DE3738874A1

DE3738874A1 - Verfahren zur herstellung von genetisch transformierten pflanzenobjekten

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Publication number: DE3738874A1
Application number: DE19873738874
Authority: DE
Inventors: Pavel Viktorovic Melnikov; Taras Petrovic Pasternak; Jurij Jurevic Gleba; Konstantin Merkurevic Sytnik
Original assignee: INST BOTAN IM N G CHOLODNOGO A
Current assignee: INST BOTAN IM N G CHOLODNOGO A
Priority date: 1987-01-29
Filing date: 1987-11-16
Publication date: 1988-11-17
Also published as: GB2200367A; DE3738874C2; CH670655A5; GB8702006D0; GB2200367B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der gentech nischen Behandlung von Pflanzen, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten pflanzlichen Objekten, das zur Herstellung neuer Arten (Formen) von Pflanzen, darunter auch von für die Landwirtschaft wichti gen Pflanzen Verwendung findet, die durch bestimmte Eigen schaften gekennzeichnet sind, wie spezifische Beständigkeit gegen pathogene Viren und Mikroorganismen, veränderte Amino säurezusammensetzung, erhöhter Anteil an verwertbarer Bio masse, sowie erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen ungünstige Umweltfaktoren u.a.

Es sind verschiedene Verfahren bekannt, die es gestatten, Protoplaste von höheren Pflanzen so zu transformieren, daß nachfolgend Zellenlinien und Pflanzen mit neuen vererbbaren Eigenschaften hergestellt werden können. So ist beispiels weise ein Verfahren bekannt, das darin besteht, daß man ei ner Suspension der Protoplasten von Nicotiana tabacum DNS zugibt, und das erhaltene Gemisch danach durch physikali sche und chemische Faktoren beeinflußt, was zum Eindringen von DNS in die Protoplaste führt (J. Potrykus, R.D. Shilli to, M.W. Saul, J. Paszkowsky, "Direct Gene Transfer. State of the Art and Future Potential", Plant Mol. Biol. Reporter, Bd. 3, Nr. 3, 1985, S. 117-128).

Es ist auch ein Verfahren bekannt, wonach man Protoplasten von Nicotiana tabacum genetisches Material, das in Lipid bläschen (Liposomen) eingeschlossen ist, in Gegenwart eines Agglutinierungsmittels zugibt. Das führt zur Vereinigung der Liposomen mit den Protoplasten unter Eindringen des geneti schen Materials in den Protoplast (T. Nagata, "Liposomes as a Carrier of Ti-Plasmid into Protoplasts", "Molecular Gene tics of the Bacteria-Plant Interactions"; Ed. Pühler, Springer-Verlag, Berlin e.a., 1983, 268-273).

Die bekannten Verfahren sind nur auf eine begrenzte Anzahl von Pflanzenarten anwendbar, und zwar nur auf Pflanzen und Zellkulturen, für die Verfahren zur Herstellung und Züchtung von Protoplasten, aus denen nachfolgend die entsprechenden Pflanzen regeneriert werden können, entwickelt worden sind. Außerdem weisen die bekannten Verfahren nur eine niedrige Transformationseffektivität (höchstens 1%) und einen erheb lichen Verbrauch an transformierendem Faktor auf.

Es ist ein Verfahren zur Herstellung genetisch transformier ter pflanzlicher Objekte bekannt, bei dem als Rezipient Pro toplaste von Nicotiana tabacum verwendet werden. In die Pro toplaste wird durch Mikroinjektion das Plasmid pCGN 561 ein geführt (A. Crossway et al., "Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts", Mol. Gen. Genet., 1986, Bd. 202, S. 179, 185).

Bei dem erwähnten Verfahren ist die Verwendung von Proto plasten unumgänglich, weshalb es ebenfalls nur auf eine be schränkte Zahl wirtschaftlich wertvoller Pflanzen, wie z.B. auf Pflanzen der Familie Solanaceae (Tomate und Kartoffel) angewandt werden kann.

