DE69434972T2

DE69434972T2 - Verfahren zur transformation von pflanzen und ein vektor dafür

Info

Publication number: DE69434972T2
Application number: DE69434972T
Authority: DE
Inventors: Toshihiko Toyoda-cho Iwata-gun KOMARI; Yasuhito Toyoda-cho Iwata-gun SAITO; Yukoh Toyoda-cho Iwata-gun HIEI
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2014-12-07
Also published as: DK0687730T3; WO1995016031A1; EP0687730A4; CA2155570A1; JP3102888B2; ES2287933T3; EP0687730A1; AU1121395A; ATE362527T1; DE69434972D1; EP0687730B1; US5731179A; PT687730E; CA2155570C

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Transformieren von Pflanzen und einen Vektor dafür.
Stand der Technik
Verfahren zum Einschleusen von fremden Genen (Verfahren zur Transformation) in höhere Pflanzen werden im Wesentlichen in Verfahren des direkten Einschleusens und Verfahren durch Bakterien, die zu Agrobacterium gehören, eingeteilt. Ersteres schließt Verfahren ein, bei denen elektrische Stimulation verwendet wird (Elektroporationsverfahren und Elektroinjektionsverfahren); Verfahren, bei denen eine chemische Behandlung, wie beispielsweise eine Behandlung mit PEG durchgeführt werden; und Verfahren, bei denen eine Partikelkanone verwendet wird. Ersteres wird weitgehend zur Transformation von Monokotyledonen eingesetzt, bei der das letztere Verfahren schwerlich angewendet werden kann. Das letztere ist das Verfahren, in dem die Fähigkeiten von Bakterien, die zu der Gattung Agrobacterium gehören, wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens und A. rhizogenes, zum Transformieren höherer Pflanzen verwendet. Die letzteren Verfahren sind hervorragende Verfahren, mit denen DNA-Fragmente, die relativ groß sind und genau festgelegte Enden haben, effektiv in höhere Pflanzen eingeschleust werden können und bei denen keine speziellen Kultivierungstechniken, wie beispielsweise Techniken zur Kultivierung von Protoplasten, erforderlich sind.
Verfahren zur Transformation sind bei Untersuchungen der Genmanipulationen und Molekularbiologie höherer Pflanzen unverzichtbar und es wird ein Verfahren, mit dem ein gegebenes DNA-Fragment effizient in Pflanzenzellen eingeschleust werden kann und mit dem eine Pflanze, die das DNA-Fragment enthält, effizient erhalten werden kann, gefordert. Bei der Einschleusung eines Gens ist es notwendig, die Pflanzenzellen, in die das fremde Gen eingeschleust wird, von den Pflanzenzellen, in die das fremde Gen nicht eingeschleust wird, zu selektieren. Da die Anzahl der letzteren gewöhnlich viel höher ist, ist es notwendig ein Gen zu verwenden, das leicht nachgewiesen werden kann. Die am häufigsten verwendeten Selektionsmarker sind Arzneimittelresistenzgene. Beispiele dafür schließen Antibiotikaresistenzgene, wie beispielsweise das Kanamycinresistenzgen und Hygromycinresistenzgen; und Herbizidresistenzgene, wie beispielsweise das Basta-Resistenzgen und das Roundup-Resistenzgen, ein.
In Fällen, wo ein Arzneimittelresistenzgen als Selektionsmarker verwendet wird, werden das DNA-Fragment von Interesse, das in die Pflanze eingeschleust werden soll, und das Arzneimittelresistenzgen miteinander verbunden, die miteinander verbundenen Gene in Pflanzen eingeschleust, die arzneimittelresistenten Zellen selektiert und transformierte Pflanzen aus den arzneimittelresistenten Zellen erhalten. In den so erhaltenen transformierten Pflanzen wird das mit dem Arzneimittelresistenzgen verbundene DNA-Fragment von Interesse auch gleichzeitig eingeschleust.
Bei diesem Verfahren stellen sich jedoch die beiden folgenden Probleme:

1. Trotz der Tatsache, dass der Selektionsmarker nur bei der Einschleusung des Gens notwendig ist, begleitet der Selektionsmarker das eingeschleuste DNA-Fragment von Interesse während der nachfolgenden Wachstumsschritte ständig und ist sogar in den Pflanzen der nachfolgenden Generationen vorhanden. Dadurch werden transformierte Pflanzen, die das überflüssige Gen enthalten, erhalten. Wenn das Transformationsverfahren bei der Anzucht von Samen verwendet wird, wird das Vorhandensein des überflüssigen Gens zu einem großen Problem, da die Sorten, die kein solches überflüssiges Gen enthalten, ein höheres Ansehen genießen. Wenn ein weiteres DNA-Fragment in die transformierten Pflanzen eingeschleust wird, ist es zudem notwendig, einen anderen Selektionsmarker zu verwenden, was beschwerlich ist. Dies stellt ebenso ein großes Problem dar.
2. Da der Arbeitsschritt, den Selektionsmarker mit dem DNA-Fragment von Interesse, das in die Pflanze eingeschleust werden soll, zu verbinden, notwendig ist, ist ein zusätzlicher Schritt bei der Konstruktion des einzuschleusenden Gens erforderlich.

Um diese Probleme zu vermeiden, wurden bei den Verfahren des direkten Einschleusens ein Verfahren der so genannten Co-Transformation entwickelt und weitgehend verwendet (Shimamoto et al., Nature 338:274-276, 1989). Bei diesem Verfahren werden die DNA des Arzneimittelresistenzgens als Selektionsmarker und das DNA-Fragment von Interesse, das in die Pflanze eingeschleust werden soll, lediglich miteinander vermischt, ohne ligiert zu werden, und die Mischung in die Pflanzen eingeschleust. Von den Pflanzen, die gemäß ihrer Arzneimittelresistenz selektiert werden, enthalten einige Pflanzen sowohl das Arzneimittelresistenzgen, als auch das DNA-Fragment von Interesse, das in die Pflanzen eingeschleust werden soll. Durch Überprüfen des Mischungsverhältnisses der beiden Arten von DNA, beträgt der Prozentsatz an arzneimittelresistenten Pflanzen, die die beiden Arten an DNA enthalten, häufiger, als dass dies nicht der Fall ist, nicht weniger als 50 %.
Da die beiden, auf diese Weise eingeschleusten Arten an DNA nicht miteinander ligiert sind, können sie unabhängig voneinander vererbt und auf die nächste Generation segregiert werden. In der nächsten Generation können somit transformierte Pflanzen erhalten werden, die das eingeschleuste DNA-Fragment von Interesse, aber nicht den Selektionsmarker enthalten.
Das mit Hilfe von Bakterien, die zur Gattung Agrobacterium gehören, in Pflanzen eingeschleuste DNA-Fragment wird gewöhnlich T-DNA (Transfer-DNA) genannt und ist dadurch gekennzeichnet, dass es an seinen beiden Enden sich wiederholende Sequenzen aufweist, die entsprechend rechte Grenze und linke Grenzen genannt werden. Ein künstliches DNA-Fragment, das aus den Sequenzen der linken und der rechten Grenze und einer DNA von Interesse konstruiert sein kann, kann ebenso als T-DNA bezeichnet werden. Etliche Wildtyp-Bakterien, die zu der Gattung Agrobacterium gehören, enthalten zwei Arten von T-DNA und Pflanzenzellen, die mit solchen Bakterien transformiert wurden, so dass die Erscheinung einer Co-Transformation an sich seit langer Zeit bekannt ist.
Das Einschleusen von zwei Arten von T-DNA wird jedoch im Rahmen der zugrunde liegenden Technik des Verfahrens der Transformation durch Agrobacterium-Bakterien (offen gelegte, japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 60-70080 ; japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 2-58917 ; Herrera-Estrella et al., The EMBO Journal 6:987-995, 1983; Bevan et al., Nature 304:184-187, 1983; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:4803-4807, 1983) und im Rahmen der Technik einer verbesserten, hocheffizienten Transformation (Koran, Plant Cell Reports 9:303-306, 1990) nicht erwähnt.
Das gleichzeitige Einschleusen von zwei Arten an DNA schließt:

1. Fälle, in denen eine erste T-DNA und eine zweite T-DNA in der gleichen Agrobacterium-Bakterienzelle enthalten sind; und
2. Fälle in denen die erste T-DNA und die zweite T-DNA in verschiedenen Agrobacterium-Bakterienzellen enthalten sind und in denen eine Mischung aus den beiden Arten an Agrobacterium-Bakterienzellen verwendet wird, ein.

