JP2000342256A - 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 - Google Patents
植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法Info
- Publication number
- JP2000342256A JP2000342256A JP11158025A JP15802599A JP2000342256A JP 2000342256 A JP2000342256 A JP 2000342256A JP 11158025 A JP11158025 A JP 11158025A JP 15802599 A JP15802599 A JP 15802599A JP 2000342256 A JP2000342256 A JP 2000342256A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- agrobacterium
- gene
- centrifugation
- plant cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来のアグロバクテリウム法による遺伝子導
入方法よりも高い効率で組織を付傷することなく簡便に
遺伝子導入を行うことができる、植物細胞への遺伝子導
入の効率を向上させる方法を提供すること。 【解決手段】 植物細胞又は植物組織を遠心処理するこ
とを伴う、アグロバクテリウム属細菌を介して行われる
植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法を提供
した。
入方法よりも高い効率で組織を付傷することなく簡便に
遺伝子導入を行うことができる、植物細胞への遺伝子導
入の効率を向上させる方法を提供すること。 【解決手段】 植物細胞又は植物組織を遠心処理するこ
とを伴う、アグロバクテリウム属細菌を介して行われる
植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法を提供
した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物細胞への遺伝
子導入の効率を向上させる方法に関する。
子導入の効率を向上させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アグロバクテリウムによる形質転換法
は、一般的に、効率が高い、導入される遺伝子のコピー
数が少ない、T-DNAという特定の領域を断片化させるこ
となく導入できる、短期間の培養により形質転換体を得
ることができるため培養変異が少ないなど、多くの優れ
た特徴を持っている。このため、さまざまな植物種で最
も有用な形質転換の手段として広く用いられている。
は、一般的に、効率が高い、導入される遺伝子のコピー
数が少ない、T-DNAという特定の領域を断片化させるこ
となく導入できる、短期間の培養により形質転換体を得
ることができるため培養変異が少ないなど、多くの優れ
た特徴を持っている。このため、さまざまな植物種で最
も有用な形質転換の手段として広く用いられている。
【０００３】このように、アグロバクテリウム法は非常
に優れた植物の形質転換方法であるが、形質転換の成否
ならびに効率は、植物種、遺伝子型ならびに用いる植物
組織に依存して大きく異なるのが実状である（Potrykus
et al. 1998(参考文献(33))）。すなわち、形質転換に
成功していない植物種があるほか、ごく一部の品種のみ
形質転換が可能な植物種も多い。また、利用可能な組織
が限定されており大量の材料を取り扱うことができない
植物種もある。遺伝子組換えにより実用的な品種を作出
するには、多数の形質転換植物を作出した上で、目的と
する形質を持った系統を選抜する必要がある。しかしな
がら、この目的に即し多数の形質転換体を容易に得るこ
とができる作物の種類は、現状では一部に限定されてい
る。したがって、このような問題点を解決することがで
きる改良手法の開発が強く望まれている。
に優れた植物の形質転換方法であるが、形質転換の成否
ならびに効率は、植物種、遺伝子型ならびに用いる植物
組織に依存して大きく異なるのが実状である（Potrykus
et al. 1998(参考文献(33))）。すなわち、形質転換に
成功していない植物種があるほか、ごく一部の品種のみ
形質転換が可能な植物種も多い。また、利用可能な組織
が限定されており大量の材料を取り扱うことができない
植物種もある。遺伝子組換えにより実用的な品種を作出
するには、多数の形質転換植物を作出した上で、目的と
する形質を持った系統を選抜する必要がある。しかしな
がら、この目的に即し多数の形質転換体を容易に得るこ
とができる作物の種類は、現状では一部に限定されてい
る。したがって、このような問題点を解決することがで
きる改良手法の開発が強く望まれている。
【０００４】アグロバクテリウムを介する形質転換方法
自体は、植物種により供試材料や培養に用いる培地の組
成などを異にするものの、材料となる組織にアグロバク
テリウムの懸濁液を接触させ、共存培養の後に形質転換
細胞の選抜を行い、形質転換植物を作出するという操作
ではほぼ共通している。材料となる植物組織には対して
は、通常、必要に応じ滅菌処理を行うがそれ以外に特別
な処理を施すことなくアグロバクテリウムの感染が行わ
れる（Rogers et al. 1988(参考文献(34)), Visser 199
1(参考文献(38)), McCormick 1991(参考文献(29)), Lin
dsey et al. 1991(参考文献(28))）。従って、形質転換
系の改良は、アグロバクテリウムの菌系、ベクター構
成、培地組成、選抜マーカー遺伝子やプロモーターの種
類、供試組織の種類などを中心に研究が行われてきた。
自体は、植物種により供試材料や培養に用いる培地の組
成などを異にするものの、材料となる組織にアグロバク
テリウムの懸濁液を接触させ、共存培養の後に形質転換
細胞の選抜を行い、形質転換植物を作出するという操作
ではほぼ共通している。材料となる植物組織には対して
は、通常、必要に応じ滅菌処理を行うがそれ以外に特別
な処理を施すことなくアグロバクテリウムの感染が行わ
れる（Rogers et al. 1988(参考文献(34)), Visser 199
1(参考文献(38)), McCormick 1991(参考文献(29)), Lin
dsey et al. 1991(参考文献(28))）。従って、形質転換
系の改良は、アグロバクテリウムの菌系、ベクター構
成、培地組成、選抜マーカー遺伝子やプロモーターの種
類、供試組織の種類などを中心に研究が行われてきた。
【０００５】これに対し、アグロバクテリウムを接種す
る前の植物組織を、遺伝子導入が生じやすい生理的状態
に変換するという考え方に基づく研究は、ほとんど行わ
れていない。何らかの簡便な処理により、そのような生
理的状態に変換することができればたいへん利用価値が
高く、遺伝子導入効率の向上に加え、従来困難であった
植物種や遺伝子型の形質転換を可能にする顕著な効果も
期待される。これまでの植物組織への前処理に関する研
究例としては、パーティクルガン(Bidney et al., 1992
(参考文献(5)))および超音波(Trick et al., 1997(参考
文献(37)))処理が上げられる。どちらも物理的に組織を
付傷することでバクテリアの植物組織内への侵入を促
し、感染対象となる植物細胞を増加させることを目的と
している。しかしながら、これは従来より広く行われて
いるリーフディスク法(Horsch et al., 1985(参考文献
(17)))を発展させたものに過ぎず、新規な考え方に基づ
く処理法ではない。なお、効果の程度や汎用性は明らか
でなく、一般的な手法として用いられていないのが現状
である。
る前の植物組織を、遺伝子導入が生じやすい生理的状態
に変換するという考え方に基づく研究は、ほとんど行わ
れていない。何らかの簡便な処理により、そのような生
理的状態に変換することができればたいへん利用価値が
高く、遺伝子導入効率の向上に加え、従来困難であった
植物種や遺伝子型の形質転換を可能にする顕著な効果も
期待される。これまでの植物組織への前処理に関する研
究例としては、パーティクルガン(Bidney et al., 1992
(参考文献(5)))および超音波(Trick et al., 1997(参考
文献(37)))処理が上げられる。どちらも物理的に組織を
付傷することでバクテリアの植物組織内への侵入を促
し、感染対象となる植物細胞を増加させることを目的と
している。しかしながら、これは従来より広く行われて
いるリーフディスク法(Horsch et al., 1985(参考文献
(17)))を発展させたものに過ぎず、新規な考え方に基づ
く処理法ではない。なお、効果の程度や汎用性は明らか
でなく、一般的な手法として用いられていないのが現状
である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来のアグロバクテリウム法による遺伝子導入方法
よりも高い効率で組織を付傷することなく簡便に遺伝子
導入を行うことができる、植物細胞への遺伝子導入の効
率を向上させる方法を提供することである。
は、従来のアグロバクテリウム法による遺伝子導入方法
よりも高い効率で組織を付傷することなく簡便に遺伝子
導入を行うことができる、植物細胞への遺伝子導入の効
率を向上させる方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導
入方法において、遺伝子導入に供する植物細胞又は植物
組織を遠心処理することにより、遺伝子導入効率を有意
に向上させることができることを見出し本発明を完成し
た。
究の結果、アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導
入方法において、遺伝子導入に供する植物細胞又は植物
組織を遠心処理することにより、遺伝子導入効率を有意
に向上させることができることを見出し本発明を完成し
た。
【０００８】すなわち、本発明は、植物細胞又は植物組
織を遠心処理することを伴う、アグロバクテリウム属細
菌を介して行われる植物細胞への遺伝子導入の効率を向
上させる方法を提供する。
織を遠心処理することを伴う、アグロバクテリウム属細
菌を介して行われる植物細胞への遺伝子導入の効率を向
上させる方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の方法では、アグロバクテ
リウム属細菌を介した遺伝子導入方法において、遺伝子
を導入する植物細胞又は植物組織を遠心処理することを
伴う。植物細胞又は植物組織は、遠心処理した後、通常
の重力下でアグロバクテリウム属細菌と接触させてもよ
いし、遠心処理しながらアグロバクテリウム属細菌と接
触させてもよい。好ましくは、植物細胞又は植物組織を
遠心処理した後、通常の重力下でアグロバクテリウム属
細菌と接触させる方法である。
リウム属細菌を介した遺伝子導入方法において、遺伝子
を導入する植物細胞又は植物組織を遠心処理することを
伴う。植物細胞又は植物組織は、遠心処理した後、通常
の重力下でアグロバクテリウム属細菌と接触させてもよ
いし、遠心処理しながらアグロバクテリウム属細菌と接
触させてもよい。好ましくは、植物細胞又は植物組織を
遠心処理した後、通常の重力下でアグロバクテリウム属
細菌と接触させる方法である。
【００１０】遠心処理条件は、用いる植物の種類等に応
じて適宜選択されるが、通常、１００Ｇ〜２５万Ｇ、好
ましくは５００Ｇ〜２０万Ｇ、さらに好ましくは１００
０Ｇ〜１５万Ｇ程度の遠心加速度範囲で行われる。ま
た、遠心処理の時間は、遠心加速度及び用いる植物の種
類等に応じて適宜選択されるが、通常１秒間以上行うこ
とが好ましい。なお、遠心時間の上限は特にないが、通
常、１０分間程度で目的を達成することができる。な
お、遠心処理時間は、遠心加速度が大きい場合には極く
短い時間、例えば１秒以下でも遺伝子導入効率を有意に
向上させることができる。一方、遠心加速度が小さい場
合には、遠心処理を長く行うことにより遺伝子導入効率
を有意に向上させることができる。特に好ましい遠心処
理条件は、５００Ｇ〜２０万Ｇ、特には１０００Ｇ〜１
５００００Ｇで１秒間〜２時間程度の場合が多いが、そ
の植物細胞又は植物組織にとっての適切な遠心処理条件
は、ルーチンな実験により容易に設定することができ
る。
じて適宜選択されるが、通常、１００Ｇ〜２５万Ｇ、好
ましくは５００Ｇ〜２０万Ｇ、さらに好ましくは１００
０Ｇ〜１５万Ｇ程度の遠心加速度範囲で行われる。ま
た、遠心処理の時間は、遠心加速度及び用いる植物の種
類等に応じて適宜選択されるが、通常１秒間以上行うこ
とが好ましい。なお、遠心時間の上限は特にないが、通
常、１０分間程度で目的を達成することができる。な
お、遠心処理時間は、遠心加速度が大きい場合には極く
短い時間、例えば１秒以下でも遺伝子導入効率を有意に
向上させることができる。一方、遠心加速度が小さい場
合には、遠心処理を長く行うことにより遺伝子導入効率
を有意に向上させることができる。特に好ましい遠心処
理条件は、５００Ｇ〜２０万Ｇ、特には１０００Ｇ〜１
５００００Ｇで１秒間〜２時間程度の場合が多いが、そ
の植物細胞又は植物組織にとっての適切な遠心処理条件
は、ルーチンな実験により容易に設定することができ
る。
【００１１】本発明の方法は、アグロバクテリウム属細
菌と接触させる植物細胞又は植物組織として遠心処理し
たものを用いる、又は遠心処理を行いながらアグロバク
テリウム属細菌と接触させることを特徴とするものであ
り、アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入ある
いは形質転換方法自体としては、周知の方法をそのまま
適用することができる。
菌と接触させる植物細胞又は植物組織として遠心処理し
たものを用いる、又は遠心処理を行いながらアグロバク
テリウム属細菌と接触させることを特徴とするものであ
り、アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入ある
いは形質転換方法自体としては、周知の方法をそのまま
適用することができる。
【００１２】アグロバクテリウム属細菌を用いた植物へ
の遺伝子導入あるいは形質転換方法自体は、この分野に
おいて周知であり、広く用いられている。
の遺伝子導入あるいは形質転換方法自体は、この分野に
おいて周知であり、広く用いられている。
【００１３】土壌細菌アグロバクテリウム（Agrobacter
ium tumefaciens）が多くの双子葉植物に根頭癌腫病（c
rown gall disease）を引き起こすことは古くから知ら
れており、1970年代には、Tiプラスミドが病原性に関与
すること、さらにTiプラスミドの一部であるT-DNAが植
物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後この
T-DNAには癌腫の誘発に必要なホルモン（サイトカイニ
ンとオーキシン）の合成に関与する遺伝子が存在し、細
菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかに
された。T-DNAの切り出しと植物への伝達にはTiプラス
ミド上のヴィルレンス領域（vir領域）に存在する遺伝
子群が必要であり、またT-DNAが切り出されるためにはT
-DNAの両端に存在するボーダー配列が必要である。他の
アグロバクテリウム属細菌であるAgrobacterium rhizog
enesもRiプラスミドによる同様なシステムを有している
（図３及び図４）。
ium tumefaciens）が多くの双子葉植物に根頭癌腫病（c
rown gall disease）を引き起こすことは古くから知ら
れており、1970年代には、Tiプラスミドが病原性に関与
すること、さらにTiプラスミドの一部であるT-DNAが植
物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後この
T-DNAには癌腫の誘発に必要なホルモン（サイトカイニ
ンとオーキシン）の合成に関与する遺伝子が存在し、細
菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかに
された。T-DNAの切り出しと植物への伝達にはTiプラス
ミド上のヴィルレンス領域（vir領域）に存在する遺伝
子群が必要であり、またT-DNAが切り出されるためにはT
-DNAの両端に存在するボーダー配列が必要である。他の
アグロバクテリウム属細菌であるAgrobacterium rhizog
enesもRiプラスミドによる同様なシステムを有している
（図３及び図４）。
【００１４】アグロバクテリウムの感染によってT-DNA
が植物ゲノムに組み込まれるので、T-DNA上に所望の遺
伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれ
ることが期待された。しかしながら、Tiプラスミドは19
0kb以上と巨大であるため、標準的な遺伝子工学手法で
はプラスミド上のT-DNA上に遺伝子を挿入することは困
難であった。そのため、T-DNA上に外来遺伝子を挿入す
るための方法が開発された。
が植物ゲノムに組み込まれるので、T-DNA上に所望の遺
伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれ
ることが期待された。しかしながら、Tiプラスミドは19
0kb以上と巨大であるため、標準的な遺伝子工学手法で
はプラスミド上のT-DNA上に遺伝子を挿入することは困
難であった。そのため、T-DNA上に外来遺伝子を挿入す
るための方法が開発された。
【００１５】まず、腫瘍性のTiプラスミドのT-DNAから
ホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型の菌系
（disarmed strains）であるLBA4404(Hoekema et al.,
1983(参考文献(12)))、C58C1(pGV3850) (Zambryski et
al., 1983(参考文献(40)))、GV3Ti11SE(Fraley et al.,
1985(参考文献(9)))などが作製された（図３）。これ
らを用いることにより、所望の遺伝子をアグロバクテリ
ウムのTiプラスミドのT-DNA中に、あるいは所望の遺伝
子を有するT-DNAをアグロバクテリウムに導入する2種類
の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が
容易で所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製
ができる中間ベクターを、アグロバクテリウムのディス
アーム型TiプラスミドのT-DNA領域中に、三系交雑法（t
riparental mating）(Ditta et al., 1980(参考文献
(8)))を介して相同組換えにより導入する方法であり、
中間ベクター法と呼ばれる(Fraley et al., 1985(参考
文献(9)); Fraley et al., 1983(参考文献(10)); Zambr
yski et al., 1983(参考文献(40))、特開昭59-140885号
（EP116718）)。もう一つは、バイナリーベクター（bin
ary vector）法とよばれるもので（図３）、T-DNAの植
物への組み込みにvir領域が必要であるが、機能するた
めに同じプラスミド上に存在する必要はないという結果
(Hoekema et al., 1983)に基づいている。このvir領域
にはvirA、virB、virC、virD、virE及びvirGが存在し、
（植物バイオテクノロジー事典（エンタプライズ株式会
社発行（1989）））、vir領域とはこのvirA、virB、vir
C、virD、virE及びvirGの全てを含むものをいう。した
がって、バイナリーベクターは、T-DNAをアグロバクテ
リウムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに
組み込んだものであり、これをディスアーム型Tiプラス
ミドを有するアグロバクテリウムに導入して用いる。ア
グロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入には、
エレクトロポレーション法や三系交雑法などの方法によ
り行うことができる。バイナリーベクターには、pBIN19
(Bevan, 1984(参考文献(4)))、pBI121(Jefferson,1987
(参考文献(19)))、pGA482(An et al., 1988(参考文献
(2))、特開昭60-70080号（EP120516）)などがあり、こ
れらをもとに数多くの新たなバイナリーベクターが構築
され、形質転換に用いられている。また、Ri プラスミ
ドのシステムにおいても、同様なベクターが構築され形
質転換に用いられている。
ホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型の菌系
（disarmed strains）であるLBA4404(Hoekema et al.,
1983(参考文献(12)))、C58C1(pGV3850) (Zambryski et
al., 1983(参考文献(40)))、GV3Ti11SE(Fraley et al.,
1985(参考文献(9)))などが作製された（図３）。これ
らを用いることにより、所望の遺伝子をアグロバクテリ
ウムのTiプラスミドのT-DNA中に、あるいは所望の遺伝
子を有するT-DNAをアグロバクテリウムに導入する2種類
の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が
容易で所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製
ができる中間ベクターを、アグロバクテリウムのディス
アーム型TiプラスミドのT-DNA領域中に、三系交雑法（t
riparental mating）(Ditta et al., 1980(参考文献
(8)))を介して相同組換えにより導入する方法であり、
中間ベクター法と呼ばれる(Fraley et al., 1985(参考
文献(9)); Fraley et al., 1983(参考文献(10)); Zambr
yski et al., 1983(参考文献(40))、特開昭59-140885号
（EP116718）)。もう一つは、バイナリーベクター（bin
ary vector）法とよばれるもので（図３）、T-DNAの植
物への組み込みにvir領域が必要であるが、機能するた
めに同じプラスミド上に存在する必要はないという結果
(Hoekema et al., 1983)に基づいている。このvir領域
にはvirA、virB、virC、virD、virE及びvirGが存在し、
（植物バイオテクノロジー事典（エンタプライズ株式会
社発行（1989）））、vir領域とはこのvirA、virB、vir
C、virD、virE及びvirGの全てを含むものをいう。した
がって、バイナリーベクターは、T-DNAをアグロバクテ
リウムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに
組み込んだものであり、これをディスアーム型Tiプラス
ミドを有するアグロバクテリウムに導入して用いる。ア
グロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入には、
エレクトロポレーション法や三系交雑法などの方法によ
り行うことができる。バイナリーベクターには、pBIN19
(Bevan, 1984(参考文献(4)))、pBI121(Jefferson,1987
(参考文献(19)))、pGA482(An et al., 1988(参考文献
(2))、特開昭60-70080号（EP120516）)などがあり、こ
れらをもとに数多くの新たなバイナリーベクターが構築
され、形質転換に用いられている。また、Ri プラスミ
ドのシステムにおいても、同様なベクターが構築され形
質転換に用いられている。
【００１６】アグロバクテリウムA281(Watson et al.,
1975(参考文献(39)))は、強病原性（super-virulent）
の菌系であり、その宿主範囲は広く、形質転換効率も他
の菌系より高い(Hood et al.,1987(参考文献(13)); Kom
ari, 1989(参考文献(21)))。この特性は、A281が有する
TiプラスミドのpTiBo542によるものである(Hood et a
l., 1984(参考文献(16)); Jin et al., 1987(参考文献
(20)); Komari et al., 1986(参考文献(24)))。
1975(参考文献(39)))は、強病原性（super-virulent）
の菌系であり、その宿主範囲は広く、形質転換効率も他
の菌系より高い(Hood et al.,1987(参考文献(13)); Kom
ari, 1989(参考文献(21)))。この特性は、A281が有する
TiプラスミドのpTiBo542によるものである(Hood et a
l., 1984(参考文献(16)); Jin et al., 1987(参考文献
(20)); Komari et al., 1986(参考文献(24)))。
【００１７】pTiBo542を用いて、これまでに2つの新し
いシステムが開発されている。一つはpTiBo542のディス
アーム型のTiプラスミドを有する菌系EHA101(Hood et a
l.,1986)およびEHA105(Hood et al., 1993)を用いたも
のであり、これらを上述のバイナリーベクターシステム
に適用することにより、形質転換能力の高いシステムと
して種々の植物の形質転換に利用されている。もう一つ
は、スーパーバイナリーベクター（'super-binary' vec
tor）(Hiei et al., 1994(参考文献(11)); Ishida et a
l., 1996(参考文献(18)); Komari et al., 1999(参考文
献(26))、WO94/00977号、WO95/06722号)システムである
（図４）。このシステムは、vir領域（virA、virB、vir
C、virD、virE及びvirG（以下、これらをぞれぞれ「vir
断片領域」ということもある。））を持つディスアーム
型のTiプラスミドおよびT-DNAを有するプラスミドから
なることから、バイナリーベクターシステムの一種であ
る。しかしながら、T-DNAを有する側のプラスミド、即
ちバイナリーベクターにvir断片領域のうち、少なくと
も一つのvir断片領域を実質的に取除いたvir領域の断片
（このうち好ましくは少なくともvirB又はvirGを含む断
片、さらに好ましくはvirB及びvirGを含む断片）を組み
込んだ(Komari, 1990a(参考文献(22)))スーパーバイナ
リーベクターを用いる点で異なる。なお、スーパーバイ
ナリーベクターを有するアグロバクテリウムに、所望の
遺伝子を組み込んだT-DNA領域を導入するには、三系交
雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる
(Komariet al., 1996(参考文献(25)))。このスーパーバ
イナリーベクターシステムは、上述の種々のベクターシ
ステムと比べて、多くの植物種で非常に高い形質転換効
率をもたらすことが明らかとなっている(Hiei et al.,
1994(参考文献(11)); Ishida et al., 1996(参考文献(1
8)); Komari, 1990b(参考文献(23)); Li et al.,1996
(参考文献(27)); Saito et al., 1992(参考文献(3
5)))。
いシステムが開発されている。一つはpTiBo542のディス
アーム型のTiプラスミドを有する菌系EHA101(Hood et a
l.,1986)およびEHA105(Hood et al., 1993)を用いたも
のであり、これらを上述のバイナリーベクターシステム
に適用することにより、形質転換能力の高いシステムと
して種々の植物の形質転換に利用されている。もう一つ
は、スーパーバイナリーベクター（'super-binary' vec
tor）(Hiei et al., 1994(参考文献(11)); Ishida et a
l., 1996(参考文献(18)); Komari et al., 1999(参考文
献(26))、WO94/00977号、WO95/06722号)システムである
（図４）。このシステムは、vir領域（virA、virB、vir
C、virD、virE及びvirG（以下、これらをぞれぞれ「vir
断片領域」ということもある。））を持つディスアーム
型のTiプラスミドおよびT-DNAを有するプラスミドから
なることから、バイナリーベクターシステムの一種であ
る。しかしながら、T-DNAを有する側のプラスミド、即
ちバイナリーベクターにvir断片領域のうち、少なくと
も一つのvir断片領域を実質的に取除いたvir領域の断片
（このうち好ましくは少なくともvirB又はvirGを含む断
片、さらに好ましくはvirB及びvirGを含む断片）を組み
込んだ(Komari, 1990a(参考文献(22)))スーパーバイナ
リーベクターを用いる点で異なる。なお、スーパーバイ
ナリーベクターを有するアグロバクテリウムに、所望の
遺伝子を組み込んだT-DNA領域を導入するには、三系交
雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる
(Komariet al., 1996(参考文献(25)))。このスーパーバ
イナリーベクターシステムは、上述の種々のベクターシ
ステムと比べて、多くの植物種で非常に高い形質転換効
率をもたらすことが明らかとなっている(Hiei et al.,
1994(参考文献(11)); Ishida et al., 1996(参考文献(1
8)); Komari, 1990b(参考文献(23)); Li et al.,1996
(参考文献(27)); Saito et al., 1992(参考文献(3
5)))。
【００１８】本発明の方法においては、宿主となるアグ
ロバクテリウム属細菌としては、特に限定されないが、
Agrobacterium tumefaciens （例えば上述のAgrobacter