Für die meisten wirtschaftlich wichtigen Pflanzen, die in vitro gezüchtet werden (Suspensionskultur, Calluskultur, Kultur isolierter Organe, embryogene Calluskultur) wurden bislang jedoch noch keine Transformationsverfahren entwik kelt.

Alle Autoren halten es für notwendig, die Protoplasten zu isolieren, wobei auch die Transformation nach der Isolierung der Protoplasten 0 bis 5 Tage betragen soll. In diesem Zu sammenhang muß jedoch bemerkt werden, daß für die meisten landwirtschaftlich nutzbaren Pflanzen die Protoplasten nicht isoliert werden können, so daß die bekannten Verfahrensweisen nicht gentechnisch verbessert werden können (H. Lorz et al., "Studies in Cereal Transformation. Nuclear Techniques and in vitro Culture for Plant Improvement", Proc. Int. Symp., Vienna 19-23, 1985, 1986, 505-509; Ju. Ju. Gleba, K.M. Sytnik, "Kletocnaja inzenerÿa rastenÿ" (Zelltechnologie bei Pflanzen), Kiev, "Naukova Dumka", 1984, bzw. Überset zung des Artikels, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1985; EP 01 75 966 A1).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung genetisch transformierter pflanzlicher Ob jekte (Zellen in Suspensionskultur, in Mikrokolonien sowie in verschiedenen pflanzlichen Strukturen) zu entwickeln, das eine Qualitätssteigerung bei Nutzpflanzen, insbesondere bei der Züchtung von Sorten landwirtschaftlicher Nutzpflan zen auf gentechnischem Wege ermöglicht, die folgende Vor züge aufweisen:

- spezifische Beständigkeit gegenüber bereits bekannten oder noch zu entwickelnden Herbiziden;
- spezifische Beständigkeit gegenüber pathogenen Viren und Mikroorganismen;
- veränderte Aminosäurezusammensetzung der wichtigsten Re serveeiweiße;
- Erhöhung des Anteils an verwertbarer Biomasse;
- erhöhte Beständigkeit gegenüber ungünstigen Umwelteinflüs sen.

Die Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen er sichtlich gelöst, indem man in eine Einzelzelle oder vor zugsweise eine Zelle in einem Zellverband ein DNS-Molekül oder ein autonom replizierendes Organell einführt. Das Re zipientenobjekt mit dem eingeführten transformierenden Fak tor wird zur Herstellung von Zellinien oder Pflanzen mit neu en erblichen Eigenschaften auf selektiven Nährmedien gezüch tet. Dabei erfolgt die Einführung des transformierenden Fak tors in das Rezipientenobjekt durch Mikroinjektion, die nach beliebigen geeigneten Methoden durchgeführt werden kann. Es ist zweckmäßig, die Mikroinjektionen unter Einwirkung von Druck oder insbesondere eines elektrischen Feldes durchzufüh ren.

Die Verwendung einer Einzelzelle oder von Zellen im Zell verband als Rezipienten ermöglicht eine erhebliche Erwei terung der Zahl der gentechnisch manipulierbaren Pflanzen arten. Dies gilt in erster Linie für wirtschaftlich so wich tige Pflanzenfamilien wie Gräser (Getreide, z.B. Weizen, Ha fer) und Hülsenfrüchtler.

Bisher hat man mit Protoplasten gearbeitet, da Zellen im ge netischen und physiologischen Sinn nicht gleichartig sind. Jede Zelle hat ihr Programm und führt es aus. Die Zelle ist ein Protoplast, der schon eine bestimmte Entwicklung hinter sich hat, während der Protoplast eine Zelle ist, die keine individuellen Merkmale besitzt und in der das gesamte gene tische Programm bisher nicht realisiert wurde. Aus dem Pro toplast kann man eine beliebige Zelle oder eine andere Zell art erhalten, je nach den Bedingungen wie Nährmedium, Zusatz von Hormonen etc. Aus der Zelle kann man nichts mehr mit ei nem bestimmten Programm erhalten. Es war deshalb überra schend, daß bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen wie Weizen, Hafer usw. von einer Einzelzelle oder von einer Zelle im Zellverband ausgegangen werden konnte.

