WO1995016031A1 - Procede de transformation de plantes et vecteur necessaire - Google Patents

Procede de transformation de plantes et vecteur necessaire Download PDF

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WO1995016031A1
WO1995016031A1 PCT/JP1994/002049 JP9402049W WO9516031A1 WO 1995016031 A1 WO1995016031 A1 WO 1995016031A1 JP 9402049 W JP9402049 W JP 9402049W WO 9516031 A1 WO9516031 A1 WO 9516031A1
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dna
vector
plant
region
plasmid
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PCT/JP1994/002049
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Toshihiko Komari
Yasuhito Saito
Yukoh Hiei
Original Assignee
Japan Tobacco Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Definitions

  • the present invention relates to a method for transforming a plant and a vector therefor.
  • Methods for introducing a foreign gene into a higher plant are roughly classified into a direct transfer method and a method via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • the former includes methods using electrical stimulation (electroporation method, electoral injection method),
  • Examples include a method using chemical treatment such as PEG, a method using a gene gun, and the like.
  • the former is a method often used for monocotyledonous plants that have been difficult to use in the past.
  • O is a method such as Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes; 7
  • the latter is an excellent method that can efficiently introduce a relatively large and fixed DNA fragment at both ends into higher plants and that does not require special culture techniques such as protoplast culture.
  • the latter is a method often used for dicotyledonous plants, but in recent years, monocots have also been used.
  • Transformation has become an essential technique in the study of genetic engineering and molecular biology of higher plants, and is a method of efficiently introducing an arbitrary DNA fragment into plant cells and efficiently obtaining a plant containing the DNA fragment. Is needed.
  • a method is required to select plant cells into which a foreign gene has been introduced from plant cells into which no foreign gene has been introduced.
  • the most frequently used selection marker is a drug resistance gene. Examples include an antibiotic resistance gene such as a kanamycin resistance gene and a hygromycin resistance gene, and a herbicide resistance gene such as a busta resistance gene and a roundup resistance gene.
  • a drug resistance gene When a drug resistance gene is used as a selection marker, usually, an arbitrary DNA fragment to be introduced into a plant is connected to the drug resistance gene, and an operation of introducing the connecting gene into the plant is performed to select drug resistant cells.
  • transgenic plants have been obtained by regenerating drug-resistant plants. Such transformed plants include drug-resistant plants. Any DNA fragment connected to the gene has been introduced at the same time.
  • the selection marker is required only during the introduction procedure, but it is always associated with the introduced arbitrary DNA fragment in the subsequent growth process and even in the progeny plants. As a result, transgenic plants containing unnecessary genes will be obtained. Especially when the transformation method is used for crop breeding, varieties that do not contain such unnecessary genes are considered to be more acceptable, and pose a major problem. In addition, when another DNA fragment is further introduced into a transformed plant, it is necessary to use another selection marker, which is a major problem.
  • the DNA of the drug resistance gene of the selection marker is not mixed with any DNA fragment to be introduced into the plant, but is simply mixed and introduced into the plant cells. Then, when drug-resistant plants are selected, some of them include both the DNA of the drug-resistant gene and an arbitrary DNA fragment to be introduced into the plant. By adjusting the mixing ratio of the two DNAs, the ratio of the plants containing the two DNAs to the drug-resistant plants is often 50% or more.
  • T-DNA transfer DNA
  • an artificial DNA fragment created by using the left and right border sequences and arbitrary DNA can also be called T-DNA.
  • wild Many bacteria of the genus Agrobacterium contain two types of T-DNA, and plant cells transformed with such a bacterium contain two types of T-DNA. The transformation itself has been known for a long time.
  • An object of the present invention is to prepare a regenerated transformed plant into which a desired gene has been introduced with high efficiency, and to produce a transgenic plant containing the desired gene in the next generation but not including a drug resistance gene used as a selection marker.
  • An object of the present invention is to provide a method for transforming a plant, which enables obtaining a transformed plant. It is also an object of the present invention to provide a vector used in this method.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that higher planting via Agrobacterium genus bacteria In a method for transforming a product, the first T-DNA containing a drug resistance gene and the second T-DNA into which an arbitrary DNA fragment to be introduced into a plant has been inserted are selected as the primary methods for selection.
  • the present inventors have found that the above object can be achieved by simultaneously introducing into higher plants by co-transformation and selecting drug-resistant plants, and completed the present invention.
  • the present invention is characterized in that a plant cell is co-transformed with the following first T-DNA (l) and the following second T-DNA (2), and cells that have become drug resistant are selected. And a method for transforming a plant via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • the above hybrid vector is prepared by homologous recombination of the following receptor vector and the following intermediate vector in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • the above acceptor vector is at least-
  • the intermediate vector is at least:
  • the present invention provides (1) a first ⁇ -DNA containing a drug resistance gene that functions in a plant,
  • the hybrid vector is prepared by homologous recombination of the following receptor vector and the following intermediate vector in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • the above-mentioned actuator vector is at least
  • the intermediate vector is at least:
  • a regenerated transformed plant into which a desired gene has been introduced with high efficiency and high efficiency is prepared, and the next generation contains the desired gene, but does not contain a drug resistance gene used as a selection marker. It becomes possible to obtain a transformed plant.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a phenomenon in which a hybrid vector is prepared from an receptor vector and an intermediate vector by homologous recombination in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • FIG. 2 is a diagram showing the configuration of pSB21.
  • FIG. 3 is a diagram showing the configuration of pSB22.
  • FIG. 4 is a diagram showing the configuration of pSB24.
  • FIG. 5 is a diagram showing a configuration of pNBl.
  • FIG. 6 is a diagram showing the configuration of pSBl.
  • Figure 7 is a diagram showing the configuration of a P SB3.
  • FIG. 8 is a diagram showing the configuration of pSB4.
  • FIG. 9 shows the structure of pNB124 prepared by homologous recombination of pNB1 and pSB24.
  • FIG. 10 shows the structure of pSB124 prepared by homologous recombination of pSBl and pSB24.
  • FIG. 11 is a diagram showing the structure of pSB324 prepared by homologous recombination of pSB3 and pSB24.
  • FIG. 12 is a diagram showing the structure of pSB424 prepared by homologous recombination of pSB4 and pSB24.
  • FIG. 13 is a diagram showing a configuration of pGA482-GUS.
  • FIG. 14 is a diagram showing the configuration of PTOK253.
  • ⁇ ⁇ A kanamycin-resistant gene connected to the N0S promoter that functions in plant cells. It also confers low levels of resistance to Escherichia coli and Agrobacterium.
  • Hygromycin resistance gene connected to 35S promoter that functions in plant cells. It also confers low levels of resistance to Agrobacterium.
  • GUS gene linked to 35S promoter functioning in GUS plant cells 1-GUS gene linked to 35S promoter that functions in plant cells and containing introns
  • the plant that can be transformed by the method of the present invention can be any plant that is infected with and transformed by a bacterium of the genus Agrobacterium, for example, evening coconut, rice, tomato, potato , Petunia, corn and oilseed rape, but not limited thereto. Transformation methods of higher plants via bacteria of the genus Agrobacterium are well known in the art. Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, and the like can be mentioned as bacteria of the genus Agrobacterium that can be used for transformation. These bacteria of the genus Agrobacterium are soil bacteria capable of transforming plant cells and causing tumors, and these bacteria include tumor-inducing plasmids.
  • Ti Plusmid Important sites in the Ti plasmid are the virulence region, which is a region involved in transformation, and the T-DNA region, which contains tumorigenic genes that are transferred to plant cells. And in the T—DNA region The only essential part for the oncogenic gene transfer is the region called the border sequence located at both ends. Therefore, conventionally, in a method for transforming a plant via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium, transformation is carried out by infecting a plant with a bacterium belonging to the genus Agrobacterium containing a plasmid having a desired gene inserted into the T-DNA. Going. Also in the method of the present invention, the drug resistance gene to be introduced into the plant and any desired gene are inserted into T-DNA.
  • a plant is co-transformed with a first T-DNA containing a drug resistance gene used as a selection marker and a second T-DNA into which a desired DNA fragment to be introduced into the plant has been introduced.
  • the drug resistance gene contained in the first T-DNA is preferably a kanamycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, but is not limited thereto.
  • At least the second T-DNA among the first and second T-DNAs exists on a hybrid vector described later.
  • the hybrid vector is prepared by homologous recombination between an acceptor vector and an intermediate vector in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • the receptor vector is a plasmid that replicates and grows in bacteria belonging to the genus Agrobacterium and in Escherichia coli, and contains a DNA fragment homologous to the intermediate vector, and is used in bacteria belonging to the genus Agrobacterium.
  • the intermediate vector is a plasmid that replicates and grows in Escherichia coli, but does not replicate and grows alone in Agrobacterium bacteria, and is a DNA fragment homologous to the Axceptor vector.
  • a plasmid which can be integrated into an ceptor vector by homologous recombination via this site, and which can be maintained in an integrated state in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • T i plus mid pTiBo542 is Agrobacteri fraction tumefaciens A281
  • the virBs and virG genes of the virulence region of pTiBo542 are also known and described in these documents. Since the virulence regions virB and virG genes of pTiBo542 are contained in a 15.2 kb DNA fragment obtained by treating pTiBo542 with the restriction enzyme Kpnl, these fragments can also be used in the present invention.
  • the receptor vector containing (a), (b) and (c) is known per se, and is described in, for example, JP-A-4-222527 and EP-A-0 504869.
  • (iii) a DNA region comprising at least a part of the second T-DNA.
  • a part of the second T-DNA may be contained in the above-mentioned acceptor vector, it is preferable that the entire region of the second T-DNA is contained in the intermediate vector, so that the desired DNA fragment can be contained. This is preferable because the efficiency of introduction into plants is high.
  • the desired DNA fragment to be introduced into the plant is preferably introduced into the second T-DNA on the intermediate vector using a restriction enzyme recognition site.
  • the intermediate vector itself containing the above (i), (ii) and (iii) is known, and is described, for example, in JP-A-4-222527 and EP-A-0 504 869.
  • Homologous recombination of the above-mentioned Axceptor and the above-mentioned intermediate vector in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium can be performed by a known method (Hellera-Estellera et al., EMBO J. 2: 987-995,
  • the first T-DNA may be present on a hybrid vector containing the second T-DNA, or may be present on another plasmid. In the latter case, the hybrid vector and the other vector may be contained in a single Agrobacterium bacterium, or may be contained in a separate Agrobacterium bacterium (two strains). Law) Yes. However, the probability that the selected drug-resistant plant cell also contains the second T-DNA is that the first T-DNA and the second T-DNA are present on a single hybrid vector. It is also preferred that the first T-DNA is also present on the hybrid vector, since it is significantly higher.
  • the present inventors have first developed a method for efficiently co-transforming a plant with T-DNA present on a single vector, and moreover, it is highly frequent and genetically independent. Can be introduced for the first time by the present inventors.
  • the first T-DNA When the first T-DNA is present on the hybrid vector, it is necessary to increase the possibility that the first T-DNA and the second T-DNA can be introduced into plants in a genetically independent manner.
  • the distance between the first T-DNA and the second T-DNA is preferably large.
  • the first T-DNA is preferably derived from the receptor vector.
  • the first T-DNA and the second T-DNA are, on the hybrid vector,
  • the above hybrid vector can be introduced into a bacterium belonging to the genus Agrobacterium by a known method. For example, it can be carried out by a three-way hybridization method of bacteria (Dittno et al., Proc. Natl. Acad, sci.
  • a bacterium belonging to the genus Agrobacterium used for plant transformation What is used for this purpose can be used. That is, it is preferable to use a plasmid which does not contain T-DNA but has a plasmid derived from Ti plasmid or Ri plasmid which contains a virulence region necessary for transfer of T-DNA to a plant. Examples of this include, but are not limited to, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoechema et al., Nature, 303: 179-180, 1983). A transformant obtained by introducing the above-described hybrid vector or a plasmid containing the first T-DNA (in the case of the two-bacterial method) into such a bacterium belonging to the genus Agrobacterium is used for transformation.
  • the plant is transformed with a bacterium belonging to the genus Agrobacterium into which the hybrid vector or the plasmid containing the first T-DNA (in the case of the two-bacterial method) has been introduced.
  • This can be performed by culturing plant cells, for example, cotyledon fragments of the plant, in a liquid medium containing bacteria of the genus Agrobacterium.
  • the cells may be cultured in a liquid medium containing two kinds of bacteria.
  • This transformation method itself is known, and is described, for example, in JP-A-4-222527 and EP-A-0 504 869.
  • the plant obtained in this way also contains, with considerable probability, the second T-DNA.
  • the first T-DNA and the second T-DNA are present on a single hybrid vector, about 50% or more of the obtained Even in the system method, about 35% also had the second T-DNA.
