PT687730E

PT687730E - Método de transformação de plantas e vector para esse fim

Info

Publication number: PT687730E
Application number: PT95902308T
Authority: PT
Inventors: Toshihiko Komari Inc; Yasuhito Saito Inc; Yukoh Hiei Inc
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 2007-07-02
Also published as: US5731179A; DK0687730T3; JP3102888B2; EP0687730A1; DE69434972D1; AU1121395A; EP0687730B1; CA2155570A1; WO1995016031A1; ES2287933T3; ATE362527T1; CA2155570C; EP0687730A4; DE69434972T2

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS E VECTOR PARA ESSE FIM"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um método de transformação de plantas e a um vector para esse fim.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Os métodos de introdução de genes estranhos (métodos de transformação) em plantas superiores classificam-se, em grande medida, em métodos de introdução directa e métodos através de bactérias pertencendo ao Agrobacterium. Os primeiros incluem métodos em que é utilizada a estimulação eléctrica (método de electroporação e método de electroinjecção); métodos em que se realizam tratamentos químicos tais como tratamento com PEG; e métodos em que é empregue um canhão de partículas. 0 primeiro é amplamente utilizado na transformação de monocotiledóneas às quais o segundo método é raramente aplicado. Os segundos são os métodos em que são utilizadas as capacidades de bactérias pertencendo ao género Agrobacterium, tais como Agrobacterium tumefaciens e A. Rhizogenes, para transformação de plantas superiores. Os segundos métodos são métodos excelentes pelos quais fragmentos de DNA possuindo tamanhos relativamente grandes e tendo extremidades definidas podem ser eficientemente introduzidos em plantas superiores, que não requerem técnicas 1 especiais de cultura, tal como a técnica de cultura de protoplastos.

Os métodos de transformação são indispensáveis aos estudos de engenharia genética e biologia molecular de plantas superiores e exige-se um método pelo qual um dado fragmento de DNA seja eficientemente introduzido em células vegetais e pelo qual uma planta contendo o fragmento de DNA seja eficientemente obtida. Na introdução de um gene é necessário seleccionar as células vegetais nas quais o gene estranho é introduzido, das células vegetais nas quais o gene estranho não é introduzido. Visto que o número das últimas células é muito maior, normalmente é necessário utilizar um gene que possa ser facilmente detectado. Os marcadores de selecção mais amplamente utilizados são os genes de resistência a fármacos. Exemplos destes incluem genes de resistência a antibióticos, tais como o gene de resistência à canamicina e o gene de resistência à higromicina; e genes de resistência a herbicidas, tais como o gene de resistência Basta e o gene de resistência Roundup.

Nos casos em que é utilizado um gene de resistência a fármacos como um marcador de selecção, um fragmento de DNA de interesse a ser introduzido numa planta e o gene de resistência a fármacos são ligados, os genes ligados são introduzidos nas plantas, seleccionam-se as células resistentes a fármacos e as plantas transformadas são obtidas a partir das células resistentes aos fármacos. Nas plantas transformadas obtidas deste modo, o fragmento de DNA de interesse ligado ao gene de resistência a fármacos é, igualmente, introduzido simultaneamente. 2

Contudo, este método possui os dois problemas seguintes: 1. Apesar do facto de o marcador de selecção ser necessário apenas na introdução do gene, o marcador de selecção acompanha sempre o fragmento de DNA de interesse introduzido durante a etapa de crescimento subsequente e, até mesmo, nas plantas de gerações subsequentes. Deste modo, obtêm-se plantas transformadas contendo o gene desnecessário. Nos casos em que o método de transformação é empregue na selecção de colheitas, visto que as variedades que não contenham um tal gene desnecessário terão melhor reputação, a existência do gene desnecessário constitui um grande problema. Para além disso, quando outro fragmento de DNA é introduzido nas plantas transformadas, é necessário utilizar outro marcador de selecção, o que é inconveniente. Trata-se igualmente de um grande problema. 2. Visto que a operação para ligar o marcador de selecção e o fragmento de DNA de interesse a ser introduzido na planta é necessária, é requerida uma etapa adicional na construção do gene a ser introduzido.

Para evitar estes problemas, nos métodos de introdução directa foi desenvolvido e amplamente utilizado o denominado método de co-transformação (Shimamoto et al., Nature 338:274-276, 1989) . Neste método, o DNA do gene de resistência a fármacos enquanto marcador de selecção e um fragmento de DNA de interesse a ser introduzido em plantas são meramente misturados sem ligação e a mistura é introduzida nas plantas. Nas plantas seleccionadas de acordo com a resistência a fármacos, algumas plantas contêm o gene de resistência a fármacos e o fragmento de DNA de interesse a ser introduzido nas plantas. Ao controlar a 3 razão de mistura dos dois tipos de DNA, na maior parte das vezes, a percentagem das plantas resistentes a fármacos que contêm os dois tipos de DNA não é inferior a 50%.

Visto que os dois tipos de fragmentos de DNA introduzidos deste modo não estão ligados, podem ser herdados e segregados independentemente na geração seguinte. Por conseguinte, na geração seguinte, podem obter-se plantas transformadas que contêm o fragmento de DNA de interesse introduzido, sem conter o marcador de selecção. O fragmento de DNA introduzido em plantas por bactérias pertencendo ao género Agrobacterium é normalmente denominado T-DNA (DNA de transferência) que é caracterizado por possuir sequências de repetição em ambas os seus terminais, denominados extremidade direita e extremidade esquerda, respectivamente. Um fragmento de DNA artificial constituído pelas sequências extremidade esquerda e direita e por um DNA de interesse pode ser igualmente denominado um T-DNA. Um número de bactérias de tipo selvagem pertencendo ao género Agrobacterium contém dois tipos de T-DNA e células vegetais transformadas com tais bactérias contêm os dois tipos de DNA, de modo que o fenómeno de co-transformação per se é conhecido desde há muito.

Contudo, a introdução de dois tipos de T-DNA não é mencionada na técnica fundamental do método de transformação através de bactérias Agrobacterium (Pedido de Patente Japonesa Pública (Kokai) N° 60-70080; Publicação de Patente Japonesa (Kokoku) N° 2-58917; Herrera-Estrella et al., The EMBO Journal 6:987-995, 1983; Bevan et al., Nature 304:184-187, 1983; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 80:4803-4807, 1983) e na 4 técnica de transformação aperfeiçoada altamente eficiente (Komari, Plant Cell Reports 9:303-306, 1990). A introdução simultânea de dois tipos de T-DNA inclui: 1. casos em que um primeiro T-DNA e um segundo T-DNA estão contidos na mesma célula bacteriana de Agrobacterium; e 2. casos em que o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA estão contidos em diferentes células bacterianas de Agrobacterium e é utilizada uma mistura dos dois tipos de células bacterianas de Agrobacterium.

Verificou-se que em qualquer caso, os dois tipos de T-DNA transformados em plantas herdaram e segregaram independentemente na geração seguinte (Depicker et al., Mol. Gen. Genet. 201:477-484, 1985; de Framond et al., Mol. Gen. Genet. 202:125-131, 1986; McKnight et al., Plant Molecular Bíology 8:439-445, 1987).

Contudo, nestas técnicas convencionais, a eficiência na obtenção de plantas regeneradas, nas quais os dois tipos de T-DNA são introduzidos, é baixa. Por conseguinte, a co-transformação através de bactérias de Agrobacterium não é amplamente empregue.

Hatamoto et al., divulgam em Plant Cell Reports, Vol. 9, N° 2 (1990) a co-transformação de explantes de folha de tabaco com Agrobacterium rhizogenes albergando o pRil855 e o vector binário pBinl9. Não divulgam a utilização de um gene de resistência a fármacos para selecção. 5 A. Depicker et al. descrevem em Mol. Gen. Genet., Vol. 201, N° 3, p. 477-484 uma transformação utilizando um vector híbrido contendo dois T-DNA. Os protoplastos de tabaco são infectados por co-cultivação com duas estirpes diferentes de agrobactérias transportando plasmídeos Ti com T-DNA distintos ou uma estirpe bacteriana transportando dois T-DNA no mesmo plasmídeo Ti. 0 vector híbrido divulgado nesta não contém as regiões de virulência VirB e VirG do plasmídeo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Um objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um método de transformação de uma planta pelo qual uma planta transformada regenerada, possuindo um gene desejado introduzido pode ser preparada com uma eficiência elevada, que possibilita a obtenção de uma planta transformada na geração seguinte que contém o gene desejado mas não contém o gene de resistência a fármacos utilizado como marcador de selecção.

Os presentes requerentes estudaram intensivamente para verificar que o objectivo mencionado acima pode ser alcançado introduzindo, por co-transformação em plantas superiores, um primeiro T-DNA contendo um gene de resistência a fármacos e um segundo T-DNA dentro do qual é inserido um fragmento de DNA de interesse a ser introduzido na planta.