Gegenwärtig sind verschiedene Verfahren zur Züchtung von Pflanzenarten in einer Suspensionskultur bekannt, die zur Synthese sekundärer Stoffwechselprodukte befähigt sind und von wichtiger praktische Bedeutung sind (Rauwolffia serpen tina, Dioscorea deltoidea, Papaver somniferum u.a.). Bei der Suspensionskultur bzw. einem ähnlichen Verfahren der Tiefenkultur ist das Pflanzenmaterial Einzelzellen oder Zel len, die mehrzellige undifferenzierte Konglomerate unter schiedlicher Größe (Mikrokalli) bilden. Bei der Passage ei ner Suspensionskultur kommt es zu einer Anhäufung der Bio masse der Zellen und zu einer Produktion wertvoller sekundä rer Stoffwechselprodukte dieser Zellen.

Für viele wirtschaftlich überaus wichtige Pflanzen wie z.B. solche aus der Familie der Kreuzblütler, wie z.B. Kraut bzw. Kohl (Brassica oleracea), Rettich (Raphanus sativus), aus der Familie der Hülsenfrüchtler, wie z.B. Soja (Glycine max), Erbsen (Pisum sativum), sowie aus der Familie der Gsamineen (Getreide), wie z.B. Weizen (Triticum aestivum), Hafer (Ave na sativa) und Gerste (Hordeum vulgare), sind bereits Verfah ren zur Herstellung von Kalli aus verschiedenen Explantaten bekannt. Bei Getreide hat sich die Verwendung unreifer und reifer Keimlinge als am erfolgreichsten erwiesen. Kalli er geben nach einer Reihe von Passagen und nach einer Übertra gung auf das entsprechende Nährmedium den Anstoß zur Ent wicklung embryonaler Gewebsverbände. Das dabei entstehende Embroyd ist ein mehrzelliges, kompaktes, differenziertes Ge bilde, bei dessen Züchtung man schließlich den ganzen pflanz lichen Organismus erhält.

Sämtliche oben erwähnten und viele andere wirtschaftlich wichtige Pflanzen können gegenwärtig nur durch Mikroinjek tion genetisch transformiert werden, da sie nicht über die Protoplaststufe hergestellt werden können. Nur das erfin dungsgemäße Verfahren ermöglicht die Transformation dieser und anderer Pflanzen, die in vitro in Form von Einzelzellen und in organisierten und nichtorganisierten mehrzelligen Ge bilden gezüchtet werden können.

Für die Gewinnung einer transformierten Zellinie in einer Suspensionskultur wird mit dem unteren Ende einer Pipette mit zurückgezogener Spitze ein geringes Volumen einer Kul tur, die mehrere hundert Zellen enthält, in eine auf dem Objekttisch eines Mikroskops befestigte Mikrokammer einge bracht. Eine der Zellen wird mit Hilfe eines Mikrosaugnapfs fixiert, dessen Durchmesser von der Größe der Zellen der je weiligen Kultur abhängt (im allgemeinen 10 bis 50 µm). Die Zellwand wird durch rasches Einstechen einer Mikronadel durchbohrt. Nach der Injizierung der DNS-Moleküle oder ei nes autonom replizierenden Organells, die entweder unter Druck zusammen mit der Flüssigkeit oder unter Einwirkung eines elektrischen Feldes durchgeführt wird, wird die Mik ropipette aus der Zelle antfernt. Dann wird die nächste Zel le fixiert, in die ebenfalls genetisches Material fremden Ursprungs injiziert wird. Der transformierende Faktor wird in 10 bis 40 Zellen injiziert.

Die Füllung der Mikropipette mit der DNS-Lösung erfolgt ent weder über das verjüngte untere Ende einer Pipette durch Er zeugung eines Unterdrucks oder über das obere Ende mit Hilfe einer Kapillare, die in die Mikronadel eingeführt wird.

In jede Zelle werden unter Druck 1 bis 10 pl DNS-Lösung ein geführt, was ca. bis zu 10% des Zellvolumens ausmacht. Die Messung des in die jeweilige Zelle eingespritzten Lösungsvo lumens erfolgt mit Hilfe eines Okularmikrometers anhand der Wanderung des Meniskus an der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser bzw. Wasser und Öl in der Mikronadel. Dabei wird die DNS-Konzentration so gewählt, daß in die Zelle jeweils bis zu hundert Plasmidkopien gelangen.