  • the first T-DNA and the second T-DNA can be inherited independently. confirmed. That is, in the following example, when the first T-DNA and the second T-DNA are present on a single hybrid vector, the first T-DNA and the second T-DNA It was confirmed that 79% of the transformed plants containing the first T-DNA and the second T-DNA were independently inherited in 71% in the case of the two-bacterial method. Therefore, if these transformed plants are cultivated, it is possible to obtain a plant that contains the second T-DNA but does not contain the first T-DNA in the next generation.
  • the present invention further provides (1) a first ⁇ -DNA containing a drug resistance gene that functions in a plant,
  • hybrid vector comprising a second T-DNA having a restriction enzyme recognition site, the hybrid vector comprising:
  • An acceptor vector comprising:
  • a hybrid prepared by homologous recombination in an Agrobacterium bacterium with an intermediate vector containing a DNA region constituting at least a part of the second T-DNA. Provide the first vector.
  • This hybrid vector is substantially the same as the hybrid vector used in the above-described method of the present invention, except that the desired DNA fragment is not yet inserted into the second T-DNA. If the desired DNA fragment is inserted into the second T-DNA using the restriction enzyme site in the second T-DNA, it can be used in the same manner as described above.
  • PBR322 was digested with EcoRI and Clal, treated with T4 DNA polymerase, and inserted with Clal phosphoric acid (5'-CATCGATG-3,) to close the ring.
  • a 2.6 kb Dral-EcoRI fragment containing the spuctinomycin resistance gene (SP gene) of the transposon Tn7 was cloned between the above plasmids EcoRV-EcoRI. After opening this plasmid with EcoRI, it was treated with T4 DNA polymerase and recircularized to remove the EcoRI site.
  • a 2.4 kb Clal fragment containing the SP gene of this plasmid was treated with T4 DNA polymerase and inserted into the Smal site of pUC19 to create pTOK107.
  • a 2.7 kb EcoRI-Hindlll fragment of pGA482 (An, Plant Physiol. 81: 86-91, 1986) was ligated with pTOK107 cut with EcoRI and Hindlll to create ⁇ .
  • PTOK170 was cleaved with BamHI and Bglll and closed to give pYS138.
  • pYS138 was digested with EcoRI and Asp718I, treated with T4 DNA polymerase, and inserted with a Sail linker (5'-GGTCGACC-3 ') to close the ring, thereby preparing pYS151.
  • pYS151 was cut with Sail, and a 4.7 kb Sail fragment containing T-DNA of pGA643 (An et al. Plant Molecular Biology Manual A3: 1-19, Kluwer Academic, Dordrecht, 1988) was introduced into this site to create PTOK235. .
  • pSB21 is: (1) a spectinomycin resistance gene that functions in Escherichia coli and bacteria of the genus Agrobacterium; A fragment containing a plasmid replication function that does not function and that can simultaneously cause homologous recombination with the receptor vector. (3) Due to the left and right border sequences of T-DNA and the GUS gene sandwiched between them. This is an intermediate vector composed of a fragment containing a T-DNA region composed of:
  • pSB24 is an intermediate vector similar to pSB21, except that the GU S gene is an intron GU S gene.
  • PT0K244 was digested with Hindlll and digested incompletely with EcoRI. A 1.9 kb fragment was isolated and introduced into PTOK246 between the Hindlll and EcoRI recognition sites to create pSB22.
  • pSB22 is an intermediate vector similar to pSB21 except that the GUS gene has been replaced by the HPT gene.
  • pYS169 has T-DNA border sequences and the ability to function in plant cells sandwiched between them. Includes T-DNA composed of the syn-resistance gene (NPT).
  • NPT syn-resistance gene
  • pVCKlOl (Knauf et al., Plasmid 8: 45-54, 1982) was digested with EcoRI, treated with T4 DNA polymerase and closed to remove the EcoRI site. Furthermore, when the procedure of closing the ring after cleavage with BgUI was performed, the Bglll site could be deleted, so this plasmid was named pVCKlOlQ. 01010 was cut with 1111 ⁇ 111 and Xhol, and ligated with pUC18 cut with Hindi II-Sail to create pTOIQ50. TOK150 was digested with Hindi II, treated with T4 DNA polymerase, inserted with EcoRI linker (5'-CCGAATTCGG-3 '), and closed to convert the Hindi I site into an EcoRI site, yielding pTOK239.
  • PGA482 was cut with Hpal, and Xhol linker (5'-CCTCGAGG-3,) was inserted to close the ring to make PTOK236.
  • pTOK236 was digested with Xbal and EcoRI, and a 2.6 kb fragment was isolated.
  • pTOK239 was digested with EcoRI and Xbal to remove the 2.7 kb fragment, and the 2.7 kb Xbal-EcoRI fragment of pTOK236 was inserted and closed to form pNBl.
  • pNBl is a type of receptor vector, but does not include DNA derived from the T-DNA / virulence region.
  • pNBl was cut with Xhol, and a 3.5 kb Sail fragment containing T-DNA containing the NPT gene of pYS169 was inserted and closed to form pNB3.
  • pNB3 is a type of receptor vector and contains T-DNA containing the NPT gene.
  • pNBl was digested with Xhol, a 3.0 kb Sail fragment containing T—DNA containing the HPT gene of pSB22 was inserted and closed to form pNB4.
  • pNB4 is a type of receptor vector and contains T-DNA containing the HP T gene.
  • pNBK p-recommended and pNB4 were cut with Kpnl, and a 15.2 kb Kpnl fragment containing the virB and virG genes of the virulence region of pTiBo542 (American Type Culture Collection accession number 37349) was inserted and closed to close three plasmids. And create pSBK pSB3 and pSB4.
  • pSBl is a type of receptor vector. When a hybrid vector containing an intermediate vector containing T-DNA is created, pSBl is combined with a helper plasmid to create a super binary vector. An evening can be organized.
  • PSB3 is a receptor vector containing T-DNA containing the NPT gene as a selectable marker gene, separated from this T-DNA by a 15.2 kb Kpnl fragment containing the virB and virG genes in the virulence region of pTiBo542.
  • the site has a site into which an intermediate vector can be inserted.
  • pSB3 can be used alone or as a hybrid vector containing an intermediate vector in combination with a helper plasmid to constitute a super binary vector.
  • the hybrid vector was composed of the first T-DNA containing the NPT gene as a selectable marker gene and at least 15.2 kb. It is characterized by containing two T-DNAs of a separated, second T-DNA.
  • PSB4 is a receptor vector containing a T-DNA containing the HPT gene as a selective gene. From this T-DNA, a 15.2 kb Kpnl containing the virB and virG genes in the virulence region of pTiBo542 is derived. The site separated by the fragments has a site into which the intermediate vector can be incorporated.
  • pSB4 can be used alone or as a hybrid vector incorporating an intermediate vector in combination with a helper plasmid to form a supervisory vector.
  • the hybrid vector was constructed using the first T-DNA containing the NPTit gene as a selectable marker gene. It is characterized in that it contains two T-DNAs of a second T DNA separated from each other by 15.2 kb or more.
  • PVCK102 (Knauf et al., Plasmid 8: 45-54, 1982) was cut with Sail, and a 4.1 kb Sail fragment containing the exact DNA of pSB21 was inserted and closed to form pTOK253.
  • ⁇ 253 is combined with the helper plasmid to form a binary vector.
  • the T-DNA contains the GUS gene expressed in plant cells and does not contain drug resistance genes.
  • PGA482 was digested with HindIII and EcoRI, and a 2.9 kb HindiII-EcoRI fragment of pBI221 was inserted to create PGA482-GUS.
  • pGA482 is a plasmid that can form a binary vector in combination with a helper plasmid, and its T-DNA contains a kanamycin resistance gene (NPTT) expressed in plant cells.
  • PGA482-GUS is a plasmid that can be used to construct a binary vector in combination with a helper plasmid. Its T-DNA contains the GUS gene and kanamycin resistance gene (NPT) expressed in plant cells. Included.
  • Example 2 Preparation of Agrobacterium Bacteria Containing a Hybrid Vector etc.
  • cultivation of Agrobacterium bacteria was performed in an AB medium (Chilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 3672). -3676, 1974) at 28 ° C.
  • a medium supplemented with tetracycline (10 / ig / ml), kanamycin (100 / z gml), dygromycin (50 ⁇ g / ral), and spectinomycin (50 g / ml) was used.
  • pNBK pSBK pSB3 and pSB4 were converted to Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 by the method of Mtta et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351, 1980).
  • LBA4404 is a bacterial strain containing pAL4404, a disarmed Ti plasmid from which T-DN N has been removed. pAL4404 retains the complete virulence region and is frequently used as a binary helper plasmid.
  • pAL4404 a bacterium belonging to the genus Agrobacterium into which plasmid has been introduced will be described by a bacterial system name followed by a plasmid name in parentheses, for example, LBA4404 (pNBl).
  • LBA4404 LBA4404 (pNBl), which is a tetracycline-resistant bacterium, according to the method of Ditta et al.
  • LBA4404 containing a hybrid vector in which pSB21 was introduced into pNBl was obtained. This hybrid vector was named pNB121.
  • LBA4404 containing the hybrid vector shown in Table 1 below was prepared.
  • TET Tetracycline resistant
  • SP Spectinomycin resistant
  • NPT Kanamycin resistance
  • HPT Hygromycin resistance
  • pGA482, pTOK253 and pGA482-GUS were introduced into LBA4404 by the method of Mtta et al. to produce LBA4404 (pGA482), LBA4404 (pTOK253) and LBA4404 (pGA482-GUS).
  • Tobacco (variety BY4) was cultivated in a greenhouse, the leaves were collected, surface-sterilized with ethyl alcohol and sodium hypochlorite, and leaf discs of about 6IM1 in diameter were prepared. This leaf piece and about 10 8 cells of the following species of the genus Agrobacterium are coexistent for 48 hours in a 2-3 ml liquid medium consisting of Linsmaier and Skoo inorganic salts and 30 g, l sucrose. Culture was performed.
  • indoleacetic acid 0.3 mg l, 6- (7,? 0-dimethylarylaminopurine 10 mg ml, kanamycin 200 mg / l, 250 mg / ml of cefotaxime and 0.9% of agar Agar was used, but when LBA4404 (pSB424) was used, a medium supplemented with 50 mg of hygromycin instead of kanamycin was used.
  • LBA4404 pSB424
  • a medium supplemented with 50 mg of hygromycin instead of kanamycin was used.
  • the rooted kanamycin-resistant or hygromycin-resistant drug-resistant plants were examined for GUS expression by the following method, and then cultivated in a greenhouse.
  • GUS The expression of GUS was determined according to the method of Jefferson et al. (Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405, 1987) by removing leaflet fragments (sizes between 22 mra and about 10 x 10 recitations) from plants, and Bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Glue) 500 mg 1, 50 mM sodium phosphate ⁇ 7.0, 10 mM / 3-mercaptoethanol, lOmM ethylene ethylenediamine tetraacetate, 0.1% sarcosine lauryl sodium 0.13 ⁇ 4 Triton X-100 was immersed for 2 hours in an aqueous solution.
  • X-Glue Bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
  • Showing drug resistance indicates that the first T-DNA containing the selected marker gene has been introduced into the plant, and showing GUS activity means having the second T-DNA containing the GUS gene. This indicates that DNA has been introduced into the plant.
  • LBA4404 (pGA482) is a bacterium that does not contain the GUS gene, all the drug-resistant plants obtained did not show GUS activity.
  • GUS activity was detected only in mosquitoes containing T-DNA linked to the drug resistance gene and GUS gene, and in 85% of the resulting drug-resistant plants. This indicates that when the GUS gene is deleted during the transformation process, or when the GUS gene is introduced, it may not be detected due to insufficient expression.
  • the method using a mixed bacterium of LBA4404 (pNB124) and LBA4404 (pGA482) is similar to the above-mentioned conventional technique of McKnight et al., Except that a hybrid vector called pNB124 is used.
  • pNB124 a hybrid vector used in the prior art of McKnight et al.
  • 19% of drug-resistant plants contained the second T-DNA, but the ratio was 22% in the mixed strain of LBA4404 (pNB124) and LBA4404 (pGA482). It can be said that similar results were obtained.
  • the method using a mixed bacterium of LBA4404 (pSB124) and LBA4404 (pGA482) is a bacterium containing the hybrid vector LBA4404 (PSB124) and pSB124, and is a method using a super binary vector.
  • This is a method developed by the invention (two-bacteria method).
  • This method confirmed that 35% of drug-resistant plants contained the second T-DNA, which was much more co-characteristic than that of a mixed strain of LBA4404 (pNB124) and LBA4404 (pGA482). The conversion efficiency was found to be high.
