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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gentransfer in Pflanzen mittels isolierter, unreifer und in vitro kultivierter Pollenkörner sowie daraus hergestelltes Saatgut und Vermehrungsprodukte desselben.
Es existieren schon verschiedene Techniken des Gentransfers in Pflanzen. Jede hat ihre Vorteile und Nachteile (Goodman et al, Science 236 : 48 bis 53,1987). Agrobacterium tumefaciens ist derzeit der gebräuchlichste Vektor. Er ist jedoch begrenzt auf einen bestimmten Wirtsbereich. Immer noch hängt die Verwendung von A. tumefaciens als Vektor von der Regeneration in vitro kultivierter somatischer Zellen ab, um transgenische Pflanzen zu produzieren, die in der Lage sind, transgenische Nachkommen zu bilden. Direkter Gentransfer durch Elektroporation, Liposomen, Mikroinjektion und andere physikalisch-chemische Methoden hängen weithin von der Verwendung von Protoplasten als Zielzellen ab. Regeneration aus Protoplasten ist jedoch schwierig und sogar bei vielen Arten noch unmöglich.
Als eine Alternative zu diesen Gentransfermethoden wurde eine andere Zielzelle vorgeschlagen, das Pollenkorn. Nach Hess D., Plenum Press. New York, 519 bis 537 1975, ist es dem reifen Pollen möglich, Fremd-DNA aufzunehmen und als"Supervektor"diese Fremd-DNA in die Eizelle mit Hilfe natürlicher Bestäubung und Befruchtung einzubringen. Auf ähnliche Weise soll röntgenbestrahlter Pollen in der Lage sein, Bruchstücke des bestrahlten Genoms in die Eizelle zu transportieren (Pandey, Nature 256 : 310 bis 313,1975). DeWet (Wo 85/01856) berichtet, dass Maispollen, der mit exogener DNA behandelt wurde, diese DNA bei der Keimung aufnimmt und nach Bestäubung in die Einzelle transportiert.
Trotz der potentiellen grossen Bedeutung des Gentransfers in und durch Pollen gelang es bislang noch in keinem Fall, die Ergebnisse von Hess, Pandey und DeWet in andern Labors zu reproduzieren. So konnte z. B. Engvild (Theor Appl. Genet 69 : 457 bis 461,1985) die Versuche von Pandey nicht reproduzieren. Bei den Versuchen von Hess [1975] und von DeWet ist die Aufnahme exogener DNA in das Pollenkorn und der genetische und molekulare Nachweis der transferierten DNA der kritische Punkt der Beweisführung. Phänotypischer und physiologischer Nachweis reichen nicht aus (Hess in : Genetic manipulation in plant breeding, de Gruyter, Berlin, New York 803 bis 811,1986).
Auch die Versuche von Sanford et al (Biotechnology and exology of pollen (Mulcaby D, ed.), Springer, Heidelberg, New York, 71 bis 75,1968) zeigten, dass Kokultivierung von reifen Nicotiana langsdorfii-Pollen mit Agrobakterien zu keinem Gentransfer in Pollen führte. In umfangreichen Versuchen von Negrutiu, Heberle-Bors und Potrykus (ebendort 65 bis 70, 1986) gelang es nicht, das Neomycinphosphotransferase-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, (Shillito et al, Biotechnology 3 : 1099 bis 1103,1985) in reife Pollen zu übertragen.
Mit Methoden, die dem neuesten Stand der Technik entsprachen, war es also nicht möglich, die Behauptungen von Hess und DeWet zu bestätigen. Dass die Ergebnisse von Hess und De Wet nicht nachvollziehbar sind, kann dadurch erklärt werden, dass reife Pollenkörner sofort mit der Bildung eines Pollenschlauches beginnen, sobald sie in ein für den Gentransfer notwendiges wässeriges Milieu gelangen. Offenbar sind sie dann nicht mehr befruchtungsfähig bzw. es ist die Zeit, die für den Gentransfer zur Verfügung steht, zu kurz.
Pareddy et al beschreiben in Planta 170 : 141 bis 143 [1987], die Kultivierung und Reifung unreifer Maisfahnen ("tassels", männl. Blütenstände) in vitro. Mit dem isolierten reifen Pollen wurde bestäubt, und aus den bestäubten Pflanzen wurden Samen gewonnen. Ein mittels genetischer Markierung geführter Beweis für erfolgreiche Befruchtung konnte nicht erbracht werden.