Bei der Einspritzung der DNS mit Hilfe eines elektrischen Feldes bedient man sich einer Spannung am Ausgang der Strom quelle von bis zu 10 V. Die Kontaktierung mit der DNS-Lö sung in der Mikronadel erfolgt mit Hilfe eines Platindrahts (′′-′′-Elektrode). Die zweite Elektrode (′′+′′-Elektrode) befin det sich in dem den Rezipienten umgebenden Nährmedium. Die elektrische Spannung wird in 3 bis 5 Impulsen mit einer Dauer von bis zu 0,5 s zugeführt.

Die Mikroinstrumente werden nach aus der Literatur bekannten Verfahren (von Brün, 1951) aus Glaskapillaren mit einem In nendurchmesser von 0,5 bis 1 mm hergestellt. Die Arbeiten mit dem pflanzlichen Material werden mit sterilen Instrumen ten in einer laminaren Strömung steriler Luft durchgeführt. Sämtliche Manipulationen erfolgen unter mikroskopischer Kon trolle.

Die mit dem verjüngten Ende der Pipette entnommenen inji zierten Zellen werden dann auf einem selektiven Nährmedium gezüchtet, dessen Wahl vom Merkmal abhängt, das durch den transformierenden Faktor kodiert wird. So z.B. ist bei der Einspritzung von Plasmiden, die T-DNS-Sequenzen des Ti-Plas mids von Agrobacterium tumefaciens enthalten und die Hormon synthese in Tumorzellen kodieren, das selektive Medium ein hormonfreies Medium. Die auf einem solchen Medium ausge wählten Zellen sind gekennzeichnet durch Wachstumsfähigkeit auf hormonfreiem Medium. Dieses Merkmal ist von großer prak tischer Bedeutung für die Züchtung von Zellen in einer Kul tur, da Phytohormone die teuerste Komponente von Nährmedien darstellen.

Für die Gewinnung transformierter Pflanzen, die in vitro einen embryoge nen Kallus bilden, überträgt man das Explantat, z.B. einen unreifen Keim ling, auf ein die Kallusbildung induzierendes Medium. Den gebildeten Kal lus überträgt man dann auf ein das Wachstum der Zellmasse förderndes Medi um. Mit zunehmender Zellenzahl kommt es zur Differenzierung der Zellen, d.h. ein Teil derselben wächst stark in die Länge und hört dann auf, sich zu teilen, während ein anderer Teil proembryogene Strukturen (kompakte Zellgebilde) bildet. Die Größe dieser Strukturen hängt von der Pflanzenart ab. Bei Weizen beträgt sie z.B. 0,5 bis 2 mm auf den verschiedenen Differenzierungsstufen. Diese Struktu ren scheidet man aus der Masse der nichtembryogenen Zellen visuell mit Hilfe von Präpariernadeln aus. Dann überträgt man sie in die Mikrokammer auf dem Objekttisch des Mikro skops und bringt sie in ein flüssiges Nährmedium, wonach man sie z.B. mit Hilfe einer Unterdruck erzeugenden Kapillare oder zweier einen Winkel einschließenden Glasplatten mecha nisch befestigt. In eine dieser Zellen der proembryogenen Struktur wird dann eine Mikronadel eingeführt und sodann nach einem der genannten Verfahren DNS injiziert. Dann wird in die nächste Zelle injiziert. Nach Behandlung sämtlicher im Gesichtsfeld zugänglicher Zellen wird der Kallus mit Hil fe einer Nadel gewendet, wonach noch in einige weitere Zel len injiziert wird.

Pro Kallus wird in 20 bis 30 Zellen DNS injiziert. Die Ver suchsbedingungen, der Mikronadeldurchmesser und andere Pa rameter für die Injizierung in die Zellen im Zellverband entsprechen denen, wie sie auch bei der Transformation von Einzelzellen angewandt werden.