Es wurde gezeigt, dass die beiden Arten von T-DNA, mit denen Pflanzen transformiert wurden, in beiden Fällen unabhängig voneinander in die nächste Generation vererbt und auf diese segregiert wurden (Depicker et al., Mol. Gen. Genet. 201:477-484, 1985; de Framond et al., Moll. Gen. Genet. 202:125-131, 1986; McKnight et al., Plant Molecular Biology 8:439-445; 1987).
Bei diesen herkömmlichen Techniken ist die Effizienz für den Erhalt von regenerierten Pflanzen, in die beide Arten von T-DNA eingeschleust wurden, jedoch gering. Eine Co-Transformation durch Agrobacterium-Bakterien ist daher nicht weit verbreitet.
Hatamoto et al. offenbaren in Plant Cell Reports, Ausg. 9, Nr. 2 (1990) die Co-Transformation von Explantaten aus Tabakblättern mit Agrobacterium rhizogenes, die pRi1855 und den binären Vektor pBin19 beherbergen. Sie offenbaren nicht die Verwendung eines Arzneimittelresistenzgens zur Selektion.
A. Depicker et al. beschreiben in Mol. Gen. Genet., Ausg. 201, Nr. 3, S. 477-484 eine Transformation, bei der ein Hybridvektor, der zwei T-DNAs enthält, verwendet wird. Die Tabakprotoplasten werden durch Co-Kultivierung mit zwei verschiedenen Agrobakterienstämmen, die Ti-Plasmide mit unterscheidbaren T-DNAs tragen, oder einen Bakterienstamm, der zwei T-DNAs auf dem gleichen Ti-Plasmid trägt, infiziert. Der darin offenbarte Hybridvektor enthält nicht die Virulenzregionen VirB und VirG des Ti-Plasmids pTiBo542 von Agrobacterium tumefaciens.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Transformieren einer Pflanze, mit dem eine regenerierte, transformierte Pflanze, in die ein gewünschtes Gen eingeschleust wurde, mit hoher Effizienz hergestellt werden kann und das den Erhalt einer transformierten Pflanze in der nächsten Generation ermöglicht, die das gewünschte Gen, aber kein Arzneimittelresistenzgen, das als Selektionsmarker verwendet wird, enthält.
Die vorliegenden Erfinder haben ausgiebige Untersuchungen unternommen, um das oben genannte Ziel durch Einschleusen einer ersten T-DNA, die ein Arzneimittelresistenzgen enthält, und einer zweiten T-DNA, in die ein DNA-Fragment von Interesse, das in die Pflanze eingeschleust werden soll, inseriert wird, durch Co-Transformation in höheren Pflanzen zu erreichen.
Das heißt, dass die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transformieren einer Pflanze durch ein Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, bereitstellt, das das Co-Transformieren von Pflanzenzellen mit einer ersten T-DNA (1) und einer zweiten T-DNA (2); und das Selektieren der Zellen, die eine Arzneimittelresistent erworben haben;
wobei die erste T-DNA (1) ein Gen enthält, das die Arzneimittelresistenz verleiht, das in der Pflanze wirkt;
wobei die zweite T-DNA (2) ein gewünschtes DNA-Fragment enthält, das in die Pflanze eingeschleust werden soll, und wobei die zweite T-DNA in einem Hybridvektor enthalten ist;
wobei der Hybridvektor durch homologe Rekombination zwischen einem Akzeptorvektor und einem Zwischenvektor in dem Bakterium das zur Gattung Agrobacterium gehört, hergestellt wurde;
wobei der Akzeptorvektor mindestens

(a) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und escherichia coli gehört, zu replizieren;
(b) einen DNA-Bereich, der das virB-Gen und das virG-Gen in einer Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens enthält, und
(c) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Zwischenvektors homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird, enthält; wobei der Zwischenvektor mindestens (i) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um in Plasmid in Escherichia coli zu replizieren, das nicht in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, wirkt, (ii) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Akzeptorvektor homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird, und (iii) einen DNA-Bereich, der mindestens einen Teil der zweiten T-DNA ausmacht, umfasst.

Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Hybridvektor, der eine erste T-DNA, die (1) ein Gen enthält, das eine Arzneimittelresistenz verleiht, das in einer Pflanze wirkt, und (2) eine zweite T-DNA mit einer Restriktionsschnittstelle umfasst, bereit,
wobei der Hybridvektor durch homologe Rekombination zwischen einem Akzeptorvektor und einem Zwischenvektor in einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, hergestellt wird;
wobei der Akzeptorvektor mindestens

(a) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und Escherichia coli gehört,
(b) einen DNA-Bereich, der das virB-Gen und das virG-Gen in einer Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens enthält und
(c) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Zwischenvektors homolog ist, der der homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobakterium gehört, unterworfen wird, enthält; wobei der Zwischenvektor mindestens (i) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in Escherichia coli zu replizieren, das in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, nicht wirkt, (ii) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Akzeptorvektors homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird, und (iii) einen DNA-Bereich, der mindestens einen Teil der zweiten T-DNA ausmacht, enthält.

Mit der vorliegenden Erfindung können regenerierte, transformierte Pflanzen, in die ein gewünschtes Gen eingeschleust wurde, mit hoher Effizienz hergestellt werden und es können transformierte Pflanzen in der nächsten Generation, die das gewünschte Gen, aber nicht das Arzneimittelresistenzgen, das als Selektionsmarker verwendet wird, enthalten, erhalten werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt schematisch das Erscheinen eines Hybridvektors, der aus einem Akzeptorvektor und einem Zwischenvektor durch homologe Rekombination in Zellen von Bakterien, die zur Gattung Agrobacterium gehören, hergestellt wurde;
2 zeigt den Aufbau von pSB21;
3 zeigt den Aufbau von pSB22;
4 zeigt den Aufbau von pSB24;
5 zeigt den Aufbau von pNB1;
6 zeigt den Aufbau von pSB1;
7 zeigt den Aufbau von pSB3;
8 zeigt den Aufbau von pSB4;
9 zeigt den Aufbau von pNB124, der durch homologe Rekombination aus pNB1 und pSB24 hergestellt wurde;
10 zeigt den Aufbau von pSB124, der durch homologe Rekombination aus pSB1 und pSB24 hergestellt wurde;
11 zeigt den Aufbau von pSB324, der durch homologe Rekombination von pSB3 und pSB24 hergestellt wurde;
12 zeigt den Aufbau von pSB424, der durch homologe Rekombination von pSB4 und pSB24 hergestellt wurde;
13 zeigt den Aufbau von pGA482-GUS; und
14 zeigt den Aufbau von pTOK253.
Die Bezugszeichen, die in den obigen Figuren gezeigt sind, haben folgende Bedeutung:

AV:: Akzeptorvektor;
IV:: Zwischenvektor;
HV:: Hybridvektor;
HR:: ein Fragment, das sowohl in dem Akzeptorvektor als auch in dem Hybridvektor enthalten ist, eine homologe Rekombination tritt zwischen DNA-Sequenzen, die in diesem Fragment enthalten sind, auf;
ORI:: Replikationsursprung von ColE1;
COS:: COS-Stelle des Phagen λ;
SP:: Spectinomycinresistenzgen, das in Escherichia coli und einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, wirkt;
TC:: Tetracyclinresistenzgen, das in Escherichia coli und einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, wirkt;
KAN:: Kanamycinresistenzgen, das in Escherichia coli und einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, wirkt;
NPT:: Kanamycinresistenzgen, das mit dem NOS-Promotor, der in Pflanzenzellen wirkt, ligiert ist. Dieses Gen verleiht Escherichia coli und einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, auch ein geringes Maß an Resistenz.
HPT:: Hygromycinresistenzgen, das mit dem 35A-Promotor, der in Pflanzenzellen wirkt, ligiert ist. Dieses Gen verleiht einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, auch ein geringes Maß an Resistenz.
GUS:: GUS-Gen, das mit dem 35S-Promotr, der in Pflanzenzellen wirkt, ligiert ist:
I-GUS:: GUS-Gen, das Introns enthält und das mit dem 35S-Promotor, der in Pflanzenzellen wirkt, ligiert ist;
T-DNA:: ein DNA-Fragment, das aus einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, in Pflanzen übertragen wird;
BR:: rechte Grenzsequenz der T-DNA;
BL:: linke Grenzsequenz der T-DNA;
15,2 kb-KpnI:: KpnI-Fragment, das 15,2 kb groß ist und aus der Virulenzregion von pTiBo542 stammt;
B:: virB-Gen aus pTiBo542;
G:: virG-Gen aus pTiBo542.

Beste Art, die Erfindung auszuführen
Die Pflanze, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren transformiert werden kann, kann jede Pflanze sein, die mit einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium infiziert ist und dadurch transformiert wird. Beispiele für solche Pflanzen schließen höhere Pflanzen, wie beispielsweise Tabak, Reis, Tomaten, Kartoffeln, Petunien, Mais, Raps und Ähnliche ein, die Beispiele sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Das Verfahren zum Transformieren von höheren Pflanzen durch ein Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, ist an sich in der Wissenschaft allgemein bekannt. Beispiele für das Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, die für die Transformation verwendet werden können, schließen Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes und Ähnliche ein. Diese Agrobacterium-Bakterien sind Bodenbakterien, die die Fähigkeit besitzen, Pflanzenzellen zu transformieren und Tumore zu verursachen. Diese Bakterien enthalten ein tumorinduzierendes Plasmid (Ti-Plasmid). Wichtige Bereiche in dem Ti-Plasmid sind die Virulenzregion, die an der Transformation beteiligt ist, und der T-DNA-Bereich, in dem die tumorinduzierenden Gene, die auf die Pflanzenzellen übertragen werden, enthalten sind. In dem T-DNA-Bereich sind die Bereiche, die für den Transfer der tumorinduzierenden Gene überflüssig sind, die Bereiche an dessen beiden Enden, die Grenzsequenzen genannt werden. Bei herkömmlichen Verfahren zur Transformation von Pflanzen durch ein Agrobacterium-Bakterium wird die Pflanze darum mit einem Agrobacterium-Bakterium infiziert, das ein Plasmid enthält, das eine T-DNA, in die das gewünschte Gen inseriert ist, enthält. Auch bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden das Arzneimittelresistenzgen und das gewünschte Gen, das in die Pflanzen eingeschleust werden soll, entsprechend in T-DNAs inseriert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Pflanze mit einer ersten T-DNA, die ein Arzneimittelresistenzgen, das als Selektionsmarker verwendet wird, enthält, und eine zweite T-DNA, in die das DNA-Fragment, das gewünschter Weise in die Pflanze eingeschleust werden soll, inseriert ist, co-transformiert. Als Arzneimittelresistenzgen, das in der ersten T-DNA enthalten ist, wird ein Kanamycinresistenzgen oder ein Hygromycinresistenzgen bevorzugt, obwohl das Arzneimittelresistenzgen nicht darauf beschränkt ist. Bei den ersten und zweiten T-DNAs liegt mindestens die zweite T-DNA in dem Hybridvektor vor, wie im Folgenden beschrieben ist.
Der Hybridvektor wird durch homologe Rekombination eines Akzeptorvektors und eines Zwischenvektors hergestellt, wobei die homologe Rekombination in einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, erfolgt. Der Akzeptorvektor ist ein Plasmid, das sowohl in einem Agrobacterium-Bakterium als auch in Escherichia coli repliziert wird. Der Akzeptorvektor enthält ein DNA-Fragment, das mit einem DNA-Fragment in dem Zwischenvektor homolog ist. Unter Verwendung dieses DNA-Fragments kann der Akzeptorvektor den Zwischenvektor darin durch homologe Rekombination in einem Agrobacterium-Bakterium einschließen. Der Zwischenvektor ist ein Plasmid, das in Escherichia coli repliziert wird, sich jedoch nicht von selbst in einem Agrobacterium-Bakterium repliziert. Der Zwischenvektor enthält ein DNA-Fragment, das mit dem DNA-Fragment, das in dem Akzeptorvektor enthalten ist, homolog ist. Der Zwischenvektor kann durch homologe Rekombination durch das DNA-Fragment in dem Akzeptorvektor eingeschlossen sein. Wenn der Zwischenvektor in dem Akzeptorvektor eingeschlossen ist, kann er in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, stabilisiert werden.
Der oben genannte Akzeptorvektor enthält