Ou seja, a presente invenção proporciona um método de transformação de uma planta através de uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, compreendendo a co-transformação de

células vegetais com um primeiro T-DNA (1) e um segundo T-DNA 6 (2); e seleccionando as células que adquiriram resistência a fármacos; o primeiro T-DNA (1) contendo um gene conferindo a resistência a fármacos, que funciona na planta; o segundo T-DNA (2) contendo um fragmento de DNA desejado a introduzir na planta, o segundo T-DNA (2) estando contido num vector híbrido; o vector híbrido sendo preparado por recombinação homóloga entre um vector aceitador e um vector intermediário na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o vector aceitador contendo, pelo menos, (a) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmídeo na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e Escherichia coli, (b) uma região de DNA contendo o gene vírB e o gene virG na região de virulência do plasmídeo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefadens, e (c) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do vector intermediário, que é submetida a recombinação homóloga na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o vector intermediário contendo, pelo menos, 7 (i) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmideo em Escherichia coli, que não funciona na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, (ii) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do vector aceitador, que é submetida a recombinação homóloga na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, e (iii) uma região de DNA que constitui, pelo menos, uma parte do segundo T-DNA. A presente invenção proporciona igualmente um vector hibrido compreendendo um primeiro T-DNA contendo (1) um gene conferindo uma resistência a fármacos, que funciona numa planta, e (2) um segundo T-DNA possuindo um sitio de restrição; o vector hibrido sendo preparado por recombinação homóloga entre um vector aceitador e um vector intermediário numa bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o vector aceitador contendo, pelo menos, (a) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmideo na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e Escherichia coli, (b) uma região de DNA contendo o gene virB e o gene virG na região de virulência do plasmideo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens, e (c) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do vector intermediário, que é submetida a recombinação homóloga na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o vector intermediário contendo, pelo menos, (i) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmideo em Escherichia coli, que não funciona na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, (ii) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do vector aceitador, que é submetida a recombinação homóloga na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, e (iii) uma região de DNA que constitui, pelo menos, uma parte do segundo T-DNA.

Pela presente invenção, plantas transformadas regeneradas possuindo um gene desejado introduzido podem ser preparadas com uma eficiência elevada e podem obter-se plantas transformadas na geração seguinte que contêm o gene desejado mas não contêm o gene de resistência a fármacos utilizado como marcador de selecção. 9

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra esquematicamente o fenómeno em que um vector híbrido é preparado a partir de um vector aceitador e de um vector intermediário por recombinação homóloga em células de uma bactéria pertencendo ao género

Agrobâcterium; A Fig. 2 mostra a constituição de pSB21; A Fig. 3 mostra a constituição de pSB22; A Fig. 4 mostra a constituição de pSB24; A Fig. 5 mostra a constituição de pNBl; A Fig. 6 mostra a constituição de pSBl; A Fig. 7 mostra a constituição de pSB3; A Fig. 8 mostra a constituição de pSB4; A Fig. 9 mostra a constituição de pNB124 preparado por recombinação homóloga de pNBl e pSB24; A Fig. 10 mostra a constituição de pSB124 preparado por recombinação homóloga de pSBl e pSB24; A Fig. 11 mostra a constituição de pSB324 preparado por recombinação homóloga de pSB3 e pSB24; 10 A Fig. 12 mostra a constituição de pSB424 preparado por recombinação homóloga de pSB4 e pSB24; A Fig. 13 mostra a constituição de pGA482-GUS; e A Fig. 14 mostra a constituição de pTOK253.

Os símbolos de referência mostrados nos desenhos mencionados acima representam os seguintes significados: AV: vector aceitador; IV: vector intermediário; HV: vector híbrido; HR: um fragmento contido tanto no vector aceitador como no vector híbrido, a recombinação homóloga ocorre entre sequências de DNA contidas neste fragmento; ORI: origem de replicação de ColEl; COS: sítio cos de um fago λ; SP: gene de resistência à espectinomicina que funciona em Escherichia coli e numa bactéria pertencendo ao género

Agrobacterium; TC: gene de resistência à tetraciclina que funciona em Escherichia coli e numa bactéria pertencendo ao género

Agrobacterium; 11 ΚΑΝ: gene de resistência à canamicina que funciona em Escherichia coli e numa bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; NPT: gene de resistência à canamicina ao qual é ligado o promotor NOS que funciona em células vegetais. Este gene confere igualmente um baixo grau de resistência a Escherichia coli e a uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium. HPT: gene de resistência à higromicina ao qual é ligado o promotor 35S que funciona em células vegetais. Este gene confere igualmente um baixo grau de resistência a uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium. GUS: gene GUS ao qual é ligado o promotor 35S que funciona em células vegetais. I-GUS: gene GUS contendo um intrão, ao qual é ligado o promotor 35S que funciona em células vegetais. T-DNA: um fragmento de DNA transferido de uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium para plantas; BR: sequência da extremidade direita de T-DNA; BL: sequência da extremidade esquerda de T-DNA;

Kpnl de 15,2 kb: fragmento Kpnl possuindo um tamanho de 15,2 kb proveniente da região de virulência de pTiBo542; 12 B: gene virB de pTiBo542; G: gene virG de pTiBo542;

MELHOR MODO DE EXECUTAR A INVENÇÃO A planta que pode ser transformada pelo método da presente invenção pode ser qualquer planta que seja infectada com uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e seja, desse modo, transformada. Exemplos de uma tal planta incluem plantas superiores tais como tabaco, arroz, tomate, batata, petúnia, milho, colza e semelhantes, embora os exemplos não estejam restringidos a estas. 0 método de transformação de plantas superiores através de uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium per se é bem conhecido na técnica. Exemplos da bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, que podem ser empregues para a transformação incluem Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes e semelhantes. Estas bactérias Agrobacterium são bactérias do solo que possuem capacidades para transformar células vegetais e produzir tumores. Estas bactérias contêm um plasmideo indutor de tumores (plasmideo Ti) . São regiões importantes no plasmideo Ti a região de virulência que participa na transformação e a região de T-DNA onde estão contidos os genes indutores de tumor transferidos para as células vegetais. Na região de T-DNA, as regiões indispensáveis à transferência dos genes indutores do tumor são as regiões em ambas as suas extremidades, que são denominadas sequências de extremidade. Deste modo, em métodos convencionais de transformação de plantas através da bactéria

Agrobacterium, a planta é infectada com uma bactéria 13

Agrobacterium que contém um plasmídeo contendo um T-DNA no qual o gene desejado é inserido. Também no método da presente invenção, o gene de resistência a fármacos e o gene desejado a ser introduzido em plantas são respectivamente inseridos em T-DNA.

No método da presente invenção, uma planta é co-transformada com um primeiro T-DNA contendo um gene de resistência a fármacos utilizado como marcador de selecção e um segundo T-DNA dentro do qual é inserido o fragmento de DNA que se deseja introduzir na planta. Enquanto gene de resistência a fármacos contido no primeiro T-DNA, são preferidos o gene de resistência à canamicina e o gene de resistência à higromicina, embora o gene de resistência a fármacos não esteja restringido a estes. Entre o primeiro e o segundo T-DNA no vector híbrido descrito a seguir existe, pelo menos, o segundo T-DNA. 0 vector híbrido é preparado por recombinação homóloga de um vector aceitador e de um vector intermediário, cuja recombinação homóloga ocorre numa bactéria pertencendo ao género Agrobacterium. 0 vector aceitador é um plasmídeo que é replicado tanto na bactéria Agrobacterium como na Escherichia coli. 0 vector aceitador contém um fragmento de DNA que é homólogo de um fragmento de DNA no vector intermediário. Utilizando este fragmento de DNA, o vector aceitador pode incorporar o vector intermediário por recombinação homóloga numa bactéria Agrobacterium. 0 vector intermediário é um plasmídeo que é replicado na Escherichia coli mas não é replicado por si só numa bactéria Agrobacterium. 0 vector intermediário contém um fragmento de DNA que é homólogo do fragmento de DNA contido no vector aceitador. 0 vector intermediário pode ser incorporado no vector aceitador por recombinação homóloga através do fragmento 14 de DNA. Depois de incorporado no vector aceitador, o vector intermediário pode ser mantido na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium. 0 vector aceitador mencionado acima contém (a) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmideo na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e Escherichia coli, (b) uma região de DNA contendo o gene virB e o gene virG na região de virulência do plasmideo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens, e (c) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do vector intermediário, que é submetida a recombinação homóloga na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium. 0 plasmideo Ti pTiBo542 é um plasmideo Ti contido no Agrobacterium tumefaciens A281 (ATCC 37349), que é conhecido pela elevada capacidade da sua região de virulência (Hood et al., Bio/Technol. 2:702-709, 1984; Hood et al., J. Bacteriol., 168:1283-1290, 1986; Komari et al., J. Bacteriol., 166:88-94, 1986; Jin et al., J. Bacteriol. 169:4417-4425, 1987; e Komari, Plant Science, 60:223-229, 1989) . Os genes virB e virG na região de virulência de pTiBo542 são conhecidos e estão descritos nestas referências. Visto que os genes virB e virG na região de virulência de pTiBo542 estão contidos no fragmento de DNA possuindo um tamanho de 15,2 kb, que é obtido pelo tratamento de pTiBo542 com uma enzima de restrição ΚρηI, este fragmento também pode ser utilizado na presente 15 invenção. Os vectores aceitadores per se contendo os acima mencionados (a) , (b) e (c) são conhecidos e descritos, por exemplo, no Pedido de Patente Japonesa Pública (Kokai) N° 4-222527 e documento EP-A-0504869.