  • LBA4404 In the case of a mixed bacterium of LBA4404 (pSB124) and LBA4404 (pGA482), LBA4404 for comparison of the results in the case of a mixed strain of (pNB124) and LBA4404 (pGA482), a statistical analysis can be performed as described below.
  • the method using LB4404 (pSB324) or LBA4404 (pSB424) is a method using bacteria containing the hybrid vector PSB324 or PSB424, a method using a super binary vector, and the method developed in the present invention. (1 bacterial system). These methods confirmed that 50-52% of drug-resistant plants contained the second T-DNA, which was a mixture of LBA4404 (pNB124) and LBA4404 (pGA482), It was found that the efficiency of co-transformation was much higher than that of the mixed strain of pSB124) and LBA4404 (pGA482).
  • Seeds were collected from the transformed plants grown in the greenhouse. Seeds of some individuals were surface-sterilized with ethyl alcohol and sodium hypochlorite, and then seeded on a medium consisting of Linsmaier and Skoog inorganic salts, 30 g 1 of sucrose and agar 0.9. The germinated plants were examined for GUS activity by the above-described method and for drug resistance by the following method.
  • Cut leaflet pieces (about 33mm), Linsmaier and Skoog inorganic salts, sucrose 30g1, indoleacetic acid 3mgl, naphthaleneacetic acid 3mg1, force ricetin O. lmg1, kanamycin 200mg / l, agar 0.9%
  • a medium consisting of: For plants derived from seeds of plants transformed with LBA4404 (PSB424), a medium supplemented with hygromycin 50 mg / nil was used instead of kanamycin. Leaf pieces of drug-resistant plants formed calli on this medium, but leaf pieces of drug-sensitive plants died without forming callus.
  • GUS + GU S active
  • GUS- GU S active
  • T-DNA containing at least one factor GUS gene was converted to T-DNA containing drug resistance gene in 5 out of 9 plants examined. It was possible to obtain a plant that did not contain drug resistance genes and contained the GUS gene in the next generation.
  • T-DNA containing at least one factor GUS gene was replaced with T-DNA containing drug resistance gene in 10 out of 10 plants examined.
  • T-DNA containing drug resistance gene was replaced with T-DNA containing drug resistance gene in 10 out of 10 plants examined.
  • T-DNA containing at least one factor GUS gene was expressed in 10 of the 14 individuals examined. Plants that transmitted independently of T-DNA containing the resistance gene and did not contain the drug resistance gene but contained the GUS gene could be obtained in the next generation.
  • Ripe seeds of rice are disinfected by immersing them in 70% ethanol for 1 minute and 1% sodium hypochlorite for 30 minutes, then 2N6 solid medium (N6 inorganic salts and vitamins) (Chu CC Pro Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp. 43-50, 1978), casamino acid lg 1, 2, 4-D 2 mg, 1, sucrose 30 g 1, gel light 2 g / l) did.
  • 2N6 solid medium N6 inorganic salts and vitamins
  • the scutellum callus After washing the scutellum callus with sterile water, it was immersed in the above-mentioned bacterial solution for 3 to 10 minutes. After the immersion treatment, the cells were transplanted to a 2N6 solid medium containing the same concentration of the modified AA medium as acetosyringone, glucose, and sucrose, and cultured at 25 ° C in the dark for 3 days. Thereafter, the scutellum callus was washed with sterilized water containing 250 mg, l of cefotaxime.
  • the callus was transferred to a 2N6 solid medium containing 50 mg / l hygromycin and 250 mg cefotaxime, and cultured for 3 weeks to select hygromycin-resistant calli.
  • the obtained resistant calli were further added to an N6-7 medium containing 100 mg 1 of hygromycin and 250 mg 1 of cefotaxime (N6 inorganic salts, N6 vitamins, casamino acid 2 g 1, 2, 4-D 1 mg 1, 6BA 0.
  • the cells were cultured with 5 mg 1, sorbitol 30 g 1, sucrose 20 g 1, and gel light 2 g 1) for 2 to 3 weeks.
  • the callus grown on this medium was reconstituted with an individual regeneration medium containing 50 mg of hygromycin and 250 rag of cefotaxime N6S3 (12 N6 major inorganic salts, N6 trace salts, N6 vitamins (Chu 1978), AA amino acids (Toriyama et al.) 1985), casamino acid lg1, naphthalene acetic acid 0.2mg l, forceinetin l.Omg 1, gel light 3g 1) to regenerate hygromycin resistant plants.
  • Hygromycin-resistant plants were assayed for GUS activity by the above-described method, and then cultivated in a closed greenhouse.
  • Hygromycin resistant plants were obtained from 12.3-44.0% of the calli tested as shown in Table 4 below. Further, as shown in Table 5 below, 42 to 51% of the hygromycin-resistant plants showed GUS activity.
  • Seeds were collected from the transformed plants grown in the greenhouse. Seeds of some individuals were surface-sterilized with ethyl alcohol and sodium hypochlorite, and then seeded on N6-formon-free medium. The germinated and rooted seeds were examined for GUS activity by the above-described method and hygromycin resistance by the following method.
  • Table 6 The results shown in Table 6 were obtained for a next-generation plant derived from the seed of a plant transformed with LBA4404 (pSB424) and showing GUS activity and hygromycin resistance.
  • these plants were transfected with more than one T-DNA containing the drug resistance gene or T-DNA containing the GUS gene, as in tobacco. .
  • the number of genetic factors was consistent with the copy number of the transgene obtained by Southern analysis, and some were low. Genetic factor numbers and those with a copy number less than the Southern analysis copy number are considered to indicate that multiple genes have been introduced into the same locus.
  • T-DNA containing the GUS gene of at least one factor expresses the drug resistance gene in eight of the 12 individuals examined. Inherited independently of the T-DNA that contained the plant, it was possible to obtain a plant that contained the GUS gene without the drug resistance gene in the next generation.
  • next-generation plants of individuals of each line shown in Table 6 were analyzed for each phenotype (GUS + and hygromycin-resistant, GUS + and hygromycin-sensitive, GUS- And hygromycin resistance, GUS- and hygromycin sensitivity). As a result, it was confirmed that the hygromycin resistance gene and the GUS gene were present in a form consistent with the phenotype.
  • a regenerated transformed plant into which a desired gene has been introduced with high efficiency is prepared, and a drug which contains the desired gene in the next generation but is used as a selective marker Since the present invention makes it possible to obtain a transformed plant that does not contain a resistance gene, the present invention is useful for producing a useful new plant having a desired trait, and is useful in agriculture.

Description

明細書
植物の形質転換方法及びそのためのベクター
技術分野
本発明は、 植物の形質転換方法及びそのためのベクターに関する。
背景技術
高等植物に外来遺伝子を導入する方法 （形質転換法） には、 大別して、 直接導 入法、 とァグロバクテリゥム属細菌を介する方法がある。 前者には、 電気刺激を 用いる方法 （エレク トロポレーション法、 エレク 卜口インジヱクション法） 、
P E Gなどの化学的な処理による方法、 遺伝子銃を用いる方法などが含まれる。 前者は、 従来後者が利用しにくかつた単子葉植物に多く用いられている方法であ る o 後者は、 Agrobacterium tumefaciens や A. rhizogenes などのァ； 7ロノヽクテ リウム属細菌の有する高等植物細胞形質転換能力を利用した方法である。 後者 は、 比較的大きくかつ両端の定まつた D N A断片を効率良く高等植物に導入で き、 かつ、 プロ トプラスト培養など特殊な培養技術を必要としない優れた方法で ある。 後者は、 双子葉植物に多く用いられている方法であるが、 近年では、 単子 葉植物についても利用が始まっている。