(a) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und Escherichia coli gehört, zu replizieren,
(b) einen DNA-Bereich, der das virB-Gen und das virG-Gen in einer Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens enthält, und
(c) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Zwischenvektors, homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird.

Das Ti-Plasmid pTiBo542 ist ein Ti-Plasmid, das in Agrobacterium tumefaciens A281 (ATCC 37349) enthalten ist und für sein hohes Leistungsvermögen der Virulenzregion bekannt ist (Hood et al., Bio/Technol. 2:702-709, 1984; Hood et al., J. Bacteriol., 168:1283-1290, 1986; Komari et al., J. Bacteriol., 166:88-94, 1986; Jin et al., J. Bacteriol. 169:4417-4425, 1987; und Komari et al., Plant Science 60:223-229, 1989). Die virB- und virG-Gene in der Virulenzregion von pTiBo542 sind bekannt und in diesen Druckschriften beschrieben. Da die virB- und virG-Gene in der Virulenzregion von pTiBo542 in dem 15,2 kb großen DNA-Fragment, das durch Behandeln von pTiBo542 mit einem Restriktionsenzym KpnI erhalten wird, enthalten sind, kann dieses Fragment ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Akzeptorvektoren, die die oben angegebenen (a), (b) und (c) enthalten, sind an sich bekannt und beispielsweise in der offen gelegten, japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 4-222527 und in der EP-A-0 504 869 beschrieben.
Der Zwischenvektor enthält zum anderen

(i) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in Escherichia coli zu replizieren, das nicht in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, wirkt,
(ii) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Akzeptorvektors homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird, und
(iii) einen DNA-Bereich, der mindestens einen Teil der zweiten T-DNA ausmacht.

Obwohl ein Teil der oben genannten, zweiten T-DNA in dem oben genannten Akzeptorvektor enthalten sein kann, wird bevorzugt, dass die gesamte zweite T-DNA in dem Zwischenvektor enthalten ist, da die Effizienz des Einschleusens des gewünschten DNA-Fragments in die Pflanze hoch ist. Das gewünschte DNA-Fragment, das in die Pflanze eingeschleust werden soll, kann unter Verwenden einer Restriktionsschnittstelle in die zweite T-DNA in dem Zwischenvektor inseriert werden. Zwischenvektoren, die die oben genannten (a), (b) und (c) enthalten, sind an sich bekannt und beispielsweise in der offen gelegten, japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 4-222527 und in der EP-A-0 504 869 beschrieben.
Die homologe Rekombination zwischen dem oben beschriebenen Akzeptorvektor und dem oben beschriebenen Zwischenvektor kann mit Hilfe eines bekannten Verfahrens durchgeführt werden (Herrera-Estrella L. et al., EMBO J. 2:987-995, 1983; Horsch R.H. et al., Science 223:496-498, 1984).
Die oben beschriebene, erste T-DNA ist entweder in dem Hybridvektor, der die oben beschriebene, zweite T-DNA enthält, oder in einem anderen Plasmid enthalten. In letzterem Fall können der Hybridvektor und der andere Vektor in der gleichen Zelle des Agrobacterium-Bakteriums oder in verschiedenen Zellen der Agrobacterium-Bakterien (Zweistammverfahren) enthalten sein. Da die Wahrscheinlichkeit, dass die selektierte, arzneimittelresistente Zelle auch die zweite T-DNA enthält, jedoch erheblich höher ist, als der Fall, in dem die erste und die zweite T-DNA in einem einzigen Hybridvektor vorliegen, wird bevorzugt, dass die erste T-DNA auch in dem Hybridvektor enthalten ist. Überraschenderweise werden die ersten und zweiten T-DNAs zudem, sogar dann, wenn sie in einem einzigen Vektor angeordnet sind, unabhängig voneinander in Pflanzen eingeschleust und können genetisch aufs die nächste Generation segregiert werden. Das Verfahren zum effizienten Co-Transformieren der Pflanzen mit T-DNAs, die in einem einzigen Vektor angeordnet sind, wurde als erstes von den vorliegenden Erfindern entwickelt und die Tatsache, dass sie mit einer großen Häufigkeit genetisch voneinander unabhängig in Pflanzen eingeschleust werden können, wurde als erstes von den vorliegenden Erfindern entdeckt.
In Fällen, wo die erste T-DNA in dem Hybridvektor vorliegt, um so die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die erste und die zweite T-DNA genetisch voneinander unabhängig in die Pflanzen eingeschleust werden, wird bevorzugt, dass der Abstand zwischen der ersten T-DNA und der zweiten T-DNA groß ist. Zu diesem Zweck stammt die erste T-DNA vorzugsweise aus dem Akzeptorvektor. Des Weiteren wird zu diesem Zweck bevorzugt, dass die erste T-DNA und die zweite T-DNA in dem Hybridvektor durch

(1) den DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und Escherichia coli gehört, zu replizieren, und
(2) den DNA-Bereich, der das virB-Gen und das virG-Gen in der Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens enthalten, voneinander getrennt werden.

Der Hybridvektor kann mit bekannten Verfahren, wie beispielsweise dem Verfahren einer dreifachen Kreuzung (Dita G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7347-7351, 1980) in das Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, eingeschleust werden.
Als Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, das zur Transformation von Pflanzen verwendet werden kann, können diejenigen verwendet werden, die gewöhnlich für diesen Zweck verwendet werden. Das heißt, dass diejenigen mit einem Plasmid, das aus einem Ti-Plasmid oder einem Ri-Plasmid, das keine T-DNA, aber die für den Transfer von T-DNA auf Pflanzen notwendige Virulenzregion enthält, stammen, bevorzugt verwendet werden können. Ein Beispiel für ein solches Bakterium ist das Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al., Nature, 303:179-180, 1983), obwohl diese nicht darauf beschränkt sind. Ein solches Agrobacterium-Bakterium, in das der oben genannte Hybridvektor oder ein Plasmid, das die erste T-DNA enthält, eingeschleust werden (im Fall eines Verfahrens der Doppellinie), wird für die Transformation verwendet.
Dann wird die Pflanze unter Verwenden des Agrobacterium-Bakteriums, in das der Hybridvektor oder ein Plasmid, das die erste T-DNA enthält, eingeschleust wurden (im Fall eines Zweistammverfahrens) transformiert. Dies kann durch Kultivieren der Pflanzenzellen, wie beispielsweise von Fragmenten des Kotyledons der Pflanze in einem flüssigen Medium, welches das Agrobacterium-Bakterium enthält, erreicht werden. Im Falle des Zweistammverfahrens werden die Pflanzenzellen in einem flüssigen Medium, das die beiden Arten von Agrobacterium-Zellen enthält, kultiviert. Das Transformationsverfahren an sich ist bekannt und wurde beispielsweise in der offen gelegten, japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 4-222527 und in der EP-A-0 504 869 beschrieben.
Von den Pflanzenzellen, die der Behandlung der Transformation unterworfen werden, werden Zellen, denen eine aufgrund des in der ersten T-DNA enthaltenen Arzneimittelresistenzgens Arzneimittelresistenz verliehen wurde, selektiert.
Aus diesen Zellen werden anschließend in einem herkömmlichen Verfahren ganze Pflanzen regeneriert.
Die auf diese Weise erhaltenen Pflanzen können mit großer Wahrscheinlichkeit auch die zweite T-CDNA enthalten. In den Beispielen unten enthielten in den Fällen, wo die ersten und die zweiten T-DNAs in dem gleichen Hybridvektor angeordnet sind, nicht weniger als ungefähr 50 % der erhaltenen Pflanzen auch die zweite T-DNA und sogar bei dem Verfahren der Doppellinie enthielten ungefähr 35 % der erhaltenen Pflanzen auch die zweite T-DNA.
Bei den meisten transformierten Pflanzen, die die ersten und zweiten T-DNAs enthielten, wurde bestätigt, dass die erste T-DNA und die zweite T-DNA unabhängig voneinander vererbt werden. Insbesondere in den Beispielen unten beträgt der Prozentsatz der transformierten Pflanzen, bei denen bestätigt wurde, dass die erste T-DNA und die zweite T-DNA unabhängig voneinander vererbt werden, 79 % in den Fällen, wo die erste und die zweite T-DNA in dem einzigen Hybridvektor vorliegen oder 71 % in dem Fall des Zweistammverfahrens. Durch Kultivieren dieser transformierten Pflanzen können daher Pflanzen, die die zweite T-DNA, aber nicht die erste T-DNA enthalten, in der nächsten Generation erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Hybridvektor bereit, der eine erste T-DNA, die (1) ein Gen, das eine Arzneimittelresistenz verleiht, das in der Pflanze wirkt, enthält, und (2) eine zweite T-DNA mit einer Restriktionsschnittstelle umfasst;
wobei der Hybridvektor durch homologe Rekombination zwischen einem Akzeptorvektor und einem Zwischenvektor in einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, hergestellt wird;
wobei der Akzeptorvektor einen mindestens

