MS1S überführt (MS, 1% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bei 27°C, so daß die Jungpflanzen wachsen und wurzeln konnten. Ein Abschnitt von 1 mm wurde an der Basis von Stiel und Blatt für die Analyse der Expression des exogenen Gens entnommen. Die Sprosse, die die exogene DNA exprimierten, wurden dann einzeln registriert und in einen neuen Kulturkolben überführt. Sobald die Jungpflanzen gewurzelt hatten, wurden sie in Gefäße überführt, die eine 1 : 1-Mischung aus Autoklaven-behandelter Erde/Vermiculit enthielten.
Die Jungpflanzen wurden 7 Tage lang mit einem Kunststoffbeutel bedeckt, der mit einem elastischen Band verschlossen war. Das elastische Band wurde entfernt, und nach 6–7 Tagen wurde auch der Kunststoffbeutel entfernt. Die Jungpflanzen wurden zur Produktion von Samen in Erde enthaltende Gefäße überführt.
Beispiel 8
Gewinnung transgener Pflanzen der Erdnuß (Arachis hypogea L. durch Selektion mit dem Herbizid Glyphosat
Unmittelbar nach der Beschießung der Embryonalachsen mit den Mikroteilchen, die mit einer exogenen, Resistenz gegen Glyphosat verleihenden DNA bedeckt waren, wurden die Embryonalachsen zur Induzierung der Mehrfachsprossung 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C im gleichen Kulturmedium (BM) mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonalachsen, die gekeimt hatten, in eine Box vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MSBH enthielt (MS-Medium, ergänzt mit 5–50 μM BAP, 3% Sucrose, 200–1000 nM Glyphosat, 0,8% Agar, pH 5,7), und dann 7 Tage bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Gesamtzahl der Mehrfachsprosse zu verringern. Dann wurden die Embryonalachsen abermals in die Kulturbox vom "Magenta"-Typ überführt, die das Kulturmedium MS3S enthielt (MS, ergänzt mit 44,3 μM BAP, 3% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), und bei einer Temperatur von 27°C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) kultiviert, um die Verlängerung der Mehrfachsprosse zu ermöglichen. Nach zwei Wochen begannen die Embryonalachsen mit dem Austreiben der Sprosse.
Die Sprosse, die 2 bis 4 cm Länge erreicht hatten, wurden in ein Kulturmedium MS1S überführt (MS, 1% Sucrose, 0,8% Agar, pH 5,7), mit einer Photoperiode von 16 Stunden (50 μmol·m^–2·s^–1) bei 27°C, so daß die Jungpflanzen wachsen und wurzeln konnten. Ein Abschnitt von 1 mm wurde an der Basis von Stiel und Blatt für die Analyse der Expression des exogenen Gens entnommen. Die Sprosse, die die exogene DNA exprimierten, wurden dann einzeln registriert und in einen neuen Kulturkolben überführt. Sobald die Jungpflanzen gewurzelt hatten, wurden sie in Gefäße überführt, die eine 1 : 1-Mischung aus Autoklaven-behandelter Erde/Vermiculit enthielten.
Die Jungpflanzen wurden 7 Tage lang mit einem Kunststoffbeutel bedeckt, der mit einem elastischen Band verschlossen war. Das elastische Band wurde entfernt, und nach 6–7 Tagen wurde auch der Kunststoffbeutel entfernt. Die Jungpflanzen wurden zur Produktion von Samen in Erde enthaltende Gefäße überführt.

Claims

Verfahren zur Selektion von keimbahntransformierten Leguminosen, umfassend die Schritte: (a) Einbringen exogener Gene in Apikalmeristemzellen der Embryonalachse von Leguminosen durch Beschießen der Pflanzenzellen mit einem DNA-Konstrukt, das eine Sequenz enthält, die für ein Protein codiert, das Toleranz gegen Herbizide aus der chemischen Gruppe der Imidazolinone oder Glyphosate zu verleihen imstande ist; (b) Induzieren einer Mehrfachsproßbildung aus den transformierten Apikalmeristemzellen in Schritt (a) durch Kultivieren der Embryonalachse in einem ein Cytokinin enthaltenden Medium; und (c) Selektionieren der wie in Schritt (b) erhaltenen, von den Meristemzellen stammenden Sprosse durch Kultivieren der Embryonalachse auf einem Medium, das ein Herbizid aus der chemischen Gruppe der Imidazolinone oder Glyphosate in einer Konzentration im Bereich von 100 bis 1000 nM enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Herbizids aus der chemischen Gruppe der Imidazolinone oder Glyphosate im Bereich von 200 bis 1000 nM liegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Leguminose ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sojabohne, Bohne, Kuherbse und Erdnuß.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das in Schritt (b) verwendete Cytokinin 6-Benzylaminopurin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das in Schritt (b) verwendete Cytokinin Thidiazuron ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Leguminose Sojabohne ist, das in Schritt (c) verwendete Herbizid ausgewählt ist aus der chemischen Gruppe der Imidazolinone, und die Konzentration des Herbizids im Bereich von etwa 500 bis 1000 nM liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Leguminose Sojabohne ist, das in Schritt (c) verwendete Herbizid ausgewählt ist aus der chemischen Gruppe der Glyphosate, und die Konzentration des Herbizids im Bereich von etwa 300 bis 1000 nM liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Leguminose ausgewählt ist aus Bohne, Kuherbse und Erdnuß, das in Schritt (c) verwendete Herbizid ausgewählt ist aus der chemischen Gruppe der Imidazolinone, und die Konzentration des Herbizids im Bereich von etwa 100 bis 500 nM liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Leguminose Sojabohne ist, das in Schritt (c) verwendete Herbizid ausgewählt ist aus der chemischen Gruppe der Glyphosate, und die Konzentration des Herbizids im Bereich von etwa 200 bis 1000 nM liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Häufigkeit der gewonnenen transgenen Sprosse als Prozentanteil beschossener Meristeme etwa 10% beträgt.