形質転換法は、 高等植物の遺伝子工学や分子生物学の研究において必須の手法 となっており、 任意の D N A断片を効率良く植物細胞に導入し、 効率良くその D N A断片を含む植物体を得る方法が必要とされている。 遺伝子導入の際、 外来 遺伝子の導入された植物細胞を、 外来遺伝子が導入されていない植物細胞から選 び出す方法が必要である。 通常は、 後者の細胞がはるかに多いため、 検出の容易 な遺伝子を選抜マ一カーとして用いる必要がある。 選抜マーカ一として最も多く 用いられているのが、 薬剤耐性遺伝子である。 例として、 カナマイシン耐 1生遺伝 子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子や、 バスタ耐性遺伝 子、 ラウンドアップ耐性遺伝子など除草剤耐性遺伝子があげられる。
薬剤耐性遺伝子を選抜マ—カーとして用いる場合、 通常は、 植物に導入する任 意の D N A断片と薬剤耐性遺伝子を接続し、 この接続遺伝子を植物に導入する操 作を行ない、 薬剤耐性細胞を選抜し、 さらに薬剤耐性の植物体を再生して形質転 換植物を得ることが行なわれている。 このような形質転換植物には、 薬剤耐性遺 伝子と接続した任意の D N A断片も同時に導入されているのである。
しかしながら、 この方法には 2つの問題点がある。 すなわち、
1 . 選抜マーカーは導入操作の時だけに必要であるのに、 これ以後の生長過程、 さらには後代の植物においても、 常に導入した任意の D N A断片と挙動を伴にす る。 そのために、 不要な遺伝子を含む形質転換植物が得られてしまうことにな る。 とくに作物育種に形質転換法を利用した場合、 このような不要な遺伝子を含 まない品種の方が、 より受入れられやすいと考えられるので、 大きな問題とな る。 また、 形質転換植物に、 さらに、 他の D N A断片を導入する場合、 別の選抜 マ一カーを用いる必要があるという不便を生み、 大きな問題である。
2 . 選抜マーカ—と植物に導入する任意の D N A断片を接続する操作が必要であ るため、 導入遺伝子構築操作において 1段階の余分な操作を行なわなくてはなら ない。
これらの問題点を回避するために、 直接導入法の場合には、 いわゆる共形質転 換法（co- transformation法） が開発され、 広く用いられている （Shimamoto ら、 Nature 338 : 274-276. 1989) 。 この方法では、 選抜マーカーの薬剤耐性遺伝子の D N Aと植物に導入する任意の D N A断片とを接続しないで、 単に混合し植物細 胞に導入するのである。 そして、 薬剤耐性の植物を選抜すると、 その中には、 薬 剤耐性遺伝子の D N Aと植物に導入する任意の D N A断片とがともに含まれてい る植物も存在するのである。 2種の D N Aの混合比を調整することにより、 薬剤 耐性植物に占める 2種の D N Aの含まれる植物の割合が 50%以上となることが多 い。
このようにして導入された 2種の D N A断片は、 接続されていないので、 独立 に遺伝し次世代において分離するため、 次世代において選抜マーカーを含まず導 入した任意の D N A断片のみが含まれる形質転換植物を得ることができるのであ る。
ァグロパクテリゥム属細菌によって植物に導入される D N A断片は通常 T一 D N A (transfer DNA) と呼ばれ、 右ボ一ダ—および左ボーダーと呼ばれる反復 配列を両端に持つことが特徴である。 また、 左右ボーダー配列と任意の D N Aと によつて作成した人工的な D N A断片も T— D N Aと呼ぶことができる。 野生の ァグロバクテリゥム属細菌には 2種の T— DNAを含むものも多く、 このような 細菌によって形質転換された植物細胞には 2種の T— DN Aが含まれているの で、 共形質転換の現象自体は古くから知られていた。
しかし、 現在用いられているァグロパクテリゥム属細菌を介する形質転換法の 基本となっている技術 （特開昭 60— 70080 ；特公平 2 - 589 1 7 ； Herrera- Estrellaら、 The EMBO Journal 6:987-995、 1983； Bevan ら、 Nature 304:184-187、 1983 ; Fraleyら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807 、 1983) 、 ならびに、 改良された高効率の形質転換技術 （Komari、 Plant Cell Reports 9:303- 306、 1990) では、 2種の T一 DN Aを植物に導入する方法につい ての言及はされていない。
2種の T一 DNAを同時に植物に導入する方法として、
1. 第 1の T一 DN Aと第 2の T一 DN Aを同一のァグロバクテリゥム属細菌中 に配置する場合
2. 第 1の T— DNAと第 2の T— DNAを別々のァグロバクテリゥム属細菌中 に配置し 2種のァグロパクテリゥム属細菌を混合して用いる場合
とがありうる。 そして、 どちらの場合でも、 植物に導入された 2種の T— DN A は独立に遺伝し、 次世代において分離することが示された （Depickerら、 Mol. Gen. Genet. 201:477 - 484、 1985； de Framondら、 Mol. Gen. Genet. 202:125- 131、 1986； McKnightら、 Plant Molecular Biology 8:439 - 445、 1987) 。
しかしながら、 これらの従来技術では、 2種の T一 DNAがともに導入されさ らに再生した植物体を得ることのできる効率が低いために、 ァグロパクテリゥム 属細菌を介した共形質転換法は広く用いられるに至っていないのである。
発明の開示
本発明の目的は、 高い効率で所望の遺伝子が導入された再生した形質転換植物 を作成し、 次世代において該所望の遺伝子を含むが、 選択マーカ一として用いる 薬剤耐性遺伝子を含まな t、形質転換植物を得ることを可能とする植物の形質転換 方法を提供することである。 また、 本発明の目的は、 この方法に用いられるべク ターを提供することである。
本願発明者らは、 鋭意研究の結果、 ァグロパクテリゥム属細菌を介する高等植 物の形質転換法において、 選抜マ一力一として薬剤耐性遺伝子を含む第 1の T一 DNAと、 植物に導入すべき任意の DN A断片が揷入された第 2の T— DN Aと を共形質転換法により同時に高等植物に導入し、 薬剤耐性植物を選抜することに より、 上記目的を達成することができることを見出し本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 下記第 1の T一 DNA(l) と下記第 2の T— DNA(2) によつて植物細胞を共形質転換し、 薬剤耐性となつた細胞を選択することを特徴 とする、 ァグロパクテリゥム属細菌を介する植物の形質転換方法を提供する。
(1) 植物中で機能する、 上記薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子を含む第 1の T 一 DN A。
(2) 下記ハイプリッ ドベクタ一中に含まれ、 植物に導入すべき所望の DNA断片 が内部に揷入された第 2の T— DN A。
上記ハイブリツ ドベクタ一は、 下記ァクセプターベクターと下記中間ベクター との、 ァグロパクテリゥム属細菌中での相同組換えによって調製されたものであ る。
上記ァクセプターベクターは、 少なくとも、 -
(a) ァグロパクテリゥム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機 能を有する DN A領域と、
(b) Agrobacterium tumefaciens の Tiプラスミ ド pTiBo542のヴィルレンス領 域の virBおよび virG遺伝子を含む D N A領域と、
(c) 下記中間ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロバクテ リウム属細菌中で相同組換えの可能な DN A領域
を含むものである。
上記中間ベクターは、 少なくとも、
(i) 大腸菌中では機能するが、 ァグロパクテリゥム属細菌中では機能しないプ ラスミ ド複製機能を有する DN A領域と、
(ii)上記ァクセプターべクタ一の一部と相同であり、 この部分を介してァグロ パクテリゥム属細菌中で相同組換えの可能な D N A領域と、
(iii) 上記第 2の T— DN Aの少なくとも一部を構成する D N A領域 を含むものである。 また、 本発明は、 （1) 植物中で機能する薬剤耐性遺伝子を含む第 1 の τ - D N Aと、
(2) 制限酵素認識部位を有する第 2の T一 D N Aとを含むハイブリツ ドベクター を提供する。
該ハイプリ ッ ドベクターは、 下記ァクセプタ一ベクターと下記中間ベクターと の、 ァグロパクテリゥム属細菌中での相同組換えによって調製されたものであ る。
上記ァクセプターべクタ一は、 少なくとも、
( a ) ァグロパクテリゥム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機 能を有する D N A領域と、
( b ) Agrobacterium tumefaciens の Tiプラスミ 卜" pTiBo542のヴィノレレンス領 域の virBおよび virG遺伝子を含む D N A領域と、
( c ) 下記中間ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロバクテ リウム属細菌中で相同組換えの可能な D N A領域
を含むものである。
上記中間ベクターは、 少なくとも、
(i) 大腸菌中では機能するが、 ァグロパクテリゥム属細菌中では機能しないプ ラスミ ド複製機能を有する D N A領域と、
(ii)上記ァクセプタ一ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロ パクテリゥム属細菌中で相同組換えの可能な D N A領域と、
(iii) 上記第 2の T— D N Aの少なくとも一部を構成する D N A領域 を含むものである。
本発明によれば、 高 t、効率で所望の遺伝子が導入された再生した形質転換植物 を作成し、 次世代において該所望の遺伝子を含むが、 選択マーカ—として用いる 薬剤耐性遺伝子を含まな 、形質転換植物を得ることが可能になる。
図面の簡単な説明
図 1は、 ァグロパクテリゥム属細菌中での相同組換えにより、 ァクセプターべ クタ一と中間ベクターから、 ハイプリッ ドベクタ一が調製される現象を模式的に 示した図である。 図 2は、 pSB21 の構成を示す図である。
図 3は、 pSB22 の構成を示す図である。
図 4は、 pSB24 の構成を示す図である。
図 5は、 pNBlの構成を示す図である。
図 6は、 pSBlの構成を示す図である。
図 7は、 PSB3の構成を示す図である。
図 8は、 pSB4の構成を示す図である。
図 9は、 pNBlと pSB24 の相同組換えにより調製される pNB124の構成を示す図で める。
図 1 0は、 pSBlと pSB24 の相同組換えにより調製される pSB124の構成を示す図 である。
図 1 1は、 pSB3と pSB24 の相同組換えにより調製される pSB324の構成を示す図 である。
図 1 2は、 pSB4と pSB24 の相同組換えにより調製される pSB424の構成を示す図 である。
図 1 3は、 pGA482-GUSの構成を示す図である。
図 1 4は、 PTOK253 の構成を示す図である。
なお、 上記図中に記載されて t、る参照符号の意味を以下に記す。
AV ァクセプターべクタ一
IV 中間ベクター
HV ハイプリ ッ ドベクター
HR ァクセプターベクターとハイプリッ ドベクターにともに含まれる断片であ り、 この断片中の D N A配列の間で相同組換えが起きる。
ORI ColEl の複製開始点
COS ラムダファージの COS 部位
SP 大腸菌中ならびにァグロバクテリゥム属細菌中で機能するスぺクチノマイ シン耐性遺伝子
TC 大腸菌中ならびにァグロバクテリウム属細菌中で機能するテトラサイクリ ン耐性遺伝子 KAN 大腸菌中ならびにァグロパクテリゥム属細菌中で機能するカナマイシン 耐性 ¾ίζ子
ΝΡΤ 植物細胞中で機能する N0S プロモータ一を接続したカナマイシン耐性遺 伝子。 大腸菌ならびにァグロバクテリゥム属細菌にも低レベルの耐性を付与す る。
ΗΡΤ 植物細胞中で機能する 35S プロモータ一を接続したハイグロマイシン耐 性遣伝子。 ァグロバクテリゥム属細菌にも低レベルの耐性を付与する。
GUS 植物細胞中で機能する 35S プロモーターを接続した G U S遺伝子 1-GUS 植物細胞中で機能する 35S プロモーターを接続した、 イントロンを含 む G U S遺伝子
T-DNA ァグロバクテリウム属細菌から植物に転移する D N A断片
BR T一 D N Aの右ボーダー配列
BL T一 D N Aの左ボーダー配列
15. 2 kb Kpnl pTiBo542のヴィルレンス領域由来の 15. 2 kb Kpnl 断片
B pTiBo542の virB遺伝子
G pTiBo542の virG遺伝子
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法により形質転換できる植物は、 ァグロバクテリゥム属細菌に感染 し、 それによつて形質転換されるいかなる植物であってもよく、 例として、 夕バ コ、 イネ、 トマ ト、 ジャガイモ、 ペチュニア、 トウモロコシ及びアブラナ等の 種々の高等植物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。 ァグロパクテリゥム属細菌を介する高等植物の形質転換方法自体はこの分野に おいて周知である。 形質転換に用いることができるァグロパクテリゥム属細菌と して、 Agrobacterium tumefaciens 及び Agrobacterium rhizogenes等を挙げるこ とができる。 これらのァグロパクテリゥム属細菌は植物細胞を形質転換し、 腫瘍 化する能力を有する土壌細菌であり、 これらの細菌には腫瘍誘導性プラスミ ド
( T iプラスミ ド） が含まれている。 T iプラスミ ドにおいて重要な部位は形質 転換に関与する領域であるヴィルレンス領域と、 植物細胞に転移される腫瘍化遺 伝子が含まれている T一 D N A領域である。 そして、 T— D N A領域において は、 腫瘍化遺伝子の転移に必須の部分はその両端に位置する境界配列と呼ばれる 領域のみである。 従って、 従来より、 ァグロバクテリウム属細菌を介する植物の 形質転換方法においては、 この T— D N A中に所望の遺伝子を挿入したプラスミ ドを含むァグロパクテリム属細菌に植物を感染させることにより形質転換を行つ ている。 本発明の方法においても、 植物に導入する薬剤耐性遺伝子及び所望の任 意の遺伝子はそれぞれ T—D N A中に挿入される。
本発明の方法では、 選択マーカーとして用いる薬剤耐性遺伝子を含む第 1の T — D N Aと、 植物に導入しょうとする所望の D N A断片が導入された第 2の T— D N Aとにより植物を共形質転換する。 第 1の T一 D N A中に含まれる薬剤耐性 遺伝子としては、 カナマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子が好 ましいがこれらに限定されるものではない。 第 1及び第 2の T— D N Aのうち、 少なくとも第 2の T— D N Aは後述するハイプリッ ドベクタ一上に存在する。 ハイプリッ ドベクターは、 ァクセプターベクターと中間ベクターとのァグロバ クテリム属細菌中での相同組換えにより調製されるものである。 ここで、 ァクセ プターべクタ一は、 ァグロパクテリゥム属細菌中および大腸菌中で複製され増殖 するプラスミ ドであって、 中間べクタ一と相同な D N A断片を含み、 ァグロバク テリゥム属細菌中でのこの部位を介した相同組換えによって、 中間ベクターを組 込むことのできるプラスミ ドである。 また、 中間べクタ一は、 大腸菌中では複製 され増殖するが、 ァグロバクテリゥム属細菌中では単独では複製されず増殖しな いプラスミ ドであって、 ァクセプターベクターと相同な D N A断片を含み、 この 部位を介した相同組換えによって、 ァクセプタ一ベクタ一に組込まれることがで き、 組込まれた状態でァグロパクテリゥム属細菌中で維持することのできるブラ スミ ドである。