Der auf diese Weise behandelte proembryogene Zellverband wird dann zwecks Embryogenese auf ein eine selektive Kompo nente enthaltendes Medium transferiert. Diese kann z.B. das Herbizid Roundup (N-(Phosphonomethyl)glycin) sein, wenn die Zellen mit einem Beständigkeit gegenüber diesem Stoff kodie renden Vektor transformiert sind. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Züchtung eines gegenüber diesem Herbizid beständi gen Weizens von großer praktischer Bedeutung ist.

Auf dem selektiven Medium entsteht dann aus dem proembryo genen Kallus ein Embryoid. Aus diesem entwickelt sich dann die Pflanze, die auf dem Nährmedium in Anwesenheit eines selektiven Faktors wurzelt. Die vollausgebildete Pflanze wird dann im Boden eingepflanzt. Im weiteren kann sie sich dann auf in der Selektionspraxis üblichen Weise weiter ver mehren.

In einer Reihe von Fällen, wie z.B. bei Soja (Glycine max) und Luzerne (Medicago sativa) ist bei der in vitro-Kultur eine Organogenese zu beobachten. In diesem Falle sind die Rezipienten die Zellen der in der Kultur de novo gebildeten Sproßspitze bzw. die Zellen des proregenerativen Gewebes. Die für die Züchtung der transformierten, aus der Organkul tur regenerierten Pflanze erforderlichen Manipulationen mit Hilfe der Mikroinjektion entsprechen den Manipulationen, die auch bei der Gewinnung von Transformanten aus einer Kultur eines embryogenen Kallus durchgeführt werden.

Die Methode zur Züchtung von Pflanzen mit neuen Eigenschaf ten unter Verwendung von gezüchteten Kalli (embryogenen oder regenerierenden Pflanzen) bzw. unter Verwendung einer Organkultur besteht somit darin, daß man Vektormoleküle in die Zellen injiziert, deren Teilung und Differenzierung schließlich zur Bildung einer ganzen Pflanze führt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur genetischen Transforma tion kann unter Verwendung von genetischem Material durch geführt werden, das unterschiedlich organisiert sein kann. So z.B. können Vektor-DNS-Moleküle (Plasmide, Kosmide, Vek toren auf der Basis von Pflanzenviren), aus verschiedenen Spenderobjekten isolierte DNS-Totalpräparate sowie Zellorga nellen (Chloroplaste und Mitochondrien), die DNS-Moleküle enthalten und zur autonomen Replikation fähig sind, verwen det werden.

Andererseits kann das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem man sich der Mikroinjizierung bedient, zur Transformation anderer Rezipientenarten verwendet werden, die in vitro als Zellsuspension oder als Kallus gezüchtet werden, der zu ver schiedenen Arten der Morphogenese befähigt ist.

Die praktische Bedeutung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bestimmt durch die Vorzüge, die sich aus den neuen Ei genschaften ergeben, die das pflanzliche Objekt durch die Aufnahme von genetischem Fremdmaterial in sein Genom erwor ben hat. Gegenwärtig sind DNS-Vektormoleküle bekannt, die für die Praxis wichtige Merkmale kodieren, wie z.B. die Be ständigkeit gegenüber Herbiziden und bestimmten Erkrankun gen. Die Zahl und das Spektrum der Merkmale, die durch die se Vektormoleküle kodiert werden, steigt ständig. Das er findungsgemäße Verfahren ist gekennzeichnet durch seine uni verselle Anwendbarkeit im Hinblick auf die Rezipienten und die transformierenden Faktoren und kann sowohl unter Ver wendung bereits bekannter Plasmide und anderer DNS-Vektor moleküle als auch noch zu erzeugender bzw. zu isolierender Vektormoleküle verwendet werden, die für die Praxis wichti ge Merkmale kodieren und zu einer Expression in Pflanzen zellen befähigt sind.