Unerwarteterweise wurde gefunden, dass die Kultivierung unreifer Pollenkörner ohne das diese umhüllende natürliche Nährgewebe möglich ist, dass weiters in diese isolierten unreifen Pollenkörner während verschiedener Stadien der Reifung Fremdgene eingebracht werden können, und dass mit den ausgereiften Pollenkörnern Pflanzen bestäubt, befruchtet, zur normalen Samenbildung, zur Keimung und zur Vermehrung gebracht werden können.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Gentransfer in Pflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) aus Staubgefässen unreife Pollenkörner in Nährlösung entnimmt und das umgebende
Gewebe entfernt,
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b) die isolierten unreifen Pollenkörner in einer Nährlösung kultiviert c) in die Pollenkörner während der in vitro-Kultivierung und Reifung fremdes Genmaterial überträgt d) die transformierten Pollenkörner in vitro zur vollständigen Reifung bringt e) mit den transformierten Pollenkörnern Empfängerpflanzen bestäubt und aus diesen Samen gewinnt.
Durch den Gentransfer in isolierte, unreife Pollenkörner, die in vitro-Reifung und die Verwendung von Pollen als universellen Supervektor wird eine völlig neue Strategie des Gentransfers in Pflanzen eröffnet. Im Vergleich zu andern Methoden ist sie wesentlich vereinfacht, da die Zellkulturphase stark verkürzt wird und die Regeneration mit der unangenehmen Begleiterscheinung der somaklonalen Variation wegfällt. Mit dieser neuen Methode können auch Pflanzen transformiert werden, die einem erfolgreichen Gentransfer bisher nicht zugänglich waren : So sind z. B. viele Arten von Getreiden, Leguminosen und Bäumen nicht aus Einzelzellen oder Protoplasten regenerierbar.
Der potentielle Nutzen aus der Gentransfertechnik ist von grossem wirtschaftlichen, ökologischen und sozialen Wert. Es wird angestrebt, Pflanzen so genetisch zu verändern, dass der Ertrag erhöht wird, dass die Pflanzen resistent gegen Krankheiten und Schädlinge werden, dass sie gegen Kälte, Hitze, Trockenheit, Versalzung, Nährstoffmangel tolerant werden, dass sie eine grössere Ernährungsqualität erlangen, dass sie neuartige Industrierohstoffe produzieren, oder dass sie ihren eigenen Stickstoff fixieren oder auf andere Weise von Düngern unabhängig werden.
Wesentlich für die Erfindung ist, dass Pollenkörper ohne das sie umhüllende Gewebe, also isoliert, kultiviert werden, so dass das zu übertragende Genmaterial in an einen Vektor gekoppelter oder in nackter Form direkten Kontakt zum Pollenkorn hat. Wird nämlich der komplette männliche Blütenstand kultiviert, ist es wegen der Behinderung durch das umfangreiche umhüllende Gewebe nicht möglich, mit Hilfe gängiger Transfermethoden (A. tumefaciens, Elektroporation, Mikroinjektion u. dgl.) Gene so in die Pollenkörner zu transferieren.
Ein weiteres wesentliches Erfindungsmerkmal ist die Verwendung unreifer Pollenkörner.
Dadurch steht die gesamte Zeit der in vitro-Reifung zum Gentransfer zur Verfügung. Die Übertragung in das unreife Pollkorn kann in verschiedenen Reifestadien, abhängig von der Pflanzenart erfolgen. Insbesondere beim Gentransfer mit Vektoren kommt es darauf an, dass das Genmaterial möglichst wenig Zellwände überwinden muss, um in das Genom der Spermakerne zu gelangen und bei Befruchtung Teil des Zygotengenoms zu werden. Die Übertragung erfolgt bevorzugt bei einkernigen Mikrosporen, kann aber auch während der ersten Pollenmitose, im frühen zweikernigen Stadium, solange die generative Zelle noch an der Pollenwand haftet, oder auch zusätzlich bei jenen Pflanzen, die im Reifestadium dreikernige Pollen aufweisen (Getreide), im Stadium kurz vor oder während der zweiten Pollenmitose erfolgen.
Im einzelnen wird das Verfahren wie folgt durchgeführt, wobei als Modellsystem Tabak (Nicotiana tabacum) verwendet wurde. Das System ist auf alle durch Bestäubung vermehrbaren Pflanzen anwendbar, insbesondere auf ein-und zweikeimblättrige Kulturpflanzen wie Weizen, Mais, Reis, Leguminosen, Ölsaaten, Gemüsepflanzen, Obst- und Forstpflanzen.