Por outro lado, o vector intermediário contém (i) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmídeo em Escherichia coli, que não funciona na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, (ii) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do vector aceitador, que é submetida a recombinação homóloga na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, e (iii) uma região de DNA que constitui, pelo menos, uma parte do segundo T-DNA.

Embora uma parte do acima mencionado segundo T-DNA possa estar contida no acima mencionado vector aceitador, é preferidoque todo o segundo T-DNA esteja contido no vector intermediário, dado que a eficiência de introdução do fragmento de DNA desejado na planta é elevada. 0 fragmento de DNA desejado que deve ser introduzido na planta pode, de um modo preferido, ser inserido no segundo T-DNA no vector intermediário utilizando um sitio de restrição. Os vectores intermediários per se contendo os acima mencionados (i), (ii) e (iii) são conhecidos e estão descritos, por exemplo, no Pedido de Patente Japonesa Pública (Kokai) N° 4-222527 e documento EP-A-0504869. A recombinação homóloga entre o vector aceitador descrito acima e o vector intermediário acima descrito pode ser efectuada 16 por um método conhecido (Herrera-Esterella L. et al., EMBO J. 2:987-995, 1983; Horsch R.H. et al., Science 223:496-498, 1984). 0 acima descrito primeiro T-DNA pode existir no vector híbrido, contendo o acima descrito segundo T-DNA ou noutro plasmídeo. No segundo caso, o vector híbrido e o outro vector podem estar contidos na mesma célula da bactéria Agrobacterium ou em células separadas da bactéria Agrobacterium (método de duas estirpes). Contudo, visto que a probabilidade de a célula de resistência a fármacos seleccionada também conter o segundo T-DNA ser significativamente superior no caso em que o primeiro e segundo T-DNA existem num único vector híbrido, prefere-se que o primeiro T-DNA também exista no vector híbrido. Para além disso, surpreendentemente, mesmo se o primeiro e segundo T-DNA estiverem localizados num único vector, estes são introduzidos independentemente nas plantas e podem ser segregados geneticamente na geração seguinte. 0 método para co-transformar eficientemente as plantas com T-DNA localizados num único vector foi desenvolvido pela primeira vez pelos presentes requerentes e o facto de poderem ser geneticamente introduzidos independentemente em plantas a uma frequência elevada foi verificado pela primeira vez pelos presentes requerentes.

Nos casos onde o primeiro T-DNA existe no vector híbrido, para aumentar a probabilidade do primeiro e segundo T-DNA serem geneticamente introduzidos independentemente em plantas, prefere-se que a distância entre o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA seja grande. Para o efeito, o primeiro T-DNA provém, de um modo preferido, do vector aceitador. Para além disso, para o efeito, prefere-se que o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA estejam separados no vector híbrido por 17 (1) a região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmideo na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e Escherichia coli, e (2) a região de DNA contendo o gene virB e o gene virG na região de virulência do plasmideo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens. 0 vector hibrido pode ser introduzido na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium por métodos conhecidos, tal como o método de cruzamento triplo de bactérias (Ditta G. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:7347-7351, 1980).

Enquanto bactéria pertencendo ao género Agrobacterium que é utilizada para a transformação de plantas, podem ser empregues aquelas que são convencionalmente utilizadas para o efeito. Ou seja, podem ser empregues, de um modo preferido, aquelas que possuem um plasmideo proveniente do plasmideo Ti ou plasmideo Ri, que não contenham T-DNA mas que contenham a região de virulência necessária para a transferência de T-DNA para plantas. Um exemplo de uma tal bactéria é a Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al., Nature, 303:179-180, 1983), embora não restringido a esta. Uma tal bactéria Agrobacterium à qual o acima mencionado vector hibrido ou um plasmideo contendo o primeiro T-DNA (no caso do método de linha dupla) é utilizada para a transformação.

Portanto, a planta é transformada utilizando a bactéria Agrobacterium na qual é introduzido o vector hibrido ou um plasmideo contendo o primeiro T-DNA (no caso do método de duas estirpes). O que pode ser alcançado por cultura de células vegetais tais como fragmentos de cotilédones da planta num meio 18 líquido contendo a bactéria Agrobacterium. No caso do método de duas estirpes, as células vegetais são cultivadas num meio líquido contendo os dois tipos de células de Agrobacterium. 0 método de transformação per se é conhecido e está descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Japonesa Pública (Kokai) N° 4-222527 e documento EP-A-0504869.

Entre as células vegetais submetidas ao tratamento de transformação, são seleccionadas as células que adquiriram a resistência a fármacos em virtude do gene de resistência a fármacos contido no primeiro T-DNA. As plantas completas são então regeneradas a partir destas células de acordo com um método convencional.

As plantas obtidas deste modo podem conter igualmente o segundo T-DNA com uma probabilidade considerável. Nos Exemplos a seguir, nos casos em que o primeiro e o segundo T-DNA estão localizados no mesmo vector híbrido, não menos de cerca de 50% das plantas obtidas continham igualmente o segundo T-DNA, e até mesmo no caso do método de linha dupla, cerca de 35% das plantas obtidas continham igualmente o segundo T-DNA.

Na maioria das plantas transformadas contendo o primeiro e o segundo T-DNA, confirmou-se que o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA são herdados independentemente. De um modo mais particular, nos Exemplos a seguir, a percentagem das plantas transformadas nas quais se confirmou que o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA são herdados independentemente, corresponde a 79% nos casos em que o primeiro e o segundo T-DNA existem no único vector híbrido, ou 71% no caso do método de duas estirpes. Por conseguinte, pelo cultivo destas plantas transformadas, as 19 plantas que contêm o segundo T-DNA mas não contêm o primeiro T-DNA podem ser obtidas na geração seguinte. A presente invenção proporciona igualmente um vector híbrido compreendendo um primeiro T-DNA contendo (1) um gene conferindo uma resistência a fármacos, que funciona numa planta, e (2) um segundo T-DNA possuindo um sítio de restrição; o vector híbrido sendo preparado por recombinação homóloga entre um vector aceitador e um vector intermediário numa bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o vector aceitador contendo, pelo menos, (a) uma região de DNA possuindo uma função de replicaçao de um plasmídeo na bactéria pertencendo ao género

Agrobacterium e Escherichia coli, (b) uma região de DNA contendo o gene virB e o gene virG na região de virulência do plasmídeo tipTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens, e (c) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do vector intermediário, que é submetida a recombinação homóloga na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o vector intermediário contendo, pelo menos, 20 (i) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmideo em Escherichia coli, que não funciona na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, (ii) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do vector aceitador, que é submetida a recombinação homóloga na bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, e (iii) uma região de DNA que constitui, pelo menos, uma parte do segundo T-DNA.

Este vector híbrido é o mesmo que o vector híbrido empregue no método descrito acima de acordo com a presente invenção, com a excepção de que o fragmento de DNA desejado não foi inserido no segundo T-DNA. Após inserção do fragmento de DNA desejado no segundo T-DNA utilizando o sítio de restrição neste, o vector híbrido resultante pode ser utilizado como o vector híbrido acima descrito.

Exemplos A presente invenção vai agora ser descrita mais concretamente por meio de exemplos. Contudo, os exemplos são apresentados apenas para fins de ilustração e não devem ser interpretados de forma restritiva.

Exemplo 1 Construção do Plasmideo

Salvo especificação em contrário, as operações de construção do plasmideo foram efectuadas de acordo com Sambrook 21 et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989.

