CH670655A5

CH670655A5 -

Info

Publication number: CH670655A5
Application number: CH316/87A
Authority: CH
Inventors: Pavel Viktorovich Melnikov; Taras Petrovich Pasternak; Jury Jurievich Gleba; Konstantin Merkurievich Sytnik
Original assignee: Inst Botan Im N G Kholodnogo A
Priority date: 1987-01-29
Filing date: 1987-01-29
Publication date: 1989-06-30
Also published as: GB2200367A; DE3738874C2; DE3738874A1; GB8702006D0; GB2200367B

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzenobjekten, das zur Herstellung neuer Arten (Formen) von Pflanzen, darunter auch von landwirtschaftlichen Pflanzen Verwendung findet, die durch bestimmte Eigenschaften gekennzeichnet werden, wie spezifische Beständigkeit gegen Herbizide, spezifische Beständigkeit gegen pathogene Viren und Mikroorganismen, die veränderte Aminosäurezusammensetzung, die Erhöhung der nützlichen Biomasse, eine erhöhte Beständigkeit gegen ungünstige Umgebungsfaktoren und ähnliches.

Es sind verschiedene Verfahren bekannt, die gestatten, Proto-plaste von höheren Pflanzen mit darauffolgender Herstellung daraus durch Selektion von Zellenlinien und Pflanzen mit neuen vererblichen Eigenschaften zu transformieren. So ist beispielsweise ein Verfahren bekannt, das darin besteht, dass zur Suspension der Protoplasten Nicotiana tabacum DNS zugegeben wird, das erhaltene Gemisch nachher durch physikalische und chemische Faktoren beeinflusst wird, was zum Durchdringen von DNS in Proto-plaste führt (Potiykus J., Shillito R.D., Saul M.W., Paszkowski J. Direct Gene Transfer. State of the Art and Future Potential. Plant Mol. Biol. Reporter, v. 3, No. 3, 1985, p. 117-128).

Es ist auch ein Verfahren bekannt, in welchem zu Protoplasten Nicotiana tabacum genetisches Material zugegeben wird, das in Lipidbläschen (Liposome) in Gegenwart eines Agglutinators eingeschlossen ist, was zum Zusammenfluss von Protoplasten und Liposomen unter Durchdringen des genetischen Materials in den Protoplast führt (Nagata T. Liposomes as a Carrier of Ti-plasmid into Protoplasts. In: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction. Ed. Pühler, Springer-Verlag, Berlin e.a. 1983, 268-273).

Die genannten Verfahren werden durch deren begrenzte Anwendungsmöglichkeiten gekennzeichnet, weil diese zu einer begrenzten Anzahl der Pflanzenarten angewendet werden können, und zwar nur zu den Pflanzen und Zellenkulturen, für welche die Methoden zur Herstellung und Kultivierung der Protopla-ste mit darauffolgender Regeneration von Pflanzen daraus entwik-kelt worden sind. Ausserdem werden die genannten Verfahren durch eine niedrige Transformationseffektivität (höchstens ein Prozent) und einen bedeutenden Verbrauch an transformierendem Faktor gekennzeichnet.

Es ist ein Verfahren zur Herstellung der genetisch transformierten Pflanzenobjekte bekannt, bei dem als Empfänger Proto-plaste von Nicotiana tabacum verwendet werden. In Protoplaste wird durch die Mikroinjektion die Plasmide pCGN 561 eingeführt (Crossway A. et al., Integration of foreign DNA following microinjection of tabacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen.

Genet., 1986, v. 202, p. 179-185).

Im erwähnten Verfahren wurden weder Zellenlinien noch Pflanzen mit neuen vererblichen Eigenschaften erhalten, es wurde auch die Expression des eingeführten genetischen Materials nicht gezeigt. Das genannte Verfahren kann ausschliesslich zu Protoplasten angewendet werden, wurde nur im Labormassstab verwirklicht und kann keine praktische Verwendung finden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Erweiterung des Kreises von Objekt-Rezipienten und transformierenden Faktoren ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, die Transformationseffektivität zu erhöhen, den Verbrauch des transformierenden Faktors herabzusetzen und die Anzahl der Pflanzenarten zu vergrössera, die den genetischen Manipulationen mit höheren Pflanzen ausgesetzt werden können.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass im erfindungsgemäs-sen Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzenobjekten durch Einführung des transformierenden Faktors in den Empfanger und darauffolgende Selektion daraus von Zellenlinien und Pflanzen mit neuen vererblichen Eigenschaften erfmdungsgemäss als transformierender Faktor ein DNS-Molekül oder eine sich autonom replizierende Zellenorganelle und als Objekt-Empfanger der Protoplast, die Einzelzelle oder eine Zelle im Zellverband verwendet werden, wobei die Einführung des transformierenden Faktors in den Objekt-Empfänger durch Mikroinjektion erfolgt. Die Mikroinjektionen können nach beliebigen geeigneten Methoden durchgeführt werden. Es ist zweckmässig, die Mikroinjektionen unter Einwirkung vom Druck oder vom elektrischen Feld durchzuführen.

Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet, die Transformationseffektivität auf 40% zu erhöhen, was die Transformationseffektivität von bekannten Verfahren um das 10- bis 20fache übersteigt, dabei wird der Verbrauch am transformierenden Faktor bedeutend geringer.

Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet, als Objekt-Empfanger sowohl den Protoplast als auch die Einzelzelle und eine Zelle im Zellverband oder in der Pflanze, und als transformierenden Faktor sowohl die DNS-Moleküle als auch die sich autonom replizierenden Zellenorganellen auszunutzen. Das gestattet, die Anzahl der Pflanzenarten zu erweitern, die in genetische Manipulationen eingezogen werden, einschliesslich landwirtschaftlich wichtige Kulturen, beispielsweise Gräserkulturen.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird wie folgt durchgeführt.

Der Protoplast, die Einzelzelle oder eine Zelle im Zellverband oder in der Pflanze (Mikrokallus, embiyogener Kallus,

Embiyoid), die als Objekt-Empfänger verwendet werden, werden in der entsprechenden Nährlösung in einer Mikrokammer untergebracht, die auf dem Objektträger des Mikroskops montiert wurde, und mit Hilfe einer Einrichtung zum Festsaugen oder durch das Begiessen mit Agar oder mechanisch fixiert. Die mit dem transformierenden Faktor (Plasmide, Kosmide, Chloroplast) im entsprechenden Medium gefüllte Glasnadel wird mit Hilfe eines Mikromanipulators in den Objekt-Empfanger unter visueller Kontrolle durch das Mikroskop eingeführt. Die Mikroinjektion wird unter Einwirkung des pneumatischen oder hydraulischen Drucks oder unter Einwirkung des elektrischen Feldes verwirklicht. Das Volumen der einzuführenden Lösung wird von 1 bis 10 pl (Pikoliter) dosiert. Die ganze Arbeit wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die injizierten Objekt-Empfanger werden auf das selektive Nährmedium übertragen. Die Auswahl des selektiven Nährmediums wird durch den transformierenden Faktor bestimmt. Die Auswahl des Transformanten und die Anreicherung deren Biomasse wird beim mehrmaligen passieren der Objekt-Empfanger auf selektiven Medien durchgeführt. Aus den transformierten Zellenlinien und Zellenkulturen werden auf den selektiven Medien Pflanzen regeneriert. Die Transformationseffektivität beträgt höchstens 40%. Die Erschliessung und die Expression des eingeführten genetischen Materials wird nach

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bekannten biochemischen Methoden bestätigt.

Zum besseren Verständnis der vorliegendën Erfindung werden folgende Beispiele zur Verwirklichung des erfindungsgemäs-sen Verfahrens angeführt.

Beispiel 1

In den aus dem Kallus Nicotiana debneyi isolierten Protoplast fuhrt man eine Mikronadel mit einem Durchmesser der Spitze von etwa 1 um ein und presst mit dem hydraulischen System 1 bis 2 pl (Pikoliter) Pufferlösung (10 mMol Iis, der pH-Wert 7,2, 1 mMol Natriumäthylendiamintetraazetat, 5 mMol KCl) aus, die die Plasmide pSV2 Neo in einer Menge von ungefähr 100 Kopien pro 1 Pikoliter Puffer enthält. Bei der Mikroinjektion und bis zu den ersten Zellteilungen befindet sich der Protoplast im Caboche-Nährmedium unter Zugabe von 0,1 Gew.-% Agarose. Die aus den injizierten Protoplasten gebildeten Mikrokolonien werden auf das Gamborg-Nährmedium unter Zugabe von 60 mg/dm3 Antibiotikum Kanamyzinsulfat übertragen. Von 53 injizierten Protoplasten wurden 8 Zellenlinien erhalten, die zum Wachstum auf einem Medium fähig sind, das bis 120 mg/dm3 Antibiotikum enthält. Die Transformationseffektivität beträgt 15%. Aus drei beständigen Linien wurden auf dem Gamborg-Nährmedium ohne Zugabe von Phytohormonen Pflanzen regeneriert, die zum Wachstum und zur Verfestigung auf dem Medium mit Kanamyzin fähig sind.