(a) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und Escherichia coli gehört, zu replizieren,
(b) einen DNA-Bereich, der das virB-Gen und das virG-Gen in der Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens, und
(c) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Zwischenvektors homolog ist, der der homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird, enthält, wobei der Zwischenvektor mindestens (i) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in Escherichia coli zu replizieren, das in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, nicht wirkt, (ii) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Akzeptorvektors homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird, und (iii) einen DNA-Bereich, der mindestens einen Teil der zweiten T-DNA ausmacht, enthält.

Der Hybridvektor ist der gleiche Hybridvektor, der in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, außer, dass das gewünschte DNA-Fragment nicht in die zweite T-DNA inseriert wurde. Nach Insertion des gewünschten DNA-Fragments in die zweite T-DNA unter Verwenden der darin enthaltenen Restriktionsschnittstelle, kann der resultierende Hybridvektor als der oben beschriebene Hybridvektor verwendet werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird anhand von Beispielen im Folgenden genauer beschrieben werden. Die angegebenen Beispiele dienen jedoch lediglich Veranschaulichungszwecken und sollen in keinster Weise einschränkend wirken.
Beispiel 1 Konstruktion des Plasmids
Soweit nicht anders angegeben ist, wurden die Arbeitsvorgänge zur Konstruktion des Plasmids gemäß Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, durchgeführt.
Konstruktion der Zwischenvektoren pSB21 und pSB24
pBR322 wurde mit EcoRI und ClaI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase behandelt. Ein ClaI-Linker (5'-CATCGATG-3') wurde in das resultierende Konstrukt inseriert und zirkularisiert. Das DraI-EcoRI-Fragment mit einer Größe von 2,6 kb, das ein Spectinomycin-Resistenzgen (SP-Gen) aus dem Transposon Tn7 (DeGreve et al., Plasmid 6:235-24, 1981) enthält, wurde an der Stelle zwischen EcoRV und EcoRI in das oben genannte Plasmid kloniert. Nach Schneiden des Plasmids mit EcoRI wurde das Plasmid nach der Behandlung mit T4-DNA-Polymerase rezirkularisiert, um die EcoRI-Schnittstelle zu entfernen. Das 2,4 kb große ClaI-Fragment, das das SP-Gen dieses Plasmids enthielt, wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt und in die Smal-Schnitstelle von pUC19 inseriert, um TOK107 zu erhalten. Das 2,7 kb große EcoRI-HindIII-Fragment aus pGS482 (An, Plant Physiol. 81:86-91, 1986) und das mit EcoRI und HindIII verdaute pROK107 wurden ligiert, um pTOK170 herzustellen.
pTO170 wurde mit BamHI und BglIII verdaut und zirkularisiert, um pYS138 zu erhalten. pYS138 wurde mit EcoRI und Asp718I verdaut und das resultierende Konstrukt mit T4-DNA-Polymerase behandelt. In das resultierende Konstrukt wurde ein SalI-Linker (5'-GGTCGACC-3') inseriert und das Plasmid zirkularisiert, um pYS151 zu erhalten. pYS151 wurde mit SalI verdaut und ein 4,7 kb großes SalI-Fragment, das T-DNA aus pGA643 (An et al., Plant Molecular Biology Manual A3:1-19, Kluwer Academic, Dordrecht, 1988) wurde in die resultierende SalI-Schnittstelle inseriert, um pTOK235 zu erhalten.
pTOK235 wurde mit SacII verdaut und das resultierende Konstrukt wurde durch T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Ein BglII-Linker (5'-CAGATCTG-3') oder ein HindIII-Linker (5'-CAAGCTTG-3') wurde in das resultierende Plasmid inseriert und das resultierende Konstrukt wurde zirkularisiert. Die erhaltenen Plasmide wurden entsprechend pTOK245 und pTOK246 genannt.
pTOK246 wurde mit HindIII und EcoRI verdaut, um den größten Teil der DNA von der T-DNA zu entfernen und das 2,9 kb große HindIII-EcoRI-Fragment aus pBI221 (Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter 5:387-405, 1987) wurde darin inseriert, um pSB21 zu erhalten. In den 2,9 kb großen HindIII-EcoRI-Fragmenten von pBI221, ist das β-Glucuronidasegen (GUS), das in Pflanzenzellen exprimiert wird, enthalten. pSB21 ist ein Zwischenvektor, der aus (i) einem Spectinomycinresistenzgen, das in Escherichia coli und in Agrobacterium wirkt; (ii) einem Fragment, das aus dem 2,7 kb großen EcoRI-Hind-III-Fragment aus pGA482 stammt und eine Funktion hat, um das Plasmid in Escherichia coli aber nicht in Agrobacterium zu replizieren; und (iii) einem Fragment, das den T-DNA-Bereich enthielt, der aus den linken und rechten Grenzsequenzen und dem GUS-Gen zwischen den beiden bestand, bestand.
In ähnlicher Weise wurde TOK246 mit HindIII und EcoRI verdaut und ein 3,1 kb großes HindIII-EcoRI-Fragment aus pIG221 (Ohta et al., Plant Cell Physiol. 31:805-813, 1990) darin inseriert, um pSB24 zu erhalten. In dem Fragment ist ein GUS-Gen, in das eine Intronsequenz inseriert wurde (Intron-GUS) enthalten. Intron-GUS wird effizient in Pflanzenzellen exprimiert, aufgrund des Introns jedoch nicht in Escherichia coli und Agrobacterium exprimiert. pSB24 ist ein Zwischenvektor, der pSB21 entspricht, außer, dass das Intron-GUS-Gen anstelle des GUS-Gens enthalten ist.
Konstruktion von pSB22
pGL2, das aus einem Hygromycin-Resistenzgen (HPT, Gritz et al., Gene 25:179-188, 1983) bestand, und pDH51 (Pietrazak et al., Nucleic Acids Res. 14:5857-5865, 1986) das das HPT-Gen, das in Pflanzenzellen wirkt, enthält, wurden mit SalI verdaut. Das verdaute Konstrukt wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt und anschließend zirkularisiert, wobei eine SalI-Schnittstelle deletiert wurde, um pTOK234 zu erhalten. Der erhaltene pTOK234 wurde mit KpnI verdaut und dann auf die gleiche Weise, wie oben angegeben ist, verarbeitet, wobei zwei KpnI-Schnittstellen deletiert wurden, um pTOK244 zu erhalten.
pTOK244 wurde mit HindIll verdaut und anschließend mit EcoRI unvollständig verdaut, um ein Fragment mit einer Größe von 1,9 kb zu isolieren. Dieses Fragment wurde zwischen eine HindIII-Schnittstelle und eine EcoRI-Schnittstelle von pTOK246 inseriert, um pSB22 zu erhalten. pSB22 ist ein Zwischenvektor, der pSB22 entspricht, außer dass das GUS-Gen gegen das HPT-Gen ausgetauscht ist.
Konstruktion von pYS169
pGA482 wurde mit HindIII und EcoRI verdaut und anschließend mit T4-DNA-Polymerase behandelt, danach zirkularisiert, wobei ein 2,7 kb großes HindIII-EcoRI-Fragment deletiert wurde, um pYS169 zu erhalten. pYS169 enthält eine T-DNA, die aus den linken und rechten Grenzsequenzen von T-DNA und einem Kanamycin-Resistenzgen (NPT), das zwischen den beiden angeordnet ist, besteht. Das NPT-Gen besitzt die Fähigkeit, Escherichia coli und Agrobacterium eine Resistenz gegen Kanamycin zu verleihen.
Konstruktion von pNB1
pVCK101 (Knauf et al., Plasmid 8:45-54, 1982) wurde mit EcoRI verdaut und anschließend mit T4-DNA-Polymerase behandelt, dann zirkularisiert, wobei eine EcoRI-Schnittstelle deletiert wurde. Durch Verdau des resultierenden Konstrukts mit BglII und anschließende Zirkularisation wurde eine BglII-Schnittstelle deletiert. Dieses Plasmid wurde pVCK101Q genannt. pVCK101Q wurde mit HindIII und XhoI verdaut und mit pUC18, der mit HindIII und SalI verdaut worden war, ligiert, um pTOK150 zu erhalten. pTOK150 wurde mit HindIII verdaut und anschließend mit T4-DNA-Polymerase behandelt. Ein EcoRI-Linker (5'-CCGAATTCGG-3') wurde inseriert und das resultierende Konstrukt geschlossen, wobei die HindIII-Schnittstelle in eine EcoRI-Schnittstelle umgewandelt wurde, um pTOK239 zu erhalten.