In einem Vorversuch wird das Entwicklungsstadium der Pollen der gewünschten Pflanze in üblicher Weise durch Isolierung von einer Anthere, Herstellung eines Quetschpräparates und Beobachtung im Mikroskop nach Zusatz von z. B. Karminessigsäure bestimmt.
Haben die Pollen das gewünschte Stadium erreicht, werden die Pollenkörner unter aseptischen Bedingungen isoliert, indem man sie in einem Nährmedium aus dem Anthere ausquetscht, durch ein Sieb passiert, wäscht, abzentrifugiert und resuspendiert.
Die Zelldichte soll für Pollenkörner im jüngeren Entwicklungsstadium höher sein, als Pollenkörner im älteren Entwicklungsstadium. Sie beträgt beim Tabak von zweikernigen Pollenkörnern etwa 105/ml, für einkernige Mikrosporen ist sie etwa doppelt so hoch.
Das verwendete Nährmedium enthält alle für die Kultivierung und Aufrechterhaltung der Reifungsfähigkeit der Pollenkörner essentiellen Nähr- und Wuchsstoffe. Je nach Pflanze können sich dabei unterschiedliche Zusammensetzungen ergeben, so dass es die Funktion des Nährgewebes (Tapetum) erfüllt. Als Hauptbestandteile enthält das Nährmedium dabei Zucker, Nährstoffe, Mineral-
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salze und Vitamine, wobei der PH-Wert etwa 6, 5 bis 7, 5 beträgt.
Im Falle von einkernigen Mikrosporen erfolgt die Kultivierung bis zum Zweikernstadium in einem an Zucker, z. B. Saccharose und weiteren Nährstoffen wesentlich angereicherten Medium.
Beispielsweise können die zusätzlichen Nährstoffe in Form von Kokosnusswasser zugeführt werden.
Haben die Pollenkörner das zweikernige Stadium erreicht, können sie in ein weniger nährstoffreiches Medium überführt werden.
Nach beendeter in vitro-Reifung werden die Pollenkörner für die Bestäubung gewonnen.
Dazu werden sie abzentrifugiert, gewaschen und in einem wässerigen Medium oder getrocknet auf Blüten, aus denen vorher die Antheren entfernt wurden, zur Bestäubung aufgebracht. Aus den mit den in vitro gereiften Pollenkörnern bestäubten Pflanzen können auf allgemein übliche Art Samen gewonnen werden, welche keimungsfähig sind.
Zum Gentransfer während der in vitro-Kultivierung kann das zu übertragende fremde Genmaterial in Verbindung mit einem üblichen Vektor, wie z. B. A. tumefaciens oder als nackte DNA durch Direkttransfer mittels Elektroporation, Mikroinjektion oder andere physikalisch-chemische Methoden in die Pollenkörner eingebracht werden. Der Ausdruck"fremdes Genmaterial"bedeutet jedes ausserhalb des zu transformierenden Pollenkorns entstandene Genmaterial. Nach erfolgter Reifung werden die Pollenkörner in der oben beschriebenen Weise zur Bestäubung gewonnen.
Als Beweis für die erfolgreiche in vitro-Reifung wurden Pollenkörner einer Tabakpflanze mit zwei Markergenen in vitro gereift und mit diesen Pollenkörnern normale Wildtypenpflanzen bestäubt. Die gewonnenen Samen wurden sterilisiert und in einem z. B. auf Kanamycin-Resistenz selektiven Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Die Mendel'sche Segregation der Markergene wurde durch Auszählung der Keimlinge im selektiven Medium nachgewiesen. Dies ist der Beweis, dass es die in vitro gereiften Pollenkörner waren, die die Befruchtung durchführten und nicht irgendwelche Pollenkontaminationen von andern Pflanzen.
Als Beweis für die Expression des durch Transformation während der in vitro-Kultivierung eingebrachten Fremdgens wurde in einem Enzymtest die Chloramphenicolacetyltransferase- - Aktivität (CAT-Aktivität) in einem Homogenat aus den transformierten Pollenkörnern nachgewiesen.
Beispiel 1 : Bestimmung des Pollenentwicklungsstadiums
Tabakblüten wurden in verschiedenen Längen geerntet, die Antheren aseptisch isoliert, eine der fünf Antheren zusammen mit einem Tropfen Karminessigsäure (4% Karmin in 45% Essigsäure) auf einen Objektträger gebracht und ein Quetschpräparat hergestellt. Das Entwicklungsstadium der Pollenkörner wurde nach 1/2 h unter dem Mikroskop bestimmt.