Construção dos Vectores Intermediários pSB21 e pDSB24 0 pBR322 foi digerido com EcoRI e Ciai e foi tratado com T4 DNA polimerase. Um adaptador Ciai (5'-CATCGATG-3') foi inserido no resultante e circularizado. 0 fragmento Dral-EcoRl possuindo um tamanho de 2,6 kb contendo um gene de resistência à espectinomicina (gene SP) do transposão Tn7 (DeGreve et al., Plasmid 6:235-248, 1981) foi clonado no plasmideo mencionado acima no sítio entre EcoRV e EcoRI. Após o corte do plasmideo com EcoRI, o plasmideo foi re-circularizado após o tratamento com T4 DNA polimerase para remover o sítio EcoRI. 0 fragmento Clal de 2,4 kb contendo o gene SP deste plasmideo foi tratado com T4 DNA polimerase e inserido no sítio Smal de pUC19 para obter ο TOK107. 0 fragmento EcoRI-EindIII de 2,7 kb de pGA482 (An, Plant Physiol. 81:86-91, 1986) e o pTOK107 digerido com

EcoRI e HindlII foram ligados para preparar o pTOK170. 0 pTOK170 foi digerido com BamHl e BglII e circularizado para obter o pYS138. 0 pYS138 foi digerido com EcoRI e Asp718l e o resultante foi tratado com T4 DNA polimerase. Ao resultante, foi inserido um adaptador Sall (5'-GGTCGACC-3') e o plasmideo foi circularizado para obter o pYS151. 0 pYS151 foi digerido com Sall e um fragmento Sall de 4,7 kb contendo T-DNA de pGA643 (An et al., Plant Molecular Biology Manual A3:1-19, Kluwer Academic, Dordrecht, 1988) foi inserido no sítio Sall resultante para obter o pTOK235. 22 Ο ρΤΟΚ235 foi digerido com SacII e o resultante foi cortado em extremidades rombas pela T4 DNA polimerase. Um ligante BglII (5'-CAGATCTG-3') ou um ligante HindiII (5'-CAAGCTTG-3') foi inserido no plasmideo resultante e o resultante foi circularizado. Os plasmideos obtidos foram denominados pTOK245 e pTOK246, respectivamente. 0 pTOK246 foi digerido com HindIII e EcoRI para remover a maior parte do DNA no T-DNA e o fragmento Hindi II-EcoRI de 2,9 kb de pBl221 (Jefferson, Plant Molecular Biology Repórter 5:387-405, 1987) foi inserido neste para obter o pSB21. No fragmento HindIII-EcoRI de 2,9 kb de pBl221, está contido o gene da β-glucuronidase (GUS) que é expresso em células vegetais. O pSB21 é um vector intermediário constituído por (i) gene de resistência à espectinomicina que funciona na Escherichia coli e no Agrobacterium; (ii) um fragmento proveniente do fragmento EcoRI-HindIII de 2,7 kb de pGA482, que possui uma função de replicação do plasmideo em Escherichia coli mas não no

Agrobacterium; e (iii) um fragmento contendo uma região de T-DNA constituída pelas sequências extremidade direita e esquerda e gene GUS entre estas.

Analogamente, o pTOK246 foi digerido com HindIII e EcoRI e um fragmento HindIII-EcoRI de 3,1 kb de pIG221 (Ohta et al., Plant Cell Physiol. 31:805-813, 1990) foi inserido neste para obter o pSB24. No fragmento, está contido um gene GUS em que está inserida uma sequência intrónica (intrão GUS). O intrão GUS é expresso eficientemente em células vegetais, mas não é expresso de modo nenhum na Escherichia coli e no Agrobacterium em virtude do intrão. O pSB24 é um vector intermediário que é idêntico ao pSB21 com a excepção de que, em vez do gene GUS, contém o gene GUS intrónico. 23

Construção de pSB22 0 pGL2 constituído por um gene de resistência à higromicina (HPT, Gritz et al., Gene 25:179-188, 1983) e pDH51 (Pietrazak et al., Nucleic Acids Res 14:5857-5868, 1986), que contém o gene HPT que funciona em células vegetais, foi digerido com Sall. A digestão foi tratada com T4 DNA polimerase e em seguida circularizada delecionando, desse modo, um sítio Sall para obter o pTOK234. 0 pTOK234 obtido foi digerido com Kpnl e em seguida processado do mesmo modo como acima mencionado delecionando, desse modo, dois sítios Kpnl para obter o pTOK244. 0 pTOK244 foi digerido com HindiII e foi em seguida digerido incompletamente com EcoRI para isolar um fragmento com um tamanho de 1,9 kb. Este fragmento foi inserido entre o sítio HindIII e o sítio EcoRI de pTOK246 para obter o pSB22. 0 pSB22 é um vector intermediário que é idêntico ao pSB21 com a excepção de que o gene GUS é trocado pelo gene HPT.

Construção de pYS169 0 pGA482 foi digerido com HindiII e EcoRI e foi em seguida tratado com T4 DNA polimerase, seguido de circularização delecionando, desse modo, o fragmento HíndIII-EcoRI de 2,7 kb para obter o pYS169. 0 pYS169 contém um T-DNA constituído pelas sequências extremidade direita e esquerda de T-DNA e um gene de resistência à canamicina (NPT) localizado entre estas. 0 gene NPT possui uma capacidade para conferir resistência à canamicina à Escherichia coli e ao Agrobacterium. 24

Construção de pNBl 0 pVCKlOl (Knauf et al., Plasmid 8:45-54, 1982) foi digerido com EcoRI e foi em seguida tratado com T4 DNA polimerase, seguido de circularização delecionando, desse modo, um sitio EcoRI. Pela digestão do resultante com Sgill e depois pela circularização, foi delecionado um sitio BglII. Este plasmideo foi denominado pVCKlOlQ. 0 pVCKlOlQ foi digerido com HindIII e XhoI e foi ligado a pUC18 digerido com HindIII e Sall para obter o pTOKl50. 0 pTOKl50 foi digerido com HindIII e foi depois tratado com T4 DNA polimerase. Foi inserido um ligante EcoRI (5'-CCGAATTCGG-3') e o resultante foi fechado convertendo, desse modo, o sitio HindIII no sitio EcoRI para obter o pTOK239. 0 pGA4 82 foi digerido com Hpal e um ligante Xhol (5'-CCTCGAGG-3') foi inserido para obter o pTOK236. 0 pTOK236 foi digerido com Xbal e EcoRI para isolar um fragmento possuindo um tamanho de 2,6 kb. 0 pTOK239 foi digerido com EcoRl e Xbal para remover um fragmento possuindo um tamanho de 2,7 kb e foi inserido um fragmento Xbal-EcoRI de 2,7 kb de pTOK236 para obter o pNBl. 0 pNBl é um tipo de vector aceitador mas não contém T-DNA ou um DNA proveniente da região de virulência.

Construção de pNB3 e pNB4 0 pNBl foi digerido com Xhol e um fragmento Sall, possuindo um tamanho de 3,5 kb que compreende T-DNA que contém o gene NPT de pYS169, foi inserido para obter o pNB3. 0 pNB3 é um tipo de vector aceitador e compreende T-DNA que contém o gene NPT. 25 0 pNBl foi digerido com XhoI e um fragmento Sall de 3,0 kb, compreendendo T-DNA que contém o gene HPT de pSB22, foi inserido para obter o pNB4. O pNB4 é um tipo de vector aceitador e compreende T-DNA contendo o gene HPT.

Construção de pSBl, pSB3 e pSB4 pNBl, pNB3 e pNB4 foram digeridos com ΚρηI e o fragmento ΚρηI de 15,2 kb contendo o gene virB e o gene virG da região de virulência de pTiBo542 (American Type Culture Collection, Registo N° 37349) foi inserido para preparar três tipos de plasmideos que foram denominados pSBl, pSB3 e pSB4, respectivamente. 0 pSBl é um tipo de vector aceitador. Nos casos onde um vector híbrido é preparado por incorporação neste de um vector intermediário contendo um T-DNA, pode ser constituído um vector super binário pela combinação do vector híbrido com um plasmídeo auxiliar. 0 pSB3 é um vector aceitador compreendendo um T-DNA contendo o gene NPT como um gene marcador de selecção. Este vector possui um sítio dentro do qual pode ser inserido um vector intermediário, estando o sítio separado do T-DNA pelo fragmento Kpnl de 15,2 kb contendo o gene virB e o gene virG da região de virulência de pTiBo542. 0 pSB3 pode constituir um vector super binário combinando-o, ou um vector híbrido preparado por incorporação de um vector intermediário, com um plasmídeo auxiliar. Nos casos em que um vector híbrido é preparado por incorporação de um vector intermediário contendo um T-DNA, este vector híbrido é caracterizado por compreender 26 dois T-DNA, ou seja, o primeiro T-DNA contendo o gene NPT como um gene marcador de selecção e um segundo T-DNA localizado num sitio afastado do primeiro T-DNA por não menos de 15,2 kb. 0 pSB4 é um vector aceitador compreendendo um T-DNA contendo o gene HPT como um gene marcador de selecção. Este vector possui um sitio dentro do qual pode ser inserido um vector intermediário, estando o sitio separado do T-DNA pelo fragmento Kpnl de 15,2 kb contendo o gene virB e o gene virG da região de virulência de pTiBo542. 0 pSB4 pode constituir um vector super binário combinando-o, ou um vector híbrido preparado por incorporação de um vector intermediário, com um plasmídeo auxiliar. Nos casos em que um vector híbrido é preparado por incorporação de um vector intermediário contendo um T-DNA, este vector híbrido é caracterizado por compreender dois T-DNA, ou seja, o primeiro T-DNA contendo o gene NPT como um gene marcador de selecção e um segundo T-DNA localizado num sítio afastado do primeiro T-DNA por não menos de 15,2 kb.