Unabhängig von der Art des transformierenden Faktors und des Rezipienten wird das erfindungsgemäße Verfahren zweckmäßi gerweise wie folgt durchgeführt:

1. Vorbereitung des Rezipienten (Gewinnung von Zellen, Kalli und Zellverbänden, die zum Wachstum, zur Teilung und Morpho genese befähigt sind).
2. Vorbereitung der transformierenden Faktoren, die durch ein selektives Merkmal (Isolierung von DNS-Molekülen, Iso lierung von Zellorganellen, Lösung von DNS-Molekülen in ei ner Pufferlösung usw.) gekennzeichnet sind.
3. Herstellung des Mikroinstruments.
4. Anbringen des Instruments auf dem Mikromanipulator und Fixierung des Rezipienten in der Mikrokammer.
5. Füllung der Mikronadel mit dem transformierenden Faktor.
6. Einführung der Mikronadelspitze in die Zelle.
7. Injizierung von DNS-Molekülen bzw. eines anderen trans formierenden Faktors in die Rezipientenzelle.
8. Wiederholung der Arbeitsgänge 6 und 7 bei den nachfolgen den Zellen.
9. Transferierung der Rezipienten auf das selektive Nährme dium.
10. Auswahl und Analyse der erhaltenen Transformanten.
11. Gegebenenfalls Regeneration der transformierten Pflan zen.

Der Nachweis der Aufnahme, der Expression und der Vererbung des injizierten genetischen Materials wird mit biochemischen und genetischen Methoden geführt (Potrykus J. et al., 1985, Crossway A. et al., 1986).

Beispiel 1

Man passiert einmal in zwei Wochen eine Suspensionskultur von Nicotiana tabacum in flüssigem Gamborg-Medium, das 1 mg/dm³ 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,5 mg/dm³ Naphthyl essigsäure, 0,5 mg/dm³ Indolylessigsäure und 0,2 mg/dm³ Ki netin enthält. 3 bis 5 cm³ der Zellsuspension werden in ei ne Kammer für die Mikroinjektion eingebracht. Nach dem Fi xieren einer Einzelzelle mit einem Mikrosaugnapf wird in diese eine Mikronadel mit einem Spitzendurchmesser von ca. 1 µm eingeführt. Mit Hilfe eines Druckluftsystems werden aus der Mikronadel 1 bis 2 pl (Pikoliter) Pufferlösung (10 mMol Tris, pH-Wert 7,2, 1 mMol Natriumethylendiamin tetraacetat, 5 mMol KC1), die das Plasmid pLGV 23 Neo (Her rerea-Estrella L. et al., 1983) in einer Konzentration von 100 Kopien pro Pikoliter Puffer enthält, eingespritzt.

Die Mikrokolonien, die sich aus den injizierten Zellen gebil det haben, werden dann auf ein agarisiertes Gamborg-Medium mit 120 mg/dm³ Kanamyzinsulfat übertragen. Aus 20 injizier ten Zellen erhält man drei Zellinien, die über lange Zeit ihre Antibiotikumbeständigkeit bewahren. Durch Übertragung einer der Linien auf ein phytohormonfreies Gamborg-Medium wurden zum Wachstum und zum Einwurzeln in kanamyzinhaltigem Medium befähigte Pflanzen regeneriert.

Beispiel 2

Eine Kalluskultur eines Gewebes von Mohn (Papaver bracte actum), die aus unreifen Kapseln der intakten Pflanze er halten wurde (Kuzovkina, Rabinovic, 1981), wird auf aqarisier tem Murashige-Skoog-Medium, das 1 mg/dm³ Kinetin, 1 mg/dm³ 2,4-Dichlor phenoxyessigsäure enthält, längere Zeit passiert. Danach wird das Gewebe alle 15 bis 17 Tage auf frisches Medium über tragen. Der Wachstumsindex beträgt 2,6 (pro 15 Tage). Wird ein phytohormonfreies Medium verwendet, lassen sich schon bei der ersten Passage nekrotische Gewebeveränderungen feststellen und die Biomasse nimmt praktisch nicht zu. Die Kallusmasse des Mohns ist auf dem erwähnten Medium in Abwe senheit von Phytohormonen nicht wachstumsfähig.