Beispiel 2

Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 1 durchgeführt. Als Objekt-Rezipienten werden die Einzelzellen von Nicotiana tabacum und als transformierender Faktor die Plasmide pLGV23 Neo ausgenutzt. Die Mikroinjektion wird mit Hilfe des pneumatischen Systems verwirklicht. Von 20 injizierten Zellen wurden nach der Selektionsmethode 3 Zellenlinien ausgewählt, die zum Wachstum auf dem Gamborg-Nährmedium fähig sind, das 120 mg/dm3 Antibiotikum Kanamyzinsulfat enthält.

Beispiel 3

Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 1 durchgeführt. Als Objekt-Rezipienten werden die Zellen im Mikrokallus (von 8 bis 30 Zellen) Lycopersicon esculentum im Sachin-Nährmedium unter Zugabe von 0,3 Gew.-% Agarose ausgenutzt. Als transformierender Faktor wird die Plasmide pGV0319 ausgenutzt. Entsprechend den mit der Plasmide kodierten Eigenschaften wird die Selektion der Transformanten auf dem Sachin-Nährmedium durchgeführt, das keine Hormone enthält. Bei der Einfuhrung der Plasmide in 95 Zellen wurden nach der Selektionsmethode 19 Zellenlinien ausgewählt, die zum Wachstum auf einem hormonlosen Medium fähig sind. Die Transformationseffektivität beträgt 19%.

Beispiel 4

5 Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 1 durchgeführt. Als Objekt-Rezipienten werden die Einzelzellen von Nicotiana tabacum und als transformierender Faktor die Kosmide pGA 471 ausgenutzt, dabei wird die Injektion unter Einwirkung der elektrischen Feldstärke von 5 bis 10 V mit einigen Impulsen von 0,5 Dauer bei einem Stromwert bis 0,1 jiA verwirklicht. Von 23 auf solche Weise transformierten Zellen wurden 6 Zellenlinien erhalten, die zum Wachstum auf dem Nährmedium fähig sind, das 120 mg/dm3 Kanamyzinsulfat enthält. Die Transformationseffektivität beträgt etwa 25%. Aus 2 Zellenlinien wurden Pflanzen regeneriert, die zum Wachstum und zur Verfestigung auf dem Medium mit Kanamyzin fähig sind.

Beispiel 5

Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 4 durchgeführt. Als Objekt-Rezipient werden die Zellen des embiyogenen Kallus vom Weizen Triticum aestivum der Sorte Mironovskaya rannyaya verwendet, die mechanisch fixiert werden. Es werden 8 Kallusse ausgenutzt und in jeden werden von 20 bis 100 Zellen injiziert. Die Kallusse werden auf dem Nährmedium von Murashige-Skoog mit 2 mg/dm2 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure unter Zugabe von 60 mg/dm3 Kanamyzinsulfat passiert. Es wurden 8 Zellenlinien erhalten, die zum Wachstum auf dem Nährmedium mit Kanamyzinsulfat fähig sind.

Beispiel 6

Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 1 durchgeführt. Als Objekt-Rezipient werden einzelne weisse Zellen der Plasto-menmutante von Nicotiana tabacum der Linie IP und als die sich autonom replizierenden Organellen Chloroplaste ausgenutzt, die aus den Blättern von Nicotiana tabacum der Linie SR2 isoliert wurden, welche durch die Beständigkeit gegen das mit Chloropla-sten kodierte Antibiotikum Streptomyzin gekennzeichnet wird. Mit der Chloroplastensuspension im Nährmedium von Jensen und Basshem füllt man eine Mikropipette mit dem Durchmesser der Spitze bis 8 um und presst daraus 5 bis 10 Chloroplaste in die Zelle aus. Die injizierten Zellen nach den ersten Teilstrichen werden auf das Gamborg-Nährmedium übertragen, das 1 mg/dm3 Streptomyzinsulfat enthält. Von 16 auf solche Weise injizierten Zellen wurden 3 Zellenlinien ausgewählt, die durch die grüne Farbe und die Fähigkeit zum Wachstum auf einem Nährmedium mit 1 mg/dm3 Antibiotikum gekennzeichnet werden.

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Claims

670 655 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzenobjekten durch Einführung eines transformierenden Faktors in den Objekt-Empfänger und darauffolgende Selektion der Zellinien und Pflanzen mit neuen vererblichen Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, dass als transformierender Faktor ein DNS-Molekül oder eine sich autonom replizierende Zellorganelle und als Objekt-Empfänger ein Protoplast, eine Einzelzelle oder ein Zelle im Zellverband verwendet werden, wobei die Einführung des transformierenden Faktors in den Objekt-Empfanger durch Mikroinjektion durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroinjektion unter Einwirkung von Druck oder Einwirkung eines elektrischen Feldes durchgeführt wird.

3. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 erhaltenen Pflanzenobjekte zur Herstellung von Pflanzen durch Regeneration auf selektiven Medien.