pGA482 wurde mit HpaI verdaut und ein XhoI-Linker (5'-CCTCGAGG-3') wurde inseriert, um pTOK236 zu erhalten. pTOK236 wurde mit XbaI und EcoRI verdaut, um ein Fragment mit einer Größe von 2,6 kb zu isolieren. pTOK239 wurde mit EcoRI und XbaI verdaut, um ein Fragment mit einer Größe von 2,7 kb zu entfernen und ein 2,7 kb großes XbaI-EcoRI-Fragment aus pTOK236 wurde inseriert, um pNB1 zu erhalten. pNB1 ist eine Art von Akzeptorvektor, enthält jedoch keine T-DNA oder DNA, die aus der Virulenzregion stammt.
Konstruktion von pNB3 und pNB4
pNB1 wurde mit XhoI verdaut und ein 3,5 kb großes SalI-Fragment, das T-DNA, die das NPT-Gen aus pYS169 enthält, umfasst, wurde inseriert, um pNB3 zu erhalten. pNB3 ist eine Art von Akzeptorvektor und umfasst T-DNA. die das NPT-Gen enthält.
pNB1 wurde mit XhoI verdaut und ein 3,0 kb großes SalI-Fragment, das T-DNA, die das HPT-Gen aus pSB22 enthält, umfasst, wurde inseriert, um pNB4 zu erhalten. pNB4 ist eine Art Akzeptorvektor, und umfasst T-DNA, die das HPT-Gen enthält.
Konstruktion von pSB1, pSB3 und pSB4
pNB1, pNB3 und pNB4 wurden mit KpnI verdaut und anschließend wurde das 15,2 kb große KpnI-Fragment, das das virB-Gen und das virG-Gen aus der Virulenzregion aus pTiBo542 (American Type Culture Collection, Zugangsnr. 37349) enthielt, inseriert, um drei Arten von Plasmiden herzustellen, die entsprechend pSB1, pSB3 und pSB4 genannt wurden.
pSB1 ist eine Art von Akzeptorvektor. In Fällen, wo ein Hybridvektor durch Einschleusen eines Zwischenvektors, der eine T-DNA enthält, darin hergestellt wird, kann ein superbinärer Vektor durch Verknüpfen des Hybridvektors mit einem Helferplasmid erzeugt werden.
pSB3 ist ein Akzeptorvektor, der eine T-DNA, die das NPT-Gen als Selektionsmarker enthält, umfasst. Dieser Vektor besitzt eine Schnittstelle, in die ein Zwischenvektor inseriert werden kann, wobei die Schnittstelle durch das 15,2 kb große KpnI-Fragment, das das virB-Gen und das virG-Gen aus der Virulenzregion aus pTiBo542 enthält, von der T-DNA getrennt sind. pSB3 kann einen superbinären Vektor ausmachen, indem dieser oder ein Hybridvektor, der durch Einschleusen eines Zwischenvektors hergestellt wurde, mit einem Helferplasmid verknüpft wird. In Fällen, wo ein Hybridvektor durch Einschleusen eines Zwischenvektors, der T-DNA enthält, hergestellt wurde, kennzeichnet sich dieser Hybridvektor dadurch, dass er zwei T-DNAs, das heißt, die erste T-DNA, die das NPT-Gen als Selektionsmarkergen enthält, und eine zweite T-DNA, die an einer von der ersten T-DNA nicht weniger als 15,2 kb entfernten Stelle angeordnet ist, umfasst.
pSB4 ist ein Akzeptorvektor, der eine T-DNA, die das HPT-Gen als Selektionsmarkergen enthält, umfasst. Dieser Vektor besitzt eine Schnittstelle, in die ein Zwischenvektor inseriert werden kann, wobei die Schnittstelle durch das 15,2 kb große KpnI-Fragment, das das virB-Gen und das virG-Gen aus der Virulenzregion aus pTiBo542 enthält, von der T-DNA getrennt ist. pSB4 kann einen super-binären Vektor ausmachen, indem dieser oder ein Hybridvektor, der durch Einschleusen eines Zwischenvektors hergestellt wurde, mit einem Helferplasmid verknüpft wird. In Fällen, wo ein Hybridvektor durch Einschleusen eines Zwischenvektors, der T-DNA enthält, hergestellt wurde, kennzeichnet sich dieser Hybridvektor dadurch, dass er zwei T-DNAs, das heißt, die erste T-DNA, die das NPT-Gen als Selektionsmarkergen enthält, und eine zweite T-DNA, die an einer von der ersten T-DNA nicht weniger als 15,2 kb entfernten Stelle angeordnet ist, umfasst.
Konstruktion von pTOK253
pVCK102 (Knauf et al., Plasmid 8:45-54, 1982) wurde mit SalI verdaut und ein 4,1kb großes SalI-Fragment, das die T-DNA aus pSB21 enthielt, inseriert, um pTOK253 herzustellen. pTOK253 ist ein Plasmid, das durch Verknüpfen mit einem Helferplasmid einen binären Vektor ausmachen kann. Die T-DNA in diesem Plasmid enthält ein GUS-Gen, das in Pflanzenzellen wirkt, jedoch kein Arzneimittelresistenzgen.
Konstruktion von pGA482-GUS
pGA482 wurde mit HindIII und EcoRI verdaut und ein 2,9 kb großes HindIII-EcoRI-Fragment aus pBI221 wurde inseriert, um pGA482-GUS zu erhalten. pGA482 ist ein Plasmid, das durch Verknüpfung mit einem Helferplasmid einen binären Vektor ausmachen kann und die T-DNA desselben enthält ein Kanamycin-Resistenzgen (NPT), das in Pflanzenzellen wirkt. pGA482-GUS ist ein Plasmid, das durch Verknüpfen mit einem Helferplasmid einen super-binären Vektor ausmachen kann und die T-DNA davon enthält das GUS-Gen und das Kanamycin-Resistenzgen (NPT), das in Pflanzenzellen wirkt.
Beispiel 2 Herstellung von Bakterien, die zur Gattung Agrobacterium gehören
In diesem Beispiel wurden Bakterien, die zur Gattung Agrobacterium gehören, in AB-Medium (Chilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:3672-3676, 1974) bei 28 °C kultiviert. Nach Bedarf wurden Medien, zu denen Tetracyclin (10 μg/ml), Kanamycin (100 μg/ml), Hygromycin (50 μg/ml) oder Spectinomycin (50 μg/ml) gegeben worden waren, verwendet.
Nach dem Verfahren von Ditta et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347-7351, 1980) wurden pNB1, pSB1, pSB3 und pSB4 in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 (Hoekema et al., Nature 303:179-180, 1983) eingeschleust. LBA4404 ist ein Stamm, der das entschärfte Ti-Plasmid pAL4404, aus dem die T-DNA entfernt worden war, enthält. pAL4404 behält eine vollständige Virulenzregion und wird häufig als Helferplasmid für binäre Vektoren verwendet. Bakterien, die zur Gattung Agrobacterium gehören und in die ein Plasmid eingeschleust worden war, werden hierin im Folgenden mit dem Namen des Stammes plus dem Namen des Plasmids in Klammern, wie beispielsweise LBA4404(pNB1) bezeichnet.
In LBA4404(pNB1), einen gegen Tetracyclin resistenten Stamm, wurde mit dem Verfahren von Ditta et al. wurde pSB21 mit einem Spectinomycin-Resistenzgen eingeschleust und die Bakterienzellen, die sowohl gegen Tetracyclin als auch gegen Spectinomycin resistent waren, wurden selektiert, wobei LBA4404, das einen Hybridvektor, in den ein Zwischenvektor pSB21 in pNB1 eingeschleust worden war, enthielt, erhalten wurde. Dieser Hybridvektor wurde pNB121 genannt.
Auf ähnliche Weise wurden LBA4404-Zellen, die entsprechend die in Tabelle 1 gezeigten Hybridvektoren enthalten, hergestellt.
Nach dem Verfahren von Ditta et al. wurden entsprechend pGA482, pTOK253 und pGA482-GUS in LBA4404 eingeschleust, um LBA4404(pGA482), LBA4404(pTOK253) und LBA4404(pGA482-GUS) zu erhalten.
Beispiel 3 Effizienz der Transformation und Co-Transformation von Tabak
Tabak (Art: BY4)-Pflanzen wurden in einem Gewächshaus kultiviert und die Blätter gesammelt. Die Oberflächen der Blätter wurden mit Ethanol und Natriumhypochlorit sterilisiert und Blattscheiben mit einem Durchmesser von ungefähr 6 mm hergestellt. Ungefähr 10⁸ Zellen wurden von jedem der folgenden Bakterien, die zur Gattung Agrobacterium gehören, zusammen mit den Blattscheiben in 2-3 ml eines flüssigen Mediums, das anorganische Salze von Linsmaier und Skoogs-Medium und 30 g/l Sucrose enthält, 48 Stunden lang kultiviert.
LBA4404(pSB324)
LBA440(pSB424)
Mischung aus gleichen Mengen an Zellen von LBA4404(pSB124) und LBA4404(pGA482)
Mischung aus gleichen Mengen an Zellen von LBA4404(pNB124) und LBA4404(pGA482)
Mischung aus gleichen Mengen an Zellen von LBA4404(pPOK253) und LBA4404(pGA482)
LBA4404(pGA482-GUS)
LBA4404(pGA482)
Nach Waschen von jeder der Blattscheiben mit sterilisiertem Wasser, um die Bakterienzellen zu entfernen, wurden die Blattscheiben in ein Medium eingebracht, das anorganische Salze von Linsmaier und Skoogs-Medium, 0,3 mg Indolessigsäure, 10 mg/ml 6-(γ,γ)-Dimethylallylaminopurin, 200 mg/ml Kanamycin, 250 mg/ml Cefotaxim und 0,9 % Agar enthielt. Im Fall von LBA4404(pSB424) wurde ein Medium, das anstelle von Kanamycin 50 mg/ml Hygromycin enthielt, verwendet. Einen Monat nach Kulturbeginn wurden die kanamycinresistenten oder hygromycinresistenten Pflanzen mit dem folgenden Verfahren auf die Expression von GUS untersucht und dann in einem Gewächshaus kultiviert.
Die Expression von GUS wurde gemäß dem Verfahren von Jefferson et al. (Plant Molecular Biology Reporter 5:387-405, 1987) untersucht, indem kleine Stücke von den Blättern (2 × 2 mm bis 10 × 10 mm groß) abgeschnitten wurden und die Blattstücke für einen von 2 Stunden bis über Nacht reichenden Zeitraum in eine wässrige Lösung, die 500 mg/l 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid (X-Gluc), 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM Natriumethylendiamintraessigsäure, 0,1 % Natriumlaurylsarcosin und 0,1 % Triton X-100 enthielt, eingetaucht wurden. Wenn die Blattscheibe GUS-Aktivität zeigt, ist die Blattscheibe, und insbesondere ihr Querschnitt, dunkelblau eingefärbt und wenn die Blattscheibe keine GUS-Aktivität zeigt, wird keine solche Färbung beobachtet.
Die Ergebnisse der Untersuchung der Expression von GUS sind im Folgenden angegeben.
Die Tatsache, dass eine Pflanze eine Arzneimittelresistenz zeigt, gibt an, dass die erste T-DNA, die das Selektionsmarkergen enthält, in die Pflanze eingeschleust wurde und die Tatsache, dass eine Pflanze GUS-Aktivität zeigt, gibt an, dass die zweite DNA, die das GUS-Gen enthält, in die Pflanze eingeschleust wurde.
Da LBA4404(pGA482) ein Bakterium ist, das kein GUS-Gen enthält, zeigten nicht alle arzneimittelresistenten Pflanzen GUS-Aktivität.
Obwohl LBA4404(pGA482-GUS) eine T-DNA enthält, durch die das Arzneimittelresistenzgen und das GUS-Gen ligiert werden, zeigten nur 85 % aller arzneimittelresistenten Pflanzen GUS-Aktivität. Das gibt an, dass es Fälle gibt, in denen das GUS-Gen während des Verfahrens der Transformation verloren gehen kann oder die GUS-Aktivität aufgrund einer nicht ausreichenden Expression desselben, sogar, wenn das GUS-Gen eingeschleust wurde, nicht nachgewiesen wird.
Das Verfahren, in dem die Mischung aus LBA4404(pPOK253) und LBA4404(pGA482) verwendet wird, entspricht demjenigen aus dem Stand der Technik (McKnight et al., Plant Molecular Biology 8:439-445, 1987). Mit diesem Verfahren wurden keine Pflanzen erhalten, in denen die beiden Arten an T-DNA eingeschleust worden waren. Dies gibt an, dass es mit dem Verfahren aus dem Stand der Technik Fälle gibt, wo keine Pflanzen, die mit den beiden Arten an T-DNA co-transformiert worden waren, erhalten wurden. Dies ist vermutlich ein Grund dafür, warum das Verfahren aus dem Stand der Technik weitgehend nicht verwendet wird.
Das Verfahren, in dem die Mischung aus LBA4404(pNB124) und LBA4404(pGA482) verwendet wird, ist ein Verfahren, das dem oben erwähnten Verfahren von McKnight et al. aus dem Stand der Technik ähnelt, außer, dass ein Hybridvektor pNB124 verwendet wird. Mit dem herkömmlichen Verfahren von McKnight et al. war die zweite T-DNA bei 19 % der arzneimittelresistenten Pflanzen enthalten. Unter Verwendung der Mischung aus LBA4404(pNB124) und LBA4404(pGA482) war bei diesem Verfahren die zweite T-DNA in 22 % der arzneimittelresistenten Pflanzen enthalten. Das Ergebnis ähnelt daher demjenigen des Verfahrens von McKnight et al.
Wie bei dem Verfahren, in dem die Mischung aus LBA4404(pSB124) und LBA4404(pGA482) verwendet wird, ist LBA4404(pSB124) ein Bakterium, das einen pSB124 genannten Hybridvektor enthält, so dass dieses Verfahren einen superbinären Vektor verwendet und das Verfahren (Zweistamm-Verfahren) gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Bei diesem Verfahren wurde bestätigt, dass die zweite T-DNA in ungefähr 35 % der arzneimittelresistenten Pflanzen enthalten ist. Mit diesem Verfahren wurde somit eine viel höhere Co-Transformationseffizienz erreicht, als mit dem Verfahren, bei dem die Mischung aus LBA4404(pNB124) und LBA4404(pGA482) verwendet wird.
Die Ergebnisse des Verfahrens, bei dem die Mischung aus LBA4404(pSB124) und LBA4404(pGA482) verwendet wird, und des Verfahrens, bei dem die Mischung aus LBA4404(pNB124) und LBA4404(pGA482) verwendet wird, können unter Verwenden einer statistischen Analyse folgendermaßen miteinander verglichen werden.
Wenn die Hypothese, dass die Wahrscheinlichkeiten einer Co-Transformation mit den beiden Verfahren die gleichen sind, aufgestellt wird, wird X² wie folgt berechnet: X2 = 6,5 × 6,5 × (1/28,5 + 1/28,5 + 1/71,5 + 1/71,5) = 4,15.
Dies besitzt einen Freiheitsgrad von 1. Wenn der Freiheitsgrad 1 ist, wird die oben angegebene Hypothese, da die Wahrscheinlichkeit, dass X² größer als 4,15 ist, nicht mehr als 5 % beträgt, am 5 %-Signifikanzniveau zurückgewiesen. Die Wahrscheinlichkeiten der Co-Transformation mit den oben genannten beiden Verfahren sind somit statistisch gesehen signifikant voneinander verschieden.
Die Verfahren, bei denen LBA4404(pSB324) oder LBA4404(pSB424) verwendet wird, sind Verfahren, bei denen ein Bakterium verwendet wird, das entsprechend den Hybridvektor pSB324 oder pSB424 enthält. Bei diesen Verfahren werden somit super-binäre Vektoren verwendet, und sie stellen Verfahren (Einstamm-Verfahren) gemäß der vorliegenden Erfindung dar. Mit diesen Verfahren wurde bestätigt, dass die zweite T-DNA in 50-52 % der arzneimittelresistenten Pflanzen enthalten ist. Somit wurde bewiesen, dass die Effizienz einer Co-Transformation mit diesen Verfahren viel höher ist als diejenige mit dem Verfahren bei dem die Mischung aus LBA4404(pNB124) und LBA4404(pGA482) oder die Mischung aus LBA4404(pSB124) und LBA4404(pGA482) verwendet wird.
Die Ergebnisse des Verfahrens, bei dem LBA4404(pSB324) oder LBA4404(pSB424) verwendet wird und die Ergebnisse des Verfahrens, bei dem die Mischung aus LBA4404(pSB124) und LBA4404(pGA482) verwendet wird, können unter Verwenden einer statistischen Analyse wie folgt miteinander verglichen werden.
Wenn die Hypothese, dass die Wahrscheinlichkeiten einer Co-Transformation mit den beiden Verfahren gleich sind, aufgestellt wird, wird X² wie folgt berechnet: X2 = 19,9 × 19,9 × (1/95,1 + 1/41,9 + 1/131,9 + 1/58,1) = 23,43.
Dies besitzt einen Freiheitsgrad von 1. Wenn der Freiheitsgrad 1 ist, beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass X² größer als 23,43 ist, nicht mehr als 1 % und die oben angegebene Hypothese wird bei einem Signifikanzniveau von 1 % zurückgewiesen. Die Wahrscheinlichkeiten der Co-Transformation mit den oben angegebenen beiden Verfahren sind somit bei einem Signifikanzniveau von 1 % statistisch gesehen signifikant voneinander verschieden.
Die Ergebnisse des Verfahrens, bei dem LBA4404(pSB324) oder LBA4404(pSB424) verwendet wird, und die Ergebnisse des Verfahrens, bei dem die Mischung aus LBA4404(pNB124) und LBA4404(pGA482) verwendet wird, können unter Verwenden einer statistischen Analyse wie folgt miteinander verglichen werden.
Wenn eine Hypothese, dass die Wahrscheinlichkeiten einer Co-Transformation mit den beiden Verfahren gleich sind, aufgestellt wird, wird X² wie folgt berechnet: X2 = 10,9 × 10,9 × (1/104,1 + 1/45,9 + 1/122,9 + 1/54,1) = 6,89.
Dies hat einen Freiheitsgrad von 1. Wenn der Freiheitsgrad 1 ist, beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass X² größer als 6,89 ist, nicht mehr als 1 % und die oben angegebene Hypothese wird bei einem Signifikanzniveau von 1 % zurückgewiesen. Die Wahrscheinlichkeiten der Co-Transformation mit den oben angegebenen beiden Verfahren sind somit bei einem Signifikanzniveau von 1 % statistisch gesehen signifikant voneinander verschieden.