Beispiel 2 : Isolierung der Pollenkörner
Die Tabakpollenkörner wurden isoliert, indem Antheren unter aseptischen Bedingungen
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wurde. Zuletzt wurde die Pollensuspension bei 6500 Umdr/min in einer Eppendorf Zentrifuge abzentrifugiert.
Beispiel 3 : Pollenkultur zur Reifung früh zweikerniger Pollenkörner
Früh zweikernige Tabakpollenkörner wurden isoliert und die Zelldichte in AMGLU-Medium auf 105/ml eingestellt. 1 ml der Pollensuspension wurde in 35 mm-Petrischalen bei 25 C in Dunkelheit kultiviert. Nach 3 bis 5 Tagen, abhängig vom genauen Entwicklungsstadium der Pollenkörner, waren die Pollenkörner reif und konnten geerntet werden.
Beispiel 4 : Pollenkultur zur Reifung einkerniger Mikrosporen
Einkernige Tabakmikrosporen wurden in MR24-Medium (2) bei einer Zelldichte von 2. 105/ml kultiviert. Sobald die Pollenkörner das zweikernige Stadium erreicht hatten (nch 2 bis 5 Tagen abhängig vom genauen Alter), wurden sie abzentrifugiert und in M1S-Medium (3) weiterkultiviert, bis die Reifung vollendet war.
Beispiel 5 : Bestäubung und Nachweis der Befruchtung
Die Tabakpollenkörner wurden abzentrifugiert, in BK-Medium (Brewbaker und Kwack 1963) gewaschen und die Zelldichte auf 1. 25. 105/ml eingestellt. Aus Blüten, die sich gerade öffneten (rote Blütenspitze) wurden die noch geschlossenen Antheren entfernt. Sobald die Blüte sich ge-
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öffnet hatte, wurde ein 4 111-Tropfen der Pollensuspension mit Hilfe einer 20 Ill-Pipette so auf die Narbe der Blüte aufgebracht, dass die Narbe komplett mit Pollensuspension bedeckt war.
Diese Operationen wurden bei Bedingungen ohne Luftbewegung und von andern Pflanzen derselben Art entfernt, durchgeführt. Sobald der Tropfen auf der Narbe angetrocknet war, wurden Narbe und Griffel mit einem 4 cm langen Strohhalm bedeckt, um Fremdbefruchtung zu verhindern.
Die Pflanzen wurden dann ins Glashaus zurückgebracht.
Als Beweis, dass die in vitro maturierten Pollenkörner die Bestäubung und Befruchtung durchgeführt hatten, wurden Pollenkörner einer transgenischen Pflanze in vitro maturiert und mit diesen Pollenkörnern normale Wildtyppflanzen bestäubt. Als Markergen enthielt die transgenische Pflanze das Neomycin-Phospho-Transferase-Gen (Resistenz gegen Kanamycin) und das Nopalinsynthase-Gen. Die reziproke Kreuzung wurde ebenfalls durchgeführt.
Beispiel 6 : Samenernte, Samenkeimung und genetischer Test
Die nach Beispiel 5 erhaltenen reifen Samenkapseln (braun und trocken) wurden geerntet und die Samen isoliert, indem die Spitze der Kapsel abgeschnitten und die Samenkörner direkt in ein Eppendorfhütchen eingefüllt wurden. Die Samen wurden in einer NaOCI-Lösung (3% freies Chlor) 5 min lang oberflächensterilisiert, zweimal mit sterilem Wasser gewaschen und auf ein Samenkeimungsmedium mit Kanamycin (4) aufgelegt.
Nach vier Wochen wurde die Zahl an Kan R und Kan Keimlingen gezählt. Bei obigem Kreuzungsversuch ergaben die beiden reziproken Kreu-
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Agrobakterien (A. tumefaciens ohne Tumorgene, mit CAT-Gen gekoppelt an 35S-Promotor) wurden in Luria-Broth (6) 1 Tag vorinkubiert. Pollenkörner im früh zweikernigen Stadium wurden isoliert und in AMGLU-Medium kultiviert. Die Bakteriensuspension wurde mit AMGLU-Medium auf eine OD 580 von 0, 2 eingestellt. Nach einer weiteren Verdünnung mit AMGLU-Medium von 1 : 10 wurden 20 111 der Bakteriensuspension zu 1 ml der Pollensuspension gegeben. Nach 24 h Kokultivierung wurde zur Abtötung der Agrobakterien 1 111 Claforan (1 g/2 ml) pro ml zugegeben.