上記ァクセプタ一ベクター上には、
( a ) ァグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機能 を有する D N A領域と、
( b ) Agrobacteriura tumefaciens の Tiプラスミ ド pTiBo542のヴィルレンス領域 の virBおよび virG遺伝子を含む D N A領域と、
( c ) 下記中間ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロバクテリ ゥム属細菌中で相同組換えの可能な D N A領域とが存在する。
ここで、 T iプラス ミ ド pTiBo542は、 Agrobacteri画 tumefaciens A281
(ATCC 37349) に含まれる T iプラスミ ドであって、 そのヴィルレンス領域の能 力が高いことで知られるものである (フッ ドら、 Bio. Technol. 2:702-709, 1984; フッ ドら、 J. Bacteriol. , 168: 1283 - 1209, 1986; コマリ ら、 J. Bacteriol. , 166:88 - 94, 1986; ジンら、 J. Bacteriol. 169 :4417 - 4425， 1987;コマリ、 Plant
Science, 60:223-229, 1989)。 pTiBo542のヴィルレンス領域 virB及び virG遺伝子 も公知であり、 これらの文献に記載されている。 pTiBo542のヴィルレンス領域 virB及び virG遺伝子は、 pTiBo542を制限酵素 Kpnlで処理して得られる 1 5. 2 k bの DNA断片中に含まれるので、 本発明においてもこの断片を用いること ができる。 なお、 上記 （a) (b) 及び （c) を含むァクセプタ一ベクター自体 は公知であり、 例えば特開平 4 - 222527号及び EP- A- 0 504869に記載され ている。
一方、 中間ベクターには、
(i) 大腸菌中では機能するが、 ァグロパクテリゥム厲細菌中では機能しないブラ スミ ド複製機能を有する DN A領域と、
(ii)上記ァクセプ夕一ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロバ クテリゥム属細菌中で相同組換えの可能な D N A領域と、
(iii) 上記第 2の T— DNAの少なくとも一部を構成する DN A領域とが含まれ ている。 上記第 2の T一 DNAの一部は上記ァクセプターベクターに含まれてい てもよいが、 第 2の T— DNAの全域が中間ベクターに含まれている方が、 所望 の DN A断片を植物に導入できる効率が高いので好ましい。 なお、 植物に導入す べき所望の D N A断片は、 中間べクタ一上の第 2の T一 D N A内に制限酵素認識 部位を利用して揷入されていることが好ましい。 なお、 上記（i) 、 （ii)及び（iii) を含む中間ベクター自体は公知であり、 例えば特開平 4 - 222527号及び EP - A - 0 504 869に記載されている。
ァグロバクテリゥム属細菌中での上記ァクセプターべクターと上記中間べク ターとの相同組換えは公知の方法 （ヘレラ—エステレラら、 EMBO J. 2:987-995,
1983;ホーチら、 Science, 223:496-498， 1984) により行うことができる。 上記第 1の T— DNAは、 上記第 2の T一 DNAを含むハイプリッ ドベクター 上に存在していてもよいし、 他のプラスミ ド上に存在していてもよい。 後者の場 合、 ハイブリツ ドベクタ一及び他のベクターは単一のァグロバクテリゥム属細菌 中に含まれていてもよいし、 別個のァグロバクテリウム属細菌中に含まれて （2 菌系法） いてもよい。 もっとも、 選択した薬剤耐性植物細胞が、 第 2の T一 DN Aをも含んでいる確率は、 第 1の T一 DNA及び第 2の T一 DNAが単一の ハイプリッ ドベクター上に存在する場合の方が有意に高くなるので、 第 1の T一 DN Aもハイプリッ ドベクター上に存在することが好ましい。 しかも、 驚くべき ことに、 第 1の T— DNAと第 2の T— DNAとが単一のべク夕一上に存在する 場合であっても、 これらは独立的に植物に導入され、 次世代において遺伝的に分 離可能である。 単一のベクタ一上に存在する T— D N Aで植物を効率良く共形質 転換する方法は本願発明者らが初めて開発したものであり、 しかも、 それが高頻 度で遺伝的に独立的に植物に導入され得ることは本願発明者らが初めて見出した ものである。
第 1の T— DNAがハイプリ ッ ドベクタ一上に存在する場合、 第 1の T— DNAど第 2の T— DNAとが遺伝的に独立的に植物に導入される可能性を高め るために、 第 1の T一 DNAと第 2の T— DNAとの距離が大きいことが好まし い。 この目的のために、 第 1の T— DNAはァクセプタ一ベクターに由来するこ とが好ましい。 また、 この目的のために、 第 1の T— DNAと、 上記第 2の T— DNAは、 上記ハイプリッ ドベクター上で、
(1) ァグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機能 を有する DNA領域と、
(2) Agrobacterium tumefaciens の Tiプラスミ ド pTiBo542のヴィルレンス領域 の virBおよび virG遺伝子を含む D N A断片、
によって互いに隔てられていることが好ましい。
上記ハイブリツ ドベクタ一は、 ァグロパクテリゥム属細菌に公知の方法で導入 することができる。 例えば、 細菌の三系交雑法 （ディッ夕ら、 Proc. Natl. Acad, sci. USA, 77:7347-7351, 1980) により行うことができる。
植物の形質転換に用 、られるァグロバクテリウム属細菌としては、 従来より、 この目的のために用いられているものを用いることができる。 すなわち、 T— DN Aを含まないが、 T一 DN Aの植物への転移に必要なヴィルレンス領域を含 む T iプラスミ ド又は R iプラスミ ドに由来するプラスミ ドを有するものを好ま しく用いることができる この例として、 例えば Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (ホエケマら、 nature, 303:179-180， 1983)を挙げることができるがこ れに限定されるものではない。 このようなァグロバクテリム属細菌に上記ハイブ リツ ドベクタ一又は第 1の T一 DN Aを含むプラスミ ド （2菌系法の場合） を導 入したものを形質転換に用いる。
次いで、 ハイブリッ ドベクター又は第 1の T— DN Aを含むプラスミ ド （2菌 系法の場合） を導入したァグロパクテリゥム属細菌で植物を形質転換する。 これ は、 植物の細胞、 例えば植物の子葉断片を、 ァグロパクテリゥム属細菌を含む液 体培地中で培養することにより行うことができる。 2菌系法の場合には、 2種類 の菌を含む液体培地中で培養すればよい。 この形質転換方法自体は公知であり、 例えば特開平 4 - 222527号及び EP- A- 0 504 869に記載されている。
形質転換処理した植物細胞のうち、 第 1の T- DNA中に含まれる薬剤耐性遺 伝子によって薬剤耐性を付与された細胞を選択する。 次いで、 これらの細胞か ら、 常法により植物体を再生させる。
このようにして得られた植物体は、 かなりの確率で第 2の T一 DNAをも含 む。 下記実施例では、 第 1の T— DNAと第 2の T— DN Aとが単一のハイプリ ッ ドベクター上に存在する場合には、 得られた植物体のうち約 50%以上、 2菌 系法の場合でも約 35 %が第 2の T— D N Aをも有していた。
第 1の T一 DN Aと第 2の T一 DN Aを含む形質転換植物の多くのものにおい て、 第 1の T一 DN Aと第 2の T一 DN Aとは独立に遺伝することが確認され た。 すなわち、 下記実施例では、 第 1の T— DNAと第 2の T一 DNAとが単一 のハイプリッ ドベクター上に存在している場合、 第 1の T— DNAと第 2の T一 DN Aとを含む形質転換植物の 79%が、 2菌系法の場合 71 %において、 第 1 の T— DNAと第 2の T— DN Aとが独立に遺伝することが確認された。 従つ て、 これらの形質転換植物を栽培すれば、 次世代において、 第 2の T— DNAを 含むが第 1の T一 D N Aを含まな t、植物を得ることが可能である。 本発明はさらに、 （1) 植物中で機能する薬剤耐性遺伝子を含む第 1の τ一 DNAと、
(2) 制限酵素認識部位を有する第 2の T一 DNAとを含むハイブリッ ドベクター であって、 該ハイプリッ ドベクターは、
少なくとも、
(a) ァグロパクテリゥム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機 能を有する DNA領域と、
(b) Agrobacterium tumefaciens の Tiプラスミ ド pTiBo542のヴィルレンス領 域の virBおよび virG遺伝子を含む D N A領域と、
(c) 下記中間ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロバクテ リウム属細菌中で相同組換えの可能な DN A領域、
を含むァクセプタ一ベクターと、
少なくとも、
(i) 大腸菌中では機能するが、 ァグロパクテリゥム属細菌中では機能しないプ ラスミ ド複製機能を有する DN A領域と、
(ii)上記ァクセプターベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロ パクテリゥム属細菌中で相同組換えの可能な DN A領域と、.
(iii) 上記第 2の T— DNAの少なくとも一部を構成する D N A領域を含む中 間べクタ一との、 ァグロパクテリゥム属細菌中での相同組換えによって調製され たものであるハイブリツ ドベクタ一を提供する。 このハイブリツ ドベクターは、 上記した本発明の方法に用いるハイプリッ ドベクターとほぼ同じものであり、 第 2の T— DNA中に未だ所望の D N A断片が挿入されていな t、点が異なる。 所望 の D N A断片を第 2の T— D N A中の制限酵素部位を利用して第 2の T— DNA に挿入すれば、 上記と同様に用いることができる。
実施例
以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 下記実施例 は例示のためにのみ記載するものであって、 いかなる意味においても限定的に解 釈してはならない。
害施例 1 プラスミ ドの構築 本例での構築作業は、 別に示す場合をのぞき、 Sambrookら、 Molecular Cloning, A laboratory Manual, ¾econd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、 1989に記載の方法により行 つた
中間べクタ一 PSB21 、 PSB24 の構築
PBR322を EcoRI および Clalで切断し、 T4 DNA polymerase で処理後、 Clalリン 力一 （5'-CATCGATG- 3，） を揷入し閉環した。 トランスポゾン Tn7 (DeGreve ら、 Plasmid 6 :235 - 248、 1981)のスぺクチノマイシン耐性遺伝子 (SP遺伝子） を含 む 2.6 kb Dral -EcoRI 断片を上記プラスミ ドの EcoRV- EcoRI の間にクローン化し した。 このプラスミ ドを EcoRI で開環後 T4 DNA polymerase で処理し再環状化す ることにより EcoRI 部位を除去した。 このプラスミ ドの SP遺伝子を含む 2.4 kb Clal 断片を、 T4 DNAポリメラ一ゼ処理後 pUC19 の Smal部位に揷入し pTOK107 を作 成した。 pGA482 (An、 Plant Physiol. 81:86-91 、 1986) の 2.7 kb EcoRI - Hindlll断片と、 EcoRI および Hindlll で切断した pTOK107 を結合し ρΤΟΚΠΟ を作 成した。
PTOK170 を BamHI および Bglll で切断後閉環し、 pYS138とした。 pYS138を EcoRI および Asp718I で切断し、 T4 DNA polymerase 処理後、 Sailリ ンカー （5'- GGTCGACC-3') を挿入し閉環し pYS151を作成した。 pYS151を Sailで切断しこの部位 に、 pGA643 (Anらヽ Plant Molecular Biology Manual A3: 1— 19， Kluwer Academic, Dordrecht、 1988) の T— D N Aを含む 4.7 kbの Sail断片を導入し PTOK235 を作成した。
PTOK235 を SacII 部位で切断し、 T4 DNAポリメラ一ゼにより平滑末端化後、 Bglll リンカ一 （5'- CAGATCTG- 3') 、 または、 Hindlll リンカ一 （5'- CAAGCTTG - 3') を揷入し閉環し、 得られたプラスミ ドをそれぞれ PTOK245 と PTOK246 と命名 した。
PTOK246 を Hindlll および EcoRI で切断し、 T— D N A中の大部分の D N Aを 除去した後、 ここに、 pBI221 (Jefferson 、 Plant Molecular Biology Reporter 5:387-405、 1987) の 2.9 kb Hindll I - EcoRI断片を揷入し pSB21 を作成した。 PBI221の 2.9 kb Hindlll- EcoRI断には、 植物細胞中で発現するベータグルクロ二 ダーゼ遺伝子 （GUS) がふくまれている。 pSB21 は、 ①大腸菌およびァグロバ クテリゥム属細菌中で機能するスぺクチノマイシン耐性遺伝子、 ② pGA482の 2.7 kb EcoR I- Hind III断片に由来する、 大腸菌中では機能するがァグロパクテリゥム 属細菌中では機能しないプラスミ ド複製機能を含む断片であって、 同時にァクセ プターべクタ一との相同組換えを起こすことのできる断片、 ③ T— DNAの左右 ボーダー配列とこれにはさまれた G U S遺伝子によつて構成される T一 D N A領 域を含む断片、 によって構成される中間ベクターである。
同様に Hindlll および EcoRI で切断した pTOK246 に、 同様に pIG221 (Ohtaら、 Plant Cell Physiol. 31 :805 - 813、 1990) の 3.1 kb Hindi 11- EcoRI断片を挿入し PSB24 を作成した。 この断片には、 イン 卜ロン配列を揷入した GU S遺伝子 （ィ ン トロン GUS) が含まれている。 イン トロン GU Sは、 植物細胞中では効率良 く発現するが、 イントロンの作用により大腸菌ならびにァグロバクテリウム属細 菌中ではまったく発現しない。 pSB24 は、 GU S遺伝子がイン トロン GU S遺伝 子になっている以外は、 pSB21 と同様な中間ベクターである。
PSB22 の構築
ハイグロマイシン耐性遺伝子 （HPT、 Gritz ら、 Gene 25:179-188、 1983) と pDH51 (Pietrazak et al. Nucleic Acids Res 14:5857-5868、 1986) より構 成されており、 植物細胞中で機能する HPT遺伝子を含む pGL2を、 Sailで切断し T4 DNAポリメラ一ゼで処理後閉環することにより、 Sail認識部位を削除し ρΤΟΚ234 とした。 さらに、 ρΤΟΚ234 を Kpnlで切断後同様の処理を行うことにより 2 か所の Kpnl認識部位を削除し ρΤ0Κ244 とした。