iumtumefaciens LBA4404(Hoekema et al., 1983(参考文
献(12)))およびEHA101(Hoodet al., 1986(参考文献(1
5))）を好ましく用いることができる。
ロバクテリウム属細菌としては、特に限定されないが、
Agrobacterium tumefaciens （例えば上述のAgrobacter
iumtumefaciens LBA4404(Hoekema et al., 1983(参考文
献(12)))およびEHA101(Hoodet al., 1986(参考文献(1
5))）を好ましく用いることができる。
【００１９】本発明の方法によれば、アグロバクテリウ
ム属細菌における病原性（vir）領域の遺伝子群の発現
に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることな
く有意な効果を得ることができる。したがって、上述の
中間ベクター、バイナリーベクター、強病原性のバイナ
リーベクター、スーパーバイナリーベクターなどいずれ
のベクターシステムに対しても用いることができ、本発
明による効果を得ることができる。これらのベクター類
を改変した異なるベクターシステムを用いた場合におい
ても同様である（例えば、アグロバクテリウム属細菌の
vir領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミ
ド中に組み込む、vir領域の一部または全部を切り出し
新たなプラスミドの一部としてアグロバクテリウムに導
入するなど）。また、当然ではあるが本発明の方法によ
れば、野生型のアグロバクテリウム属細菌においても、
植物へ野生型のT-DNA領域の導入効率を高め、事実上感
染効率を向上することができる。
ム属細菌における病原性（vir）領域の遺伝子群の発現
に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることな
く有意な効果を得ることができる。したがって、上述の
中間ベクター、バイナリーベクター、強病原性のバイナ
リーベクター、スーパーバイナリーベクターなどいずれ
のベクターシステムに対しても用いることができ、本発
明による効果を得ることができる。これらのベクター類
を改変した異なるベクターシステムを用いた場合におい
ても同様である（例えば、アグロバクテリウム属細菌の
vir領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミ
ド中に組み込む、vir領域の一部または全部を切り出し
新たなプラスミドの一部としてアグロバクテリウムに導
入するなど）。また、当然ではあるが本発明の方法によ
れば、野生型のアグロバクテリウム属細菌においても、
植物へ野生型のT-DNA領域の導入効率を高め、事実上感
染効率を向上することができる。
【００２０】植物に導入しようとする所望の遺伝子は、
上記プラスミドのT-DNA領域中の制限酵素部位に常法に
より組み込むことができ、当該プラスミドに同時に若し
くは別途組込んだカナマイシン、パロモマイシン等の薬
剤に対する耐性を有する遺伝子等の適当な選択マーカー
に基づいて選択することができる。大型で多数の制限部
位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所
望のDNAをT-DNA領域内に導入することが必ずしも容易で
ないことがある。このような場合には、三系交雑法によ
り、アグロバクテリウム属細菌の細胞内での相同組換え
を利用することで目的のDNAを導入することができる。
上記プラスミドのT-DNA領域中の制限酵素部位に常法に
より組み込むことができ、当該プラスミドに同時に若し
くは別途組込んだカナマイシン、パロモマイシン等の薬
剤に対する耐性を有する遺伝子等の適当な選択マーカー
に基づいて選択することができる。大型で多数の制限部
位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所
望のDNAをT-DNA領域内に導入することが必ずしも容易で
ないことがある。このような場合には、三系交雑法によ
り、アグロバクテリウム属細菌の細胞内での相同組換え
を利用することで目的のDNAを導入することができる。
【００２１】また、プラスミドをAgrobacterium tumefa
ciens等のアグロバクテリウム属細菌に導入する操作は
従来法により行うことができ、例としては、上記した三
系交雑法やエレクトロポレーション法、エレクトロイン
ジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法な
どが含まれる。
ciens等のアグロバクテリウム属細菌に導入する操作は
従来法により行うことができ、例としては、上記した三
系交雑法やエレクトロポレーション法、エレクトロイン
ジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法な
どが含まれる。
【００２２】植物に導入しようとする遺伝子は、従来の
技術と同様に基本的にはT-DNAの左右境界配列の間に配
置されるものである。しかし、プラスミドが環状である
ため、境界配列の数は１つでもよく、複数の遺伝子を異
なる部位に配置しようとする場合には、境界配列が3個
以上あってもよい。また、アグロバクテリウム属細菌中
で、TiまたはRiプラスミド上に配置されてもよく、また
は他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには、複
数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
技術と同様に基本的にはT-DNAの左右境界配列の間に配
置されるものである。しかし、プラスミドが環状である
ため、境界配列の数は１つでもよく、複数の遺伝子を異
なる部位に配置しようとする場合には、境界配列が3個
以上あってもよい。また、アグロバクテリウム属細菌中
で、TiまたはRiプラスミド上に配置されてもよく、また
は他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには、複
数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
【００２３】アグロバクテリウム属細菌を介して遺伝子
導入を行う方法は、植物細胞又は植物組織をアグロバク
テリウム属細菌と単に接触させることにより行うことが
できる。例えば、１０6 〜１０11細胞／ｍｌ程度の細胞
濃度のアグロバクテリウム属細菌懸濁液を調製し、この
懸濁液中に植物細胞又は植物組織を３〜１０分間程度浸
漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行う
ことができる。
導入を行う方法は、植物細胞又は植物組織をアグロバク
テリウム属細菌と単に接触させることにより行うことが
できる。例えば、１０6 〜１０11細胞／ｍｌ程度の細胞
濃度のアグロバクテリウム属細菌懸濁液を調製し、この
懸濁液中に植物細胞又は植物組織を３〜１０分間程度浸
漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行う
ことができる。
【００２４】遺伝子導入に供される細胞又は組織は、何
ら限定されるものではなく、葉、根、茎、実、その他い
ずれの部位であってもよいし、カルスのような脱分化し
たものでも脱分化していない胚等であってもよい。ま
た、植物の種類も何ら限定されないが、被子植物が好ま
しく、被子植物ならば双子葉植物でも単子葉植物でもよ
い。
ら限定されるものではなく、葉、根、茎、実、その他い
ずれの部位であってもよいし、カルスのような脱分化し
たものでも脱分化していない胚等であってもよい。ま
た、植物の種類も何ら限定されないが、被子植物が好ま
しく、被子植物ならば双子葉植物でも単子葉植物でもよ
い。
【００２５】下記実施例において具体的に示されるよう
に、本発明の方法によれば、従来のアグロバクテリウム
法に比較して、遺伝子導入の効率が有意に向上する。
に、本発明の方法によれば、従来のアグロバクテリウム
法に比較して、遺伝子導入の効率が有意に向上する。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２７】実施例１ （1）アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド アグロバクテリウムおよびそのべクターには、LBA4404
（pBI121）(pBI121は米国クローンテック社より市販、
(Jefferson RA 1987(参考文献(19)))、LBA4404（pIG121
Hm）(Hiei, Y. et al., 1994(参考文献(11))、LBA4404
(pTOK233)(Hiei etal., 1994（参考文献(11)）)およびL
BA4404(pSB133）（図２）を用いた。
（pBI121）(pBI121は米国クローンテック社より市販、
(Jefferson RA 1987(参考文献(19)))、LBA4404（pIG121
Hm）(Hiei, Y. et al., 1994(参考文献(11))、LBA4404
(pTOK233)(Hiei etal., 1994（参考文献(11)）)およびL
BA4404(pSB133）（図２）を用いた。
【００２８】なお、pSB133の構築は、以下のように行っ
た。pGA482(An G et al., 1985(参考文献(3)))を制限酵
素Sal Iで消化して得た6.2 kbのＤＮＡ断片を、pSB11(K
omari et al., 1996(参考文献(25))をSalIで消化して得
られる5.1 kbpのＤＮＡ断片と結合してプラスミドを作
製した。次いで、このプラスミドを制限酵素EcoRI、Bgl
IIで消化して8.6 kbのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断
片を平滑化処理し、BglIIリンカー(TaKaRa社製)を挿入
してプラスミドpSB27を得た。このpSB27を制限酵素Hind
IIIで消化し、pIG221(Ohta S et al., 1990(参考文献(3
2))をHind IIIで消化することで得られる3.1 kbの35Sプ
ロモーター及びイントロン介在GUS遺伝子を含む断片を
挿入してpSB33を得た。pSB33を大腸菌LE392株に導入し
た後、Triparental mating法(Ditta G et al., 1980(参
考文献(8))により、pSB1(Komari et al., 1996(参考文
献(25)))を有するアグロバクテリウムLBA4404株に導入
した。pSB133はアグロバクテリウム内でpSB1とpSB33の
間の相同組換えにより得られた。pBI121のT-DNA領域に
は、ノパリン合成酵素遺伝子（nos）のプロモーターに
より制御されるカナマイシン耐性遺伝子（nptII）、カ
リフラワーモザイクウィルス（CaMV）の35Sプロモータ
ーにより制御されるGUS遺伝子を有する。pIG121Hm及びp
TOK233のT-DNA領域には、nosプロモーターにより制御さ
れるnptII遺伝子、35Sプロモーターにより制御されるhp
t遺伝子、35Sプロモーターにヒマのカタラーゼ遺伝子の
イントロンが介在するGUS遺伝子を有する。また、pSB13
3のT-DNA領域には、nosプロモーターにより制御されるn
ptII遺伝子、CaMVの35Sプロモーターに制御されヒマの
カタラーゼ遺伝子のイントロンが介在するGUS遺伝子を
有する(図２)。なお、pSB133及びpTOK233は形質転換能
力が高いスーパーバイナリーベクター(Komari, T. et a
l., 1999(参考文献(26)))である。
た。pGA482(An G et al., 1985(参考文献(3)))を制限酵
素Sal Iで消化して得た6.2 kbのＤＮＡ断片を、pSB11(K
omari et al., 1996(参考文献(25))をSalIで消化して得
られる5.1 kbpのＤＮＡ断片と結合してプラスミドを作
製した。次いで、このプラスミドを制限酵素EcoRI、Bgl
IIで消化して8.6 kbのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断
片を平滑化処理し、BglIIリンカー(TaKaRa社製)を挿入
してプラスミドpSB27を得た。このpSB27を制限酵素Hind
IIIで消化し、pIG221(Ohta S et al., 1990(参考文献(3
2))をHind IIIで消化することで得られる3.1 kbの35Sプ
ロモーター及びイントロン介在GUS遺伝子を含む断片を
挿入してpSB33を得た。pSB33を大腸菌LE392株に導入し
た後、Triparental mating法(Ditta G et al., 1980(参
考文献(8))により、pSB1(Komari et al., 1996(参考文
献(25)))を有するアグロバクテリウムLBA4404株に導入
した。pSB133はアグロバクテリウム内でpSB1とpSB33の
間の相同組換えにより得られた。pBI121のT-DNA領域に
は、ノパリン合成酵素遺伝子（nos）のプロモーターに
より制御されるカナマイシン耐性遺伝子（nptII）、カ
リフラワーモザイクウィルス（CaMV）の35Sプロモータ
ーにより制御されるGUS遺伝子を有する。pIG121Hm及びp
TOK233のT-DNA領域には、nosプロモーターにより制御さ
れるnptII遺伝子、35Sプロモーターにより制御されるhp
t遺伝子、35Sプロモーターにヒマのカタラーゼ遺伝子の
イントロンが介在するGUS遺伝子を有する。また、pSB13
3のT-DNA領域には、nosプロモーターにより制御されるn
ptII遺伝子、CaMVの35Sプロモーターに制御されヒマの
カタラーゼ遺伝子のイントロンが介在するGUS遺伝子を
有する(図２)。なお、pSB133及びpTOK233は形質転換能
力が高いスーパーバイナリーベクター(Komari, T. et a
l., 1999(参考文献(26)))である。
【００２９】（2）供試品種および組織 供試品種として、日本稲品種のコシヒカリおよび月の光
を用いた。開花後8〜14日目の未熟種子の頴を除去し、7
0％エタノールで数秒、ツイーン20を含む1％次亜塩素酸
ナトリウム水溶液で15分間滅菌処理を行った。滅菌水で
数回洗浄後、長さ1.5〜2mmの未熟胚を摘出し供試組織と
した。
を用いた。開花後8〜14日目の未熟種子の頴を除去し、7
0％エタノールで数秒、ツイーン20を含む1％次亜塩素酸
ナトリウム水溶液で15分間滅菌処理を行った。滅菌水で
数回洗浄後、長さ1.5〜2mmの未熟胚を摘出し供試組織と
した。
【００３０】（3）遠心処理 イネ未熟胚を滅菌水入りのチュ−ブの中に入れ、微量高
速遠心機、大型高速遠心機もしくは超高速遠心機を用い
て、760G〜150,000Gの遠心処理を行った。遠心処理終了
後、未熟胚にアグロバクテリウムを接種した。
速遠心機、大型高速遠心機もしくは超高速遠心機を用い
て、760G〜150,000Gの遠心処理を行った。遠心処理終了
後、未熟胚にアグロバクテリウムを接種した。
【００３１】（4）接種および共存培養 未熟胚への接種および共存培養の方法は、 Hiei et al.