1 mg des im Wachstum befindlichen weichen Kallus wird in ein flüssiges Medium eingebracht und mit einem sterilen Glasstab zerrieben. Mit einer Pipette wird dann die Zell suspension in eine Mikrokammer transferiert. Die Injizie rung erfolgt nach dem in Beispiel 1 angeführten Verfahren mit dem Unterschied, daß das Einspritzen durch ein hydrauli sches System bewerkstelligt wird und daß als transformie render Faktor das Plasmid pGV 0319 (Depicker A. et al., 1980) verwendet wird, das den Mittelteil der T-DNK des Ti- Plasmids von Agrobacterium tumefaciens pTiC 58 enthält. 34 Zellen wurden nach der Injizierung auf ein phytohormonfreies Murashige-Skoog-Medium übertragen. Nach zweimonatiger Züch tung auf diesem Medium wurde ein Kallusgewebe erhalten, das zu einem starken und beständigen Wachstum auf dem Nährmedium in Abwesenheit von Phytohormonen befähigt war, wobei der Wachstumsindex nicht schlechter war, als bei der nicht trans formierten Zellinie in Anwesenheit von Phytohormonen.

Beispiel 3

Das Verfahren wird analog zu Beispiel 2 durchgeführt mit dem Unterschied, daß man als Rezipienten Zellen im Mikrokallus (8 bis 30 Zellen) von Lycopersicum esculentum im Sachin-Me dium unter Zugabe von 0,3 Gew.-% Agarose verwendet. Durch die Einführung des Plasmids in 95 Zellen wurden 19 zum Wachstum auf hormonfreiem Medium befähigte Zellinien her ausselektiert.

Beispiel 4

Das Verfahren wird analog zu Beispiel 1 durchgeführt mit dem Unterschied, daß man als transformierenden Faktor das Kosmid pG-A 472 (An G. et al., 1985) verwendet. Die Inji zierung erfolgt dabei unter Einwirkung eines elektrischen Feldes mit einer Spannung von 3 bis 5 V mit 10 Impulsen bei einer Impulsdauer von 0,5 s. Aus 23 auf diese Weise transformierten Zellen erhielt man 6 Zellinien, die zum Wachstum auf einem Medium befähigt waren, das 120 mg/dm³ Kanamyzinsulfat enthielt. Von zwei Zellinien wurden Pflan zen regeneriert, die fähig sind, auf kanamyzinhaltigem Me dium zu wachsen und zu wurzeln.

Beispiel 5

Aus unreifen Weizenkeimlingen wurde nach bekannten Verfahren (Gaponenko et al., 1985) auf einem Murashige-Skoog-Medium, das 2 mg/dm³ 2,4-Dichlor phenoxyessigsäure und 0,1 mg/dm³ Kinetin enthielt, ein embryogener Kal lus gewonnen. Nach dreiwöchiger Züchtung wurde der Kallus auf eine Petrischale übertragen, wonach man unter dem Mik roskop mit Präpariernadeln vom Kallus Stücke abtrennte, die aus kleinen kompakt gepackten Zellen bestanden. Diese Gebil de wurden dann in eine Mikrokammer mit einem Nährmedium übertragen und mechanisch zwischen zwei , miteinander einen Winkel einschließenden Glasstücken fixiert. Die Injizierung der DNS in die Zelle erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. Auf diese Weise wurden 6 bis 10 im Blickfeld des Mikroskops befindlichen Zellen DNS injiziert. Danach wurde das Kallus stück mit einer Nadel gewendet und die nächsten Zellen be handelt. Nach der Injizierung von 30 Zellen wurde der pro embryogene Kallus auf ein Murashige-Skoog-Medium übertragen, das 1,2 mg/dm³ 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,1 mg/dm³ Ki netin und 0,1 mg/dm³ Gibberellinsäure enthielt. Nach zwei wöchiger Züchtung wurde der Kallus auf ein Medium, das 50 mg/dm³ Kanamyzinsulfat enthielt, übertragen. Nach vier wöchiger Züchtung auf diesem antibiotikumhaltigen Medium, wurden die im Wachstum befindlichen Kalli auf ein Murashi ge-Skoog-Medium, das 0,2 mg/dm³ 2,4-Dichlorphenoxyessigsäu re und 50 mg/dm³ Kanamyzinsulfat enthielt, übertragen und dem Licht ausgesetzt (ca. 2000 Lux 16 Stunden pro Tag). Die gebildeten Embryoiden wurden auf ein Murashige-Skoog-Medium, das keine Hormone, aber den gleichen Gehalt an Kanamyzin aufwies, ausgebracht. Die vollständig ausgebildeten Pflanzen wurden dann in den Boden gepflanzt.