PT0K244 を Hindlll で切断後 EcoRI で不完全分解し、 1.9 kb 断片を単離して PTOK246 の Hindlll と EcoRI 認識部位の間に導入することにより pSB22 を作成し た。 pSB22 は、 GUS遺伝子が HPT遺伝子に置換されている点以外は、 pSB21 と同様な中間ベクターである。
PYS169の構築
6八482を^1«1111 および EcoRI により切断し、 T4 DNAポリメラ一ゼ処理後閉環 することにより 2.7 kb Hindlll- EcoRI断片を削除し pYS169を作成した。 pYS169に は、 T— D N Aの左右ボーダー配列とこれにはさまれた植物細胞中で機能する力 シン耐性遺伝子 （NPT) によって構成される T— DN Aが含まれてい る。 なお、 この NPT遺伝子は、 大腸菌およびァグロパクテリゥム属細菌にも力 ナマイシン耐性を付与する能力がある。
pNBlの構築
pVCKlOl (Knauf ら、 Plasmid 8 :45 - 54 、 1982) を EcoRI により切断し、 T4 DNAポリメラーゼで処理後閉環することによって EcoRI 部位を削除した。 さらに、 BgUI で切断後閉環する操作を行ったところ、 Bglll 部位が削除できたので、 こ のプラスミ ドを pVCKlOlQと命名した。 01010を1111^111 と Xholで切断し、 Hindi II - Sailで切断した pUC18 と結合し pTOIQ50 を作成した。 TOK150 を Hindi II で切断し、 T4 DNAポリメラーゼ処理後 EcoRI リンカ一 （5'-CCGAATTCGG-3') を揷 入し閉環することにより、 Hindi I】 部位を EcoRI 部位に変換し、 pTOK239 とし た。
PGA482を Hpalで切断し、 Xholリンカ一 （5'-CCTCGAGG- 3，） を揷入し閉環して PTOK236 を作成した。 pTOK236 を Xbalおよび EcoRI で分解し、 2.6 kb 断片を単 離した。 pTOK239 を EcoRI および Xbalで切断し、 2.7 kb 断片を除去し、 pTOK236 の 2.7 kb Xbal -EcoRI 断片を揷入し閉環して pNBlを作成した。 pNBlは、 ァクセプ ターベクターの 1種であるが、 T一 DNAゃヴィルレンス領域由来の DN Aなど は含んでいない。
PNB3と PNB4の構築
pNBlを Xholで切断し、 pYS169の NPT遺伝子を含む T— DNAを含む 3.5 kb Sail 断片を挿入し閉環して pNB3を作成した。 pNB3はァクセプタ一ベクターの 1種 であり、 NPT遺伝子を含むT— DNAを含んでぃる。
pNBlを Xholで切断し、 pSB22 の H P T遺伝子を含む T— D N Aを含む 3.0 kb Sail 断片を揷入し閉環して pNB4を作成した。 pNB4はァクセプタ一ベクターの 1種 であり、 HP T遺伝子を含む T— DN Aを含んでいる。
pSBK pSB3、 および、 pSB4の構築
pNBK p薦、 および、 pNB4を Kpnlで切断し、 pTiBo542 (American Type Culture Collection 受託番号 37349 ) のヴィルレンス領域の virBおよび virG遺伝子を含 む 15.2 kb Kpnl断片を揷入して閉環して 3種のプラスミ ドを作成し、 それぞれ、 pSBK pSB3、 pSB4とした。
pSBlは、 ァクセプターベクターの一種であり、 これに、 T— DNAを含む中間 ベクタ一を組込んだハイプリッ ドベクターを作成した場合、 ヘルパープラスミ ド と組合わせることにより、 スーパ一バイナリ一べク夕一を構成することができ る。
PSB3は選抜マーカー遺伝子として NPT遺伝子を含む T— DNAを含んでいる ァクセプターべクタ一であり、 この T一 DNAから、 pTiBo542のヴィルレンス領 域の virBおよび virG遺伝子を含む 15.2 kb Kpnl断片によって隔てられた部位に、 中間ベクターを組込むことのできる部位を有する。 pSB3は、 単独で、 もしくは、 中間ベクターを組込んだハイブリツ ドベクタ一として、 ヘルパープラスミ ドと組 合わせることにより、 スーパ一バイナリ一ベクターを構成することができる。 T — DNAを含む中間ベクターの組込によりハイプリ ッ ドベクターを作成した場合 には、 このハイブリツ ドベクタ一は、 選抜マーカ一遺伝子として NPT遺伝子を 含む第 1の T一 DNAと、 これから、 15.2 kb 以上隔てられた、 第 2の T一 DNAの、 2つの T— DNAを含むことが特徴である。
PSB4は選抜マ一力一遺伝子とし H P T遺伝子を含む T一 D N Aを含んでいるァ クセプターべクタ一であり、 この T— DNAから、 pTiBo542のヴィルレンス領域 の virBおよび virG遺伝子を含む 15· 2 kb Kpnl断片によって隔てられた部位に、 中 間べクタ一を組込むことのできる部位を有する。 pSB4は、 単独で、 もしくは、 中 間べクタ一を組込んだハイプリッ ドベクターとして、 ヘルパープラスミ ドと組合 わせることにより、 スーパーバイ リーべクタ一を構成することができる。 T— DN Aを含む中間べクタ一の組込によ ¾·ハイプリッ ドベクターを作成した場合に は、 このハイプリッ ドベクタ一は、 選抜マーカー遺伝子として NPTit云子を含 む第 1の T一 DNAと、 これから、 15.2 kb以上隔てられた、 第 2の T DNA の、 2つの T— DN Aを含むことが特徴である。
PTQK253 の作成
PVCK102 (Knauf ら、 Plasmid 8:45-54 、 1982) を Sailで切断し、 pSB21 の丁 一 DN Aを含む 4.1 kb Sail 断片を挿入し閉環することにより pTOK253 を作成し た。 ρΤΟΚ253 は、 ヘルパープラスミ ドと組合わせてバイナリ一ベクタ一を構成す ることができるプラスミ ドであり、 その T一 D N Aには植物細胞中で発現する G U S遺伝子が含まれ、 薬剤耐性遺伝子は含まれていない。
PGA482- GUSの構築
PGA482を Hindl l l および EcoRI で切断し、 pBI221の 2. 9 kb Hindi I I-EcoRI断片 を挿入し PGA482-GUSを作成した。 pGA482は、 ヘルパープラスミ ドと組合わせてバ イナリーベクターを構成することができるプラスミ ドであり、 その T— D N Aに は植物細胞中で発現するカナマイシン耐性遺伝子 （N P T ) が含まれてる。 ま た、 pGA482-GUSは、 ヘルパープラスミ ドと組合わせてバイナリーベクターを構成 することができるプラスミ ドであり、 その T一 D N Aには植物細胞中で発現する G U S遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子 （N P T ) が含まれてる。
実施例 2 ハイプリッ ドベクタ一等を含むァグロパクテリゥム属細菌の作成 本実施例では、 ァグロバクテリウム属細菌の培養は AB培地 （Chilton ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 :3672-3676 、 1974) を用いて、 28°Cで行った。 また、 必要に応じ、 テトラサイクリン （10 /i g/ml) 、 カナマイシン （100 /z g ml) 、 ノヽ ィグロマイシン （50 μ g/ral) 、 スぺクチノマイシン （50 g/ml) を添加した培地 を用いた
pNBK pSBK pSB3、 および、 pSB4を、 Mtta ら （Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 : 7347-7351、 1980) の方法により、 Agrobacterium tumefaciens 菌系 LBA4404
(Hoekema ら、 Nature 303 : 179-180、 1983) に導入した。 LBA4404 は、 T一 D N Αを除去した disarmed の Tiプラスミ ド pAL4404 を含む菌系である。 pAL4404 は完全なヴィルレンス領域を保持しており、 バイナリ一べク夕一のへルパープラ スミ ドとして頻用されている。 以下、 プラスミ ドを導入したァグロパクテリゥム 属細菌は、 例えば、 LBA4404 (pNBl) のように、 菌系名とこれに続く括弧内のプ ラスミ ド名によって記載することとする。
テトラサイクリン耐性菌である LBA4404 (pNBl) に、 Ditta らの方法により、 スぺクチノマイシン耐性遺伝子を有する PSB21 を導入し、 テトラサイクリン、 ス ぺクチノマイシン両薬剤に耐性の菌を選抜することにより、 中間べクタ一 pSB21 が pNBlに導入されたハイプリッ ドベクターを含む LBA4404 を得ることができた。 このハイプリッ ドベクターを pNB121と命名した。 以下同様の操作により、 下記表 1に示すハイプリ ッ ドベクターを含む LBA4404 を作成した。
表 1
ハイプリッ ドベクターの乍成 ァクセプター ァクセプタ一 中間べク 中間べク ハイプリッド ハイプリッ ド ベクター名 ベクターの ター名 ターの ベクタ一名 ベクターの 靈賺 翻耐性 翻耐 I生 NBl TET 雌 SP pNB121 TET SP pNBl TET PSB24 SP pNB124 TET SP pSBl TET pSB21 SP PSB121 TET SP pSBl TET pSB24 SP PSB124 TET SP pSB3 TET NPT PSB21 SP PSB321 TET SP NPT pSB3 TET NPT PSB24 SP PSB324 TET SP NPT pSB4 TET HPT PSB21 SP PSB421 TET SP HPT pSB4 TET HPT PSB24 SP PSB424 TET SP HPT
TET ：テトラサイクリン耐性、 SP：スぺクチノマイシン耐！ 4
NPT ：カナマイシン耐性、 HPT ：ハイグロマイシン耐性
pGA482、 pTOK253 、 および、 pGA482- GUSを、 Mtta らの方法により LBA4404 に 導入し、 LBA4404(pGA482) 、 LBA4404(pTOK253)と LBA4404(pGA482- GUS) を作成し た。
実施例 3 タバコの形質転換と共形質転換の効率
タバコ （品種 BY4)を温室で栽培し、 葉を採取し、 エチルアルコールおよび次亜 塩素酸ナトリウムで表面殺菌した後、 直径約 6IM1 の葉片ディスクを調整した。 こ の葉片と下記のうちの一種のァグロパクテリゥム属細菌約 108 個の細胞とを Linsmaier and Skoo の無機塩類と 30g, l のショ糖より成る液体培地 2〜3ml 中 で 48時間共存培養を行った。
LBA4404(pSB324)
LBA4404(pSB424)
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の等量混合菌
LBA4404(pNB124) と LBA4404(pGA482) の等量混合菌
LBA4404(pTOK253)と LBA4404(pGA482) の等量混合菌
LBA4404(pGA482-GUS)
LBA4404TpGA482)
その後、 葉片を滅菌水で洗浄し細菌を洗い落とした後、 Linsmaier and Skoog の無機塩類、 イン ドール酢酸 0. 3 mg l、 6 -（ 7、 ？0-ジメチルァリルアミノプリ ン 10mg ml 、 カナマイシン 200mg/l 、 セフオタキシム 250mg/mlおよび寒天 0. 9¾を 含む培地に置床した。 ただし、 LBA4404(pSB424) を用いた場合には、 カナマイシ ンに代えてハイグロマイシン 50mg 'lを添加した培地を用いた。 培養 1力月後、 発 根したカナマイシン耐性もしくはハイグロマイシン耐性の薬剤耐性の植物体につ いて、 以下の方法により G U Sの発現を調査した後、 温室で栽培した。
G U Sの発現は、 Jefferson ら （Plant Molecular Biology Reporter 5 : 387- 405、 1987) の方法に準じ、 小葉片 （2 2mra から 10 x 10誦程度の間の大きさ） を 植物から切除し、 5 -ブロモ -4- クロロ- 3- インドリルグルクロニド（X- Glue) 500mg 1、 50mM リン酸ナトリウム ρΗ7· 0、 10mM /3—メルカプトエタノール、 lOmM エチレンジアミ ン 4酢酸ナトリウム、 0. 1%ザルコシンラウリルナト リウム、 0. 1¾ Triton X - 100 の水溶液中に 2 時間からー晚浸すことによって調査した。 G U S 活性を示す場合には、 葉片の特に切断面が濃青色を呈するが、 G US活性を示さ ない場合にはそのような発色は認められない。
GUS発現調査結果は下記表 2に示すとおりである。
表 2
形離換体の G U S'離 形質車^に用いた imm^\ G U S活性 ％ ァグロパクテリゥム属 β 耐 I生個体 を示す側機
LBA4404(pSB324) 118 61 52
LBA4404(pSB424) 109 54 50
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 100 35 35
LBA4404(pNB124) と LBA4404(pGA482) の混合 100 22 22
LBA4404(pTOK253)と LBA4404(pGA482) の混合 110 0 0
LBA4404(pGA482-GUS) 39 33 85
LBA4404(pGA482) 25 0 0
薬剤耐性を示すことは、 選抜マ—カー遺伝子を含む第 1の T一 D N Aが当該植 物に導入されていることを示しており、 G U S活性を示すことは G U S遺伝子を 含む第 2の T— D N Aが当該植物に導入されていることを示している。
LBA4404(pGA482) は G U S遺伝子を含んでいない菌であるので、 得られた薬剤 耐性植物はすべて G U S活性を示さなかった。
LBA4404(pGA482-GUS) は、 薬剤耐性遺伝子と G U S遺伝子が接続された T一 D N Aを含んでいるカ、 得られた薬剤耐性植物の 85% から G U S活性が検出され たのみであった。 これは、 形質転換過程で G U S遺伝子が欠落する場合、 もしく は、 G U S遺伝子が導入されていても発現が不十分であるために検出されなかつ た場合があることを示している。
LBA4404 (pTOK253)と LBA4404 (pGA482) の混合菌を用いる方法は、 従来技術 (McKnightら、 Plant Molecular Biology 8 : 439 - 445 、 1987) と同一の手法とい うことができるが、 この従来技術では、 2種の T— D N Aが導入された植物は全 く検出することができなかった。 これは、 この従来技術の場合には、 2種の T一 D N Aによる共形質転換個体が全く得られない場合もありうることを示してお り、 このことが、 この方法が広く用いられていない原因のひとつであると考えら れる。
LBA4404(pNB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌を用いる方法は、 pNB124という ハイプリ ッ ドベクタ一を用いている点以外は、 上記 McKnightらの従来技術に類似 した方法である。 McKnightらの従来技術では、 薬剤耐性の植物の内 19¾ に第 2の T— D N Aが含まれていたが、 LBA4404(pNB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌で はその比は 22¾ であり、 よく似た結果が得られたといえる。