Nach zwei weiteren Tagen wurden die Pollenkörner geerntet und in Extrakt hergestellt. Dazu wurden pro ml Pollensuspension 1, 5 ml Calcium-Waschlösung (5), PH-Wert 5, 6 zugegeben, bei 4000 Umdr/min 5 min zentrifugiert und mit einem Tris-Puffer (0, 25 M, PH 7, 8) gewaschen. Nach Zentrifugation wurde das Pollenpellet mit 200 lil Tris-Puffer versetzt, und durch Ultraschall (3 x 15 s) auf Eis homogenisiert. Nach 10 min auf Eis wurde abzentrifugiert und der Überstand bei-20 C aufbewahrt.
Das CAT-Test erfolgte wie von Sleigh (Anal. Biochem., 56 : 251 bis 256,1986) beschrieben.
30 l des Extraktes wurden vermischt mit 20 il Chloramphenicol (8 mM), 30 111 Tris-Puffer und 20 tl C-markiertes Acetyl-CoA (5 I1Ci/ml in 0, 5 mM kaltes Acetyl-CoA) vermischt. Nach Inkubation bei 37 C für 1 h wurde das acetyliert Chloramphenicol durch Äthylacetat ausgeschüttelt (2 x 100 (11) und die Radioaktivität im Szintillationszähler gemessen.
Radioaktivität (cpm) im CAT-Test von Extrakten aus Tabakpollen nach Kokultivierung mit A. tumefaciens cpm
Pollen in AMGLU-Medium 400
Pollen mit Agrobakterien in AMGLU-Medium 6000
Pollen mit Acetosyringon-aktivierten Agrobakterien in AMGLU-Medium 6000 nur Agrobakterien in AMGLU-Medium 500 nur Acetosyringon-aktivierte Agrobakterien in AMGLU-Medium 500
Das starke Radioaktivitätssignal zeigt, dass die Agrobakterien die Pollenkörner erfolgreich infiziert haben und die T-DNA zur Expression (Transkription) in den Zellkern der wachsenden Zelle gelangt sein muss.
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Als weitere Kontrolle, um zu zeigen, dass die Agrobakterien selbst keine CAT-Aktivität hatten, zeigte eine Agrobakterienkultur in Luria-broth über einen kompletten Wachstumszyklus keine CAT-Aktivität.
Kulturmedien : (1) AMGLU-Medium
Miller Makrosalze (7)
MS Mikrosalze (8)
Saccharose (0, 25 M)
Glutamin (440 mg/l)
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(2) MR24-Medium
MS Makrosalze
MS Mikrosalze
Saccharose (0, 5 M)
Glutamin (440 mg/l)
Kokosnusswasser (2 Vol.-%)
Lactalbumin Hydrolysat (200 mg/l)
Inositol (100 mg/l)
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(4) Samenkeimungsmedium
MS Makrosalze
MS Mikrosalze
FeEDTA (10-4 M)
Saccharose (1 Gew.-%)
Agar (0, 8 Gew.-%)
Kanamycin.SO4 (50mg/l)
PH 5, 5 (5) Calcium-Waschlösung
CaCl2.2H2O (0,16M)
MES-Puffer (0, 5 Gew.-%)
PH 5, 6 (6) Luria-Broth
Trypton 10 g/l
Hefe-Extrakt 5 g/l
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Gentamycin 50 mg/l
Rifampicin 20 mg/l (7)
Miller-Makro-Salze
KN03 1000 mg/l NHNOg 1000 mg/l
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24H20 347 mg/lH3 B03 6, 2 mg/l KJ 0,83 mg/l Na2MoO 4. 2H20 0, 25 mg/l
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5H2O 0,1. Verfahren zum Gentransfer in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) aus Staubgefässen unreife Pollenkörner in Nährlösung entnimmt und das umgebende
Gewebe entfernt, b) die isolierten unreifen Pollenkörner in einer Nährlösung kultiviert, c) in die Pollenkörner während der in vitro-Kultivierung und Reifung fremdes Genma- terial überträgt, d) die transformierten Pollenkörner in vitro zur vollständigen Reifung bringt, e) mit den transformierten Pollenkörnern Empfängerpflanzen bestäubt und aus diesen
Samen gewinnt.