Beispiel 6

Das Verfahren wird analog zu Beispiel 4 durchgeführt mit dem Unterschied, daß als Rezipient ein embryogener Kallus von Ha fer (Avena sativa) verwendet wird und das Nährmedium keine Gibberelinsäure enthält.

Beispiel 7

Aus den Kotyledonarknoten von aseptisch gezogenen Sojapflan zen (Glycine max) wurde auf einem Murashige-Skoog-Medium, das einen reduzierten Salzgehalt aufwies, in Gegenwart von 5 mMol Benzylaminopurin (Wright M.S. et al., 1986) ein primä rer Kallus gewonnen. Nach einer Kultivierungsdauer von vier Wochen wurden Kallusstücke bis zu einer Größe von 2 mm, die den regenerierfähigen Teil und die de novo gebildete Sproß spitze enthielten, isoliert. Die genetische Transformation wurde analog zu Beispiel 5, jedoch mit dem Unterschied durch geführt, daß die Rezipienten Zellen des proregenerativen Ge webes und der Sproßspitze waren. Die behandelten Kalli wurden auf das Ausgangsmedium übertragen, dem 80 mg/dm³ Kanamyzin sulfat zugesetzt wurde. Nach einer Kultivierungsdauer von drei Wochen wurden die gebildeten grünen Triebe in einem Mu rashige-Skoog-Medium, das keine Phytohormone, aber 80 mg/dm³ Kanamyzin enthielt, eingewurzelt. Die vollständig ausgebilde ten Pflanzen wurden in den Boden gepflanzt.

Beispiel 8

Das Verfahren wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchge führt. Als Rezipienten werden einzelne weiße Zellen des Pla stommutanten von Nicotiana tabacum der Linie IP und als au tonom replizierende Organellen Chloroplaste verwendet, die aus den Blättern von Nicotiana tabacum der Linie SR 2 iso liert wurden, die sich durch Resistenz gegenüber dem Anti biotikum Streptomyzin, die durch die Chloroplasten kodiert wird, auszeichnet. Eine Mikropipette mit einem Spitzendurch messer von 8 µm wird mit einer Chloroplastensuspension in einem Ensen-Baschem-Medium gefüllt. Aus dieser Mikropipette werden dann 5 bis 10 Chloroplaste in die Zelle gespritzt. Nach den ersten Teilungen der Zellen nach der Injizierung werden diese auf ein Gamborg-Medium übertragen, das 1 mg/cm³ Streptomyzinsulfat enthält. Von 16 auf diese Weise injizier ten Zellen werden 3 Zellinien isoliert, die grün gefärbt sind und auf einem Medium, das 1 mg/cm³ dieses Antibiotikums ent hält, wachstumsfähig sind.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzenobjekten durch Einführung eines transformierenden Faktors in das Rezipientenobjekt und nachfolgende Selektion von Zellinien und Pflanzen aus diesem Rezipientenobjekt, die neue erbliche Eigenschaften besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man als transformierenden Faktor ein DNS-Molekül oder ein autonom replizierendes Or ganell und als Rezipientenobjekt eine Einzelzelle oder eine Zelle im Zellverband verwendet und den transformierenden Faktor in das Rezipientenobjekt durch Mikroinjizierung ein führt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Rezipientenobjekt eine Zelle im Zellverband verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Rezipientenobjekt eine Ein zelzelle oder eine Zelle im Zellverband verwendet, die zur Embryoidgenese oder zur Regenerierung einer ganzen Pflanze fähig ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da durch gekennzeichnet, daß die Mikro injizierung unter Einwirkung von Druck oder eines elektri schen Feldes ausgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die Mikroinjizierung unter Einwirkung eines elektrischen Feldes ausgeführt wird.