LBA4404 (pSB124) と LBA4404 (pGA482) の混合菌を用いる方法は、 LBA4404 (PSB124) 力、、 pSB124というハイプリッ ドベクタ一を含む菌であり、 スーパ一バイ ナリーべクタ一を利用した手法であり、 本発明で開発した方法 （2菌系法） であ る。 この方法では、 薬剤耐性の植物のうち 35% に第 2の T— D N Aが含まれるこ とが確認され、 LBA4404(pNB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌の場合よりもはる かに共形質転換の効率が高いことが判明した。
なお、 LBA4404 (pSB124) と LBA4404 (pGA482) の混合菌の場合と、 LBA4404 (pNB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌の場合の結果の比較については、 下記のよ うに統計学的分析を行うことができる。
両混合菌による共形質転換の確率が等しいという仮説を設定すると、
X2 =6.5 x6.5 x(l '28.5+1/28.5+1/71.5+1 1.5) =4.15
と計算され、 これは自由度 1をもつ。 自由度 1のとき X2 が 4.15よりも大きい確 率は 5%以下であるので、 上記仮説は 5%水準で棄却される。 よって、 両混合菌によ る共形質転換の確率には統計学的に有意な差がある。
LB4404(pSB324)もしくは LBA4404(pSB424) を用いる方法は、 ハイプリ ッ ドべク タタ一 PSB324もしくは PSB424を含む菌を用いる方法であり、 スーパーバイナリ一 ベクターを利用した方法であり、 本発明で開発した方法 （1菌系法） である。 こ れらの方法では、 薬剤耐性の植物のうち 50〜52% に第 2の T— DNAが含まれる ことが確認され、 LBA4404(pNB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌の場合や、 LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌の場合よりもはるかに共形質転換 の効率が高 L、ことが判明した。
なお、 LB4404(pSB324) しくは LBA4404(pSB424) を用いる方法と、 LBA4404 (PNB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌を用いる方法の結果の比較については、 下 記のように統計学的分析を行うことができる。
両方法による共形質転換の確率が等しいという仮説を設定すると、
X2 =19.9x 19.9 (1/95.1+1/41.9+1/131.9+1/58.1)=23.43
と計算され、 これは自由度 1 をもつ。 自由度 1 のとき X2 が 23.43 よりも大きい 確率は 1¾以下であるので、 上記仮説は 1%水準で棄却される。 よって、 両方法によ る共形質転換の確率には 1¾水準で統計学的に有意な差がある。
また、 LB4404(pSB324)もしくは LBA4404(pSB424) を用いる方法と、 LBA4404 (PSB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌を用いる方法の結果の比較については、 下 記のように統計学的分析を行うことができる。
両方法による共形質転換の確率が等しいという仮説を設定すると、
X2 = 10.9 10.9 X (1 104.1+1 45.9+1, 122.9+1.54.1) =6.89 一 と計算され、 これは自由度 1をもつ。 自由度 1のとき X2 が 6.89よりも大きい確 率は 1%以下であるので、 上記仮説は 1%水準で棄却される。 よって、 両方法による 共形質転換の確率には 水準で統計学的に有意な差がある。
実施例 4 タバコに導入した T—D N Aの遺伝
温室で栽培した形質転換植物より種子を採取した。 一部の個体の種子につい て、 エチルアルコールおよび次亜塩素酸ナトリゥムで表面殺菌した後、 Linsmaier and Skoog の無機塩類と 30g 1 のショ糖と寒天 0. 9!¾より成る培地に播種した。 発 芽した植物について、 上記の手法により G U S活性を調査するとともに、 下記の 手法により薬剤耐性を調査した。
小葉片 （3 3mm 程度） を切り取り、 Linsmaier and Skoog の無機塩類、 ショ 糖 30g 1 、 イン ドール酢酸 3mg l 、 ナフタレン酢酸 3mg 1 、 力イネチン O. lmg 1 、 カナマイシン 200mg/l 、 寒天 0. 9%より成る培地に置床した。 なお、 LBA4404 (PSB424) によって形質転換された植物の種子由来の植物については、 カナマイシ ンに代えてハイグロマイシン 50mg/nil を添加した培地を用いた。 薬剤耐性植物の 葉片はこの培地上でカルスを形成したが、 薬剤感受性植物の葉片はカルスを形成 せず枯死した。
LBA4404(pSB324) 、 LBA4404(pSB424) 、 または、 LBA4404(pSB124) と LBA4404 (PGA482) の混合菌によって形質転換され、 G U S活性を示した植物の種子由来の 植物については下記表 3に示す結果が得られた。
表 3 導入した難 I厨 I生および GU Sにっ ヽての次世 ί弋での分離 形 l激に用いた 系統番号
/ン CJ ヽン 7 "リソ 困
当代の GUS+ GUS+ GUS- GUS - 側样号） 翻生 驗 i生 耐 1生 翻生
LBA4404(pSB324) 324-6 45 ο 12 4
LBA4404(pSB324) 324-8 7 0 52 0
LBA4404(pSB324) 324-14 49 0 o 11
LBA4404(pSB324) 324-23 37 17 2 0
LBA4404(pSB324) 324-25 49 0 0 11
LBA4404(pSB324) 324-28 35 9 12 3
LBA4404(pSB324) 324-32 0 55 0 4
LBA4404(pSB324) 324-41 16 1 40 3
LBA4404(pSB324) 324-49 42 9 0 4
LBA4404(pSB424) 424-1 32 6 14 6
LBA4404(pSB424) 424-4 30 15 in 4
LBA4404(pSB424) 424-10 50 9 n 1
LBA4404(pSB424) 424-14 55 2 o 0
LBA4404(pSB424) 424-15 45 11 π 1
LBA4404(DSB424) 42 - 20 8 ο n 1
LBA4404(pSB424) 42^-30 QQ I fi 1 1
LBA4404(DSB424) 424-3? ϋϋ o π u π u
LBA4404(pSB424) 424-38 14 R
LBA4404(pSB424) 424-41 26 6 17
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-6 0 0 53 4
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-9 44 o 13
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-33 21 22 1 Ifi
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-40 32 0 π
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-53 24 23 0 q
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-63 38 6 50 0
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-64 30 5 35 4
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-66 34 14 13 3
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の! ^昆合 12482-77 84 5 1 1
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-101 52 0 28 1
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-108 13 2 72 7
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の？見合 12482-113 57 16 17 5
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-137 80 18 2 0
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合 12482-139 76 20 0 0
GUS+： GU S活性あり、 GUS-： GU
Figure imgf000028_0001
耐 I生：難隱あり、 翩生：靈隱なし 以上の結果がしめすように、 これらの植物には、 薬剤耐性遺伝子を含む T一 D N Aや G U S遺伝子を含む T一 D N Aが複数因子以上導入されていた場合もあ つた。
LBA4404(pSB324) によって形質転換され、 G U S活性を示した植物について は、 調査した 9個体中 5個体について、 少なくとも 1因子の G US遺伝子を含む T一 DNAが、 薬剤耐性遺伝子を含む T一 DN Aとは独立に遺伝し、 次世代にお いて薬剤耐性遺伝子を含まず、 G U S遺伝子を含む植物を得ることができた。
LBA4404(pSB424) によって形質転換され、 G U S活性を示した植物について は、 調査した 10個体中 10個体について、 少なくとも 1因子の GUS遺伝子を 含む T-DNAが、 薬剤耐性遺伝子を含む T-DN Aとは独立に遺伝し、 次世代 において薬剤耐性遺伝子を含まず、 G U S遺伝子を含む植物を得ることができ た。
LBA4404(pSB124) と LBA4404(pGA482) の混合菌よって形質転換され、 GUS活 性を示した植物については、 調査した 14個体中 10個体について、 少なくとも 1因子の G U S遺伝子を含む T— D N Aが、 薬剤耐性遺伝子を含む T— D N Aと は独立に 伝し、 次世代において薬剤耐性遺伝子を含まず、 GUS遺伝子を含む 植物を得ることができた。
なお、 LBA4404(pGA482- GUS) によつて形質転換され、 G U S活性を示した植物 の次世代には、 薬剤耐性遺伝子を含まず、 GUS遺伝子を含む植物はなかった。 また、 LBA4404(pGA482) によって形質転換された植物の次世代には G U S活性を 示す植物はなかった。
表 3の系統番号 324— 28、 424— 4、 424 - 30の形質転換体並びに その次世代の植物の葉より、 Komariら （Theor. Appl. Genet. 77; 547-552， 1989)の方法に従い DNAを抽出し、 制限酵素 Hind IIIで処理後、 Sambrookら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor, NY)の方法に従いサザン分析を行った。 その結果、 薬剤耐性かつ G US活性を示す 植物には両遺伝子が検出された。 薬剤耐性を示し、 GUS活性を示さない植物に は薬剤耐性遺伝子のみが検出された。 薬剤耐性を示さず、 GUS活性を示す植物 には GU S遺伝子のみが検出された。 また、 薬剤耐性と G US活性を共に示さな い植物にはどちらの遺伝子も検出されなかった。
実施例 5 イネの形質転換と共形質転換効率
イネ （品種月の光） の完熟種子を 70¾ エタノールに 1分間、 1%次亜塩素酸ナ卜 リウムに 30分間浸漬することによって消毒した後、 2N6 固体培地 （N6の無機塩類 およびビタ ミ ン類 （Chu C. C. Pro Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp. 43-50、 1978) 、 カザミノ酸 lg 1、 2， 4- D 2mg, 1 、 ショ糖 30g 1 、 ゲルライ ト 2g/l) に置床した。 約 3週間培養後、 形成された胚盤由来のカル スを 2N6 固体培地に移植し、 4〜7日経過したカルスを胚盤カルスとして用い た。
AB培地上で 3〜 1 0日間 2 8 で培養した LBA4404(pSB424) のコロニーを白金 耳でかきとり、 修正 AA培地 （AA主要無機塩類、 AAアミ ノ酸およびビタ ミ ン類 (Toriyamaら、 Plant Science 41 : 179-183、 1985) 、 MS微量塩類 (Murashige ら、 Physiol. Plant. 15 :473-497、 1962) 、 カザミノ酸 0. 5g, l、 ショ糖 0. 2M、 グ ルコース 0. 2M、 ァセ トシリ ンゴン 100 、 ρΗ5. 2 ) に懸濁し、 菌濃度を 1 x 1 0 9 細胞 Zmlに調整し接種に用いた。
胚盤カルスを滅菌水で洗浄後、 上述の菌液に 3〜1 0分間浸潰した。 浸漬処理 後、 ァセトシリンゴン、 グルコースとショ糖を、 修正 AA培地と同濃度で含む 2N6 固体培地に移植し、 2 5 °C、 暗黒下で 3日間培養した。 その後、 胚盤カルスをセ フオタキシム 250mg, l を含む滅菌水で洗浄した。
カルスをハイグロマイシン 50mg/lとセフオタキシム 250mg 1 を含む 2N6 固体培 地に移し、 3週間培養してハイグロマイシン耐性のカルスを選抜した。 得られた 耐性カルスを、 さらに、 ハイグロマイシン 100 mg 1とセフオタキシム 250mg 1 を 含む N6- 7培地 （N6無機塩類、 N6ビタミン類、 カザミノ酸 2g 1、 2, 4-D 1 mg 1、 6BA 0. 5mg 1 、 ソルビトール 30g 1 、 ショ糖 20g 1 、 ゲルライ ト 2g 1) で 2〜 3週間 培養した。 この培地で増殖したカルスをハイグロマイシン 50mg Ίとセフオタキシ ム 250rag 1 を含む個体再生用培地 N6S3 (1 2 N6主要無機塩類、 N6微量塩類、 N6ビ タミン類 （Chu 1978) 、 AAァミノ酸 （Toriyamaら、 1985) 、 カザミノ酸 lg 1、 ナ フタレン酢酸 0. 2mg l 、 力イネチン l. Omg 1 、 ゲルライ ト 3g 1) に移し、 ハイグ ロマイシン耐性植物を再生させた。 ハイグロマイシン耐性植物について、 上記の手法により G U S活性を検定した 後、 閉鎖系温室で栽培した。
ハイグロマイシン耐性植物は、 下記表 4に示すように供試したカルスの 1 2. 3〜44. 0%から得られた。 また、 下記表 5に示すように、 ハイグロマイシン 耐性植物のうち 42〜5 1 %が G US活性を示した。
表 4 共形質転換によるハイグロマイシン
耐性個体の選抜効率 カルス数 供試 耐 再分化 選抜効率
カルス （a) カルス カルス （b) (b/a ： %)
227 40 28 1 2. 3
398 90 75 1 8. 8
220 1 1 6 97 44. 0
324 77 72 22. 2
表 5 ハイグロマイシン耐性個体に
おける G U S活性 供試薬剤 G U S活性を %
耐性個体数 示す個体数
9 7 4 1 4 2
1 7 6 8 2 4 7
1 2 6 6 0 4 8
1 5 0 7 6 5 1 ハイグロマイシン耐性かつ G U S活性を示した個体の葉より Komariら （Theor. Appl. Genet. 77 ; 547-552, 1989)の方法に従い D N Aを抽出し、 制限酵素 Hind I I Iで処理後ヽ Sambrookら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor, NY)の方法に従いサザン分析を行った。 その結果、 各 個体ともハイグロマイシン耐性遺伝子、 G U S遺伝子の存在が確認された （表 6 ) o .