Construção de pTOK253 0 pVCK102 (Knauf et al., Plasmid 8:45-54, 1982) foi digerido com Sall e o fragmento Sall de 4,1 kb contendo o T-DNA de pSB21 foi inserido para preparar o pTOK253. 0 pTOK253 é um plasmídeo que pode constituir um vector binário por combinação com um plasmídeo auxiliar. 0 T-DNA neste plasmídeo contém o gene GUS que funciona em células vegetais mas não contém um gene de resistência a fármacos. 27

Construção de pGA482-GUS 0 pGA482 foi digerido com HindIII e EcoRl e o fragmento Hindi II-£coRI de 2,9 kb de pBl221 foi inserido para obter o pGA482-GUS. 0 pGA482 é um plasmideo que pode constituir um vector binário por combinação com um plasmideo auxiliar e o seu T-DNA contém o gene de resistência à canamicina (NPT) que funciona em células vegetais. 0 pGA482-GUS é um plasmideo que pode constituir um vector binário por combinação com um plasmideo auxiliar e o seu T-DNA contém o gene GUS e o gene de resistência à canamicina (NPT), que funciona em células vegetais.

Exemplo 2 Preparação de bactérias pertencendo ao género Agrobacterium

Neste exemplo, bactérias pertencendo ao género Agrobacterium foram cultivadas em meio AB (Chilton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71:3672-3676, 1974) a 28 °C. Conforme requerido, foram utilizados meios aos quais foram adicionados tetraciclina (10 yg/mL), canamicina (100 yg/mL), higromicina (50 yg/mL) ou espectinomicina (50 yg/mL).

Pelo método de Ditta et al., (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77:7347-7351, 1980), pNBl, pSBl, pSB3 e pSB4 foram introduzidos na estirpe de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al., Nature 303:179-180, 1983). A LBA4404 é uma estirpe que contém um plasmideo Ti desarmado pAL4404 do qual foi removido T-DNA. O pAL4404 retém uma região completa de virulência e é frequentemente utilizado como plasmideo auxiliar de vectores binários. As bactérias pertencendo ao género Agrobacterium nas 28 quais foi introduzido um plasmideo serão a seguir indicadas pelo nome da estirpe seguido do nome do plasmideo entre parênteses, tal como, por exemplo, LBA4404 (pNBl).

Em LBA4404(pNBl) que é uma estirpe resistente à tetraciclina, foi introduzido o pSB21 possuindo um gene de resistência à espectinomicina, pelo método de Ditta et al., e foram seleccionadas células bacterianas que eram resistentes tanto à tetraciclina como à espectinomicina obtendo, desse modo, LBA4404 contendo um vector híbrido, no qual um vector intermediário pSB21 foi introduzido no pNBl. Este vector híbrido foi denominado pNB121.

De forma análoga, foram preparadas células de LBA4404 que contêm, respectivamente, os vectores híbridos apresentados na Tabela 1. 29

Tabela 1

Construção do Vector Híbrido Nome do Resistência Nome do Vector Resistência a Nome do Resistência Vector Aceitador a Fármacos do Vector Aceitador Intermediário Fármacos do Vector Intermediário Vector Híbrido a Fármacos do Vector Híbrido pNBl TET pSB21 SP pNB121 TET SP pNBl TET pSB24 SP pNBl24 TET SP pSBl TET pSB21 SP pSBl21 TET SP pSBl TET pSB24 SP pSB124 TET SP pSB3 TET NPT pSB21 SP pSB321 TET SP NPT pSB3 TET NPT pSB24 SP pSB324 TET SP NPT pSB4 TET HPT pSB21 SP pSB421 TET SP HPT pSB4 TET HPT pSB24 SP pSB424 TET SP HPT TET: resistente à tetraciclina; SP: resistente à espectinomicina NPT: resistente à canamicina; HPT: resistente à higromicina

Pelo método de Ditta et al., pGA482, pTOK253 e pGA482-GUS foram introduzidos, respectivamente, em LBA4404 para obter LBA4404(pGA482), LBA4404(pTOK253) e LBA4404(pGA482-GUS) .

Exemplo 3 Eficiência de Transformação e Co-transformação de Tabaco

Plantas de tabaco (variedade: BY4) foram cultivadas numa estufa e foram recolhidas folhas. As superfícies das folhas foram esterilizadas com etanol e hipoclorito de sódio e foram 30 preparados discos de folhas com um diâmetro de cerca de 6 mm. Cerca de 108 células de uma das bactérias seguintes pertencendo ao género Agrobacterium foram cultivadas juntamente com o disco de folha em 2 - 3 mL de um meio liquido contendo sais inorgânicos de Linsmaier e meio de Skoog e 30 g/L de sacarose durante 48 horas. LBA4404(pSB324) LBA4404(pSB424)

Mistura de igual número de células de LBA4404(pSB124) e LBA4404(pGA482)

Mistura de igual número de células de LBA4404(pNB124) e LBA4404 (pGA482)

Mistura de igual número de células de LBA4404(pTOK253) e LBA9404(pGA482) LBA4404(pGA482-GUS) LBA4404 (pGA482)

Após lavagem de cada um dos discos de folhas com água esterilizada para remover as células bacterianas, os discos de folhas foram colocados num meio contendo sais inorgânicos de Linsmaier e meio Skoog, 0,3 mg de ácido índole acético, 10 mg/mL de 6-(γ,γ)-dimetilalilaminopurina, 200 mg/L de canamicina, 31 250 mg/mL de cefotaxima e 0,9% de agar. No caso de LBA4404 (pSB424), foi utilizado um meio contendo 50 mg/L de higromicina em vez de canamicina. Após um mês desde o inicio da cultura, as plantas resistentes à canamicina ou resistentes à higromicina foram examinadas para expressão de GUS pelo método seguinte e depois cultivadas numa estufa. A expressão de GUS foi examinada de acordo com o método de Jefferson et al (Plant Molecular Biology Repórter 5:387-405, 1987) pelo corte de pequenos pedaços das folhas (medindo 2 x 2 mm a 10 x 10 mm) e mergulhando os pedaços das folhas numa solução aquosa contendo 500 mg/L de 5-bromo-4-cloro-3-indolilglucuronida (X-Gluc), fosfato de sódio a 50 mM pH 7,0, β-mercaptoetanol a 10 mM, ácido etilenodiaminotetracético de sódio a 10 mM, laurilsarcosina de sódio 0,1% e Triton X-100 a 0,1% durante 2 horas até de um dia para o outro. Se os discos de folhas exibirem actividade de GUS, o disco de folha, especialmente a sua secção transversal, fica colorida de azul-escuro e, se a folha de disco não exibir actividade de GUS, tal coloração não é observada.

Os resultados do exame da expressão de GUS são como se segue. 32

Tabela 2

Actividade de GUS de Transformantes Bactéria Agrobacterium Número de Número de Plantas Q, 0 Utilizada para Plantas Exibindo Transformação Resistentes a Actividade de GUS Fármacos LBA4404(pSB324) 118 61 52 LBA4404(pSB424) 109 54 50 Mistura de LBA4404(pSBl24) 100 35 35 e LBA4404(pGA482) Mistura de LBA4404(pNB124) 100 22 22 e LBA4404(pGA482) Mistura de LBA4404(pTOK253) 110 0 0 e LBA4404(pGA482) LBA4404(pGA482-GUS) 39 33 85 LBA4404(pGA482) 25 0 0 0 facto de uma planta exibir resistência a fármacos indica que o primeiro T-DNA contendo o gene marcador de selecção foi introduzido na planta e o facto de a planta exibir actividade de GUS indica que o segundo T-DNA contendo o gene GUS foi introduzido na planta.