(1994)（参考文献(11)）によった。すなわち、遠心処
理後、チューブ内部の滅菌水を除き、アグロバクテリウ
ムの懸濁液を加え、5〜30秒間ボルテックスミキサーに
より攪拌した。バクテリア懸濁液の調製は、ＡＢ培地
（Chilton, M-D et al., 1974(参考文献(6))）上で３〜
１０日間培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金
耳でかきとり、修正ＡＡ培地（ＡＡ主要無機塩類、ＡＡ
アミノ酸及びＡＡビタミン類（Toriyama K. et al., 19
85(参考文献(36))、ＭＳ微量塩類（Murashige, T et a
l., 1962(参考文献(30))、1.0 g/l カザミノ酸、100 μ
Ｍアセトシリンゴン、0.2 Mショ糖、0.2 M グルコー
ス）に懸濁することにより行った。約5分間室温で静置
した後、共存培養用の培地に置床した。共存培養用の培
地としては、2N6-AS培地(Hiei et al. 1994(参考文献(1
1)))の無機塩類をR2培地(Ohira et al. 1973(参考文献
(31)))の組成に変更して用いた。ただし、主要無機塩類
（KNO3, KH2PO4,CaCl22H2O, MgSO47H2O）については1/2
の濃度で培地に添加した。なお、接種菌密度は1×108
〜1×109 cfu/ml に調整した。共存培養は3〜13日間行
い、一部の未熟胚についてX-Glucを処理することによる
GUS発現を調査した（Hiei et a1.1994）（参考文献(1
1)）。すなわち、共存培養処理直後、組織を0.1% Trito
n X-100 を含む0.1 M リン酸緩衝液(pH6.8) に浸漬し、
３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液でアグロバクテ
リウムを除去した後、1.0 mM ５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸(X-gluc)およ
び20% メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７
℃で２４時間処理した後、青色の呈色を示す組織を顕微
鏡下で観察した。
(1994)（参考文献(11)）によった。すなわち、遠心処
理後、チューブ内部の滅菌水を除き、アグロバクテリウ
ムの懸濁液を加え、5〜30秒間ボルテックスミキサーに
より攪拌した。バクテリア懸濁液の調製は、ＡＢ培地
（Chilton, M-D et al., 1974(参考文献(6))）上で３〜
１０日間培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金
耳でかきとり、修正ＡＡ培地（ＡＡ主要無機塩類、ＡＡ
アミノ酸及びＡＡビタミン類（Toriyama K. et al., 19
85(参考文献(36))、ＭＳ微量塩類（Murashige, T et a
l., 1962(参考文献(30))、1.0 g/l カザミノ酸、100 μ
Ｍアセトシリンゴン、0.2 Mショ糖、0.2 M グルコー
ス）に懸濁することにより行った。約5分間室温で静置
した後、共存培養用の培地に置床した。共存培養用の培
地としては、2N6-AS培地(Hiei et al. 1994(参考文献(1
1)))の無機塩類をR2培地(Ohira et al. 1973(参考文献
(31)))の組成に変更して用いた。ただし、主要無機塩類
（KNO3, KH2PO4,CaCl22H2O, MgSO47H2O）については1/2
の濃度で培地に添加した。なお、接種菌密度は1×108
〜1×109 cfu/ml に調整した。共存培養は3〜13日間行
い、一部の未熟胚についてX-Glucを処理することによる
GUS発現を調査した（Hiei et a1.1994）（参考文献(1
1)）。すなわち、共存培養処理直後、組織を0.1% Trito
n X-100 を含む0.1 M リン酸緩衝液(pH6.8) に浸漬し、
３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液でアグロバクテ
リウムを除去した後、1.0 mM ５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸(X-gluc)およ
び20% メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７
℃で２４時間処理した後、青色の呈色を示す組織を顕微
鏡下で観察した。
【００３２】（5）形質転換細胞の選抜 共存培養後、未熟胚およびカルスを250mg/l カルベニシ
リンおよび250mg/l セフォタキシムを含み、200mg/lパ
ロモマイシンまたは10〜30mg/lハイグロマイシンを含む
1次選抜培地に移植し、30℃明条件下で1〜2週間培養し
た。1次選抜培地には、 Hiei et al. (1994)（参考文献
(11)）による2N6K培地に30g/lのD-ソルビトールを添加
した培地を用いた（K培地）。また、Hiei et al. (199
4)(参考文献(11))による2N6培地（Ｎ6 の無機塩および
ビタミン類（Chu C. C. 1978 (参考文献(7))）、1 g/l
カザミノ酸、2 mg/l ２，４−Ｄ）の(NH4)2SO4を232 m
g/lとしAA培地(Toriyama et al., 1985(参考文献(36)))
のアミノ酸類を添加した培地についても試験に供した
（N培地）。
リンおよび250mg/l セフォタキシムを含み、200mg/lパ
ロモマイシンまたは10〜30mg/lハイグロマイシンを含む
1次選抜培地に移植し、30℃明条件下で1〜2週間培養し
た。1次選抜培地には、 Hiei et al. (1994)（参考文献
(11)）による2N6K培地に30g/lのD-ソルビトールを添加
した培地を用いた（K培地）。また、Hiei et al. (199
4)(参考文献(11))による2N6培地（Ｎ6 の無機塩および
ビタミン類（Chu C. C. 1978 (参考文献(7))）、1 g/l
カザミノ酸、2 mg/l ２，４−Ｄ）の(NH4)2SO4を232 m
g/lとしAA培地(Toriyama et al., 1985(参考文献(36)))
のアミノ酸類を添加した培地についても試験に供した
（N培地）。
【００３３】1次選抜培地上に形成されたカルスを、250
mg/lセフォタキシムおよび250mg/lカルベニシリンを含
み、200mg/lパロモマイシンもしくは80mg/lハイグロマ
イシンを含む2次選抜培地上に移植し、30℃明条件下で1
〜2週間の培養を行った。2次選抜培地には、Hiei et a
l. (1994)（参考文献(11)） によるN6-7培地 の(NH4)2S
O4を232 mg/lとしAA培地(Toriyama et al., 1985(参考
文献(36)))のアミノ酸類を添加した培地を使用した。な
お、パロモマイシンを合有する上記の1次および2次選抜
培地には、培地固化剤に8g/lアガロースを使用した。耐
性カルスの出現率は、2次選抜後に調査した。
mg/lセフォタキシムおよび250mg/lカルベニシリンを含
み、200mg/lパロモマイシンもしくは80mg/lハイグロマ
イシンを含む2次選抜培地上に移植し、30℃明条件下で1
〜2週間の培養を行った。2次選抜培地には、Hiei et a
l. (1994)（参考文献(11)） によるN6-7培地 の(NH4)2S
O4を232 mg/lとしAA培地(Toriyama et al., 1985(参考
文献(36)))のアミノ酸類を添加した培地を使用した。な
お、パロモマイシンを合有する上記の1次および2次選抜
培地には、培地固化剤に8g/lアガロースを使用した。耐
性カルスの出現率は、2次選抜後に調査した。
【００３４】（6）形質転換体の再分化 未熟胚の胚盤部位から得られた選抜薬剤耐性のカルス
を、250mg/lカルベニシリンおよび250mg/lセフォタキシ
ムを含み、100mg/lパロモマイシンまたは50mg/lハイグ
ロマイシンを含む再分化培地N6S3培地(Hiei et al. 199
4（参考文献(11)））上に置床した。
を、250mg/lカルベニシリンおよび250mg/lセフォタキシ
ムを含み、100mg/lパロモマイシンまたは50mg/lハイグ
ロマイシンを含む再分化培地N6S3培地(Hiei et al. 199
4（参考文献(11)））上に置床した。
【００３５】（7）再分化個体におけるGUS発現の調査 25℃明条件下で4〜5週間の再分化培養を行なって得られ
た各薬剤耐性の再分化植物の葉片を、上記のようにX-Gl
ucを処理することにより、GUS発現を調査した（Hiei et
a1.1994（参考文献(11)））。再分化個体は500倍のHyp
onex水溶液中に移植し、25℃明条件下で約2週間育苗し
た後、温室内のポットヘ移植した。
た各薬剤耐性の再分化植物の葉片を、上記のようにX-Gl
ucを処理することにより、GUS発現を調査した（Hiei et
a1.1994（参考文献(11)））。再分化個体は500倍のHyp
onex水溶液中に移植し、25℃明条件下で約2週間育苗し
た後、温室内のポットヘ移植した。
【００３６】(8) 結果 (i)遠心処理効果の検討 微量高速遠心機、大型高速遠心機および超高速遠心機を
用いてイネの未熟胚への遠心処理効果を調べた結果、10K
Gから100KGの範囲の処理で遺伝子の導入効率が高まった
(表1, 2, 3, 6)。処理時間については10分間の処理で明
らかな効果が認められた(表4, 5)。また、コシヒカリと
月の光の品種間でのGUSの一過性発現頻度に違いは認め
られなかった。なお、遠心処理は遺伝子導入効率の向上
だけでなくカルス誘導を促進する効果が認められたこと
から、ほかの植物種を含めて、培養におけるカルスの誘
導および増殖に有用であることが示唆された。
用いてイネの未熟胚への遠心処理効果を調べた結果、10K
Gから100KGの範囲の処理で遺伝子の導入効率が高まった
(表1, 2, 3, 6)。処理時間については10分間の処理で明
らかな効果が認められた(表4, 5)。また、コシヒカリと
月の光の品種間でのGUSの一過性発現頻度に違いは認め
られなかった。なお、遠心処理は遺伝子導入効率の向上
だけでなくカルス誘導を促進する効果が認められたこと
から、ほかの植物種を含めて、培養におけるカルスの誘
導および増殖に有用であることが示唆された。
【００３７】表６の結果から超高速遠心機を用いた250K
Gの60分処理では、月の光未熟胚からのカルス誘導が全
く認められなかった。しかし、110KGの60分処理ではカル
ス誘導が確認され、GUS発現も高率で認められた。 同様に
コシヒカリについても超高速遠心機を用いた250 KG・60
分処理では、未熟胚からのカルス誘導が認められなかっ
た。以上の結果から、イネ未熟胚における遠心処理の効
果の範囲は5KG〜200KGと考えられ、処理方法の簡便性を
考慮すると微量高速遠心機および大型高速遠心機を使用
する場合には、20KG,40KG処理が適当と考えられる。さら
に表9, 10, 11の結果から、形質転換能力が高いとされ
るスーパーバイナリーベクターを有するLBA4404(pSB13
3)のみならず、通常のバイナリーベクターであるLBA4404
(pIG121Hm)でも、20KG・60分の遠心処理により未熟胚を
用いた形質転換が可能であることが明らかとなった。
Gの60分処理では、月の光未熟胚からのカルス誘導が全
く認められなかった。しかし、110KGの60分処理ではカル
ス誘導が確認され、GUS発現も高率で認められた。 同様に
コシヒカリについても超高速遠心機を用いた250 KG・60
分処理では、未熟胚からのカルス誘導が認められなかっ
た。以上の結果から、イネ未熟胚における遠心処理の効
果の範囲は5KG〜200KGと考えられ、処理方法の簡便性を
考慮すると微量高速遠心機および大型高速遠心機を使用
する場合には、20KG,40KG処理が適当と考えられる。さら
に表9, 10, 11の結果から、形質転換能力が高いとされ
るスーパーバイナリーベクターを有するLBA4404(pSB13
3)のみならず、通常のバイナリーベクターであるLBA4404
(pIG121Hm)でも、20KG・60分の遠心処理により未熟胚を
用いた形質転換が可能であることが明らかとなった。
【００３８】(ii) 遠心処理と共存培養期間の検討 表-7, 8の結果から共存培養期間が３日より6, 13日がト