Beispiel 4 Vererbbarkeit von T-DNA, die in Tabak eingeschleust wurde
Aus den transformierten Pflanzen, die in einem Gewächshaus kultiviert worden waren, wurden Samen geerntet. Die Samen aus einigen Pflanzen wurden mit Ethanol und Natriumhypochlorit oberflächensterilisiert und anschließend auf einem Medium, das anorganische Salze von Linsmaier und Skoog, 30 g/l Sucrose und 0,9 % Agar enthielt, ausgesät. Die ausgekeimten Pflanzen wurden mit dem oben angegebenen Verfahren auf GUS-Aktivität und mit dem folgenden Verfahren auf Arzneimittelresistenz untersucht.
Kleine Stücke (ungefähr 3 mm × 3 mm) wurden ausgeschnitten und auf ein Medium gebracht, das anorganische Salze von Linsmaier und Skoog, 30 g/l Sucrose, 3 mg/l Indolessigsäure, 3 mg/l Naphthalenessigsäure, 0,1 g/l Kinetin, 200 mg/l Kanamycin und 0,9 % Agar enthielt. Samen aus Pflanzen, die mit LBA4404(pSB424) transformiert worden waren, wurden auf das gleiche Medium, wie es oben angegeben ist, gebracht, außer, dass anstelle des Kanamycins 50 mg/l Hygromycin enthalten sind. Die Blattstücke aus den arzneimittelresistenten Pflanzen bildeten Kalli aus, während die Blattstücke aus den arzneimittelsensitiven Pflanzen ohne Ausbilden von Kalli abstarben.
Die in Tabelle 3 unten gezeigten Ergebnisse wurden bei den Pflanzen erhalten, die aus den Samen der Pflanzen, die mit LBA4404(pSB324), LBA4404(pSB424) oder der Mischung aus LBA4404(pSB124) und LBA4404(pGA482) transformiert worden waren, stammten.
Wie aus den oben genannten Ergebnissen zu sehen ist, wurden in manchen Fällen mehr als eine T-DNA, die das Arzneimittelresistenzgen enthält, oder mehr als eine T-DNA, die das die das GUS-Gen enthielt, in die Pflanzen eingeschleust.
In Bezug auf die Pflanzen, die mit LBA4404(pSB324) transformiert worden waren und GUS-Aktivität zeigten, wurde, bei 5 von 9 untersuchten Pflanzen mindestens eine T-DNA, die das GUS-Gen enthielt, unabhängig von der T-DNA, die das Arzneimittelresistenzgen enthielt, vererbt und in der nächsten Generation wurden Pflanzen enthalten, die kein Arzneimittelresistenzgen, jedoch ein GUS-Gen enthielten.
In Bezug auf die Pflanzen, die mit LBA4404(pSB424) transformiert worden waren und GUS-Aktivität zeigten, wurde, bei 10 von 10 untersuchten Pflanzen mindestens eine T-DNA, die das GUS-Gen enthielt, unabhängig von der T-DNA, die das Arzneimittelresistenzgen enthielt, vererbt und in der nächsten Generation wurden Pflanzen enthalten, die kein Arzneimittelresistenzgen, jedoch ein GUS-Gen enthielten.
In Bezug auf die Pflanzen, die mit der Mischung aus LBA4404(pSB124) und LBA4404(pGA482) transformiert worden waren und GUS-Aktivität zeigten, wurde, bei 10 von 14 untersuchten Pflanzen mindestens eine T-DNA, die das GUS-Gen enthielt, unabhängig von der T-DNA, die das Arzneimittelresistenzgen enthielt, vererbt und in der nächsten Generation wurden Pflanzen enthalten, die kein Arzneimittelresistenzgen, jedoch ein GUS-Gen enthielten.
In der nächsten Generation der Pflanzen, die mit LBA4404(pGA482-GUS) transformiert worden waren und die GUS-Aktivität zeigten, gab es keine Pflanzen, die nicht das Arzneimittelresistenzgen, aber das GUS-Gen enthielten. In der nächsten Generation der Pflanzen, die mit LBA4404(pGA482) transformiert worden waren, gab es keine Pflanzen, die GUS-Aktivität zeigten.
Aus den Blättern der Transformanten mit den Liniennummern 324-28, 424-4 und 424-30, die in Tabelle 3 gezeigt sind, sowie aus den Blättern der Pflanzen aus der nächsten Generation derselben wurden die DNAs mit Hilfe des Verfahrens von Komari et al. (Theor. Appl. Genet. 77, 547-552, 1989) extrahiert und mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut, anschließend mittels Southern Blot nach dem Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, NY) analysiert. Bei den Pflanzen, die eine Arzneimittelresistenz und eine GUS-Aktivität zeigten, konnten folglich beide Gene nachgewiesen werden. Bei den Pflanzen, die eine Arzneimittelresistenz, jedoch keine GUS-Aktivität zeigten, wurde einzig das GUS-Gen nachgewiesen. Bei den Pflanzen, die keine Arzneimittelresistenz und keine GUS-Aktivität zeigten, wurde keines der beiden Gene nachgewiesen.
Beispiel 5 Effizienz der Transformation und Co-Transformation von Reis
Reife Samen von Reis (Sorte: Tsukinohikari) wurden 1 Minute lang in 70 % Ethanol und anschließend 30 Minuten lang in 1 % Natriumhypochlorit getaucht, um die Samen zu sterilisieren und die sterilisierten Samen wurden auf festes 2N6-Medium (anorganische Salze und Vitamine von N6 (Chu C.C., Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, S. 43-50, 1978), 1 g/l Casaminsäure, 2 mg/l 2,4-D, 30 g/l Sucrose und 2 g/l Gelrite) gebracht. Nach Kultivieren der Samen für ungefähr 3 Wochen wurden die aus dem Skutellum stammenden Kalli auf festes 2N6-Medium übertragen und die Kalli wurden 4-7 Tage nach der Transplantation als Kalli aus Skutellum verwendet.
Kolonien von LBA4404(pSB424), die durch 3-10-tägiges Kultivieren dieses Stammes bei 28 °C auf AB-Medium erhalten wurden, wurden mit einer Öse aus Platin gesammelt und in modifiziertem AA-Medium (AA hauptsächlich anorganische Salze, AA Aminosäuren und Vitamine (Toriyama et al., Plant Science 41:179-183, 1985), MS geringfügig Salze (Murashige et al., Physiol. Plant., 15:473-497, 1962), 0,5 g/l Casaminsäure, 0,2 M Sucrose, 0,2 M Glucose, 100 μM Acetosilingon, pH 5,2) suspendiert. Nach Einstellen der Zellpopulation von 1 × 10⁹ Zellen/ml wurde die Suspension zum Animpfen verwendet.
Nach Waschen der Kalli mit sterilisiertem Wasser wurden sie 3-10 Minuten lang in die oben beschriebene Zellsuspension getaucht. Nach dem Eintauchen wurden die Kalli auf festes 2N6-Medium, das Acetosilingon, Glucose und Sucrose in den gleichen Konzentrationen wie in dem modifizierten AA-Medium enthielt, übertragen und die Kalli wurden bei 25 °C 3 Tage lang im Dunkeln kultiviert. Dann wurden die Skutellum-Kalli mit sterilisiertem Wasser, das 250 mg/l Cefotaxim enthielt, gewaschen.
Die Kalli wurden auf festes 2N6-Medium, das 50 mg/l Hygromycin und 250 mg/l Cefotaxim enthielt, übertragen und 3 Wochen lang kultiviert und anschließend auf hygromycinresistenten Kalli selektiert. Die erhaltenen, resistenten Kalli wurden auf N6-7-Medium (N6 anorganische Salze, N6 Vitamine, 2 g/l Casaminsäure, 1 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l 6BA, 30 g/l Sorbitol, 20 g/l Sucrose und 2 g/l Gelrite), das 100 mg/l Hygromycin und 250 mg/l Cefotaxim enthielt, weitere 2-3 Wochen kultiviert. Die auf diesem Medium angeztichteten Kalli wurden auf ein Pflanzenregenerationsmedium NgS3 (1/2 N6 hauptsächlich anorganische Salze, N6 geringfügig Salze, N6 Vitamine (Chu, 1978), AA Aminosäuren (Toriyama et al., 1985), 1 g/l Casaminsäure, 0,2 mg/l Naphthalenessigsäure, 1,0 mg/l Kinetin und 3 g/l Gelrite), das 50 mg/l Hygromycin und 250 mg/l Cefotaxim enthielt, übertragen, um hygromycinresistente Pflanzen zu regenerieren.
Die hygromycinresistenten Pflanzen wurden mit dem oben beschriebenen Verfahren auf GUS-Aktivität untersucht und anschließend in einem luftdichten Gewächshaus angezüchtet.
Wie in Tabelle 4 unten gezeigt ist, wurden bei 12,3-44,0 % der verwendeten Kalli hygromycinresistente Pflanzen erhalten. Wie in Tabelle 5 unten gezeigt ist, zeigten zudem 42-51 % der hygromycinresistenten Pflanzen GUS-Aktivität. Tabelle 4 Effizienz der Selektion von hygromycinresistenten Pflanzen durch Co-Transformation