Visto que LBA4404(pGA482) é uma bactéria que não contém o gene GUS, todas as plantas resistentes a fármacos não exibiram actividade de GUS. 33

Embora o LBA4404(pGA482-GUS) contenha um T-DNA ao qual estão ligados o gene de resistência a fármacos e o gene GUS, apenas 85% das plantas resistentes a fármacos exibiram actividade de GUS. 0 que indica que há casos em que o gene GUS pode ser omisso durante o processo de transformação ou que a actividade de GUS não é detectada em virtude da sua expressão insuficiente, mesmo quando o gene GUS é introduzido. 0 método no qual é utilizada a mistura de LBA4404(pTOK253) e LBA4404(pGA482) é idêntico ao da técnica anterior (McKnight et al., Plant Molecular Biology 8:439-445, 1987). Através deste método, não se obtiveram plantas nas quais foram introduzidos os dois tipos de T-DNA. 0 que indica que pelo método da técnica anterior, há casos em que não se obtêm plantas que sejam co-transformadas com os dois tipos de T-DNA. Considera-se que esta seja uma razão por que o método da técnica anterior não é amplamente utilizado. 0 método em que é utilizada a mistura de LBA4404(pNB124) e LBA4404(pGA482) é um método idêntico ao da técnica anterior mencionado acima por McKnight et al., com excepção de que é utilizado um vector hibrido pNB124. Pelo método convencional de McKnight et al., o segundo T-DNA estava contido em 19% das plantas resistentes a fármacos. Pelo método utilizando a mistura de LBA44 04(pNBl24) e LBA4404 (pGA982), o segundo T-DNA estava contido em 22% das plantas resistentes a fármacos. Deste modo, o resultado é idêntico ao do método de McKnight et al.

Quanto ao método em que é utilizada a mistura de LBA4404(pSB124) e LBA4404(pGA482), LBA4404(pSB124) é uma bactéria contendo um vector hibrido denominado pSB124, de modo que este método utiliza um vector super binário e é o método 34 (método de duas estirpes) de acordo com a presente invenção. Através deste método, confirmou-se que o segundo T-DNA está contido em cerca de 35% das plantas resistentes a fármacos. Deste modo, este método alcançou uma eficiência de co-transformação muito superior do que pelo método utilizando a mistura de LBA4404(pNB124) e LBA4404(pGA482).

Os resultados do método utilizando a mistura de LBA4404(pSB124) e LBA4404(pGA482) e do método utilizando a mistura de LBA4404(pNBl24) e LBA4404(pGA482) podem ser comparados utilizando uma análise estatística como se segue.

Se for empregue uma hipótese de tal modo que as probabilidades de co-transformação pelos dois métodos sejam idênticas, X2 é calculado como se segue: X2 = 6,5 x 6,5 x (1/28,5 + 1/28,5 + 1/71,5 + 1/71,5) = 4,15

Esta possui um grau de liberdade de 1. Quando o grau de liberdade é 1, visto que a probabilidade de que X2 seja superior a 4,15 não é superior a 5%, a hipótese mencionada acima é rejeitada a um nível de 5%. Por conseguinte, as probabilidades da co-transformação pelos dois métodos mencionados acima são estatisticamente significativamente diferentes.

Os métodos que utilizam LBA4404(pSB324) ou LAB4404(pSB424) são os métodos que utilizam uma bactéria contendo o vector híbrido pSB324 e pSB424, respectivamente. Deste modo, estes métodos utilizam vectores super binários e são métodos (método de estirpe única) de acordo com a presente invenção. Através destes métodos, confirmou-se que o segundo T-DNA está contido em 50 - 52% das plantas resistentes a fármacos. Deste modo, 35 provou-se que a eficiência de co-transformação por estes métodos é muito superior do que pelo método utilizando a mistura de LBA4404(pNBl24) e LBA4404(pGA482) ou a mistura de LHA4404 (pSB124) e LBA4909 (pGA482).

Os resultados do método utilizando a mistura LBA4404(pSB324) ou LBA4404(pSB424) e os resultados do método utilizando a mistura de LBA4404(pSB124) e LBA4404(pGA482) podem ser comparados utilizando uma análise estatística como se segue.

Se for empregue uma hipótese de tal modo que as probabilidades de co-transformação pelos dois métodos sejam idênticas, X2 é calculado como se segue: X2 = 19,9 x 19,9 x (1/95,1 + 1/41,9 + 1/131,9 + 1/58,1 = 23,43

Esta possui um grau de liberdade de 1. Quando o grau de liberdade é 1, a probabilidade de que X2 seja superior a 23,43 não é superior a 1%, a hipótese mencionada acima é rejeitada a um nível de 1%. Por conseguinte, as probabilidades da co-transformação pelos dois métodos mencionados acima são estatisticamente significativamente diferentes a um nível de 1%.

Os resultados do método utilizando LBA4404(pSB324) ou LBA4404(pSB424) e os resultados do método utilizando a mistura de LBA4404(pNB124) e LBA4404(pGA482) podem ser comparados utilizando uma análise estatística como se segue.

Se for empregue uma hipótese de tal modo que as probabilidades de co-transformação pelos dois métodos sejam idênticas, X2 é calculado como se segue: 36 Χ2 = 10,9 χ 10,9 χ (1/104,1 + 1/45,9 + 1/122,9 + 1/54,1 =6,89

Esta possui um grau de liberdade de 1. Quando o grau de liberdade é 1, a probabilidade de que X2 seja superior a 6,89 não é superior a 1%, a hipótese mencionada acima é rejeitada a um nivel de 1%. Por conseguinte, as probabilidades da co-transformação pelos dois métodos mencionados acima são estatisticamente significativamente diferentes a um nível de 1%.

Exemplo 4 Herança de T-DNA Introduzido em Tabaco

As sementes foram colhidas a partir de plantas transformadas cultivadas numa estufa. As sementes de algumas plantas foram esterilizadas à superfície com etanol e hipoclorito de sódio e em seguida semeadas num meio contendo sais inorgânicos de Linsmaier e Skoog, 30 g/L de sacarose e 0,9% de agar. As plantas germinadas foram testadas para a actividade de GUS pelo método mencionado acima e para resistência a fármacos pelo método seguinte.

Foram cortados pequenos pedaços (cerca de 3 mm x 3 mm) e colocados num meio contendo sais inorgânicos de Linsmaier e Skoog, 30 g/L de sacarose, 3 mg/L de ácido acético indole, 3 mg/mL de ácido acético naftalénico, 0,1 mg/mL de cenetina, 200 mg/L de canamicina e 0,9% de agar. As sementes das plantas transformadas com LBA4404(pSB424) foram colocadas no mesmo meio como acima mencionado com excepção de que, em vez de canamicina, contém 50 mg/L de higromicina. Pedaços de folha de plantas resistentes a fármacos formaram calli enquanto pedaços de folha de plantas sensíveis a fármacos morreram sem formar calli. 37

Os resultados apresentados na Tabela 3 a seguir foram obtidos para as plantas provenientes das sementes das plantas transformadas com LBA9404(pSB324), LBA4404(pSB424) ou da mistura de LBA4404(pSB124) e LBA4404(pGA482).

Tabela 3

Segregação de Resistência a Fármacos e GUS Introduzida na Geração Seguinte Bactéria Agrobacterium Utilizada para Transformação Número de Linhagem (N° Individual de Transformantes da Geração Presente) Número de Plantas Resistente a GUS + Sensível a GUS+ Resistente a GUS- Sensível a GUS- LBA4404(pSB324) 324-6 45 0 12 4 LBA44 04(pSB324) 324-8 7 0 52 0 LBA4404 (pSB324) 324-14 49 0 0 11 LBA4404(pSB324) 324-23 37 17 2 0 LBA4404(pSB324) 324-25 49 0 0 11 LBA4404(pSB324) 324-28 35 9 12 3 LBA4404(pSB324) 324-32 0 55 0 4 LBA4404(pSB324) 324-41 16 1 40 3 LBA4404(pSB324) 324-49 42 9 0 4 LBA4404(pSB424) 424-1 32 6 14 6 LBA4404(pSB424) 424-4 30 15 10 4 LBA4404(pSB424) 424-10 50 9 0 1 LBA4404(pSB424) 424-14 55 2 0 0 LBA4404(pSB424) 424-15 45 11 0 1 38

Segregação de Resistência a Fármacos e GUS Introduzida na Geração Seguinte

Bactéria Número de Número de Plantas Agrobacteríum Utilizada para Transformação Linhagem (N° Individual de Transformantes da Geração Presente) Resistente a GUS + Sensível a GUS+ Resistente a GUS- Sensível a GUS- LBA4404(pSB424) 424-20 48 5 0 1 LBA4404(pSB424) 424-30 39 18 1 1 LBA44 04(pSB424) 424-32 55 3 0 0 LBA4404(pSB424) 424-38 39 14 0 6 LBA4404(pSB424) 424-41 26 6 17 5 Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) 12482-6 0 0 53 4 Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4-404(pGA482 .) 12482-9 44 0 13 3 Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404 (pGA482) 12482-33 21 22 1 16 Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404 (pGA482) 12482-40 32 0 0 15 Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404 (pGA482) 12482-53 24 23 0 9 Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) 12482-63 38 6 50 0 39

Segregação de Resistência a Fármacos e GUS Introduzida na Geração Seguinte Bactéria Agrobacterium Número de Linhagem (N° Número de Plantas Resistente Sensível Resistente Sensível Utilizada para Individual de a GUS+ a GUS+ a GUS- a GUS- Transformação Transformantes da Geração Presente) Mistura de 12482-64 30 5 35 4 LBA4404(pSB124) /LBA4409(pGA482) Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) 12482-66 34 14 13 3 Mistura de 12482-77 84 5 1 1 LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) 12482-101 52 0 28 1 Mistura de 12482-108 13 2 72 7 LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) 12482-113 57 16 17 5 Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) 12482-137 80 18 2 0 Mistura de LBA4404(pSB124) /LBA4404(pGA482) 12482-139 76 20 0 0 GUS+: possuindo actividade de GUS; GUS-: não possuindo actividade de GUS Resistente: possuindo resistência a fármacos; Sensível: não possuindo resistência a fármacos 40

Como se pode verificar a partir dos resultados descritos acima, em alguns casos, foi introduzido nas plantas mais de um T-DNA contendo o gene de resistência a fármacos ou mais de um T-DNA contendo o gene GUS.

Quanto às plantas transformadas com LBA4404 (pSB324), que exibiram actividade de GUS, com 5 plantas entre as 9 plantas examinadas, pelo menos um T-DNA contendo o gene GUS herdado, independentemente de o T-DNA conter o gene de resistência a fármacos e, na geração seguinte, obtiveram-se plantas não contendo nenhum gene de resistência a fármacos mas contendo o gene GUS.

Quanto às plantas transformadas com LBA4404(pSB424), que exibiram actividade de GUS, com 10 plantas entre as 10 plantas examinadas, pelo menos um T-DNA contendo o gene GUS herdou, independentemente de o T-DNA conter o gene de resistência a fármacos e, na geração seguinte, obtiveram-se plantas não contendo nenhum gene de resistência a fármacos mas contendo o gene GUS.

Quanto às plantas transformadas com a mistura de LBA4404(pSB124) e LBA4404(pGA482), que exibiram actividade de GUS, com 10 plantas entre as 14 plantas examinadas, pelo menos um T-DNA contendo o gene GUS herdou, independentemente de o T-DNA conter o gene de resistência a fármacos e, na geração seguinte, obtiveram-se plantas não contendo nenhum gene de resistência a fármacos mas contendo o gene GUS.

Na geração seguinte das plantas transformadas com LBA4404 (pGA482-GUS) , que exibiram actividade de GUS, não ocorreram plantas que não contivessem o gene de resistência a 41 fármacos e que contivessem o gene GUS. Na geração seguinte das plantas transformadas com LBA4404(pGA482), não ocorreram plantas que exibissem actividade de GUS. A partir das folhas dos transformantes possuindo as linhagens n.os 324-28, 424-4 e 424-30 apresentadas na Tabela 3, bem como a partir das folhas da geração seguinte de plantas destas, extrairam-se os DNA pelo método de Komari et al (Theor. Appl. Genet. 77; 547-552, 1989) e digeriram-se com a enzima de restrição HindIII, seguida de análise de Southern de acordo com o método de Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor, NY) . Como resultado, nas plantas exibindo resistência a fármacos e actividade de GUS, ambos os genes foram detectados. Nas plantas que exibiram resistência a fármacos mas que não exibiram actividade de GUS, só foi detectado o gene GUS. Nas plantas que não exibiram resistência a fármacos e actividade de GUS, não foi detectado nenhum dos genes.

Exemplo 5 Eficiência de Transformação e Co-transformação de

Arroz

Sementes maduras de arroz (variedade: Tsukinohikari) foram mergulhadas em etanol a 70% durante 1 minuto e em seguida em 1% de hipoclorito de sódio durante 30 minutos para esterilizar as sementes e as sementes esterilizadas foram colocadas em meio sólido 2N6 (sais inorgânicos e vitaminas de N6 (Chu C.C., Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp. 43-50, 1978), 1 g/L de casaminoácidos, 2 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarose e 2 g/L de Gelrite) . Após cultivo das sementes durante cerca de 3 semanas, os calli formados provenientes dos escutelos 42 foram transplantados para meio sólido 2N6 e calli após 4-7 dias desde a transplantação foram empregues como calli de escutelo.

Colónias de LBA4404(pSB424) obtidas por cultivo desta estirpe em meio AB a 28 °C durante 3-10 dias foram recolhidas com um gancho de platina e suspendidas em meio AA modificado (sais inorgânicos principais AA, aminoácidos e vitaminas AA (Toriyama et al., Plant Science 41:179-183, 1985), sais secundários MS (Murashige et al., Physiol. Plant. 15:473-497, 1962), 0,5 g/L de casaminoácidos, sacarose a 0,2 M, glucose a 0,2 M, acetosilingona a 100 μΜ, pH 5,2). Após ajuste da população celular para 1 x 109 células/mL, a suspensão foi utilizada para inoculação.

Após lavagem dos calli com água esterilizada, estes foram mergulhados na suspensão celular descrita acima durante 3-10 minutos. Após a imersão, os calli foram transplantados para meio sólido 2N6 contendo acetosilingona, glucose e sacarose nas mesmas concentrações como no meio AA modificado e os calli foram cultivados no escuro a 25 °C durante 3 dias. Os calli do escutelo foram depois lavados com água esterilizada contendo 250 mg/mL de cefotaxima.

Os calli foram transplantados para meio sólido 2N6 contendo 50 mg/L de higromicina e 250 mg/L de cefotaxima e cultivados durante 3 semanas, seguido de selecção de calli resistente à higromicina. Os calli resistentes obtidos foram adicionalmente cultivados em meio N6-7 (sais inorgânicos N6, vitaminas N6, 2 g/L de casaminoácidos, 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 mg/L de 6BA, 30 g/L de sorbitol, 20 g/L de sacarose e 2 g/L de Gelrite) contendo 100 mg/L de higromicina e 250 mg/L de cefotaxima 43 durante 2-3 semanas. Os calli crescidos neste meio foram transplantados para meio de regeneração de plantas N6S3 (1/2 de sais inorgânicos principais Νβ, sais secundários N6, vitaminas N6 (Chu, 1978), aminoácidos AA (Toriyama et al., 1985), 1 g/L de casaminoácidos, 0,2 mg/L de ácido acético naftalénico, 1,0 mg/L de cenetina e 3 g/L de Gelrite) contendo 50 mg/L de higromicina e 250 mg/L de cefotaxima para regenerar plantas resistentes à higromicina.

As plantas resistentes à higromicina foram testadas para actividade de GUS pelo método acima descrito e foram em seguida cultivadas numa estufa hermética.

Como apresentado na Tabela 4 a seguir, as plantas resistentes à higromicina foram obtidas a partir de 12,3 - 44,0% dos calli utilizados. Para além disso, como apresentado na Tabela 5 a seguir, de entre as plantas resistentes à higromicina, 42 - 51% exibiram actividade de GUS.

Tabela 4 Eficiência de Selecção de Plantas Resistentes à Higromicina por Co-transformação Número de Calli Eficiência de Selecção (b/a:%) Calli Utilizado (a) Calli Resistente Calli Regenerado (b) 227 40 28 12,3 398 90 75 18,8 220 116 97 44,0 324 77 72 22,2 44

Tabela 5 Actividade de GUS em Plantas Resistentes à Higromicina Número de Plantas Resistentes a Fármacos Utilizado Número de Plantas Exibindo Actividade de GUS o, 0 97 41 42 176 82 47 126 60 48 150 76 51 A partir das folhas das plantas que exibiram resistência à higromicina e actividade de GUS, foram extraidos DNA pelo método de Komari et al. (Theor. Appl. Genet. 77; 547-552, 1989) e digeridos com a enzima de restrição Hindm, seguido de análise de Southern de acordo com o método de Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a ed. Cold Spring Harbor, NY). Como resultado, foi confirmada, em todas as plantas, a existência do gene de resistência à higromicina e do gene GUS (Tabela 6). 45

Tabela 6

Resultados de Análise de Southern de Transformantes e Segregação de Gene Introduzido na Geração Seguinte

Linhagem de Transformante Número de Cópias de Gene Introduzido por Análise de Southern Número de Plantas na Geração Seguinte HPT* GUS Resistente a GUS+ Sensível a GUS+ Resistente a GUS- Sensível a GUS- 1 1 1 44 11 12 3 2 1-2 2-3 41 22 2 5 3 2-3 2-3 67 1 2 0 4 4 2 68 2 6 0 5 1 2 51 14 0 5 6 2 1 52 0 0 18 7 1 1 51 0 0 19 8 1 2 34 11 17 7 9 2 3-4 14 43 4 9 10 2 1 52 0 14 3 11 1 2-3 46 17 0 7 12 2 2 51 0 0 19 *HPT: gene de resistência à higromicina 46

Exemplo 6 Herança de T-DNA Introduzido em Arroz

As sementes foram colhidas a partir de plantas transformadas cultivadas numa estufa. As sementes de algumas plantas foram esterilizadas à superfície com etanol e hipoclorito de sódio e em seguida semeadas num meio não contendo nenhumas hormonas N6. As sementes germinadas e com raízes foram testadas para a actividade de GUS pelo método acima descrito e para resistência à higromicina pelo método como se segue.

As radículas foram cortadas até um comprimento de 5 - 10 mm e os fragmentos de radícula obtidos foram colocados em meio 2N6 contendo 50 mg/L de higromicina. Os fragmentos de radícula de plantas resistentes à higromicina formaram calli enquanto aqueles de plantas sensíveis à higromicina morreram sem formar calli.

Os resultados apresentados na Tabela 6 foram obtidos para as plantas da geração seguinte provenientes das sementes das plantas que foram transformadas com LBA4404(pSB424) e exibiram actividade de GUS e resistência à higromicina.

Como pode ser verificadoa partir dos resultados, em algumas destas plantas, como plantas de tabaco, foram introduzidos múltiplos T-DNA contendo o gene de resistência a fármacos ou múltiplos T-DNA contendo o gene GUS. O número de genes foi idêntico ou inferior ao número de cópias detectadas por análise de Southern. Nos casos em que o número de genes é inferior ao número de cópias detectadas por análise de Southern, considera-se que foram introduzidas no mesmo lócus múltiplas cópias de genes. 47

Quanto às plantas transformadas com LBA4404(pBS424), que exibiram actividade de GUS e resistência à higromicina, com 8 plantas entre as 12 plantas examinadas, o T-DNA contendo, pelo menos, um gene GUS herdou, independentemente de o T-DNA conter o gene de resistência a fármacos e, na geração seguinte, obtiveram-se plantas não contendo nenhum gene de resistência a fármacos mas contendo o gene GUS.

Para confirmar a existência dos genes introduzidos na geração seguinte de plantas das plantas transformadas, as plantas da geração seguinte das plantas de cada linhagem apresentadas na Tabela 6 foram classificadas de acordo com os fenótipos (GUS+ e resistente à higromicina, GUS+ e sensível à higromicina, GUS- e resistente à higromicina e GUS- e sensível à higromicina) e submetidas a análise de Southern. Como resultado, confirmou-se que a existência do gene de resistência à higromicina e do gene GUS era coincidente com o fenótipo.

Disponibilidade Industrial

Como acima descrito, a presente invenção tornou possível a preparação de plantas transformadas e regeneradas nas quais é introduzido um gene desejado com uma elevada eficiência e a obtenção, na geração seguinte, das plantas que contêm o gene desejado mas não contêm o gene de resistência a fármacos utilizado como marcador de selecção. Deste modo, a presente invenção é útil para a criação de uma nova planta útil possuindo o carácter desejado, de modo a que a presente invenção seja útil na agricultura.

Lisboa, 21 de Junho de 2007 48

Claims

REIVINDICAÇÕES Método de transformação de uma planta através de uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, compreendendo a co-transformação de células vegetais com um primeiro T-DNA (1) e um segundo T-DNA (2); e seleccionando as células que adquiriram resistência a fármacos; o referido primeiro T-DNA (1) contendo um gene conferindo a referida resistência a fármacos, que funciona na referida planta; o referido segundo T-DNA (2) contendo um fragmento de DNA desejado a introduzir na referida planta, o segundo T-DNA (2) estando contido num vector híbrido; o referido vector híbrido sendo preparado por recombinação homóloga entre um vector aceitador e um vector intermediário na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o referido vector aceitador contendo, pelo menos, (a) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmídeo na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e Escherichia coli, (b) uma região de DNA contendo o gene virB e o gene virG na região de virulência do plasmídeo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens, e 1 (c) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do referido vector intermediário, que é submetida a recombinação homóloga na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o referido vector intermediário contendo, pelo menos, (i) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmideo em Escherichia coli, que não funciona na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, (ii) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do referido vector aceitador, que é submetida a recombinação homóloga na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, e (iii) uma região de DNA que constitui, pelo menos, uma parte do referido segundo T-DNA.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido primeiro T-DNA e referido segundo T-DNA estão contidos no referido vector híbrido único.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido primeiro T-DNA está contido no referido vector aceitador.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido primeiro T-DNA e referido segundo T-DNA estão separados no referido vector híbrido por 2 (1) a referida região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmideo na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e Escherichia coli, e (2) a referida região de DNA contendo o gene virB e o gene vir G na região de virulência do plasmideo Ti pTiBo592 de Agrobacterium tumefaciens.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido primeiro T-DNA e referido vector hibrido estão contidos em diferentes células bacterianas de Agrobacterium e a referida planta é transformada com uma mistura destes dois tipos de células de Agrobacterium.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a referida região de DNA contendo o gene virB e o gene vírG na região de virulência do plasmideo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens é o fragmento Kpnl possuindo um tamanho de 15,2 kb de pTiBo542.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, em que o referido fragmento de DNA desejado a ser introduzido na referida planta é inserido na referida região de DNA constituindo, pelo menos, uma parte do referido segundo T-DNA utilizando um sitio de restrição.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, em que o referido vector intermediário contém toda a região do referido segundo T-DNA. 3
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, em que uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium contendo o referido vector hibrido juntamente com um plasmídeo Ti ou plasmídeo Ri que não contém T-DNA mas contém uma região de virulência necessária para a transferência de T-DNA para uma planta, é infectada na referida planta.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, em que o referido gene conferindo a referida resistência a fármacos é o gene de resistência à canamicina ou o gene de resistência à higromicina.
11. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o referido primeiro T-DNA fica situado num plasmídeo, e uma bactéria pertencendo ao género Agrobacterium contendo o referido primeiro T-DNA juntamente com um segundo plasmídeo proveniente do plasmídeo Ti ou do plasmídeo Ri contendo a região de virulência necessária para a transferência de T-DNA para a referida planta mas não contendo um T-DNA, é infectada à referida planta.
12. Método de obtenção de uma planta transformada compreendendo o cultivo da referida planta transformada pelo referido método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e a obtenção de uma planta na geração seguinte, que contém o referido fragmento de DNA desejado ser introduzido na referida planta mas não contém o referido gene conferindo a referida resistência a fármacos. 4
13. Vector híbrido compreendendo um primeiro T-DNA contendo (1) um gene conferindo uma resistência a fármacos, que funciona numa planta, e (2) um segundo T-DNA possuindo um sítio de restrição; o referido vector híbrido sendo preparado por recombinação homóloga entre um vector aceitador e um vector intermediário numa bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o referido vector aceitador contendo, pelo menos, (a) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmídeo na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e Escherichia coli, (b) uma região de DNA contendo o gene virB e o gene vírG na região de virulência do plasmídeo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens, e (c) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do referido vector intermediário, que é submetida a recombinação homóloga na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium; o referido vector intermediário contendo, pelo menos, (i) uma região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmídeo em Escherichia coli, que 5 não funciona na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, (ii) uma região de DNA que é homóloga de uma parte do referido vector aceitador, que é submetida a recombinação homóloga na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium, e (iii) uma região de DNA que constitui, pelo menos, uma parte do referido segundo T-DNA.
14. Vector híbrido de acordo com a reivindicação 13, em que o referido primeiro T-DNA está contido no referido vector aceitador.
15. Vector híbrido de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que o referido primeiro T-DNA e referido segundo T-DNA estão separados no referido vector híbrido por (1) referida região de DNA possuindo uma função de replicação de um plasmídeo na referida bactéria pertencendo ao género Agrobacterium e Escheríchia coli, e (2) referida região de DNA contendo o gene virB e o gene virG na região de virulência do plasmídeo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens.
16. Vector híbrido de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que a referida região de DNA contendo o gene virB e o gene virG na região de virulência 6 do plasmídeo Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumefaciens é o fragmento Kpnl possuindo um tamanho de 15,2 kb de pTiBo542.
17. Vector hibrido de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, em que o referido gene conferindo a referida resistência a fármacos é o gene de resistência à canamicina ou o gene de resistência à higromicina.
18. Vector hibrido de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que o referido vector aceitador é o pSB3 ou pSB4. Lisboa, 21 de Junho de 2007 7