ランジェントアッセイで高いGUS発現効率を示した。共存
培養期間が9日についても別の実験で高いGUS発現が認め
られた。現在、共存培養期間が異なる各種未熟胚を一次選
抜培地上(10ppmハイグロマイシン, 200ppmパロモマイシ
ン)で培養しているが、9,13日共存の区では、3,6日の共存
区と比較して薬剤耐性カルスの出現率が低い傾向にあ
る。
ランジェントアッセイで高いGUS発現効率を示した。共存
培養期間が9日についても別の実験で高いGUS発現が認め
られた。現在、共存培養期間が異なる各種未熟胚を一次選
抜培地上(10ppmハイグロマイシン, 200ppmパロモマイシ
ン)で培養しているが、9,13日共存の区では、3,6日の共存
区と比較して薬剤耐性カルスの出現率が低い傾向にあ
る。
【００３９】(iii) 遠心処理による形質転換効率の調
査 現在、上記により作出したGUS陽性の形質転換体(表4,5)
をそれぞれ順化し、栽培を継続している。一部分の系統に
ついては、採種を終了し稔性調査を行った。その結果、遠
心処理した形質転換体は無処理の形質転換体(コシヒカ
リ、月の光)と比較し、形態および稔性に差は認められな
かった。
査 現在、上記により作出したGUS陽性の形質転換体(表4,5)
をそれぞれ順化し、栽培を継続している。一部分の系統に
ついては、採種を終了し稔性調査を行った。その結果、遠
心処理した形質転換体は無処理の形質転換体(コシヒカ
リ、月の光)と比較し、形態および稔性に差は認められな
かった。
【００４０】Hiei et al. (1994（参考文献(11)））
は、イネのカルスを材料として比較的高い効率で形質転
換が行うことができることを報告している。また、Alde
mita RR et al. 1996(参考文献(1))は、イネの未熟胚を
用いた形質転換例を報告している。これらの形質転換手
法をより効率よく安定して実施するために、上述した遠
心処理法は非常に有効である。特に、未熟胚は栽培環境
に左右されやすく形質転換に好適な未熟胚材料を常時得
ることは容易ではないが、遠心処理を施すことにより安
定した高い形質転換効率を維持することが可能である。
Hiei et al. (1994（参考文献(11)））は、形質転換能
力の高いベクターであるスーパーバイナリーベクターが
イネの形質転換効率を向上させることを示した。また、
Aldemita et al., 1996(参考文献(1))によれば、スーパ
ーバイナリーベクターのLBA4404(pTOK233)を用いた試験
においてのみ、形質転換体を得ている。本研究における
遠心処理法は、通常のバイナリーベクターを用いた場合
においても、スーパーバイナリーベクターに匹敵する
か、それ以上の遺伝子導入効率を得ることができる。ま
た、スーパーバイナリーベクターと遠心処理法を併用す
ることにより、より一層効率を向上させることが可能で
ある。さらに、遠心処理法を用いることにより、これま
で全く形質転換体を得ることができなかった品種におい
ても形質転換体を得ることができるものと推察される。
は、イネのカルスを材料として比較的高い効率で形質転
換が行うことができることを報告している。また、Alde
mita RR et al. 1996(参考文献(1))は、イネの未熟胚を
用いた形質転換例を報告している。これらの形質転換手
法をより効率よく安定して実施するために、上述した遠
心処理法は非常に有効である。特に、未熟胚は栽培環境
に左右されやすく形質転換に好適な未熟胚材料を常時得
ることは容易ではないが、遠心処理を施すことにより安
定した高い形質転換効率を維持することが可能である。
Hiei et al. (1994（参考文献(11)））は、形質転換能
力の高いベクターであるスーパーバイナリーベクターが
イネの形質転換効率を向上させることを示した。また、
Aldemita et al., 1996(参考文献(1))によれば、スーパ
ーバイナリーベクターのLBA4404(pTOK233)を用いた試験
においてのみ、形質転換体を得ている。本研究における
遠心処理法は、通常のバイナリーベクターを用いた場合
においても、スーパーバイナリーベクターに匹敵する
か、それ以上の遺伝子導入効率を得ることができる。ま
た、スーパーバイナリーベクターと遠心処理法を併用す
ることにより、より一層効率を向上させることが可能で
ある。さらに、遠心処理法を用いることにより、これま
で全く形質転換体を得ることができなかった品種におい
ても形質転換体を得ることができるものと推察される。
【００４１】
【表１】表１ 各種遠心処理と共存培養後のGUS発現結
果 (供試菌系：LBA4404/pSB133) 遠心処理時間：10分、共存培養期間：3〜5日、GUS陽性
未熟胚数／供試未熟胚数 ( )内は胚盤におけるGUS発現領域の面積 -:なし,+:
小, ++:中, +++:大
果 (供試菌系：LBA4404/pSB133) 遠心処理時間：10分、共存培養期間：3〜5日、GUS陽性
未熟胚数／供試未熟胚数 ( )内は胚盤におけるGUS発現領域の面積 -:なし,+:
小, ++:中, +++:大
【００４２】
【表２】表２ コシヒカリ未熟胚からのパロモマイシン
耐性カルスの出現率 (供試菌系：LBA4404/pSB133) 耐性カルスの出現した未熟胚数／供試未熟胚数、2次選
抜終了時調査 遠心処理時間：10分、共存培養期間：3〜5日
耐性カルスの出現率 (供試菌系：LBA4404/pSB133) 耐性カルスの出現した未熟胚数／供試未熟胚数、2次選
抜終了時調査 遠心処理時間：10分、共存培養期間：3〜5日
【００４３】
【表３】表3月の光未熟胚からのパロモマイシン耐性カ
ルスの出現率(供試菌系：LBA4404/pSB133) 耐性カルスの出現した未熟胚数／供試未熟胚数、2次選
抜終了時調査 遠心処理時間：10分、共存培養期間：3〜5日
ルスの出現率(供試菌系：LBA4404/pSB133) 耐性カルスの出現した未熟胚数／供試未熟胚数、2次選
抜終了時調査 遠心処理時間：10分、共存培養期間：3〜5日
【００４４】
【表４】表4遠心処理時間と共存培養後のGUS発現結果
（品種：コシヒカリ） 遠心加速度：20,000G、供試品種:コシヒカリ GUS陽性
未熟胚数／供試未熟胚数 胚盤領域におけるGUS発現領域の面積 +:小, ++:中, ++
+:大
（品種：コシヒカリ） 遠心加速度：20,000G、供試品種:コシヒカリ GUS陽性
未熟胚数／供試未熟胚数 胚盤領域におけるGUS発現領域の面積 +:小, ++:中, ++
+:大
【００４５】
【表５】表-5 遠心処理時間とパロモマイシン耐性カル
スの出現率（品種：コシヒカリ） 遠心加速度：20,000G、共存培養期間：3〜5日、2次選抜
終了時調査 耐性カルスの出現した未熟胚数／供試未熟胚数
スの出現率（品種：コシヒカリ） 遠心加速度：20,000G、共存培養期間：3〜5日、2次選抜
終了時調査 耐性カルスの出現した未熟胚数／供試未熟胚数
【００４６】
【表６】表6 遠心処理強度と共存培養後のGUS発現(品
種：月の光) 供試菌系：LBA4404/pIG121Hm 、遠心処理時間：60分 1）微量高速遠心機 2)大型高速遠心機 3)超高速遠心
機 胚盤部に占めるGUS発現領域の割合 -:なし,±:＜1/8,
+:1/8-1/4, ++:＞1/4
種：月の光) 供試菌系：LBA4404/pIG121Hm 、遠心処理時間：60分 1）微量高速遠心機 2)大型高速遠心機 3)超高速遠心
機 胚盤部に占めるGUS発現領域の割合 -:なし,±:＜1/8,
+:1/8-1/4, ++:＞1/4
【００４７】
【表７】表7 遠心処理および共存培養期間と共存培養
後のGUS発現(品種:月の光) 供試菌系：LBA4404/pIG121Hm 、1)微量高速遠心機 2)
大型高速遠心機 それぞれの回転数に対し、60分間の遠心処理 胚盤部に占めるGUS発現領域の割合 -:なし,±:＜1/8,
+:1/8-1/4, ++:＞1/4
後のGUS発現(品種:月の光) 供試菌系：LBA4404/pIG121Hm 、1)微量高速遠心機 2)
大型高速遠心機 それぞれの回転数に対し、60分間の遠心処理 胚盤部に占めるGUS発現領域の割合 -:なし,±:＜1/8,
+:1/8-1/4, ++:＞1/4
【００４８】
【表８】表8 遠心処理および共存培養期間と共存培養
後のGUS発現(品種:コシヒカリ) 供試菌系：LBA4404/pIG121Hm 、1)微量高速遠心機 2)
大型高速遠心機 それぞれの回転数に対し、60分間の遠心処理 胚盤部に占めるGUS発現領域の割合 -:なし,±:＜1/8,
+:1/8-1/4, ++:＞1/4
後のGUS発現(品種:コシヒカリ) 供試菌系：LBA4404/pIG121Hm 、1)微量高速遠心機 2)
大型高速遠心機 それぞれの回転数に対し、60分間の遠心処理 胚盤部に占めるGUS発現領域の割合 -:なし,±:＜1/8,
+:1/8-1/4, ++:＞1/4
【００４９】
【表９】表9 LBA4404(pBI121)による形質転換結果（品
種：月の光） 遠心処理:20KG・60分 共存培養5日間
種：月の光） 遠心処理:20KG・60分 共存培養5日間
【００５０】
【表１０】表10 LBA4404(pIG121Hm)による形質転換結
果（品種：月の光） 遠心処理:20KG・60分 共存培養5日間
果（品種：月の光） 遠心処理:20KG・60分 共存培養5日間
【００５１】
【表１１】表11 LBA4404(pBI121)による形質転換結果
（品種：コシヒカリ） 遠心処理:20KG・60分 共存培養5日間
（品種：コシヒカリ） 遠心処理:20KG・60分 共存培養5日間
【００５２】
【表１２】表12 LBA4404(pSB133)による形質転換結果
（品種：コシヒカリ） 遠心処理:20KG・60分 共存培養3日間
（品種：コシヒカリ） 遠心処理:20KG・60分 共存培養3日間
【００５３】実施例2 大きさ約1.2 mmのトウモロコシ未熟胚（品種A188、農林
水産省生物資源研究所より入手）を無菌的に取り出し、
LS-inf液体培地で一回洗浄した。遠心管に未熟胚と100
μＭのアセトシリンゴンを含むLS-inf培地2.0 mlに約1
x 109 cfu/mlの濃度で、Agrobacterium tumefaciens LB
A4404(pSB131)（Ishida et al. 1996(参考文献(18))）
を懸濁した液を加え、40,000G, 4℃で30分間遠心処理し
た。対照の未熟胚は、前記と同様の細菌懸濁液中で30分
間、室温で静置した。処理後、緩やかに攪拌した後、胚
軸面が培地に接するようにLS-AS培地に置床した。ま
た、遠心処理後の未熟胚への接種は、以下の通り行っ
た。無菌的に取り出した未熟胚をLS-inf液体培地で一回
洗浄した後、同液体培地を含む遠心管に移し、20 KGま
たは40 KGで4℃、1時間の遠心処理を行った。対照は液
体培地中で1時間、室温で静置した。処理後、液体培地
を除き、約1 x 109 cfu/mlの濃度でLBA4404(pSB131)を
懸濁した液を加え、緩やかに攪拌した。5分間室温で静
置した後、胚軸面が培地に接するように10 μＭ AgNO3
を含むLS-AS培地に置床した。25℃、暗黒下で3日間共存
培養した後、一部の未熟胚を採取し、実施例１と同様に
X-glucによりGUS遺伝子のトランジェントな発現を調査
した。なお、上記の培地および培養法は、Ishida, Y.et
al. 1996(参考文献(18))に記載の方法に従った。
水産省生物資源研究所より入手）を無菌的に取り出し、
LS-inf液体培地で一回洗浄した。遠心管に未熟胚と100
μＭのアセトシリンゴンを含むLS-inf培地2.0 mlに約1
x 109 cfu/mlの濃度で、Agrobacterium tumefaciens LB
A4404(pSB131)（Ishida et al. 1996(参考文献(18))）
を懸濁した液を加え、40,000G, 4℃で30分間遠心処理し
た。対照の未熟胚は、前記と同様の細菌懸濁液中で30分
間、室温で静置した。処理後、緩やかに攪拌した後、胚
軸面が培地に接するようにLS-AS培地に置床した。ま
た、遠心処理後の未熟胚への接種は、以下の通り行っ
た。無菌的に取り出した未熟胚をLS-inf液体培地で一回
洗浄した後、同液体培地を含む遠心管に移し、20 KGま
たは40 KGで4℃、1時間の遠心処理を行った。対照は液
体培地中で1時間、室温で静置した。処理後、液体培地
を除き、約1 x 109 cfu/mlの濃度でLBA4404(pSB131)を