Anzahl an Kalli Effizienz der Selektion (b/a: %)

Verwendete Kalli (a) Resistente Kalli Regenerierte Kalli (b)

227 398 220 324 40 90 116 77 28 75 97 72 12,3 18,8 44,0 22,2

Tabelle 5 GUS-Aktivität in hygromycinresistenten Pflanzen

Anzahl der verwendeten arzneimittelresistenten Pflanzen Anzahl an Pflanzen, die GUS-Aktivität zeigen %

97 41 42

176 82 47

126 60 48

150 76 51
Aus den Blättern der Pflanzen, die Hygromycinresistenz und GUS-Aktivität zeigten, wurden die DNAs mit dem Verfahren von Komari et al. (Theor. Appl. Genet. 77; 547-552, 1989) extrahiert und mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und anschließend mittels Southern Blot nach dem Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, NY) analysiert. Bei allen Pflanzen wurde folglich das Vorhandensein des Hygromycinresistenzgens und des GUS-Gens bestätigt (Tabelle 6).
Beispiel 6 Vererbbarkeit von T-DNA, die in Reis eingeschleust worden war
Aus transformierten Pflanzen, die in einem Gewächshaus kultiviert worden waren, wurden Samen geerntet. Die Samen wurden mit Ethanol und Natriumhypochlorit oberflächensterilisiert und anschließend auf einem Medium, das keine N6-Hormone enthielt, ausgesät. Die ausgekeimten und wurzelnden Samen wurden mit dem oben beschriebenen Verfahren auf GUS-Aktivität und mit den folgenden Verfahren auf Hygromycinresistenz untersucht.
Die Wurzeln wurden auf eine Länge von etwa 5-10 mm zugeschnitten und die erhaltenen Wurzelfragmente auf 2N6-Medium, das 50 mg/l Hygromycin enthielt, gebracht. Die Wurzelfragmente aus den hygromycinresistenten Pflanzen bildeten Kalli aus, während diejenigen der hygromycinsensitiven Pflanzen ohne Ausbildung von Kalli abstarben.
Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse wurden für die Pflanzen der nächsten Generation, die aus den Samen der Pflanzen, die mit LB4404(pSB424) transformiert worden waren und GUS-Aktivität und Hygromycinresistenz zeigten, stammten, erhalten.
Wie aus den Ergebnissen zu sehen ist, wurden in manchen Pflanzen, wie bei den Tabakpflanzen, mehrere T-DNAs, die das Arzneimittelresistenzgen enthielten, oder mehrere T-DNAs, die das GUS-Gen enthielten, eingeschleust. Die Anzahl an Genen war gleich oder kleiner als der Anzahl an Kopien, die mit der Southern Blot-Analyse nachgewiesen werden konnte. In Fällen, wo die Anzahl an Genen kleiner als die Anzahl an Kopien ist, die mit der Southern Blot-Analyse nachgewiesen wurde, wurden vermutlich mehrere Kopien der Gene in den gleichen Locus eingeschleust.
In Bezug auf die Pflanzen, die mit LBA4404(pSB424) transformiert worden waren und GUS-Aktivität und Hygromycinresistenz zeigten, wurde, bei 8 von 12 untersuchten Pflanzen mindestens eine T-DNA, die das GUS-Gen enthielt, unabhängig von der T-DNA, die das Arzneimittelresistenzgen enthielt, vererbt und in der nächsten Generation wurden Pflanzen enthalten, die kein Arzneimittelresistenzgen, jedoch ein GUS-Gen enthielten.
Um das Vorhandensein der eingeschleusten Gene in den Pflanzen der nächsten Generation der transformierten Pflanzen zu bestätigen, wurden die Pflanzen der nächsten Generation der Pflanzen von jeder in Tabelle 6 gezeigten Linie entsprechend ihren Phänotypen (GUS+ und hygromycinresistent, GUS+ und hygromycinsensitiv, GUS- und hygromycinresistent und GUS- und hygromycinsensitiv) klassifiziert und einer Southern Blot-Analyse unterworfen. Demzufolge wurde bestätigt, dass das Vorhandensein des Hygromycinresistenzgens und des GUS-Gens mit dem Phänotyp übereinstimmte.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben beschrieben ist, ermöglicht die vorliegende Erfindung, transformierte und regenerierte Pflanzen, in die ein gewünschtes Gen mit Effektivität eingeschleust wurde, herzustellen, das gewünschte Gen in der nächsten Generation der Pflanze zu erhalten, jedoch das als Selektionsmarker verwendete Arzneimittelresistenzgen nicht zu erhalten. Somit ist die vorliegende Erfindung dazu nützlich, eine neue, nützliche Pflanze mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen, so dass die vorliegende Erfindung in der Landwirtschaft von Nutzen ist.

Claims

Verfahren zum Transformieren einer Pflanze durch eine Bakterien, die zur Gattung Agrobacterium gehört, umfassend das Co-Transformieren von Pflanzenzellen mit einer ersten T-DNA (1) und einer zweiten T-DNA (2); und Selektieren der Zellen, die eine Arzneimittelresistent erworben haben; wobei die erste T-DNA (1) ein Gen enthält, das die Arzneimittelresistent verleiht, das in der Pflanze wirkt; wobei die zweite T-DNA (2) ein gewünschtes DNA-Fragment enthält, das in die Pflanzenzelle eingeführt werden soll, wobei die zweite T-DNA (2) in einem Hybridvektor enthalten ist; wobei der Hybridvektor durch homologe Rekombination zwischen einem Akzeptorvektor und einem Zwischenvektor in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, hergestellt wurde; wobei der Akzeptorvektor mindestens enthält (a) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und Escherichia coli gehört, zu replizieren, (b) einen DNA-Bereich, der das virB-Gen und virG-Gen in einer Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens enthält, und (c) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Zwischenvektor homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird; wobei der Zwischenvektor mindestens enthält (i) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in Escherichia coli zu replizieren, das nicht in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, wirkt, (ii) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Akzeptorvektors homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird, und (iii) einen DNA-Bereich, der mindestens einen Teil der zweiten T-DNA ausmacht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste T-DNA und die zweite T-DNA einzeln in einem Hybridvektor enthalten sind.
Verfahren gemäß ANspruch 2, wobei die erste T-DNA in dem Akzeptorvektor enthalten ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste T-DNA und die zweite T-DNA auf dem Hybridvektor getrennt sind durch (1) den DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und Escherichia coli gehört, zu replizieren, und (2) den DNA-Bereich der das virB-Gen und virG-Gen in einer Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste T-DNA und der Hybridvektor in unterschiedlichen Agrobacterium-Bakterienzellen enthalten sind und die Pflanze mit einer Mischung dieser zwei Arten von Agrobacterium-Zellen transformiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der DNA-Bereich, der das virB-Gen und virG-Gen in der Virulenzregion des Ti-Plasmids TiBo542 des Agrobacteriums tumefaciens enthält, ein KpnI-Fragment mit einer Größe von 15,2 kb aus pTiBo542 ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das gewünschte DNA-Fragment, das in die Pflanze eingeführt werden soll, in den DNA-Bereich, der mindestens einen Teil der zweiten T-DNA ausmacht unter Verwendung einer Restriktionsstelle eingefügt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Zwischenvektor den gesamten Bereich der zweiten T-DNA enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Pflanze mit einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, das den Hybridvektor zusammen mit einem Ti-Plasmid oder Ri-Plasmid enthält, welches keine T-DNA, jedoch eine Virulenzregion enthält, die für den Transfer von T-DNA auf eine Pflanze benötigt wird, infiziert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Gen, das die Arzneimittelresistenz verleiht, ein Kanamycin-resistentes Gen oder ein Hygromycinresistentes Gen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die erste T-DNA auf einem Plasmid liegt, und die Pflanze mit einem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, das die erste T-DNA zusammen mit einem zweiten Plasmid enthält, das aus einem Ti-Plasmid oder einem Ri-Plasmid stammt, das die Virulenzregion enthält, die für den Transfer von T-DNA auf die Pflanze benötigt wird, jedoch keine T-DNA enthält, infiziert wird.
Verfahren zum Gewinnen einer transformierten Pflanze, umfassend Kultivieren der Pflanze, die durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 transformiert wurde, und Gewinnen einer Pflanze in der nächsten Generation, die das gewünschte DNA-Fragment, das in die Pflanze eingeführt werden soll, nicht jedoch das Gen, das die Arzneimittelresistenz verleiht, enthält.
Hybridvektor, umfassend eine erste DNA, enthaltend, (1) ein Gen, das eine Arzneimittelresistenz verleiht, das in einer Pflanze wirkt, und (2) eine zweite T-DNA mit einer Restriktionsstelle; wobei der Hybridvektor durch homologe Rekombination zwischen einem Akzeptorvektor und einem Zwischenvektor in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, hergestellt wird; wobei der Akzeptorvektor mindestens enthält (a) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und Escherichia coli gehört, zu replizieren, (b) einen DNA-Bereich, der das virB-Gen und virG-Gen in einer Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens enthält, und (c) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Zwischenvektor homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird; wobei der Zwischenvektor mindestens enthält (i) einen DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in Escherichia coli zu replizieren, das in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, nicht wirkt, (ii) einen DNA-Bereich, der mit einem Teil des Akzeptorvektors homolog ist, der einer homologen Rekombination in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium gehört, unterworfen wird, und (iii) einen DNA-Bereich, der mindestens einen Teil der zweiten T-DNA ausmacht.
Hybridvektor gemäß Anspruch 13, wobei die erste T-DNA in dem Akzeptorvektor enthalten ist.
Hybridvektor gemäß den Ansprüche 13 oder 14, wobei die erste T-DNA und die zweite T-DNA auf dem Hybridvektor getrennt sind durch (1) den DNA-Bereich mit einer Funktion, um ein Plasmid in dem Bakterium, das zur Gattung Agrobacterium und Escherichia coli gehört, zu replizieren, und (2) den DNA-Bereich der das virB-Gen und virG-Gen in einer Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 aus Agrobacterium tumefaciens enthält.
Hybridvektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der DNA-Bereich, der das virB-Gen und virG-Gen in der Virulenzregion des Ti-Plasmids TiBo542 des Agrobacteriums tumefaciens enthält, ein KpnI-Fragment mit einer Größe von 15,2 kb aus pTiBo542 ist.
Hybridvektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei das Gen, das die Arzneimittelresistenz verleiht, ein Kanamycin-resistentes Gen oder ein Hygromycin-resistentes Gen ist.
Hybridvektor gemäß einem der Ansprache 13 bis 17, wobei der Akzeptorvektor pSB3 oder pSB4 ist.