表 6 形質転換体のサザン分析結果および次世代における
導入遺伝子の分離 形質 サザン分析 次世代
転換 導入遺伝子 植物数
体の コピー数 GU S + GU S + GU S - GU S - 系統 HPT * GUS 耐性 感受性 耐性 感受性
1 1 1 44 1 1 12 3
2 1一 2 2-3 4 1 22 2 5
3 2- 3 2 - 3 67 1 2 0
4 4 2 68 2 6 0
5 1 2 51 14 0 5
6 2 1 52 0 0 1 8
7 1 1 51 0 0 1 9
8 1 2 34 1 1 17 7
9 2 3-4 14 43 4 9
10 2 1 52 0 14 3
1 1 1 2- 3 46 17 0 7
12 2 2 51 0 0 1 9
* H P T： ハイグロマイシン耐性遺伝子
実施例 6 イネに導入した T— DNAの遺伝
温室で栽培した形質転換植物より種子を採取した。 一部の個体の種子につい て、 エチルアルコール及び次亜塩素酸ナトリゥムで表面殺菌した後、 N 6ホルモ ンフリーの培地に播種した。 発芽発根した種子について、 上記の手法により G U S活性を調査すると共に、 下記の手法によりハイグロマイシン耐性を調査し た。
幼根を 5〜1 0mmの長さで切り取り、 ハイグロマイシン 5 Omg/ 1を含む 2 N 6培地に置床した。 ハイグロマイシン耐性の個体の幼根断片はカルスを形成 したが、 ハイグロマイシンに感受性の個体の根はカルスを形成せず座死した。
LBA4404(pSB424) で形質転換され、 G U S活性及びハイグロマイシン耐性を示 した植物の種子由来の次世代植物について表 6に示す結果が得られた。
以上の結果が示すように、 これらの植物には、 タバコにおけるのと同様に、 薬 剤耐性遺伝子を含む T— D N Aや G U S遺伝子を含む T— D N Aが複数因子以上 導入されていた場合もあった。 また、 遺伝因子数はサザン分析により得られた導 入遺伝子のコピー数と一致するものと、 少ないものが認められた。 遺伝因子数 力、 サザン分析によるコピー数より少ないものについては、 複数の遺伝子が同一 遺伝子座に導入されたことを示すものと考えられる。
LBA4404(pSB424) によって形質転換され、 G U S活性及びハイグロマイシン耐 性を示した植物については、 調査した 1 2個体中 8個体について、 少なくとも 1 因子の G U S遺伝子を含む T一 D N Aが、 薬剤耐性遺伝子を含む T一 D N Aとは 独立に遺伝し、 次世代において薬剤耐性遺伝子を含まず、 G U S遺伝子を含む植 物を得ることができた。
形質転換体の次世代植物における導入遺伝子の存在を確認するため、 表 6の各 系統の個体の次世代の植物を各表現型 （G U S +かつハイグロマイシン耐性、 G U S +かつハイグロマイシン感受性、 G U S—かつハイグロマイシン耐性、 G U S—かつハイグロマイシン感受性） に分けてサザン分析を行った。 その結 果、 ハイグロマイシン耐性遺伝子及び G U S遺伝子が表現型と一致するかたちで 存在していることが確認された。
産業上の利用可能性
上述のように、 本発明によれば、 高い効率で所望の遺伝子が導入された再生し た形質転換植物を作成し、 次世代において該所望の遺伝子を含むが、 選択マ— 力一として用いる薬剤耐性遺伝子を含まな t、形質転換植物を得ることが可能にな るので、 本発明は、 所望の形質を有する有用な新規植物を作出する上で有用であ り、 農業上有用である。

Claims

請求の範囲
1. 下記第 1の T一 DNA(l) と下記第 2の T— DNA(2) によって植物細胞を 共形質転換し、 薬剤耐性となった細胞を選択することを特徴とする、 ァグロパク テリウム属細菌を介する植物の形質転換方法。
(1) 植物中で機能する、 上記薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子を含む第 1の T 一 DN A。
(2) 下記ハイプリ ッ ドベクタ一中に含まれ、 植物に導入すべき所望の DN A断片 が内部に揷入された第 2の T— DNA。
上記ハイブリ ツ ドベクタ一は、 下記ァクセプタ一ベクタ一と下記中間ベクター との、 ァグロパクテリゥム属細菌中での相同組換えによって調製されたものであ る。
上記ァクセプタ一ベクタ一は、 少なくとも、
(a) ァグロパクテリゥム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機 能を有する DN A領域と、
(b) Agrobacterium tumefaciens の Tiプラスミ ド pTiBo542のヴィルレンス領 域の virBおよび virG遺伝子を含む D N A領域と、
(c) 下記中間ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロバクテ リウム属細菌中で相同組換えの可能な DN A領域
を含むものである。
上記中間べクターは、 少なくとも、
(i) 大腸菌中では機能するが、 ァグロパクテリゥム属細菌中では機能しないプ ラスミ ド複製機能を有する DN A領域と、
(ii)上記ァクセプタ一ベクタ一の一部と相同であり、 この部分を介してァグロ バクテリウム属細菌中で相同組換えの可能な D N A領域と、
(iii) 上記第 2の T— DNAの少なくとも一部を構成する D N A領域 を含むものである。
2. 上記第 1の T一 D N Aと上記第 2の T— DNAとは単一の上記ハイブリ ッ ド ベクター中に含まれる請求項 1記載の方法。
3. 上記第 1の T— DNAは、 上記ァクセプターベクター中に含まれる請求項 2 記載の方法。
4. 上記第 1の T— DNAと、 上記第 2の T一 DN Aは、 上記ハイプリッ ドべク ター上で、
(1) ァグロパクテリゥム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機能 を有する DNA領域と、
(2) Agrobacterium tumefaciens の Tiプラスミ ド pTiBo542のヴィルレンス領域 の virBおよび virG遺伝子を含む D N A断片、
によって互いに隔てられている請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載の方法。
5. 上記第 1の T一 D N Aと、 上記ハイブリッ ドベクタ一は異なるァグロバクテ リゥム属細菌に含まれており、 この 2種のァグロパクテリゥム属細菌を混合して 上記植物を形質転換することを特徴とする請求項 1記載の方法。
6. 上記 pTiBo542のヴィルレンス領域の virBおよび virG遺伝子を含む DN A領域 は、 1180542の15.2 kb Kpnl断片である請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載 の方法。
7. 植物に導入すべき上記所望の DNA断片は、 上記中間ベクター中の、 上記第 2の Τ— D Ν Αの少なくとも一部を構成する D N A領域中に制限酵素認識部位を 利用して揷入されて L、る請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の方法。
8. 上記中間ベクターは、 上記第 2の T一 DN Aの全域を含む請求項 1ないし 7 のいずれか 1項に記載の方法。
9. T— DNAを含まないが、 T一 DN Aの植物への転移に必要なヴィルレンス 領域を含む T iプラスミ ド又は R iプラスミ ドに由来するプラスミ ドとともに上 記ハイプリッ ドベクタ一を含むァグロパクテリゥム属細菌を上記植物に感染させ ることを含む請求項 1ないし 8のいずれか 1項に記載の方法。
10. 上記薬剤耐性遺伝子は、 カナマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン 耐性遺伝子である請求項 1ないし 8のいずれか 1項に記載の方法。
1 1. 上記第 1の T一 DNAはプラスミ ド上にあり、 T— DNAを含まないが T -DNAの植物への転移に必要なヴィルレンス領域を含むことを特徵とする Tiま たは Riプラスミ ドに由来する第 2のプラスミ ドとともに上記第 1の T— DNAを 含むァグロバクテリゥム属細菌を感染させることを含む請求項 5記載の方法。
12. 上記ァクセプタ一ベクターは pSB3または pSB4である請求項 1ないし 4のい ずれか 1項に記載の方法。
13. 上記ァクセプターベクターは pSBlまたは pTOK162 である請求項 5又は 10 記載の方法。
14. 上記中間ベクターは、 pSB21 、 SB22 、 pSB24 、 ρΤΟΚΠΟ 、 pYS15K ΡΤΟΚ235、 ρΤΟΚ245、 ρΤΟΚ246又はこれらの誘導体である請求項 1ないし 1 2の いずれか 1項記載の方法。
15. 請求項 1ないし 13のいずれか 1項に記載の方法により形質転換した植物 を栽培し、 次世代において、 植物に導入すべき上記所望の DNA断片を有するが 上記薬剤耐性遣伝子を有さな L、植物を得る、 形質転換植物の取得方法。
16. (1) 植物中で機能する薬剤耐性遺伝子を含む第 1の T— DNAと、
(2) 制限酵素認識部位を有する第 2の T— DN Αとを含むハイプリ ッ ドべク ター。
該ハイプリ ッ ドベクタ一は、 下記ァクセプターべクタ一と下記中間ベクターと の、 ァグロバクテリゥム属細菌中での相同組換えによって調製されたものであ る
上記ァクセプタ一ベクターは、 少なくとも、
(a) ァグロパクテリゥム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機 能を有する DNA領域と、
( b ) Agrobacterium tumefaciens の Tiプラスミ ド pTiBo542のヴィノレレンス領 域の virBおよび virG遺伝子を含む D N A領域と、
(c) 下記中間ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロバクテ リウム属細菌中で相同組換えの可能な DN A領域
を含むものである。
上記中間べクタ一は、 少なくとも、
(i) 大腸菌中では機能するが、 ァグロバクテリウム属細菌中では機能しないプ ラスミ ド複製機能を有する DNA領域と、
(ii)上記ァクセプタ一ベクターの一部と相同であり、 この部分を介してァグロ バクテリウム属細菌中で相同組換えの可能な D N A領域と、 (iii) 上記第 2の T一 D N Aの少なくとも一部を構成する D N A領域 を含むものである。
1 7 . 上記第 1の T一 D N Aは、 上記ァクセプターベクター中に含まれる請求項 1 5記載のハイプリッ ドベクタ一。
1 8 . 上記第 1の T一 D N Aと、 上記第 2の T— D N Aは、 上記ハイブリッ ドべ クタ一上で、
( 1 ) ァグロパクテリゥム属細菌中および大腸菌中で有効なプラスミ ド複製機能 を有する D N A領域と、
( 2 ) Agrobacterium tumefaciens の Tiプラスミ ド pTiBo542のヴィルレンス領域 の virBおよび virG遺伝子を含む D N A断片、
によって互いに隔てられている請求項 1 5又は 1 6記載のハイプリ ッ ドべク ター。
1 9 . 上記 pTiBo542のヴィルレンス領域の virBおよび virG遺伝子を含む D N A領 域は、 1180542の15. 2 kb Kpnl断片である請求項 1 5ないし 1 7のいずれか 1項 に記載のハイブリッ ドベクター。
2 0 . 上記薬剤耐性遺伝子は、 カナマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン 耐性遺伝子である請求項 1 5ないし 1 8のいずれか 1項に記載のハイプリッ ドべ クタ一。
2 1 . 上記ァクセプターべクタ一は pSB3または pSB4である請求項 1 5ないし 1 9 のいずれか 1項に記載のハイプリッ ドベクター。
2 2 . 上記中間べクタ—は、 pSB21 、 pSB22 、 pSB24 、 ρΤΟΚΠΟ 、 pYS15K PTOK235、 pT0K245、 pTOK246 又はこれらの誘導体である請求項 1 5ないし 2 0 のいずれか 1項記載のハイプリ ッ ドベクタ一。
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