懸濁した液を加え、緩やかに攪拌した。5分間室温で静
置した後、胚軸面が培地に接するように10 μＭ AgNO3
を含むLS-AS培地に置床した。25℃、暗黒下で3日間共存
培養した後、一部の未熟胚を採取し、実施例１と同様に
X-glucによりGUS遺伝子のトランジェントな発現を調査
した。なお、上記の培地および培養法は、Ishida, Y.et
al. 1996(参考文献(18))に記載の方法に従った。
【００５４】LBA4404(pSB131)を接種したA188未熟胚で
のGUS遺伝子のトランジェントな発現を表１３に示す。
いずれの未熟胚もGUS遺伝子の発現を示したが、対照の
未熟胚に比べ、遠心処理を行った未熟胚では、より広い
範囲での発現を示すものが多く確認された。遠心処理に
よる遺伝子導入部位の増大は、アグロバクテリウム菌と
ともに遠心処理を行った場合、遠心処理後アグロバクテ
リウム菌を接種した場合の両方で認められた。また、遠
心強度及び処理時間を変えた場合でも対照に比べより広
い範囲でのGUS遺伝子の発現が認められた。
のGUS遺伝子のトランジェントな発現を表１３に示す。
いずれの未熟胚もGUS遺伝子の発現を示したが、対照の
未熟胚に比べ、遠心処理を行った未熟胚では、より広い
範囲での発現を示すものが多く確認された。遠心処理に
よる遺伝子導入部位の増大は、アグロバクテリウム菌と
ともに遠心処理を行った場合、遠心処理後アグロバクテ
リウム菌を接種した場合の両方で認められた。また、遠
心強度及び処理時間を変えた場合でも対照に比べより広
い範囲でのGUS遺伝子の発現が認められた。
【００５５】以上の結果から、遠心処理した未熟胚を選
抜培地で培養すれば、対照に比べより高い効率で、形質
転換植物の得られる可能性が示された。また、従来のア
グロバクテリウム法では形質転換できなかったA188以外
のトウモロコシ品種（Ishidaet al. 1996(参考文献(1
8))）についても遠心処理することにより形質転換植物
の得られる可能性が示唆された。
抜培地で培養すれば、対照に比べより高い効率で、形質
転換植物の得られる可能性が示された。また、従来のア
グロバクテリウム法では形質転換できなかったA188以外
のトウモロコシ品種（Ishidaet al. 1996(参考文献(1
8))）についても遠心処理することにより形質転換植物
の得られる可能性が示唆された。
【００５６】
【表１３】表１３ A188未熟胚でのGUS遺伝子のトラ
ンジェントな発現 対照は1 Gでの処理。試験1はアグロバクテリウム菌共存
下で遠心処理を行った。試験2は遠心処理後、アグロバ
クテリウム菌の接種を行った。
ンジェントな発現 対照は1 Gでの処理。試験1はアグロバクテリウム菌共存
下で遠心処理を行った。試験2は遠心処理後、アグロバ
クテリウム菌の接種を行った。
【００５７】
【発明の効果】本発明により、従来のアグロバクテリウ
ム法による遺伝子導入方法よりも高い効率で、組織を付
傷することなく簡便に遺伝子導入を行うことができる、
植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法が提供
された。本発明の方法は、単子葉植物に対しても双子葉
植物に対しても適用可能である。
ム法による遺伝子導入方法よりも高い効率で、組織を付
傷することなく簡便に遺伝子導入を行うことができる、
植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法が提供
された。本発明の方法は、単子葉植物に対しても双子葉
植物に対しても適用可能である。
【００５８】参考文献 (1) Aldemita RR, Hodges TK (1996) Agrobacterium tu
mefaciens-mediated transformation of japonica and
indica rice varieties. Planta 199: 612-617 (2) An, G., Evert, P.R., Mitra, A. and Ha, S.B. (1
988) Binary vectors. In Gelvin, S.B. and Schilpero
ort, R.A. (eds.), Plant Molecular Biology Manual A
3. Kluwer Academic Press, Dordrecht, pp. 1-19. (3) An, G., Watson, BD., Stachel, S., Gordon, MP.
& Nester, EW., (1985)New cloning vehicles for tran
sformation of higher plants. EMBO J., 4:277-288. (4) Bevan, M. (1984) Binary Agrobacterium vectors
for plant transformation. Nucleic Acids Res., 12,
8711-8721. (5) Bidney, D., Scelonge, C., Martich, J., Burrus,
M., Sims, L., and Huffmanm G. (1992) Microproject
ile bombardment of plant tissues increases transfo
rmation frequency by Agrobacterium tumefaciens. Pl
ant Mol. Biol.,18, 301-313. (6) Chilton, M-D., Currier, TC. Farrand, SK. Bendi
ch, AJ. Gordon, MP. &Nester EW. (1974) Agrobacteri
um tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not d
etected in crown gall tumers . Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 71:3672-3676 (7) Chu, C. C., (1978) Proc. Symp. Plant Tissue Cu
lture, Science Press Peking, pp.43-50 (8) Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D. and Helin
ski, D.R. (1980) Broadhost range DNA cloning syste
m for Gram-negative bacteria: Constructionof gene
bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77, 7347-7351. (9) Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B., Eich
oltz, D.A. and Flick,J.S. (1985) The SEV system: a
new disarmed Ti plasmid vector for plant transfor
mation. Bio/technology, 3, 629-635. (10) Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B., San
ders, P.R., Flick, J.S., Adams, S.P., Bittner, M.
L., Brand, L.A., Fink, C.L., Fry, J.S., Galluppi,
G.R., Goldberg, S.B., Hoffmann, N.L. and Woo, S.C.
(1983) Expression of bacterial genes in plant cel
ls. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 4803-4807. (11) Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. and Kumashiro,
T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza
sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence
analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plan
t Journal, 6, 271-282. (12) Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. a
nd Schilperoort, R.A.(1983) A binary plant vector
strategy based on separation of vir- and T-region
of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Natur
e, 303, 179-180. (13) Hood, E.E., Fraley, R.T. and Chilton, M.-D.
(1987) Virulence of Agrobacterium tumefaciens stra
in A281 on legumes. Plant Physiol, 83, 529-534. (14) Hood, E.E., Gelvin, S.B., Melchers, L.S. and
Hoekema, A. (1993) NewAgrobacterium helper plasmid
s for gene transfer to plants. Transgenic Res., 2,
208-218. (15) Hood, E.E., Helmer, G.L., Fraley, R.T. and Ch
ilton, M.-D. (1986) The hypervirulence of Agrobact
erium tumefaciens A281 is encoded in a region of p
TiBo542 outside of T-DNA. J. Bacteriol., 168, 1291
-1301. (16) Hood, E.E., Jen, G., Kayes, L., Kramer, J., F
raley, R.T. and Chilton, M.-D. (1984) Restriction
endonuclease map of pTiBo542, a potential Ti-plasm
id vector for genetic engineering of plants. Bio/t
echnology, 2, 702-709. (17) Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., E
ichholtz, D., Rpgers,S. G. and Fraley, R. T.(1985)
A simple and general method for transferring gene
s into plants. Science 227, 1229-1231. (18) Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Ko
mari, T. and Kumashiro, T. (1996) High efficiency
transformation of maize (Zea mays L.) mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnol, 14,
745-750. (19) Jefferson, R.A. (1987) Assaying chimeric gene
s in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mo
l. Biol. Rep., 5, 387-405. (20) Jin, S., Komari, T., Gordon, M.P. and Nester,
E.W. (1987) Genes responsible for the supervirule
nce phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281.
J. Bacteriol., 169, 4417-4425. (21) Komari, T. (1989) Transformation of callus cu
ltures of nine plant species mediated by Agrobacte
rium. Plant Sci., 60, 223-229. (22) Komari, T. (1990a) Genetic characterization o
f double-flowered tobacco plant obtained in a tran
sformation experiment. Theor. Appl. Genet.,80, 167
-171. (23) Komari, T. (1990b) Transformation of cultured
cells of Chenopodiumquinoa by binary vectors that
carry a fragment of DNA from the virulenceregion
of pTiBo542. Plant Cell Reports, 9, 303-306. (24) Komari, T., Halperin, W. and Nester, E.W. (19
86) Physical and functional map of supervirulent A
grobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid pT
iBo542. J. Bacteriol., 166, 88-94. (25) Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N. an
d Kumashiro, T. (1996)Vectors carrying two separat
e T-DNAs for co-transformation of higher plants me
diated by Agrobacterium tumefaciens and segregatio
n of transformants free from selection markers. Pl
ant J, 10, 165-174. (26) Komari, T. and Kubo, T. (1999) Methods of Gen
etic Transformation: Agrobacterium tumefaciens. In
Vasil, I.K. (ed.) Molecular improvement ofcereal
crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp.
43-82. (27) Li, H.-Q., Sautter, C., Potrykus, I. and Puon
ti-Kaerlas, J. (1996)Genetic transformation of cas
sava (Manihot esculenta Crantz). Nature Biotechno
l., 14, 736-740. (28) Lindsey, K., Gallois, P. and Eady, C. (1991)
Regeneration and transformation of sugarbeet by Ag
robacterium tumefaciens. Plant Tissue Culture Manu
al B7:1-13. Kluwer Academic Publishers. (29) McCormick, S. (1991) Transformation of tomato
with Agrobacterium tumefaciens. Plant Tissue Cult
ure Manual B6:1-9. Kluwer Academic Publishers. (30) Murashige, T. and Skoog, F. (1962) Physiol. P
lant 15:473-497. (31) Ohira, K., Ojima, K., Fujiwara, A. (1973) Stu
dies on the nutritionof rice cell culture I. A sim
ple, defined medium for rapid growth in suspension
culture. Plant Cell Physol., 14:1113-1121. (32) Ohta, S., Mita, S., Hattori, T., Namamura,
K. (1990) Constructionand expression in tobacco of
aβ-glucuronidase (GUS) reporter gene containing
an intron within the coding sequence. Plant Cell P
hysiol. 31: 805-813. (33) Potrykus, I., Bilang, R., Futterer, J., Saut
ter, C. and Schrott, M. (1998) Agricultural Biotec
nology, NY:Mercel Dekker Inc. pp. 119-159. (34) Rogers, S.G., Horsch, R.B. and Fraley, R. T.
(1988) Gene transfer in plants: Production of tran
sformed plants using Ti plasmid vectors. Method fo
r Plant Molecular Biology, CA: Academic Press Inc.
pp.423-436. (35) Saito, Y., Komari, T., Masuta, C., Hayashi,
Y., Kumashiro, T. and Takanami, Y. (1992) Cucumber
mosaic virus-tolerant transgenic tomato plants ex
pressing a satellite RNA. Theor. Appl. Genet., 83,
679-683. (36) Toriyama, K. and Hinata, K. (1985) Plant Sci.
41:179-183 (37) Trick, H.N. and Finer, J.J. (1997) SAAT: soni
cation-assisted Agrobacterium-mediated transformat
ion. Transgenic Research 6:329-336. (38) Visser, R.G.F. (1991) Regeneration and transf
ormation of potato byAgrobacterium tumefaciens. Pl
ant Tissue Culture Manual B5:1-9. Kluwer Academic
Publishers. (39) Watson, B., Currier, T.C., Gordon, M.P., Chil
ton, M.-D. and Nester,E.W. (1975) Plasmid required
for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bac
teriol, 123, 255-264. (40) Zambryski, P., Joos, H., Genetello, C., Leema
ns, J., Van Montagu, M. and Schell, J. (1983) Ti p
lasmid vector for the introduction of DNA into pla
nt cells without alteration of their normal regene
ration capacity.EMBO J, 2, 2143-2150.
mefaciens-mediated transformation of japonica and
indica rice varieties. Planta 199: 612-617 (2) An, G., Evert, P.R., Mitra, A. and Ha, S.B. (1
988) Binary vectors. In Gelvin, S.B. and Schilpero
ort, R.A. (eds.), Plant Molecular Biology Manual A
3. Kluwer Academic Press, Dordrecht, pp. 1-19. (3) An, G., Watson, BD., Stachel, S., Gordon, MP.
& Nester, EW., (1985)New cloning vehicles for tran
sformation of higher plants. EMBO J., 4:277-288. (4) Bevan, M. (1984) Binary Agrobacterium vectors
for plant transformation. Nucleic Acids Res., 12,
8711-8721. (5) Bidney, D., Scelonge, C., Martich, J., Burrus,
M., Sims, L., and Huffmanm G. (1992) Microproject
ile bombardment of plant tissues increases transfo
rmation frequency by Agrobacterium tumefaciens. Pl
ant Mol. Biol.,18, 301-313. (6) Chilton, M-D., Currier, TC. Farrand, SK. Bendi
ch, AJ. Gordon, MP. &Nester EW. (1974) Agrobacteri
um tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not d
etected in crown gall tumers . Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 71:3672-3676 (7) Chu, C. C., (1978) Proc. Symp. Plant Tissue Cu
lture, Science Press Peking, pp.43-50 (8) Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D. and Helin
ski, D.R. (1980) Broadhost range DNA cloning syste
m for Gram-negative bacteria: Constructionof gene
bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77, 7347-7351. (9) Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B., Eich
oltz, D.A. and Flick,J.S. (1985) The SEV system: a
new disarmed Ti plasmid vector for plant transfor
mation. Bio/technology, 3, 629-635. (10) Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B., San
ders, P.R., Flick, J.S., Adams, S.P., Bittner, M.
L., Brand, L.A., Fink, C.L., Fry, J.S., Galluppi,
G.R., Goldberg, S.B., Hoffmann, N.L. and Woo, S.C.
(1983) Expression of bacterial genes in plant cel
ls. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 4803-4807. (11) Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. and Kumashiro,
T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza
sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence
analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plan
t Journal, 6, 271-282. (12) Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. a
nd Schilperoort, R.A.(1983) A binary plant vector
strategy based on separation of vir- and T-region
of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Natur
e, 303, 179-180. (13) Hood, E.E., Fraley, R.T. and Chilton, M.-D.
(1987) Virulence of Agrobacterium tumefaciens stra
in A281 on legumes. Plant Physiol, 83, 529-534. (14) Hood, E.E., Gelvin, S.B., Melchers, L.S. and
Hoekema, A. (1993) NewAgrobacterium helper plasmid
s for gene transfer to plants. Transgenic Res., 2,
208-218. (15) Hood, E.E., Helmer, G.L., Fraley, R.T. and Ch
ilton, M.-D. (1986) The hypervirulence of Agrobact
erium tumefaciens A281 is encoded in a region of p
TiBo542 outside of T-DNA. J. Bacteriol., 168, 1291
-1301. (16) Hood, E.E., Jen, G., Kayes, L., Kramer, J., F
raley, R.T. and Chilton, M.-D. (1984) Restriction
endonuclease map of pTiBo542, a potential Ti-plasm
id vector for genetic engineering of plants. Bio/t
echnology, 2, 702-709. (17) Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., E
ichholtz, D., Rpgers,S. G. and Fraley, R. T.(1985)
A simple and general method for transferring gene
s into plants. Science 227, 1229-1231. (18) Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Ko
mari, T. and Kumashiro, T. (1996) High efficiency
transformation of maize (Zea mays L.) mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnol, 14,
745-750. (19) Jefferson, R.A. (1987) Assaying chimeric gene
s in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mo
l. Biol. Rep., 5, 387-405. (20) Jin, S., Komari, T., Gordon, M.P. and Nester,
E.W. (1987) Genes responsible for the supervirule
nce phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281.
J. Bacteriol., 169, 4417-4425. (21) Komari, T. (1989) Transformation of callus cu
ltures of nine plant species mediated by Agrobacte
rium. Plant Sci., 60, 223-229. (22) Komari, T. (1990a) Genetic characterization o
f double-flowered tobacco plant obtained in a tran
sformation experiment. Theor. Appl. Genet.,80, 167
-171. (23) Komari, T. (1990b) Transformation of cultured
cells of Chenopodiumquinoa by binary vectors that
carry a fragment of DNA from the virulenceregion
of pTiBo542. Plant Cell Reports, 9, 303-306. (24) Komari, T., Halperin, W. and Nester, E.W. (19
86) Physical and functional map of supervirulent A
grobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid pT
iBo542. J. Bacteriol., 166, 88-94. (25) Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N. an
d Kumashiro, T. (1996)Vectors carrying two separat
e T-DNAs for co-transformation of higher plants me
diated by Agrobacterium tumefaciens and segregatio
n of transformants free from selection markers. Pl
ant J, 10, 165-174. (26) Komari, T. and Kubo, T. (1999) Methods of Gen
etic Transformation: Agrobacterium tumefaciens. In
Vasil, I.K. (ed.) Molecular improvement ofcereal
crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp.
43-82. (27) Li, H.-Q., Sautter, C., Potrykus, I. and Puon
ti-Kaerlas, J. (1996)Genetic transformation of cas
sava (Manihot esculenta Crantz). Nature Biotechno
l., 14, 736-740. (28) Lindsey, K., Gallois, P. and Eady, C. (1991)
Regeneration and transformation of sugarbeet by Ag
robacterium tumefaciens. Plant Tissue Culture Manu
al B7:1-13. Kluwer Academic Publishers. (29) McCormick, S. (1991) Transformation of tomato
with Agrobacterium tumefaciens. Plant Tissue Cult
ure Manual B6:1-9. Kluwer Academic Publishers. (30) Murashige, T. and Skoog, F. (1962) Physiol. P
lant 15:473-497. (31) Ohira, K., Ojima, K., Fujiwara, A. (1973) Stu
dies on the nutritionof rice cell culture I. A sim
ple, defined medium for rapid growth in suspension
culture. Plant Cell Physol., 14:1113-1121. (32) Ohta, S., Mita, S., Hattori, T., Namamura,
K. (1990) Constructionand expression in tobacco of
aβ-glucuronidase (GUS) reporter gene containing
an intron within the coding sequence. Plant Cell P
hysiol. 31: 805-813. (33) Potrykus, I., Bilang, R., Futterer, J., Saut
ter, C. and Schrott, M. (1998) Agricultural Biotec
nology, NY:Mercel Dekker Inc. pp. 119-159. (34) Rogers, S.G., Horsch, R.B. and Fraley, R. T.
(1988) Gene transfer in plants: Production of tran
sformed plants using Ti plasmid vectors. Method fo
r Plant Molecular Biology, CA: Academic Press Inc.
pp.423-436. (35) Saito, Y., Komari, T., Masuta, C., Hayashi,
Y., Kumashiro, T. and Takanami, Y. (1992) Cucumber
mosaic virus-tolerant transgenic tomato plants ex
pressing a satellite RNA. Theor. Appl. Genet., 83,
679-683. (36) Toriyama, K. and Hinata, K. (1985) Plant Sci.
41:179-183 (37) Trick, H.N. and Finer, J.J. (1997) SAAT: soni
cation-assisted Agrobacterium-mediated transformat
ion. Transgenic Research 6:329-336. (38) Visser, R.G.F. (1991) Regeneration and transf
ormation of potato byAgrobacterium tumefaciens. Pl
ant Tissue Culture Manual B5:1-9. Kluwer Academic
Publishers. (39) Watson, B., Currier, T.C., Gordon, M.P., Chil
ton, M.-D. and Nester,E.W. (1975) Plasmid required
for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bac
teriol, 123, 255-264. (40) Zambryski, P., Joos, H., Genetello, C., Leema
ns, J., Van Montagu, M. and Schell, J. (1983) Ti p
lasmid vector for the introduction of DNA into pla
nt cells without alteration of their normal regene
ration capacity.EMBO J, 2, 2143-2150.
【図１】本発明の方法に好ましく用いることができるス
ーパーバイナリーベクターの例であるpTOK233の構築方
法を示す図である。
ーパーバイナリーベクターの例であるpTOK233の構築方
法を示す図である。
【図２】本発明の方法に好ましく用いることができるス
ーパーバイナリーベクターの例であるpSB133の遺伝子地
図を示す図である。
ーパーバイナリーベクターの例であるpSB133の遺伝子地
図を示す図である。
【図３】アグロバクテリウム属細菌の主要な２種類のベ
クターシステムである中間ベクターシステムとバイナリ
ーベクターシステムの構築過程を示す模式図である。
クターシステムである中間ベクターシステムとバイナリ
ーベクターシステムの構築過程を示す模式図である。
【図４】アグロバクテリウム ツメファシエンスの強病
原性菌株A281に由来する２種類のバイナリーベクターシ
ステムを示す模式図である。
原性菌株A281に由来する２種類のバイナリーベクターシ
ステムを示す模式図である。
virB Agrobacterium tumefaciens A281に含まれるＴｉ
プラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirB遺伝子 virC Agrobacterium tumefaciens A281に含まれるＴｉ
プラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirC遺伝子 virG Agrobacterium tumefaciens A281に含まれるＴｉ
プラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirG遺伝子 BL アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの左ボーダ
ー配列 BR アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダ
ー配列 TC テトラサイクリン抵抗性遺伝子 SP スペクチノマイシン抵抗性遺伝子 IG イントロンＧＵＳ遺伝子 HPT ハイグロマイシン抵抗性遺伝子 K 制限酵素ＫｐｎＩ部位 H 制限酵素ＨｉｎｄIII 部位 Ampr アンピシリン耐性遺伝子 BAR bar遺伝子 Pnos ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター Tnos ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター P35S CaMV 35Sプロモーター COS, cos ラムダファージのCOS部位 ORI, ori ColE1の複製開始点 NPT,NPTII カナマイシン抵抗性遺伝子 Vir アグロバクテリウム属細菌のTiプラスミドの全vir
領域 S Vir 強病原性アグロバクテリウム属細菌のTiプラス
ミドpTiBo542の全vir領域 s vir* TiプラスミドpTiBo542のvir領域の一部を含む
断片
プラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirB遺伝子 virC Agrobacterium tumefaciens A281に含まれるＴｉ
プラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirC遺伝子 virG Agrobacterium tumefaciens A281に含まれるＴｉ
プラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirG遺伝子 BL アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの左ボーダ
ー配列 BR アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダ
ー配列 TC テトラサイクリン抵抗性遺伝子 SP スペクチノマイシン抵抗性遺伝子 IG イントロンＧＵＳ遺伝子 HPT ハイグロマイシン抵抗性遺伝子 K 制限酵素ＫｐｎＩ部位 H 制限酵素ＨｉｎｄIII 部位 Ampr アンピシリン耐性遺伝子 BAR bar遺伝子 Pnos ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター Tnos ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター P35S CaMV 35Sプロモーター COS, cos ラムダファージのCOS部位 ORI, ori ColE1の複製開始点 NPT,NPTII カナマイシン抵抗性遺伝子 Vir アグロバクテリウム属細菌のTiプラスミドの全vir
領域 S Vir 強病原性アグロバクテリウム属細菌のTiプラス
ミドpTiBo542の全vir領域 s vir* TiプラスミドpTiBo542のvir領域の一部を含む
断片
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石田 祐二 静岡県磐田郡豊田町東原700番地 日本た ばこ産業株式会社遺伝育種研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 4B024 AA20 BA12 CA04 DA01 EA10 FA10 GA17 GA25 HA20 4B065 AA11X AA89X AB01 AB03 AC10 BA25 BC50 CA31 CA60
Claims (11)
- 【請求項１】 植物細胞又は植物組織を遠心処理するこ
とを伴う、アグロバクテリウム属細菌を介して行われる
植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法。 - 【請求項２】 植物細胞又は植物組織を遠心処理した
後、遺伝子導入処理を行う請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 遠心処理が１００Ｇ〜２５万Ｇの遠心加
速度の範囲で行われる請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 遠心処理が５００Ｇ〜２０万Ｇの遠心加
速度の範囲で行われる請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 遠心処理が１０００Ｇ〜１５万Ｇの遠心
加速度の範囲で行われる請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 遠心処理が１秒間〜４時間の範囲で行わ
れる請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 遠心処理が５分間〜２時間の範囲で行わ
れる請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 用いる植物細胞又は植物組織が被子植物
由来である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項９】 用いる植物細胞又は植物組織が単子葉植
物由来である請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 用いる植物細胞又は植物組織がイネ科
植物由来である請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 用いる植物細胞又は植物組織がイネ又
はトウモロコシである請求項１０記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15802599A JP4424784B2 (ja) | 1999-06-04 | 1999-06-04 | 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 |
| PCT/JP2000/005213 WO2002012520A1 (fr) | 1999-06-04 | 2000-08-03 | Procede permettant d'ameliorer l'efficacite du transfert de genes dans des cellules vegetales |
| US13/099,917 US9840714B2 (en) | 1999-06-04 | 2011-05-03 | Method for promoting efficiency of gene introduction into plant cells |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15802599A JP4424784B2 (ja) | 1999-06-04 | 1999-06-04 | 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 |
| PCT/JP2000/005213 WO2002012520A1 (fr) | 1999-06-04 | 2000-08-03 | Procede permettant d'ameliorer l'efficacite du transfert de genes dans des cellules vegetales |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000342256A true JP2000342256A (ja) | 2000-12-12 |
| JP4424784B2 JP4424784B2 (ja) | 2010-03-03 |
Family
ID=26344920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15802599A Expired - Lifetime JP4424784B2 (ja) | 1999-06-04 | 1999-06-04 | 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4424784B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005017169A1 (ja) * | 2003-08-13 | 2005-02-24 | Japan Tobacco Inc. | 植物材料への遺伝子導入を行う方法 |
| WO2005017152A1 (ja) | 2003-08-13 | 2005-02-24 | Japan Tobacco Inc. | 銅イオンの添加により植物の形質転換効率を向上させる方法 |
| WO2007069643A1 (ja) | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Japan Tobacco Inc. | 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 |
| WO2008105508A1 (ja) | 2007-02-28 | 2008-09-04 | Japan Tobacco Inc. | ３，６－ジクロロ－ｏ－アニシン酸を含む共存培地で植物組織を培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法 |
| WO2008105509A1 (ja) | 2007-02-28 | 2008-09-04 | Japan Tobacco Inc. | 選抜工程を経ないアグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 |
| WO2009122962A1 (ja) | 2008-03-31 | 2009-10-08 | 日本たばこ産業株式会社 | アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 |
-
1999
- 1999-06-04 JP JP15802599A patent/JP4424784B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2085477A1 (en) | 2003-08-13 | 2009-08-05 | Japan Tobacco, Inc. | A method for improving plant transformation efficiency by adding copper ion |
| US7709700B2 (en) | 2003-08-13 | 2010-05-04 | Japan Tobacco Inc. | Method for improving plant transformation efficiency by adding copper ion |
| JP4532413B2 (ja) * | 2003-08-13 | 2010-08-25 | 日本たばこ産業株式会社 | 植物材料への遺伝子導入を行う方法 |
| JPWO2005017169A1 (ja) * | 2003-08-13 | 2007-10-04 | 日本たばこ産業株式会社 | 植物材料への遺伝子導入を行う方法 |
| US7812222B2 (en) | 2003-08-13 | 2010-10-12 | Japan Tobacco Inc. | Method of transducing gene into plant material |
| WO2005017169A1 (ja) * | 2003-08-13 | 2005-02-24 | Japan Tobacco Inc. | 植物材料への遺伝子導入を行う方法 |
| WO2005017152A1 (ja) | 2003-08-13 | 2005-02-24 | Japan Tobacco Inc. | 銅イオンの添加により植物の形質転換効率を向上させる方法 |
| WO2007069643A1 (ja) | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Japan Tobacco Inc. | 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 |
| US8324456B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-12-04 | Japan Tobacco Inc. | Method for improving transformation efficiency using powder |
| WO2008105509A1 (ja) | 2007-02-28 | 2008-09-04 | Japan Tobacco Inc. | 選抜工程を経ないアグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 |
| WO2008105508A1 (ja) | 2007-02-28 | 2008-09-04 | Japan Tobacco Inc. | ３，６－ジクロロ－ｏ－アニシン酸を含む共存培地で植物組織を培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法 |
| US8058514B2 (en) | 2007-02-28 | 2011-11-15 | Japan Tobacco Inc. | Agrobacterium-mediated method for producing transformed plant without selection step |
| US8101820B2 (en) | 2007-02-28 | 2012-01-24 | Japan Tobacco Inc. | Method for increasing transformation efficiency in plants, comprising coculture step for culturing plant tissue with coculture medium containing 3,6-dichloro-o-anisic acid |
| WO2009122962A1 (ja) | 2008-03-31 | 2009-10-08 | 日本たばこ産業株式会社 | アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4424784B2 (ja) | 2010-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gheysen et al. | Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications | |
| US7960611B2 (en) | Method for promoting efficiency of gene introduction into plant cells | |
| US7939328B1 (en) | Method of transforming monocotyledons using scutella of immature embryos | |
| Barampuram et al. | Recent advances in plant transformation | |
| EP0687730B1 (en) | Method of transforming plant and vector therefor | |
| US10266835B2 (en) | Agrobacterium bacterium to be used in plant transformation method | |
| Solleti et al. | Additional virulence genes in conjunction with efficient selection scheme, and compatible culture regime enhance recovery of stable transgenic plants in cowpea via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation | |
| US7902426B1 (en) | Method of improving gene transfer efficiency into plant cells utilizing heat and centrifugation | |
| JP4424784B2 (ja) | 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 | |
| US20080184393A1 (en) | Auto-Regulated Expression Of Bacterial Isopentenyltransferase Gene Promotes T-DNA Transformation In Soybean | |
| JP2000342255A (ja) | 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 | |
| JP4428757B2 (ja) | 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 | |
| Lindsey | Transgenic plant research | |
| AU733623B2 (en) | Method for transforming plants and vector therefor | |
| AU771116B2 (en) | Agrobacterium mediated method of plant transformation | |
| Yokoi et al. | Transgenic rice (Oryza sativa) | |
| WANG et al. | High-frequency non-selective transformation method in Brassica napus for obtaining marker-free plants | |
| Luo | Soybean transformation and analysis of transformed tissues using PCR |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060320 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090106 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090312 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091201 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091208 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4424784 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121218 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131218 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |