WO2009122962A1 - アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 - Google Patents

アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 Download PDF

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WO2009122962A1
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agrobacterium
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石田　祐二
祐弘 樋江井
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    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a novel transformed plant by Agrobacterium.
  • electroporation method, particle gun method and the like are known as transformation methods for monocotyledonous plants such as corn and rice which are main cereals.
  • these physical gene introduction methods have problems such as the introduction of multiple copies of genes, the insertion of genes in an intact form, and the appearance of many malformations and sterility in transformed plants. Yes.
  • Agrobacterium The gene transfer method using Agrobacterium is commonly used as a method for transforming dicotyledonous plants.
  • Agrobacterium hosts are limited to dicotyledonous plants and do not infest monocotyledonous plants (De Cleane and De Ley 1976), but there are attempts to transform monocotyledonous plants with Agrobacterium. Has been made.
  • Mooney et al. Attempted to introduce a kanamycin resistance gene into wheat embryos using Agrobacterium. First, embryos were treated with enzymes to damage the cell walls and then inoculated with Agrobacterium. A very small number of calli that appeared to be resistant to kanamycin grew in the treated callus, but the plant body could not be regenerated from this callus. Moreover, when the presence of the kanamycin resistance gene was confirmed by Southern analysis, structural mutation of the transgene was observed in all resistant calli (Mooney et al. 1991). Raineri et al.
  • attempts to improve the efficiency of maize transformation with Agrobacterium include selection of transformed cells in N6 basic medium (Zhao et al. 2001), addition of AgNO 3 and carbenicillin to the medium (Zhao). et al. 2001, Ishida et al. 2003), addition of cysteine to a co-culture medium (Frame et al. 2002), and the like.
  • the efficiency is improved even in transformation of rice and corn by Agrobacterium.
  • selection marker genes the genes used for selection of transformed cells (selection marker genes), the most commonly used genes confer resistance to herbicides or antibiotics (Kuiper et al. 2001). Bar genes and EPSP genes (De Block et al., 1987; Comai et al., 1985) are genes that confer resistance to herbicides, and NPTII gene and HPT gene (contains resistance to antibiotics). Bevan et al., 1983; Waldron et al., 1985) are often used as selection marker genes for plant transformation. In recent years, it has been reported that PMI genes and XylA genes (Jörsbo et al., 1998; Haldrup et al., 1998) utilizing the metabolic ability of specific sugars are also effective as selection marker genes. In addition to those described above, a number of genes have been reported as selective marker genes using a mechanism for selectively growing transformed cells. And in the transformation method using these genes, it is thought that the selection process which selectively proliferates a transformed cell is essential.
  • the transformed seed is obtained without going through the selection step (Bent, 2000).
  • a selection process using an antibiotic resistance gene or the like is required in order to obtain a desired transformed seed from seeds in which a large number of non-transformed seeds are mixed.
  • Techniques for removing selected marker genes from transformed plants include the co-transformation system (Komari et al., 1996), the MAT vector system (Ebinuma et al., 1997), and the CreLox system (Gleave et al., 1999; Zhang et. al., 2003) has been reported.
  • a transformed plant not containing a selection marker gene can be obtained.
  • this selection step requires a selection marker gene for selection in addition to the target gene (GOI gene).
  • GOI gene target gene
  • the selection marker gene is unnecessary for the transformed plant produced, and if the selection marker gene is still contained in the transformed plant, the herbicide resistance gene and antibiotic resistance gene are transformed.
  • selection marker genes have been reported, the selection marker genes that can be adapted depending on the plant species are limited, which poses a problem when a plurality of genes are introduced separately. Furthermore, techniques for removing selectable marker genes from transformants have also been reported, but these methods require much labor, such as a longer culture period and selection of selectable marker-free individuals in progeny plants than conventional transformation methods. .
  • An object of the present invention is to develop and provide a method capable of obtaining a transformed plant without undergoing such a selection process.
  • the present inventors generally noted that in the plant transformation process, the number of plant cells into which a foreign gene is incorporated is extremely small, and the efficiency of transformation is greatly improved. If the proportion of transformed cells in the transformed cells is increased and maintained until plant regeneration, transformed plants can not be obtained without a selection process using a selection marker gene. I thought. As a result of intensive studies, it was found that a transformed plant can be obtained with sufficiently practical efficiency by appropriately performing the transformation improving treatment, and the present invention has been conceived.
  • this invention contains the following aspect as a preferable aspect.
  • a method for producing a transformed plant using Agrobacterium which includes the step of re-differentiating the plant body by culturing in a regeneration medium later, 1) performing transformation improvement treatment, and 2) redifferentiation from coexistence The method for producing a transformed plant according to any one of the above steps, wherein selection of transformed cells using a selective drug is not performed.
  • Transformation improvement treatment is a treatment that improves the efficiency of introduction of the target gene into plant cells, a treatment that improves the callus induction rate from immature embryos, or a treatment that improves the redifferentiation efficiency from transformed callus.
  • the present invention provides a method for producing a transformed plant by Agrobacterium.
  • the present invention is a method for introducing a gene into a plant via an Agrobacterium, and is based on the discovery that the introduction of a selection marker gene becomes unnecessary by performing a transformation efficiency improvement treatment.
  • the method of the present invention comprises: (I) a coexistence step of culturing plant material inoculated with Agrobacterium in a coexisting medium, and (ii) the tissue obtained in (i) was not subjected to callus growth culture or was subjected to callus growth culture
  • a method for producing a transformed plant using Agrobacterium which includes the step of re-differentiating the plant body by culturing in a regeneration medium later, 1) performing transformation improvement treatment, and 2) redifferentiation from coexistence It is characterized in that selection of transformed cells using a selective drug is not performed in all the steps up to.
  • transformation Improvement Treatment is characterized by performing transformation improvement treatment.
  • the “transformation improving treatment” refers to a treatment in which the proportion of transformed plants obtained is improved by performing the treatment. Specifically, but not limited to, treatment that improves the efficiency of introducing the target gene into plant cells, treatment that improves the callus induction rate from immature embryos, etc., and improvement of redifferentiation efficiency from transformed callus And the like.
  • Such a transformation improving process is not limited, but includes, for example, the following or a combination thereof.
  • heat treatment, centrifugal treatment, heat and centrifugal treatment, pressure treatment, and powder addition are all treatments that improve gene transfer efficiency, and the addition of silver nitrate, copper sulfate, and carbenicillin has the effect of improving callus induction rate. There is. Moreover, the addition of copper sulfate to the regeneration medium improves the regeneration efficiency.
  • the heat treatment can be performed using, for example, the method described in WO98 / 54961.
  • the plant material is treated at 33 ° C. to 60 ° C., preferably 37 ° C. to 52 ° C., for 5 seconds to 24 hours, preferably 1 minute to 24 hours before contacting with Agrobacterium.
  • Centrifugation can be performed, for example, using the method described in WO02 / 12520.
  • 100 G to 250,000 G preferably 500 G to 200,000 G, more preferably 1000 G to 150,000 G with a centrifugal acceleration of 1 second to 4 hours
  • the treatment is preferably performed for 1 second to 2 hours.
  • the heat and centrifugation can be performed using the method described in WO02 / 12521, for example.
  • the conditions for the heat treatment and the centrifugal treatment for example, the above-described conditions can be adopted.
  • the pressurizing treatment can be performed using, for example, the method described in WO2005 / 018169.
  • the pressure treatment is not limited, but is preferably performed in the range of 1.7 to 10 atm, more preferably in the range of 2.4 to 8 atm.
  • silver nitrate and / or copper sulfate to the co-culture medium is described in, for example, Zhao et al. 2001, Ishida et al. 2003, WO2005 / 017152.
  • Silver nitrate and / or copper sulfate can be added to the co-culture medium at a concentration of 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, for example.
  • the treatment of inoculating Agrobacterium in the presence of powder can be performed using, for example, the method described in WO2007 / 069643. Specifically, for example, it is performed by mixing Agrobacterium suspension and powder and inoculating the plant material, or mixing plant and powder and inoculating it with Agrobacterium.
  • the powder is not limited, but is a porous powder, glass wool or activated carbon, preferably porous ceramics, glass wool or activated carbon, more preferably hydroxyapatite, silica gel or glass wool.
  • N6 inorganic salt In the process of adding N6 inorganic salt to callus growth medium (Zhao et al. 2001), N6 inorganic salt (Chu 1978) is added to callus growth medium.
  • cysteine can be added to the co-culture medium at 10 mg / l to 1 g / l, preferably 50 mg / l to 750 mg / l, more preferably 100 mg / l to 500 mg / l.
  • Carbenicillin addition to the medium in the callus growth and / or regeneration process after the coexistence process is described in Zhao et al. 2001, or Ishida et al. It can be performed using the method described in 2003.
  • Carbenicillin may be added to the callus growth medium and / or the redifferentiation step, for example, at a concentration of 50 mg / l to 500 mg / l, preferably 100 mg / l to 300 mg / l.
  • Carbenicillin is an antibiotic, but it is hardly toxic to plants and can be used for the purpose of preventing the growth of microorganisms in the medium.
  • preferable transformation improvement treatment is heat treatment, centrifugation, heat and centrifugation, pressure treatment, treatment of adding AgNO 3 and / or CuSO 4 to the co-culture medium, or inoculation of Agrobacterium in the presence of powder. Treatment, converting the antibiotic in the callus growth medium and / or regeneration medium to carbenicillin, or a combination thereof.
  • the present inventors have succeeded in sufficiently increasing the number of transformed individuals in the finally obtained redifferentiated individuals by performing these treatments, and without performing the selection process of transformed cells. We found that sufficient transformed individuals could be obtained, and established a selection-free transformation method sufficient for practical use.
  • transformed individuals can be easily obtained by confirming the presence or absence of the transgene by a technique such as PCR, and if it is a progeny individual, confirming the phenotype of the transgene.
  • the present invention is characterized in that in any step for plant transformation from coexistence to redifferentiation, selection of transformed cells using the characteristics of nucleic acids introduced by Agrobacterium is not performed.
  • Examples of selection of transformed cells using the characteristics of nucleic acids introduced by Agrobacterium include selection of transformed cells using a resistance gene against the selected drug and the selected drug.
  • Selection of transformed cells using resistance gene for selected drug and selected drug means that in any step for plant transformation from coexistence to redifferentiation, drug for selecting transformed plant was added It means culturing in a medium and selecting transformed cells depending on the presence or absence of resistance to the selected drug. The present invention does not include such a process at all.
  • selective drugs that have been used in the prior art are antibiotics and / or herbicides.
  • the DNA inserted into the T-DNA in Agrobacterium contained not only the gene intended to be expressed in plants but also a resistance gene for the selected drug. Resistance genes for such selective drugs are known in the art. For example, when the regeneration process is performed in a regeneration medium containing hygromycin as a selective drug, it is necessary that the plant has been introduced with a hygromycin resistance gene from Agrobacterium.
  • a selection step using a drug since a selection step using a drug is not performed, it is not necessary for a nucleic acid introduced by Agrobacterium to have a resistance gene for the selected drug, that is, a selection marker gene.
  • a selection marker gene for the selected drug, that is, a selection marker gene.
  • the present invention does not include such nucleic acids.
  • selection of transformed plants may be performed based on “nutrition requirement selection” of plant cells, for example, “sugar requirement”.
  • sugars that can be used by plant cells include sucrose and glucose, but mannose cannot be used. Therefore, when plant tissue is cultured in a medium containing only mannose as a carbon source, the plant tissue dies because there is no available sugar. Selection based on sugar requirement utilizes this principle.
  • a gene that makes available sugars that cannot be normally used by plant cells from Agrobacterium is introduced into the plant tissue. Such genes are known in the art, and for example, PMI gene, xylose isomerase gene, etc. can be used. In the present invention, the introduced nucleic acid need not contain such a gene.
  • a gene that can be easily detected may be introduced as a screening index and selected depending on the presence or absence of expression of the gene.
  • Examples of such a gene serving as a screening index include the GFP gene.
  • the introduced nucleic acid need not contain such a gene.
  • the selection marker gene refers to a target gene (GOI gene) to be transformed in addition to a target gene to be transformed for the purpose of selecting a transformed cell among many non-transformed cells.
  • a target gene GOI gene
  • the selection marker gene include, but are not limited to, a herbicide resistance gene, an antibiotic resistance gene, and a fluorescence gene.
  • Method for producing transformed plant A method for producing a transformed plant by Agrobacterium generally comprises all or part of the following steps IV.
  • a plant as a control of the present invention is a plant to which a transformation introduction method using Agrobacterium can be applied. Preferably it is a monocotyledonous plant.
  • Monocotyledonous plants to be used in the method of the present invention are preferably gramineous plants, and include, but are not limited to, rice, corn, barley, wheat, sorghum and the like. The most preferred plant to be subjected to the method of the present invention is rice or corn.
  • the “plant material” refers to cells, leaves, roots, stems, buds, flowers (including stamens, pistils, etc.) of the plant to be used for plant transformation by the Agrobacterium method, Seed, seed, germinated seed or any other part of plant tissue, growth point, explant, immature embryo, callus or somatic embryo-like tissue (hereinafter referred to as callus etc. or simply callus in this specification), or complete All aspects of the plant, such as various plant bodies, are included.
  • immature embryos Preferred forms of plant material used in the method of the present invention are immature embryos or callus, and most preferred are immature embryos.
  • expressions of plant cells, tissues, and complete plants are used in the meaning generally used in the technical field.
  • immature embryos refer to immature seed embryos and scutellum that are in the process of ripening after pollination.
  • the stage (ripening stage) of the immature embryo used for the method of the present invention is not particularly limited, and it may be collected at any time after pollination. However, the thing after 2 days after pollination is preferable.
  • the immature embryos are preferably immature embryos of inbread, F1 between inbreads, F1 between inbread and naturally pollinated varieties, and commercially available F1 varieties.
  • callus refers to an undifferentiated cell mass that grows randomly.
  • differentiated cells of plant tissue can be obtained by culturing in a medium (referred to as dedifferentiation medium) containing a plant growth regulator such as auxin (eg, 2,4-D) or cytokinin.
  • auxin eg, 2,4-D
  • cytokinin cytokinin
  • plant tissue, immature embryos, etc. are taken out from the plant body, seeds, etc., and plant materials suitable for transformation are prepared.
  • the plant material can be prepared by a known method. If desired, the plant material may be cultured before being infected with Agrobacterium.
  • Agrobacterium preparation and inoculation process The plant material used in the present invention is inoculated with Agrobacterium.
  • inoculating refers to contacting Agrobacterium with plant material, and methods for inoculating various Agrobacterium are known in the art. Examples of the method include adding a plant material to a suspension in which Agrobacterium is suspended in a liquid medium, a method of dropping Agrobacterium suspension directly on a plant material on a co-culture medium, And a method of injecting an Agrobacterium suspension into the plant and a method of immersing the plant material in the Agrobacterium suspension and reducing the pressure.
  • the plant material inoculated with Agrobacterium used in the present invention is not limited to the plant material inoculated with Agrobacterium by these methods.
  • various additives such as acetosyringone, surfactant, porous ceramics and the like are added to the suspension of Agrobacterium in order to improve the transformation efficiency by Agrobacterium. It can be included.
  • the Agrobacterium that can be used in the present invention may be any known genus Agrobacterium, but is preferably Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes .
  • the Agrobacterium is, for example, LBA4404, EHA101 and AGL1, C58C1, etc., but is not limited thereto.
  • T-DNA which is part of the Ti plasmid, is integrated into the plant genome. Subsequently, this T-DNA contains genes involved in the synthesis of hormones (cytokinin and auxin) necessary for the induction of carcinoma, and it was revealed that they are expressed in plants despite being bacterial genes.
  • Agrobacterium genus Agrobacterium rhizogenes has a similar system using the Ri plasmid (eg, FIGS. 3 and 4 of JP-A-2000-342256).
  • T-DNA was integrated into the plant genome by infection with Agrobacterium, it was expected that when a desired gene was inserted into T-DNA, this gene was also integrated into the plant genome.
  • the Ti plasmid is as large as 190 kb or more, it has been difficult to insert a gene onto T-DNA on the plasmid by standard genetic engineering techniques. For this reason, a method for inserting a foreign gene onto T-DNA has been developed.
  • LBA4404 (Hoekema, A., et al., (1983), Nature, Vol. 4), which is a disarmed strain in which hormone synthesis genes have been removed from the T-DNA of the neoplastic Ti plasmid. 303, p.179-180), C58C1 (pGV3850), GV3Ti11SE, and the like were produced.
  • two kinds of methods have been developed in which a desired gene is introduced into T-DNA of an Agrobacterium Ti plasmid or T-DNA having a desired gene is introduced into Agrobacterium.
  • One of them is an intermediate vector that can be easily manipulated and inserted into a desired gene and can be replicated in Escherichia coli in the T-DNA region of a disarmed Ti plasmid of Agrobacterium. This is a method of introducing by homologous recombination via a hybrid method, called the intermediate vector method.
  • the other is called the binary vector method, which requires the vir region for T-DNA integration into plants, but does not need to exist on the same plasmid to function. Based on. In this vir region, there are virA, virB, virC, virD, virE and virG (Plant Biotechnology Encyclopedia (issued by Enterprise Co., Ltd. (1989))), and the vir region is the virA, virB, virC, virD, Includes all of virE and virG.
  • the binary vector is obtained by incorporating T-DNA into a small plasmid that can be replicated in both Agrobacterium and Escherichia coli, and is used by introducing it into Agrobacterium having a disarm type Ti plasmid.
  • binary vectors include pBIN19, pBI121, pGA482, and many new binary vectors have been constructed and used for transformation.
  • Ri plasmid system a similar vector is constructed and used for transformation.
  • Agrobacterium A281 is a super-virulent fungal system, its host range is wide, and its transformation efficiency is higher than other fungal systems. This characteristic is due to the Ti plasmid pTiBo542 of A281. Two new systems have been developed so far using pTiBo542. One uses fungal strains EHA101 and EHA105 having a disarm-type Ti plasmid of pTiBo542. By applying these to the binary vector system described above, various plant traits can be obtained as a system with high transformation ability. It is used for conversion.
  • the other is a super binary vector system.
  • the super binary vector ('super-binary' vector) is described in, for example, the following documents incorporated herein.
  • This system has a disarm type Ti plasmid and T-DNA having a vir region (virA, virB, virC, virD, virE, and virG (hereinafter, these may also be referred to as “vir fragment regions”, respectively)). Since it consists of a plasmid, it is a kind of binary vector system. However, the T-DNA-containing plasmid, that is, a fragment of the vir region in which at least one vir fragment region is substantially removed from the vir fragment region in the binary vector (of these, preferably a fragment containing at least virB or virG) , More preferably a fragment containing virB and virG). In order to introduce a T-DNA region into which a desired gene has been incorporated into Agrobacterium having a super binary vector, it can be used as a technique that facilitates homologous recombination via a three-way hybridization method.
  • the host genus Agrobacterium is not particularly limited, but Agrobacterium tumefaciens (for example, the above-mentioned Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema, A., et al., 1983), Nol. 303, p. 179-180) and EHA 101) can be preferably used.
  • Agrobacterium tumefaciens for example, the above-mentioned Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema, A., et al., 1983), Nol. 303, p. 179-180) and EHA 101
  • the effect of the present invention can be obtained without particular limitation as long as it is a gene transfer system based on the expression of a gene group of a pathogenicity (vir) region in an Agrobacterium.
  • a vector or a super binary vector is preferable because the transformation efficiency is further improved.
  • the introduction plant is maize, it is preferable to use a super binary vector.
  • the same applies to the case of using different vector systems in which these vectors are modified for example, a part of the vir region of an Agrobacterium genus is excised and additionally incorporated into a plasmid. Excise part or all of it and introduce it into Agrobacterium as part of a new plasmid).
  • a desired gene to be introduced into a plant can be incorporated into a restriction enzyme site in the T-DNA region of the plasmid by a conventional method.
  • a large one having many restriction sites may not always be easy to introduce a desired DNA into a T-DNA region by a normal subcloning technique.
  • the target DNA can be introduced by utilizing homologous recombination in the cells of the genus Agrobacterium by a three-line hybridization method.
  • the size of the introduced gene is preferably about 100 bp to 200 kbp.
  • the operation of introducing a plasmid into an Agrobacterium such as Agrobacterium tumefaciens can be performed by a conventional method.
  • the method include the above three-line hybridization method, electroporation method, electroinjection method, PEG and other chemicals. The method by typical processing is included.
  • Genes to be introduced into plants are basically arranged between the left and right border sequences of T-DNA, as in the conventional technique.
  • the plasmid is circular, the number of border sequences may be one, and when a plurality of genes are to be arranged at different sites, there may be three or more border sequences. It may also be placed on Ti or Ri plasmids in Agrobacterium, or on other plasmids. Furthermore, it may be arranged on a plurality of types of plasmids.
  • the inoculation of plant material with Agrobacterium may be performed, for example, by simply contacting the plant material with Agrobacterium.
  • the inoculation may be performed by normal inoculation or by inoculation dropwise.
  • inoculation is performed by mixing plant material and Agrobacterium suspension (inoculation source), immersing the plant material in the suspension, taking out the immersed plant material, and placing it on the medium to coexist.
  • Inoculation is performed by culturing.
  • an Agrobacterium suspension having a cell concentration of about 10 6 to 10 11 cfu / ml is prepared, and the plant material is immersed in the suspension for about 3 to 10 minutes, and then on a solid medium for several days. It can be performed by co-culturing.
  • a suspension of Agrobacterium spp. Is dropped on the plant material that has been deposited on the medium, and after the dripped suspension has dried, the plant material is placed on another place in the medium or on another medium. It is a method of inoculating by cultivating and co-culturing.
  • plant cells inoculated with Agrobacterium as described above are cultured in a medium containing auxins in the presence of Agrobacterium. This is a process to ensure introduction.
  • the plant material is co-cultured with Agrobacterium at the same time as the plant material is infected with Agrobacterium or before the removal of Agrobacterium after infection.
  • the medium used in this step is referred to as “coexisting medium” in this specification.
  • a known medium can be used for co-culture.
  • LS-AS medium, nN6-AS medium, or other, N6S3-AS medium, 2N6-AS medium Hiei, Y., et al., (1994), The Plant Journal, Vol. 6, p. 271- Medium (see 282).
  • auxins are preferably added to the co-culture medium. Since auxins generally have an action of dedifferentiating plant material, most or all of the plant material becomes dedifferentiated tissue (callus) in this step.
  • auxins include 3,6-dichloro-o-anisic acid (dicamba), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), and / or triiodobenzoic acid salt (TIBA).
  • the co-culture medium does not contain auxins other than dicamba, picloram, 2,4-D, 2,4,5-T.
  • the total amount of auxins such as dicamba, picloram, 2,4D, 2,4,5-T in the co-culture medium is preferably 0.1-5.0 mg / l, more preferably Is 0.5-3.0 mg / l, more preferably 1.0-2.0 mg / l, most preferably 1.5 mg / l.
  • the present inventors further improved the transformation efficiency by adding a substance exhibiting auxin activity belonging to benzoic herbicides among auxins to the co-culture medium, and the selection marker gene It has been found that a transformed plant can be obtained without introduction.
  • Benzoic herbicides are divided into (i) benzoic acid type, (ii) salicylic acid type, (iii) picolinic acid type, and (iv) terephthalic acid type (Takematsu, 1982).
  • the terephthalic acid type does not show auxin activity
  • herbicides belonging to any one of (i) benzoic acid type, (ii) salicylic acid type, and (iii) picolinic acid type are preferable, and (ii) ) Salicylic acid type, or (iii) picolinic acid type.
  • More preferred is dicamba (3,6-dichloro-o-anisic acid) or picroram (4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid). Therefore, in the case of corn, it is most preferable to add a substance exhibiting auxin activity belonging to the benzoic herbicide to the co-culture medium.
  • “Cultivation” in this step refers to placing plant material on a solidified co-culture medium or in a liquid co-culture medium and growing it at an appropriate temperature, light / dark conditions and duration. Solidification of the co-culture medium can be carried out by adding a solidifying agent known in the art, and as such a solidifying agent, for example, agarose or the like is known.
  • the culture temperature in this step can be appropriately selected, and is preferably 20 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed in a dark place, but is not limited thereto.
  • the culture period in this step can also be appropriately selected, and is preferably 1 to 10 days, more preferably 7 days.
  • Callus growth medium is a medium containing plant hormones and nutrients that are suitable for dividing and proliferating dedifferentiated cells. In general transformation tests, it is a drug that inhibits the growth of untransformed cells. (Selection pressure) is added, and it is also used as a “selection medium” for selectively growing transformed cells.
  • selection pressure selection pressure
  • plant materials that have undergone the above coexistence process are generally cultured in a medium containing auxins.
  • the medium used in this step is referred to as “selection medium” and is selected for selection based on the presence or absence of gene introduction. Contains drugs.
  • this step is repeated a plurality of times by changing the composition of the medium. For example, in multiple selection processes, by increasing the concentration of the selected drug in each selection process, the certainty of drug selection increases and the possibility of obtaining transformed plants can be increased. .
  • This selection step is preferably performed at least twice, more preferably three times. When this process is performed a plurality of times, this process requires a period of about 10 days to 3 weeks, and the entire selection process requires about 5-10 weeks. Therefore, this step is the most time-consuming step in the plant transformation method using Agrobacterium.
  • this step has been considered an essential step.
  • the present inventors have performed transformation without any selection of transformed cells using a selective drug in any step from coexistence to redifferentiation, including during the callus growth step, by “transformation improving treatment”.
  • this step can be omitted preferably. That is, the step of culturing the tissue after co-cultivation in a callus growth medium is not included between the co-existence step and the regeneration step.
  • the working efficiency is further improved, and the transformation process can be performed in a shorter period of time, so that it has been found that a transformed plant can be obtained more efficiently.
  • Examples 1-4 and 6-7 in the present specification describe examples in which the callus growth step was omitted and plant transformation was successful particularly in the case of corn.
  • the callus growth step may be performed without adding a selective agent to the callus growth medium. In this case, callus growth occurs but “selection” of the transformant is not performed.
  • V. Redifferentiation step This is a step of redifferentiating the obtained cell mass, growing a redifferentiated individual, and obtaining a complete plant as desired.
  • a known method for example, Hiei, Y., et al., (1994), The Plant Journal, Vol. 6, p. 271-282; And Ishida, Y., et al., (1996), Nature Biotechnology, Vol.14, p.745-750).
  • This step is an essential step in both the conventional method and the present invention.
  • selection of a transformant with a selective drug is essential in the redifferentiation step.
  • Selection of transformed plants is performed by cultivating plant material that has undergone the coexistence process in a regeneration medium containing a selection drug and having resistance to the selection drug.
  • the present invention is characterized in that selection of transformed cells using a selection agent is not performed in any step for plant transformation from coexistence to regeneration. Therefore, in the present invention, selection using a selective drug is not performed in the redifferentiation step.
  • the medium used in this step is referred to as “regeneration medium” in the present specification, and the characteristic is that it does not contain auxins.
  • a medium that can be used as the regeneration medium for example, a medium based on LS inorganic salts or N6 inorganic salts, specifically, an LSZ medium or the like can be used.
  • the “regeneration medium” does not contain a selective drug.
  • Redifferentiation in the present invention means that a plant material that has been completely or partially dedifferentiated again acquires the properties of the original plant material or plant body.
  • the dedifferentiated tissue is redifferentiated and a completely transformed plant body can be obtained.
  • Whether or not a plant has regenerated can be easily determined by observing the morphology of the plant. For example, it can be determined by whether or not specific differentiated plant organs such as stems and leaves appear from the dedifferentiated tissue.
  • “bigger” refers to the vigorous growth of re-differentiated plants. Plant bigger can be measured using known measurement methods performed in the art. For example, in the case of maize, after the redifferentiation step, 0 points of transformed plant tissue in which no redifferentiation was observed, 1 point of transformed plant tissue having a maximum regenerated leaf length of less than 5 mm, and regenerated foliage The average length of all transformed plant tissues is scored by scoring 2 transformed plant tissues with a maximum length of 5 mm or more and less than 2 cm and 3 transformed plant tissues with a maximum length of redifferentiated stems and leaves of 2 cm or more. Can be obtained by calculating. The evaluation method of the bigger is not limited to this, and it is possible to add an appropriate correction to a known method depending on the evaluation object.
  • “Cultivation” in this step refers to placing a plant tissue on a solidified regeneration medium or in a liquid regeneration medium and growing it at an appropriate temperature, light / dark conditions and period.
  • the regeneration medium can be solidified using, for example, agar.
  • the culture temperature in this step can be appropriately selected, and is preferably 20 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed under illumination for 16-24 hours / day, but is not limited thereto.
  • the culture period in this step can also be appropriately selected, and is preferably 7 days to 21 days, more preferably 14 days.
  • This step it is possible to easily obtain a completely transformed plant body by using a method known in the art.
  • This is a step of confirming the presence or absence of the transgene for the obtained redifferentiated individual and identifying the transformed individual.
  • PCR, Southern analysis, etc. can be used preferably. It can also be easily selected by confirming the phenotype of the transgene.
  • stable and efficient transformation can be performed without introducing a plant selection marker gene into a desired plant.
  • FIG. 1 shows the result of Southern blot analysis of a Yukihikari redifferentiated plant obtained by non-selective transformation.
  • Genomic DNA was extracted from a redifferentiated plant that had been transformed with Agrobacterium LBA4404 (pSB134) and selected without selection, and digested with the restriction enzyme HindIII. The digested DNA was subjected to agarose gel electrophoresis and then hybridized with a GUS probe. Seed-derived Yukihikari (control) (lane C), GUS positive expression (GUS uniformly expressed) redifferentiated plant (lane 1-11), GUS dot-like expression redifferentiated plant (lane 12-17).
  • FIG. 2 shows the results of Southern blot analysis of A188 redifferentiated plants obtained by non-selective transformation.
  • Genomic DNA was extracted from a redifferentiated plant body (corn) obtained by transformation with Agrobacterium LBA4404 (pSB124) and selected without selection, and digested with the restriction enzyme BamHI. The digested DNA was subjected to agarose gel electrophoresis and then hybridized with a GUS probe. Seed-derived A188 (control) (lane C), GUS positive expression (GUS uniformly expressed) redifferentiated plant (lane 1-13).
  • FIG. 3 shows the results of Southern blot analysis of A188 regenerated plantlets and T1 progeny plants obtained by non-selective transformation.
  • Example 1 Gene expression in a plant body regenerated without selection from immature corn embryos inoculated by a conventional method .
  • Materials and Methods Immature embryos (size 1.0-1.5 mm) of corn (variety: A188) 7 to 14 days after pollination were aseptically collected and LS-inf liquid medium (Ishida et al., 1996). ) Once.
  • pretreatment 46 ° C., heat treatment for 3 minutes and 20,000 ⁇ g, centrifugation for 10 minutes
  • An Agrobacterium strain LBA4404 (pSB134) (Hiei and Komari, 2006) was suspended in an LS-inf liquid medium containing 100 ⁇ M acetosyringone at about 1.0 ⁇ 10 9 cfu / ml as an inoculum source.
  • the inoculum was added to the heat-centrifugated immature embryo, stirred for 30 seconds, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • 1.5 mg in LS-AS medium (Ishida et al. 1996, solidifying agent is 8 g / l agarose) containing 5 ⁇ M AgNO 3 and 5 ⁇ M CuSO 4 except 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy-acetic acid)
  • An immature embryo inoculated with Agrobacterium in a co-culture medium supplemented with dicamba (3,6-dichloro-o-anisic acid) at a concentration of 1 / l was placed so that the scutellum was on top.
  • Immature embryos cultured for 7 days at 25 ° C. in the dark were placed on LSZ medium (Ishida et al. 1996) containing 10 ⁇ M CuSO 4 and cultured at 25 ° C. under illumination for about 2 weeks.
  • a part of the leaf of the plant body that had undergone redifferentiation was cut out, immersed in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 0.1% Triton X-100, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • a phosphate buffer containing 1.0 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X-gluc) and 20% methanol was added. After treatment at 37 ° C. for 24 hours, the expression of the GUS gene was examined.
  • Example 1 The conditions of Example 1 are summarized below.
  • Vector Super Binary Vector having pSB134 GUS gene, hygromycin resistance gene (selection marker gene) and part of pathogenicity gene of strong pathogenic strain Selection process: None in all steps Results Regeneration of the plant body was observed from all 16 immature embryos placed on the LSZ medium. Four to thirteen leaf pieces were collected from plants regenerated from each immature embryo and examined for expression of the GUS gene.
  • the leaf pieces derived from the two immature embryos were all GUS negative. In the leaf pieces collected from the remaining 14 immature embryos, GUS gene expression was observed in at least one leaf piece. Leaf pieces showing dot-like expression were found in 5 immature embryos. Leaf pieces expressing the GUS gene in stripes were found in 6 immature embryos. Two immature embryos having both leaf-like and strip-like leaf pieces were observed. Here, it is speculated that those expressed in stripes are chimeras of transformed cells and non-transformed cells, and those expressed in dots are gene silencing in some transformed cells Is done. GUS positive leaf pieces whose cuts were uniformly stained blue were obtained from one immature embryo.
  • results of this example indicate that a GUS gene-transformed corn plant was obtained under the condition that no selection step using antibiotics or the like was performed in any step from coexistence to redifferentiation.
  • Example 2 Gene expression in plant bodies regenerated without selection from immature corn embryos inoculated by the dropping method
  • Materials and Methods Approximately 80 mg of hydroxyapatite (Bio-Rad) was added to 1 ml of the inoculum of Agrobacterium strain LBA4404 (pSB134) prepared in the same manner as in Example 1.
  • pretreatment 46 ° C., heat treatment for 3 minutes and 20,000 ⁇ g, centrifugation for 10 minutes
  • immature embryos (variety A188), except 2,4-D, were added to LS-AS medium (Ishida et al. 1996, solidifying agent 8 g / l agarose) containing 5 ⁇ M AgNO 3 and 5 ⁇ M CuSO 4 .
  • the scutellum was placed on a co-culture medium supplemented with dicamba at a concentration of 5 mg / l so that the scutellum was on top.
  • Example 2 The conditions of Example 2 are summarized below.
  • Material Corn Immature embryo Method: Agrobacterium inoculation by dripping method Transformation improvement treatment: Powder treatment, heat and centrifugation treatment, treatment adding Ag + and Cu 2+ ions to the medium Addition of auxin to the coexistence process: Daikanba Coexistence After culturing, go directly to the redifferentiation step without going through the callus growth step.
  • results of this example indicate that a GUS gene-transformed corn plant was obtained under the condition that no selection step using antibiotics or the like was performed in any step from coexistence to redifferentiation.
  • Example 3 Effect of auxin in co-culture medium on gene expression in plant bodies regenerated without selection from immature maize embryos
  • Immature embryos (size 1.0-1.5 mm) of corn (variety: A188) 7 to 14 days after pollination were aseptically collected and washed once with LS-inf liquid medium.
  • a pretreatment 46 ° C., 3 minutes heat treatment
  • An Agrobacterium strain LBA4404 (pSB124) was suspended in an LS-inf liquid medium containing 100 ⁇ M acetosyringone as an inoculum.
  • the inoculation source was added to the heat-treated immature embryo, stirred for 30 seconds, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. 6.8 ⁇ M in LS-AS medium (Ishida et al. 1996, solidifying agent is 8 g / l agarose) containing 5 ⁇ M AgNO 3 and 5 ⁇ M CuSO 4 except 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy-acetic acid) Immature embryos inoculated with Agrobacterium in co-culture medium supplemented with dicamba (3,6-dichloro-o-anisic acid) or picloram (4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid) Twenty-four immature embryos were placed so that the scutellum was on top.
  • Immature embryos cultured for 7 days at 25 ° C. in the dark were placed on LSZ medium (Ishida et al. 1996) containing 10 ⁇ M CuSO 4 and cultured at 25 ° C. under illumination for about 2 weeks.
  • a part of the leaf of the plant body that had been redifferentiated was cut out, immersed in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 0.1% Triton X-100, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. .
  • a phosphate buffer containing 1.0 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X-gluc) and 20% methanol was added. After treatment at 37 ° C. for 24 hours, the expression of the GUS gene was examined.
  • Example 3 The conditions of Example 3 are summarized below.
  • immature embryos co-cultured in a medium containing dicamba and picloram showed high efficiency of plant redifferentiation, and the regenerated plants obtained showed a high percentage of transgene expression.
  • Transgene expression was also observed in immature embryos co-cultured in a medium containing 2,4-D, but was slightly lower.
  • Example 4 Effect of heat and centrifugation treatment on immature corn embryos on gene expression in plants regenerated without selection
  • Immature embryos (size 1.0-1.5 mm) of corn (variety: A188) 7 to 14 days after pollination were aseptically collected and washed once with LS-inf liquid medium.
  • pretreatment 46 ° C., 3 minutes heat treatment and 20,000 ⁇ g, 4 ° C., 10 minutes centrifugation
  • immature embryos without these pretreatments were used.
  • Agrobacterium strain LBA4404 (pSB124) was suspended in an LS-inf liquid medium containing 100 ⁇ M acetosyringone to obtain an inoculum.
  • Inoculums were added to immature embryos that had been pretreated with heat and centrifugation and immature embryos that were not pretreated with controls, respectively, and stirred for 30 seconds, and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Except for 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy-acetic acid), LS-AS medium containing 5 ⁇ M AgNO 3 and 5 ⁇ M CuSO 4 (Ishida et al. 1996, solidifying agent is 8 g / l agarose) 6.
  • Immature embryos cultured for 7 days at 25 ° C. in the dark were placed on LSZ medium (Ishida et al. 1996) containing 10 ⁇ M CuSO 4 and cultured at 25 ° C. under illumination for about 2 weeks.
  • a part of the leaf of the plant body that had undergone redifferentiation was cut out, immersed in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 0.1% Triton X-100, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • a phosphate buffer containing 1.0 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X-gluc) and 20% methanol was added. After treatment at 37 ° C. for 24 hours, the expression of the GUS gene was examined.
  • Example 4 The conditions of Example 4 are summarized below.
  • Material Corn Immature embryo Method: Agrobacterium inoculation by conventional method (1) Heat and centrifugation treatment, treatment of adding Ag + and Cu 2+ ions to the medium (2) No heat and centrifugation treatment, treatment of adding Ag + and Cu 2+ ions to the medium, auxin to the co-culture medium Addition: Daikanba After co-culture, go directly to the redifferentiation step without going through the callus growth step.
  • Example 5 Non-selective transformation of rice Materials and Methods
  • Rice (variety: Yukihikari) immature seeds 8 to 12 days after flowering are defatted and treated with 1% sodium hypochlorite containing 70% ethanol for a few seconds and 1 drop of Tween 20 (registered trademark) for 5 minutes. did. Immature seeds were washed several times with sterile water, and immature embryos having a length of 1.3-1.8 mm were collected. Subsequently, in order to increase gene transfer efficiency, immature embryos were subjected to centrifugation at 20,000 ⁇ g for 10 minutes as a transformation improvement treatment (Hiei et al., 2006).
  • Agrobacterium LBA4404 (pSB134) (Hiei and Komari, 2006) was suspended in an AA-inf liquid medium (Hiei and Komari, 2006) containing 100 ⁇ M acetosyringone at a concentration of about 1.0 ⁇ 10 9 cfu / ml, and used as an inoculum source. Centrifugated immature embryos were placed on nN6-As medium (Hiei et al., 2006) with the scutellum side facing up. 5 ⁇ l of the inoculum was dropped on each immature embryo and co-cultured for 7 days in the dark at 25 ° C.
  • each immature embryo was divided into 4 to 5 with a scalpel.
  • the divided immature embryos were placed on an nN6 medium (Hiei et al., 2006) containing 250 mg / l cefotaxime and 100 mg / l carbenicillin with the scutellum side facing upward and cultured at 30 ° C. for about 10 days.
  • Each of the sections enlarged primarily by blastocyst proliferation was further divided into 4-5. At this stage, 18-25 sections were obtained per immature embryo.
  • the sections were placed on an nN6 medium (Hiei et al., 2006) containing 250 mg / l cefotaxime and 100 mg / l carbenicillin with the scutellum side facing upward and cultured under light conditions at 30 ° C. for about 2 weeks.
  • callus was propagated by culturing twice, individual cells of the scutellum grew about 140 times, and the sections were covered with callus.
  • the cell growth rate was estimated from the size of each section. From the callus formed in the section, only one callus (0.5-1 mm large) is taken out for each section, placed on N6R regeneration medium (Hiei et al., 2006), and 2 under 30 ° C light conditions. Cultured for a week. The reason why only one callus was placed on the regeneration medium from each section was to obtain a plant body derived from random and independent cells.
  • Southern blot analysis was performed by the following method. DNA was extracted from the leaves of the redifferentiated plant by the method of Komari (1989), and 7 ⁇ g of DNA was digested with the restriction enzyme HindIII for each plant. The digested DNA was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis (1.5 V / cm, 15 hours). Southern hybridization was performed by the method of Sambrook et al. (1989). As a probe, a SalI-SacI (1.9 kb) fragment of pGL2-IG (Hiei et al., 1994), which is a GUS gene fragment, was used.
  • Example 5 The conditions of Example 5 are summarized below.
  • Test 1 Super Binary Vector having pSB134 GUS gene, hygromycin resistance gene (selection marker gene) and part of pathogenicity gene of strong pathogenic strain Selection process: None in all steps Results The test was performed twice (Tests 1 and 2). The results of Test 1 are shown in Table 1. In Test 1, 100 divided sections were obtained from 5 immature embryos, and 100 calluses were placed on the regeneration medium from each, yielding 92 plants. Of these, 73 plants were examined for GUS gene expression one leaf at a time. Nine plants were transformants that expressed GUS uniformly throughout the leaf tissue (GUS positive). It was. The transformation efficiency was 12.3% per regenerated plant body.
  • Test 2 The results of Test 2 are shown in Table 2.
  • 107 divided sections were obtained from 5 immature embryos, and 107 calluses were placed on the regeneration medium from each, yielding 100 plants. Of these, 95 plants were examined for GUS gene expression with leaves one by one, and 16 plants were transformants that uniformly expressed GUS. The transformation efficiency was 16.8% per redifferentiated plant body. As described above, a transformant was obtained with a very high efficiency of 10% or more per redifferentiated plant without any selection process.
  • FIG. 1 The result of Southern blot analysis is shown in FIG.
  • the presence of the introduced GUS gene was confirmed in all the 11 individuals examined in the redifferentiated plants that showed a positive expression of the GUS gene (FIG. 1). Even in redifferentiated plants in which the expression of the GUS gene showed a dot shape, the presence of the GUS gene was confirmed in all 6 individuals examined, but there was a tendency that the copy number of the introduced gene was high in any individual. (FIG. 1). Further, Southern blot analysis was also performed on the redifferentiated plants in which the expression of the GUS gene was negative, but no band hybridizing with the GUS probe was detected in any of the 7 plants tested.
  • blastocysts of immature embryos into which genes were introduced were proliferated, and redifferentiated plants were obtained from callus randomly extracted from them. Of these, 10% or more were transformed plants. This indicates that 10% or more of the blastocysts of immature embryos have been transformed by Agrobacterium infection.
  • Example 6 Southern analysis of transgenic maize plant obtained without selection Materials and Methods
  • the transformed corn (variety: A188) obtained in Examples 3 and 4 was cultivated in a greenhouse.
  • DNA was extracted from the leaves of these plants by the method of Komari et al. ( Komari et al. (1989)), and 10 ⁇ g of DNA was digested with the restriction enzyme BamHI for each plant.
  • the digested DNA was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis (1.5 V / cm, 15 hours).
  • Southern hybridization was performed by Sambrook et al. (Sambrook, J., et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. .
  • a SalI-SacI 1.9 kb
  • fragment of pGL2-IG Hiei et al., 1994
  • Example 7 Inheritance to a progeny plant of a transgene in transformed maize obtained without selection Materials and Methods The transformed corn (variety: A188) obtained in Examples 3 and 4 was cultivated in a greenhouse. Pollen was collected from a non-transformed A188 plant and crossed with the silk thread of the transformed plant to obtain a progeny seed (T1 generation).
  • the obtained seeds were sown in a plastic pot containing culture soil.
  • the seedling leaves on the 11th day after sowing were cut out, immersed in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 0.1% Triton X-100, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • a phosphate buffer containing 1.0 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X-gluc) and 20% methanol was added. After treatment at 37 ° C. for 24 hours, the expression of the GUS gene was examined.
  • DNA was extracted from the leaves of the transformed plant and the above-mentioned T1 plant by the method of Komari (1989), and 10 ⁇ g of DNA was digested with the restriction enzyme BamHI for each plant.
  • the digested DNA was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis (1.5 V / cm, 15 hours).
  • Southern hybridization was performed by the method of Sambrook et al. (1989).
  • a SalI-SacI (1.9 kb) fragment of pGL2-IG Hiei et al., 1994, which is a GUS gene fragment, was used.
  • Results Table 3 shows the results of examining the separation of the GUS gene in the progeny plants of corn transformed plants obtained by non-selected traits.
  • DNA extracted from the transgenic plant of line number 195 showed one hybridizing band.
  • DNA extracted from five plants showing GUS positivity showed a single band of the same size as the T0 plant.
  • no hybridizing band was detected in the DNA extracted from the plant showing GUS negative.
  • DNA extracted from the transformed plant of line number 169 showed 5 hybridizing bands.
  • DNA extracted from 5 plants that showed GUS positivity showed bands of the same size as the T0 plant, but the number was different from 1, 4 and 5. Since the expression of the GUS gene in the T1 plant of line number 169 showed separation of two factors, it was estimated that 4 copies and 1 copy of the GUS gene are located on different chromosomes. No hybridizing band was detected in DNA extracted from plants that showed GUS negative (FIG. 3).

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Abstract

 本発明は、新規のアグロバクテリウムによる形質転換植物の作成方法を提供することを目的とする。  本発明の作成方法は、 　　（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び 　　(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程 を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって 　１）形質転換向上処理を行うこと、及び 　２）共存から再分化までのいずれの工程においても、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行なわないこと を特徴とする。

Description

アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
　本出願は、２００８年３月３１日に出願された日本国特許出願２００８－０９４０４９に基づく優先権を主張する。
　本発明は、新規のアグロバクテリウムによる形質転換植物の作成方法に関する。
　主要穀類であるトウモロコシ、イネなどの単子葉植物の形質転換方法としては、従来より、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが知られている。しかし、これらの物理的遺伝子導入方法は多コピーの遺伝子が導入されてしまう、遺伝子の挿入がインタクトな形でなされない、形質転換植物に奇形や不稔が多くみられるなどの問題を有している。
　アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入法は、双子葉植物の形質転換法として普遍的に用いられている。アグロバクテリウム属細菌の宿主は双子葉植物のみに限られ、単子葉植物には寄生しないとされている（Ｄｅ　Ｃｌｅｅｎｅ　ａｎｄ　Ｄｅ　Ｌｅｙ　１９７６）が、アグロバクテリウムにより単子葉植物を形質転換する試みがなされている。
　Ｇｒｉｍｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．はアグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡの中にトウモロコシストリークウイルス（Ｍａｉｚｅ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ）のＤＮＡを挿入したものをトウモロコシ生長点に接種したところ、トウモロコシストリークウイルスの感染を確認したことを報告している。トウモロコシストリークウイルスのＤＮＡを接種しただけでは、このような感染症状が認められないことから、上の観察はアグロバクテリウムがトウモロコシにＤＮＡを導入することができることを示すものと解釈している（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９８７）。しかし、ウイルスは核ゲノムに組み込まれなくても増殖する可能性があるので、この結果はＴ－ＤＮＡが核に組み込まれたものを示しているとはいえない。Ｇｒｉｍｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．はさらに感染効率はトウモロコシの茎頂の生長点に接種したときが最も高く（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９８８）、感染にはアグロバクテリウムのプラスミドのＶｉｒ　Ｃ遺伝子が必須であることを示した（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９８９）。
　Ｇｏｕｌｄ　ｅｔ　ａｌ．はトウモロコシの生長点に針で傷を付けた後、カナマイシン抵抗性遺伝子とＧＵＳ遺伝子を持った強病原性アグロバクテリウムＥＨＡ１を接種し、処理後の生長点をカナマイシンで選抜したところ、抵抗性を示す植物を得た。この後代の種子が導入した遺伝子を持つことを確認するためサザン分析を行ったところ、一部の種子で導入遺伝子が確認された（Ｇｏｕｌｄ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１）。このことは、アグロバクテリウム処理された生長点からカナマイシン選抜により得られた植物体には形質転換細胞と非形質転換細胞が混在していたことを示す（キメラ現象）。
　Ｍｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．は、アグロバクテリウムを用いてコムギの胚にカナマイシン抵抗性遺伝子の導入を試みた。まず、胚を酵素で処理することにより、細胞壁に傷を付け、その後アグロバクテリウムを接種した。処理したカルスのうち極めて少数のカナマイシン抵抗性と思われるカルスが増殖したが、このカルスから植物体の再生はできなかった。また、カナマイシン抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で確認したところ、全ての抵抗性カルスで導入遺伝子の構造変異がみられた（Ｍｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１）。
Ｒａｉｎｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ．はイネの胚盤に傷を付けた後、強病原性のアグロバクテリウムＡ２８１　（ｐＴｉＢｏ５４２）をイネの８品種に処理したところ、日本晴、藤坂５号の２品種で腫瘍状の組織の増殖がみられた。さらに、Ｔ－ＤＮＡからホルモン合成遺伝子を除いたＴｉプラスミドにカナマイシン抵抗性遺伝子とＧＵＳ遺伝子を挿入したプラスミドを持つアグロバクテリウムをイネの胚に接種したところカナマイシン抵抗性カルスの増殖がみられた。この抵抗性カルスでは、ＧＵＳ遺伝子の発現が認められたが、形質転換植物を得ることはできなかった。これらのことから、アグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡがイネの細胞に導入されたと解釈している（Ｒａｉｎｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ．　１９９０）。
　このように、イネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科の作物でもアグロバクテリウムによる遺伝子導入が可能であることを示唆する研究報告がなされていたが、何れも再現性に問題があるほか、導入した遺伝子の確認についても不完全で、説得できる結果が示されていなかった（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　１９９０）。
　Ｃｈａｎ　ａｔ　ｌ．は２，４－Ｄ共存下で２日間培養したイネ未熟胚に付傷後、ジャガイモ懸濁培養細胞を含む培地中でｎｐｔ　ＩＩ遺伝子とＧＵＳ遺伝子を持ったアグロバクテリウムを接種した。処理した未熟胚をＧ４１８添加培地上で培養したところ、誘導されたカルスから再分化植物体が得られた。再分化植物体およびその後代の植物体でのＧＵＳ遺伝子の所在をサザン分析で確認したところ、再分化当代、後代いずれの植物体でも導入遺伝子の存在が認められたことを報告している（Ｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９３）。この結果は、アグロバクテリウムによるイネの形質転換を支持するものであるが、形質転換効率は１．６％と非常に低く、供試した未熟胚数２５０に対し、正常な生長を示した再生植物体は１個体にすぎなかった。イネの未熟胚を摘出するには多大な労力を要するため、このように低い形質転換効率では実用的なレベルにあるとは言い難い。
　近年、強病原性アグロバクテリウムの病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクターの利用により、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても、安定して、高効率で形質転換のなされることが報告された（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．　１９９４，　Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）。これらの報告では、アグロバクテリウムによる形質転換は、安定して、高効率で形質転換がなされる他に、得られた形質転換植物に変異が少なく、導入された遺伝子はコピー数が少なく、かつインタクトな形のものが多いという利点をもつとしている。イネ、トウモロコシでの成功に続いて、主要な穀類であるコムギ（Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）、オオムギ（Ｔｉｎｇａｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）およびソルガム（Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２０００）でのアグロバクテリウムによる形質転換の報告がなされた。
　アグロバクテリウムによるトウモロコシ形質転換の効率を改善する試みとしては、上記以外にも、Ｎ６基本培地での形質転換細胞の選抜（Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）、培地へのＡｇＮＯ3およびカルベニシリンの添加（Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１、Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００３）、共存培地へのシステインの添加（Ｆｒａｍｅ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）などがなされてきた。このように培地組成や選抜マーカー遺伝子の改変により、アグロバクテリウムによるイネやトウモロコシの形質転換においても効率の向上がなされている。
　これまでに報告されているアグロバクテリウムによるイネ・トウモロコシの形質転換方法では、そのほとんどが、アグロバクテリウムを接種した胚盤由来カルス、あるいはアグロバクテリウムを接種した未熟胚から誘導されたカルスについて、除草剤の成分や抗生物質を含む培地で形質転換カルスを選択的に増殖させ、得られた形質転換細胞塊を再分化培地に置床して再分化させる、という工程を経て形質転換植物を得ている（Ｄｅｊｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００；　Ｎｅｇｒｏｔｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００；　Ｎｏｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００ａ；　Ｎｏｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００ｂ；　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００；　Ｆｒａｍｅ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　２００３；　Ｆｒａｍｅ　ｅｔ　ａｌ．　２００６）。
　植物の形質転換方法においては、形質転換細胞の選抜は形質転換植物の作出に不可欠であり、この工程がなければ植物の形質転換は成功しないとされてきた（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８；　Ｅｒｉｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００５；　Ｊｏｅｒｓｂｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１）。形質転換細胞の選抜は多くの場合、非形質転換細胞の増殖を阻害する薬剤に対して抵抗性を示す遺伝子を植物材料に導入する操作を行い、この薬剤を含む培地で植物材料を培養することにより、薬剤抵抗性遺伝子が植物細胞のゲノムに組み込まれ発現する形質転換細胞のみを選択的に増殖させる方法により行われる。
　形質転換細胞の選抜に用いられる遺伝子（選抜マーカー遺伝子）のうち、最も一般的に使用される遺伝子は除草剤あるいは抗生物質に対する抵抗性を付与するものである（Ｋｕｉｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）。除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子としてはｂａｒ遺伝子やＥＰＳＰ遺伝子（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８７；　Ｃｏｍａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８５）、抗生物質に対する抵抗性を付与する遺伝子としてはＮＰＴＩＩ遺伝子やＨＰＴ遺伝子（Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８３；　Ｗａｌｄｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８５）が植物の形質転換の選抜マーカー遺伝子として使用されることが多い。また近年、特定の糖の代謝能を利用したＰＭＩ遺伝子やＸｙｌＡ遺伝子（Ｊｏｅｒｓｂｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８；　Ｈａｌｄｒｕｐ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）なども選抜マーカー遺伝子として有効であることが報告されている。形質転換された細胞を選択的に増殖させる機構を利用した選抜マーカー遺伝子としては、上述したものの他にも数多くの遺伝子が報告されている。そして、これらの遺伝子を用いた形質転換法では形質転換細胞を選択的に増殖させる選抜工程は必須であると考えられている。
　花芽組織に減圧浸潤法を用いて形質転換を行うインプランタ形質転換法では、形質転換された種子は選抜工程を経ずに得られる（Ｂｅｎｔ，　２０００）。しかし、非形質転換種子が多数混在した種子の中から目的とする形質転換種子を得るためには抗生物質抵抗性遺伝子などを利用した選抜工程が必要となる。
　ＧＦＰ遺伝子を導入し、紫外線照射下で蛍光を発する細胞を指標に可視的に形質転換部位を選抜し、形質転換植物を得る方法が報告されている（Ｅｌｌｉｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８；　Ｚｈｕ　ｅｔ　ａｌ．，　２００４）。この方法では、形質転換細胞は増殖の違いにより非形質転換細胞と混在した中からは選抜されることはないが、ＧＦＰ遺伝子の発現の有無により、形質転換細胞と非形質転換細胞を区別し、より分ける選抜工程が必要である。
　選抜マーカー遺伝子を形質転換植物から除く技術として、コ・トランスフォーメーションシステム（Ｋｏｍａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）、ＭＡＴベクターシステム（Ｅｂｉｎｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）およびＣｒｅＬｏｘシステム（Ｇｌｅａｖｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　２００３）が報告されている。これらのシステムを用いることにより、選抜マーカー遺伝子を含まない形質転換植物を得ることができる。しかし、選抜マーカーフリーの形質転換植物を作出する過程では、従来より用いられている薬剤耐性遺伝子や植物ホルモン合成遺伝子などを使用し、形質転換細胞と非形質転換細胞を区別し選抜する工程が必要である。
　このように、植物の形質転換においてこれまでになされている方法では、形質転換細胞と非形質転換細胞を選り分ける選抜工程が不可欠であった。この選抜工程には、上記のように、目的とする遺伝子（ＧＯＩ遺伝子）の他に選抜を行うための選抜マーカー遺伝子が必要である。この選抜マーカー遺伝子が発現することにより産生されるタンパク質や酵素の働きにより生ずる反応、例えば除草剤抵抗性、抗生物質抵抗性や蛍光の発光などを利用し、多数の非形質転換細胞の中のごく一部の形質転換細胞を区別して増殖させ形質転換植物が得られる。しかし、選抜マーカー遺伝子は作出された形質転換植物には不要なものであり、さらに選抜マーカー遺伝子が形質転換植物に含まれたままでは、除草剤抵抗性遺伝子や抗生物質抵抗性遺伝子が形質転換体を介して一般の非組換え植物に伝播する危険は皆無とはいえないとして、形質転換植物の利用に不安を抱く一般消費者も多い。また、選抜マーカー遺伝子は多くの種類が報告されているものの、植物の種により適応できる選抜マーカー遺伝子は限定され、複数の遺伝子を分けて導入するときには問題となる。さらに形質転換体から選抜マーカー遺伝子を除く技術も報告されているが、これらの方法は通常の形質転換法よりも長い培養期間や後代植物での選抜マーカーフリー個体の選抜など、多大な労力を要する。
　以上のように、これまでに形質転換植物の作出に関する報告が数多くなされているが、形質転換された細胞、組織、器官あるいは個体を、形質転換されていない細胞、組織、器官あるいは個体からより分ける選抜工程を経ずに形質転換体を得る方法は報告されていない。すなわち、ＧＯＩ（Ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）遺伝子のみを導入して形質転換植物を得ることは現在まで不可能であったといえる。
ＷＯ９８／５４９６１ ＷＯ０２／１２５２０ ＷＯ０２／１２５２１ ＷＯ２００５／０１７１６９ ＷＯ２００５／０１７１５２ ＷＯ２００７／０６９６４３ Ｄｅ　Ｃｌｅｅｎｅ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｄｅ　Ｌｅｙ，　Ｊ．　（１９７６）　Ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｃｒｏｗｎ　ｇａｌｌ．　　Ｂｏｔ．　Ｒｅｖ．　４２：３８９－４６６． Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，　Ｎ．，　Ｈｏｒｎ，　Ｔ．，　Ｄａｖｉｓ，　Ｊ．Ｗ．　ａｎｄ　Ｈｏｒｎ，　Ｂ．　（１９８７）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｍａｉｚｅ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｔｏ　ｍａｉｚｅ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　３２５：１７７－１７９． Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，　Ｎ．Ｈ．，　Ｒａｍｏｓ，　Ｃ．，　Ｈｅｉｎ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｈｏｒｎ，　Ｂ．　（１９８８）　Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ｐｌａｎｔｓ　ａｒｅ　ｍｏｓｔ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ｔｏ　Ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｍａｉｚｅ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ．　Ｂｉｏ／ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ　６：１８５－１８９． Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，　Ｎ．，　Ｈｏｒｎ，　Ｂ．，　Ｒａｍｏｓ，　Ｃ．，　Ｋａｄｏ，　Ｃ．　ａｎｄ　Ｒｏｇｏｗｓｋｙ，　Ｐ．　（１９８９）　ＤＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｆｒｏｍ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｏ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　ｏｒ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｂｙ　ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２１７：３０９－３１６． Ｇｏｕｌｄ，　Ｊ．，　Ｄｅｖｅｙ，　Ｍ．，　Ｈａｓｅｇａｗａ，　Ｏ．，　Ｕｌｉａｎ，　Ｅ．Ｃ．，　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｒ．Ｈ．　（１９９１）　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．　ｕｓｉｎｇ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ａｎｄ　ｓｈｏｏｔ　ａｐｅｘ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　９５：４２６－４３４． Ｍｏｏｎｅｙ，　Ｐ．Ａ．，　Ｇｏｏｄｗｉｎ，　Ｐ．Ｂ．，　Ｄｅｎｎｉｓ，　Ｅ．Ｓ．　ａｎｄ　Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，　Ｄ．Ｊ．　（１９９１）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎｔｏ　ｗｈｅａｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　Ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　２５：２０９－２１８． Ｒａｉｎｅｒｉ，　Ｄ．Ｍ．，　Ｂｏｔｔｉｎｏ，　Ｐ．，　Ｇｏｒｄｏｎ，　Ｍ．Ｐ．　ａｎｄ　Ｎｅｓｔｅｒ，　Ｅ．Ｗ．　（１９９０）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）．　Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：３３－３８． Ｐｏｔｒｙｃｕｓ，　Ｉ　（１９９０）　Ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ　ｃｅｒｅａｌｓ：　ａｎ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．　Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：５３５－５４２． Ｃｈａｎ，　Ｍ－Ｔ．，　Ｃｈａｎｇ，　Ｈ－Ｈ．，　Ｈｏ，　Ｓ－Ｌ．，　Ｔｏｎｇ，　Ｗ－Ｆ．　ａｎｄ　Ｙｕ，　Ｓ－Ｍ．　（１９９３）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　α－ａｍｙｌａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　／　β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ．　　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２２：４９１－５０６． Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｏｈｔａ，　Ｓ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　（１９９４）　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ．　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　６：２７１－２８２． Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｓａｉｔｏ，　Ｈ．，　Ｏｈｔａ，　Ｓ．，　Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　（１９９６）　Ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４：７４５－７５０． Ｃｈｅｎｇ，　Ｍ．，　Ｆｒｙ，　Ｊ．　Ｅ．，　Ｐａｎｇ，　Ｓ．，　Ｚｈｏｕ，　Ｈ．，　Ｈｉｒｏｎａｋａ，　Ｃ．　Ｍ．，　Ｄｕｎｃａｎ，　Ｄ．　Ｒ．，　Ｃｏｎｎｅｒ，　Ｔ．　Ｗ．，　　Ｗａｎ，　Ｙ．　（１９９７）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１１５：　９７１－９８０． Ｔｉｎｇａｙ，　Ｓ．，　ＭｃＥｌｒｏｙ，　Ｄ．，　Ｋａｌｌａ，　Ｒ．，　Ｆｉｅｇ，　Ｓ．，　Ｗａｎｇ，　Ｍ．，　Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，　Ｓ．，　Ｂｒｅｔｔｅｌｌ，　Ｒ．　（１９９７）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂａｒｌｅｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　１１：　１３６９－１３７６． Ｚｈａｏ，　Ｚ．－Ｙ．，　Ｃａｉ，　Ｔ．，　Ｔａｇｌｉａｎｉ，　Ｌ．，　Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｍ．，　Ｗａｎｇ，　Ｎ．，　Ｐｅｎｇ，　Ｈ．，　Ｒｕｄｅｒｔ，　Ｍ．，　Ｓｃｈｏｅｄｅｒ，　Ｓ．，　Ｈｏｎｄｒｅｄ，　Ｄ．，　Ｓｅｌｔｚｅｒ，　Ｊ．，　Ｐｉｅｒｃｅ，　Ｄ．　（２０００）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｏｒｇｈｕｍ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　４４：　７８９－７９８． Ｄｅｊｉ，　Ａ．，　Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，　Ｈ．，　Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｙａｍａｄａ，　Ｓ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．，　Ｋｕｂｏ，　Ｔ．，　Ｓｕｇｉｙａｍａ，　Ｔ．　（２０００）　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ＺｍＲＲ１　ａｎｄ　ＺｍＲＲ２　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　１４９２：　２１６－２２０． Ｎｅｇｒｏｔｔｏ，　Ｄ．，　Ｊｏｌｌｅｙ，　Ｍ．，　Ｂｅｅｒ，　Ｓ．，　Ｗｅｎｃｋ，　Ａ．　Ｒ．，　Ｈａｎｓｅｎ，　Ｇ．　（２０００）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ａｓ　ａ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ　ｔｏ　ｒｅｃｏｖｅｒ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍａｉｚｅ　ｐｌａｎｔｓ　（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）　ｖｉａ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９：　７９８－８０３． Ｎｏｍｕｒａ，　Ｍ．，　Ｓｅｎｔｏｋｕ，　Ｎ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，　Ａ．，　Ｌｉｎ，　Ｊ－Ｈ．，　Ｈｏｎｄａ，　Ｃ．，　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，　Ｍ．，　Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｏｈｔａ，　Ｓ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．，　Ｍｉｙａｏ－Ｔｏｋｕｍｏｒｉ，　Ｍ．，　Ｋｏｎｏ－Ｍｕｒａｋａｍｉ，　Ｙ．，　Ｔａｊｉｍａ，　Ｓ．，　Ｋｕ，　Ｍ．　Ｓ．　Ｂ．，　Ｍａｔｓｕｏｋａ，　Ｍ．　（２０００ａ）　Ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ４　ｐｌａｎｔｓ：　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　Ｃ４－ｔｙｐｅ　ｐｙｒｕｖａｔｅ，　ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｉｋｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　２２：　２１１－２２１． Ｎｏｍｕｒａ，　Ｍ．，　Ｋａｔａｙａｍａ，　Ｋ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，　Ａ．，　Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｏｈｔａ，　Ｓ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．，　Ｍｉｙａｏ－Ｔｏｋｕｔｏｍｉ，　Ｍ．，　Ｔａｊｉｍａ，　Ｓ．，　Ｍａｔｓｕｏｋａ，　Ｍ．　（２０００ｂ）　Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　ｒｂｃＳ　ｉｎ　ａ　Ｃ３　ｐｌａｎｔ　（ｒｉｃｅ）　ｄｉｒｅｃｔｓ　ｏｒｇａｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ，　ｌｉｇｈｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ａ　Ｃ４　ｐｌａｎｔ　（ｍａｉｚｅ），　ｂｕｔ　ｄｏｅｓ　ｎｏｔ　ｃｏｎｆｅｒ　ｂｕｎｄｌｅ　ｓｈｅａｔｈ　ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　４４：　９９－１０６． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，　Ｍ．，　Ｉｚａｗａ，　Ｋ．，　Ｋｕ，　Ｍ．　Ｓ．　Ｂ．，　Ｌｉｎ，　Ｊ－Ｈ．，　Ｓａｉｔｏ，　Ｈ．，　Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｏｈｔａ，　Ｓ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．，　Ｍａｔｓｕｏｋａ，　Ｍ．，　Ｓｕｇｉｙａｍａ，　Ｔ．　（２０００）　Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍａｉｚｅ　Ｃ4　ｐｙｒｕｖａｔｅ，　ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｉｋｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｄｉｒｅｃｔｓ　ｃｅｌｌ－　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍａｉｚｅ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　４１：　４２－４８． Ｚｈａｏ，　Ｚ．－Ｙ．，　Ｇｕ，　Ｗ．，　Ｃａｉ，　Ｔ．，　Ｔａｇｌｉａｎｉ，　Ｌ．，　Ｈｏｎｄｒｅｄ，　Ｄ．，　Ｂｏｎｄ，　Ｄ．，　Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，　Ｓ．，　Ｒｕｄｅｒｔ，　Ｍ．，　Ｐｉｅｒｃｅ，　Ｄ．　（２００１）　Ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ．　Ｍｏｌ．　Ｂｒｅｅｄ．　８：　３２３－３３３． Ｆｒａｍｅ，　Ｂ．Ｒ．，　Ｓｈｏｕ，　Ｈ．，　Ｃｈｉｋｗａｍｂａ，　Ｒ．Ｋ．，　Ｚｈａｎｇ，　Ｚ．，　Ｘｉａｎｇ，　Ｃ．，　Ｆｏｎｇｅｒ，　Ｔ．Ｍ．，　Ｐｅｇｇ，　Ｓ．Ｅ．Ｋ．，　Ｌｉ，　Ｂ．，　Ｎｅｔｔｌｅｔｏｎ，　Ｄ．Ｓ．，　Ｐｅｉ，　Ｄ．，　Ｗａｎｇ，　Ｋ．　（２００２）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２９：　１３－２２． Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｓａｉｔｏ，　Ｈ．，　Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　（２００３）　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０：５７－６６． Ｚｈａｎｇ，　Ｗ．，　Ｓｕｂｂａｒａｏ，　Ｓ．，　Ａｄｄａｅ，　Ｐ．，　Ｓｈｅｎ，　Ａ．，　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，　Ｃ．，　Ｐｅｓｃｈｋｅ，　Ｖ．，　Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ，　Ｌ．　（２００３）　Ｃｒｅ／ｌｏｘ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍａｒｋｅｒ　ｇｅｎｅ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍａｉｚｅ　（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）　ｐｌａｎｔｓ．　Ｔｈｅｏｒ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１０７：　１１５７－１１６８． Ｆｒａｍｅ，　Ｂ．Ｒ．，　ＭｃＭｕｒｒａｙ，　Ｊ．Ｍ．，　Ｆｏｎｇｅｒ，　Ｔ．Ｍ．，　Ｍａｉｎ，　Ｍ．Ｌ．，　Ｔａｙｌｏｒ，　Ｋ．Ｗ．，　Ｔｏｒｎｅｙ，　Ｆ．Ｊ．，　Ｐａｚ，　Ｍ．Ｍ．，　Ｗａｎｇ，　Ｋ．　（２００６）　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｍａｉｚｅ　ｉｎｂｒｅｄ　ｌｉｎｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ＭＳ　ｓａｌｔｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．　２５：　１０２４－１０３４． Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｋａｓａｏｋａ，　Ｋ．　＆　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ａｎｄ　ｍａｉｚｅ　ｂｙ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｍｍａｔｕｒｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｉｔｈ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｅａｔ　ｐｒｉｏｒ　ｔｏ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　８７，　２３３－２４３　（２００６）． Ｈｉｅｉ，　Ｙ．　＆　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｉｃａ　ｒｉｃｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　８５，　２７１－２８３　（２００６）． Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｌｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｎｉｎｅ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．　６０，　２２３－２２９　（１９８９）． Ｂｅｎｔ，　Ａ．Ｆ．　（２０００）　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔａ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　　Ｕｓｅｓ，　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　１２４：１５４０－１５４７． Ｂｅｖａｎ，　Ｍ．Ｗ．，　Ｆｌａｖｅｌｌ，　Ｒ．Ｂ．，　Ｃｈｉｌｔｏｎ，　Ｍ．－Ｄ．　（１９８３）　Ａ　ｃｈｉｍａｅｒｉｃ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ａ　ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔｓ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｎａｔｕｒｅ，　３０４：１８４－１８７． Ｃｏｍａｉ，　Ｌ．，　Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ，　Ｄ．，　Ｈｉａｔｔ，　Ｗ．Ｒ．，　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｇ．，　Ｒｏｓｅ，　Ｒ．Ｅ．，　Ｓｔａｌｋｅｒ，　Ｄ．Ｍ．　（１９８５）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　ａ　ｍｕｔａｎｔ　ａｒｏＡ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ．　Ｎａｔｕｒｅ，　３１７：７４１－７４４． Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ，　Ｍ．，　Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ，　Ｊ．，　Ｖａｎｄｅｗｉｅｌｅ，　Ｍ．，　Ｄｏｃｋｘ，　Ｊ．，　Ｔｈｏｅｎ，　Ｃ．，　Ｇｏｓｓｅｌe，　Ｖ．，　Ｍｏｖｖａ，　Ｎ．Ｒ．，　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｃ．，　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ，　Ｍ．，　Ｌｅｅｍａｎｓ，　Ｊ．　（１９８７）　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｂｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ．　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　６：２５１３－２５１８． Ｅｂｉｎｕｍａ，　Ｈ．，　Ｓｕｇｉｔａ，　Ｋ．，　Ｍａｔｓｕｎａｇａ，　Ｅ．，　Ｙａｍａｋａｄｏ，　Ｍ．　（１９９７）　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｒｋｅｒ－ｆｒｅｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ａ　ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．，　９４：２１１７－２１２１． Ｅｌｌｉｏｔｔ，　Ａ．Ｒ．，　Ｃａｍｐｂｅｌｌ，　Ｊ．Ａ．，　Ｂｒｅｔｔｅｌｌ　Ｒ．Ｉ．Ｓ．，　Ｇｒｏｆ，　Ｃ．Ｐ．Ｌ．　（１９９８）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｕｓｉｎｇ　ＧＦＰ　ａｓ　ａ　ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒ．　Ａｕｓｔ．　Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　２５：７３９－７４３． Ｅｒｉｋｓｏｎ，　Ｏ．Ｓ．，　Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ，　Ｍ．，　Ｎaｓｈｏｌｍ，　Ｔ．　（２００５）　Ｔｈｅ　ｄｓｄＡ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５７：４２５－４３３． Ｇｌｅａｖｅ，　Ａ．Ｐ．，　Ｍｉｔｒａ，　Ｄ．Ｓ．，　Ｍｕｄｇｅ，　Ｓ．Ｒ．，　Ｍｏｒｒｉｓ，　Ｂ．Ａ．Ｍ．　（１９９９）　Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒ－ｆｒｅｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｅｘｕａｌ　ｃｒｏｓｓｉｎｇ：　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｒｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　ａｎｄ　ｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｌｅｔｈａｌ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｇｅｎｅ．　Ｐｌａｎｔ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　４０：２２３－２３５． Ｈａｌｄｒｕｐ，　Ａ．，　Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，　Ｓ．Ｇ．，　Ｏｋｋｅｌｓ，　Ｆ．Ｔ．　（１９９８）　Ｔｈｅ　ｘｙｌｏｓｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ　ａｌｌｏｗｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｄ－ｘｙｌｏｓｅ　ａｓ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｇｅｎｔ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　３７：２８７－２９６． Ｊｏｅｒｓｂｏ，　Ｍ．，　Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，　Ｉ．，　Ｋｒｅｉｂｅｒｇ，　Ｊ．，　Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，　Ｓ．Ｇ．，　Ｂｒｕｎｓｔｅｄｔ，　Ｊ．，　Ｏｋｋｅｌｓ，　Ｆ．Ｔ．　（１９９８）　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍａｎｎｏｓｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｇａｒ　ｂｅｅｔ．　Ｍｏｌ．　Ｂｒｅｅｄ．，　４：１１１－１１７． Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．，　Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｓａｉｔｏ，　Ｙ．，　Ｍｕｒａｉ，　Ｎ．，　Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　（１９９６）　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｔｗｏ　ｓｅｐａｒａｔｅ　Ｔ－ＤＮＡｓ　ｆｏｒ　ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ａｎｄ　ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ　ｆｒｅｅ　ｆｒｏｍ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒｓ．　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　１０：１６５－１７４． Ｋｕｉｐｅｒ，　Ｈ．Ａ．，　Ｋｌｅｔｅｒ，　Ｇ．Ａ．，　Ｎｏｔｅｂｏｒｎ，　Ｈ．Ｐ．Ｊ．Ｍ．，　Ｋｏｋ，　Ｅ．Ｊ．　（２００１）　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｏｏｄ　ｓａｆｅｔｙ　ｉｓｓｕｅｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｆｏｏｄ．　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　２７：５０３－５２８． Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，　Ｉ．，　Ｂｉｌａｎｇ，　Ｒ．，　Ｆuｔｔｅｒｅｒ　Ｊ．，　Ｓａｕｔｔｅｒ，　Ｃ．，　Ｓｃｈｒｏｔｔ，　Ｍ．　（１９９８）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｃｒｏｐ　ｐｌａｎｔｓ．　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｅｒ　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．　１１９－１５９． 竹松哲夫　（１９８２）　除草剤研究総覧　博友社　７９－１５４． Ｗａｌｄｒｏｎ，　Ｃ．，　Ｍｕｒｐｈｙ，　Ｅ．Ｂ．，　Ｒｏｂｅｒｔｓ，　Ｊ．Ｌ．，　Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ，　Ｇ．Ｄ．，　Ａｒｍｏｕｒ，　Ｓ．Ｌ．，　Ｍａｌｃｏｌｍ，　Ｓ．Ｋ．　（１９８５）　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ：　Ａ　ｎｅｗ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｉｅｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５：１０２－１０８． Ｚｈｕ，　Ｙ．Ｊ．，　Ａｓｂａｙａｎｉ，　Ｒ．，　Ｍｏｏｒｅ，　Ｐ．Ｈ．　（２００４）　Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓ　ａ　ｖｉｓｕａｌ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｐａｐａｙａ　（Ｃａｒｉｃａ　ｐａｐａｙａ　Ｌ．）　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．，　２２：６６０－６６７． Ｃｈｕ，　Ｃ．－Ｃ．　（１９７８）　Ｔｈｅ　Ｎ６　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ａｎｔｈｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｅｒｅａｌ　ｃｒｏｐｓ．　Ｉｎ　Ｐｒｏｃ．　Ｓｙｍｐ．　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ．　Ｐｅｋｉｎｇ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ，　ｐｐ．　４３－５０． Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　（１９８９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．
　従来のアグロバクテリウム属細菌を介した単子葉植物への遺伝子導入方法において、選抜マーカー遺伝子導入を利用した、形質転換細胞、組織、器官あるいは個体の選抜工程は不可欠であった。本発明はこのような選抜工程を経ずに形質転換植物を得ることのできる方法を開発し、提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、単子葉植物について形質転換効率向上処理を行うことにより、選抜マーカー遺伝子を導入することなく、実用的な効率で形質転換植物を得られることを見出した。
　具体的には、本発明者らは、一般に、植物の形質転換工程では、外来遺伝子の組み込まれる植物細胞の数が非常に少ないことに着目し、形質転換の効率を大幅に向上させて、非形質転換細胞中に占める形質転換細胞の割合を高めてやり、それを植物体再分化まで維持することができれば、選抜マーカー遺伝子を利用した選抜工程を経ることなく形質転換植物を得られるのではないかと考えた。鋭意研究の結果、形質転換向上処理を適切に行うことにより十分実用的な効率で形質転換植物を得られることを見出し、本発明を想到した。
　限定されるわけではないが本発明は、好ましい態様として下記の態様を含む。
［態様１］
　　（ｉ）アグロバクテリウム菌を接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
　　(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
　１）形質転換向上処理を行うこと、及び
　２）共存から再分化までのいずれの工程においても選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないこと
を特徴とする、前記形質転換植物の作成方法。
［態様２］
　３）共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まないこと、をさらに特徴として有する、態様１に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様３］
　アグロバクテリウム菌により導入される核酸が選抜薬剤に対する耐性遺伝子を含まない、態様１又は２に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様４］
　１）形質転換向上処理が、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、あるいは、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理である、態様１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様５］
　１）形質転換向上処理が以下からなるグループから選択される、態様１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
　熱処理；
　遠心処理；
　熱及び遠心処理；
　加圧処理；
　硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加；
　粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理；
　共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加
　カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理；ならびに
　共存培地にシステインを添加する処理
［態様６］
　共存工程において、ベンゾイック系除草剤に属する化合物を添加することを含む、態様１ないし５に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様７］
　ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、安息香酸型、サリチル酸型またはピコリン酸型のいずれかである、態様６に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様８］
　ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、３，６－ジクロロ－ｏ－アニシン酸、または４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸である、態様６または７に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様９］
　植物が単子葉植物である、態様１ないし８に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様１０］
　植物がトウモロコシ又はイネである、態様１ないし９に記載の形質転換植物の作成方法。
　［本発明の実施するための好ましい態様］
　本発明は、アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法を提供する。本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介して植物への遺伝子導入を行う方法であって、形質転換効率向上処理を行うことにより、選抜マーカー遺伝子の導入が不要になる、という発見に基づく。本発明の方法は、
　　（ｉ）アグロバクテリウム菌を接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
　　(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
　１）形質転換向上処理を行うこと、及び
　２）共存から再分化までの全ての工程で選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないこと
を特徴とする。
　形質転換向上処理
　本発明は、形質転換向上処理を行うことを特徴の１つとする。本発明の方法において、「形質転換向上処理」とは、当該処理を行うことにより、得られる形質転換植物の割合が向上する処理をいう。限定されるわけではないが、具体的には、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理などが挙げられる。このような形質転換向上処理としては、限定されるものではないが、例えば以下のようなものあるいはこれらの組み合わせが含まれる。
　熱処理（参照：ＷＯ９８／５４９６１）、
　遠心処理（参照：ＷＯ０２／１２５２０）、
　熱及び遠心処理（参照：ＷＯ０２／１２５２１）、
　加圧処理（参照：ＷＯ２００５／０１７１６９）、
　硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加（参照：ＡｇＮＯ3（Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１、Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００３；ＣｕＳＯ4（ＷＯ２００５／０１７１５２）、
　粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理（参照：ＷＯ２００７／０６９６４３）、
　共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加（参照：Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１、Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００３）、
　カルス増殖培地にＮ６無機塩（Ｃｈｕ　１９７８）を添加する処理（Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）、ならびに
　共存培地にシステインを添加する処理（Ｆｒａｍｅ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）。
　このうち、熱処理、遠心処理、熱及び遠心処理、加圧処理、粉体の添加はいずれも遺伝子導入効率を向上させる処理であり、硝酸銀、硫酸銅、カルベニシリンの添加はカルス誘導率を向上させる効果がある。また、再分化培地への硫酸銅の添加は再分化効率を向上させる。
　限定されるわけではないが、熱処理は例えばＷＯ９８／５４９６１に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に、３３℃ないし６０℃、好ましくは３７℃ないし５２℃で、５秒間ないし２４時間、好ましくは１分間ないし２４時間、処理する。
　遠心処理は、例えばＷＯ０２／１２５２０に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に、１００Gないし２５万G、好ましくは、５００Gないし２０万G、更に好ましくは１０００Gないし１５万Gの遠心加速度で、１秒間ないし４時間、更に好ましくは１秒間ないし２時間処理する。
　熱及び遠心処理は例えばＷＯ０２／１２５２１に記載の方法を用いて行うことができる。熱処理及び遠心処理の条件は、例えば上述した条件を採用しうる。
　加圧処理は、例えばＷＯ２００５／０１７１６９に記載の方法を用いて行うことができる。加圧処理は、限定されるわけではないが、好ましくは１．７気圧ないし１０気圧の範囲、より好ましくは２．４気圧ないし８気圧の範囲で行われる。
　硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加は、例えば、Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１、Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００３、ＷＯ２００５／０１７１５２に記載されている。硝酸銀および／または硫酸銅は、例えば、１μＭないし５０μＭ、好ましくは１μＭないし１０μＭの濃度で、共存培地に添加しうる。
　粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理は、例えばＷＯ２００７／０６９６４３に記載の方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウム懸濁液と粉体を混合して植物材料に接種する、あるいは、植物と粉体を混合してこれにアグロバクテリウムを接種する、といった方法で行う。粉体は、限定されるものではないが、多孔質の粉体、グラスウールまたは活性炭であり、好ましくは多孔性セラミックス、グラスウールまたは活性炭、さらに好ましくはハイドロキシアパタイト、シリカゲル、グラスウールである。
　カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理（Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）では、カルス増殖培地にＮ６無機塩（Ｃｈｕ　１９７８）を添加することにより行う。
　共存培地にシステインを添加する処理では、システインを１０ｍｇ／ｌないし１ｇ／ｌ、好ましくは５０ｍｇ／ｌないし７５０ｍｇ／ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／ｌないし５００ｍｇ／ｌで、共存培地に添加しうる。
　共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加は、Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１、またはＩｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００３に記載の方法を用いて行うことができる。カルベニシリンは、カルス増殖用培地、及び／または再分化工程に例えば、５０ｍｇ／ｌないし５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００ｍｇ／ｌないし３００ｍｇ／ｌの濃度で添加しうる。なお、カルベニシリンは抗生物質であるが、植物に対してほとんど毒性がなく、培地中の微生物の増殖を防ぐ目的で利用することができる。
　当業者は、これらの処理を適切なタイミング・条件で行うことができる。また、これらを適宜組み合わせることは、形質転換効率向上のために一層好ましい。例えば、またトウモロコシであれば、熱及び遠心処理、粉体処理、共存培地へのＡｇＮＯ3及び／又はＣｕＳＯ4の添加処理、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質としてカルベニシリン添加処理のうち２つ以上を組み合わせることが望ましい。イネでは、熱処理および／または遠心処理を含むことが好ましく、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質としてカルベニシリン添加処理を組み合わせることが最も好ましい。
　従って、好ましい形質転換向上処理は、熱処理、遠心処理、熱及び遠心処理、加圧処理、共存培地にＡｇＮＯ3および／またはＣｕＳＯ4を添加する処理、あるいは粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質をカルベニシリンにする処理、またはこれらの組み合わせである。
　本発明者らは、これらの処理を行うことで、最終的に得られる再分化個体中の形質転換個体の数を十分に増加させることに成功し、形質転換細胞の選抜処理を行わなくても十分な形質転換個体が得られることを見出し、実用に足る無選抜形質転換方法を確立した。
　これらの形質転換個体は、導入遺伝子の有無をＰＣＲなどの手法で確認することにより、また後代個体であれば導入遺伝子の表現型を確認することにより、容易に獲得することができる。
　形質転換細胞の選抜
　本発明は、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程でも、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行わないことを特徴とする。
　アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜の例として、選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜が挙げられる。
　「選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜」とは、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程において、形質転換植物を選抜するための薬剤を添加した培地での培養を行い、選抜薬剤に対する耐性の有無により形質転換された細胞を選抜することを意味する。本発明はこのような工程を全く含まない。
　従来の技術で使用されてきた選抜薬剤の例は、抗生物質および／または除草剤である。抗生物質としては、植物に対して毒性を有するもの、例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、またはブラストサイジンＳ等が、除草剤としては、例えば、フォスフィノスライシン、ビアラフォス、またはグリホセート等が使用されてきた。
　本工程のために、アグロバクテリウム中のＴ－ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、選抜薬剤に対する耐性遺伝子を含むことが必要であった。このような選抜薬剤に対する耐性遺伝子は当該技術分野においては公知である。例えばハイグロマイシンを選抜薬剤として含む再分化培地において再分化工程が行われる場合、植物にはアグロバクテリウムからハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていることが必要である。
　本発明では、薬剤を用いた選抜工程を行わないため、選抜薬剤に対する耐性遺伝子、即ち、選抜マーカー遺伝子をアグロバクテリウムにより導入される核酸が有する必要がない。よって、限定されるわけではないが、好ましい態様において、本発明ではこのような核酸を含まない。
　あるいは、従来法として、形質転換植物の選抜は、植物細胞の「栄養要求性選抜」、例えば「糖要求性」に基づいて行われることもある。
　糖要求性の場合、植物細胞が利用できる糖はシュークロース、グルコースなどがあるが、マンノースは利用できないことが知られている。したがって、マンノースのみを炭素源とする培地で植物組織を培養すると、利用できる糖がないために植物組織は枯死する。糖要求性に基づく選抜はこの原理を利用するものである。糖要求性に基づき形質転換植物の選抜を行う場合には、植物組織には、アグロバクテリウムから通常植物細胞が利用できない糖類を利用可能にする遺伝子が導入されている。このような遺伝子は当該技術分野において公知であり、例えば、ＰＭＩ遺伝子、キシロースイソメラーゼ遺伝子等が使用可能である。本発明では、導入される核酸がこのような遺伝子を含む必要がない。
　あるいは、従来法として、容易に検出可能な遺伝子をスクリーニングの指標として導入し、当該遺伝子の発現の有無により選抜することがある。このようなスクリーニングの指標となる遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子等があげられる。本発明では、導入される核酸がこのような遺伝子を含む必要がない。
　本発明の方法において、選抜マーカー遺伝子とは、多数の非形質転換細胞の中にある形質転換細胞を選抜することを目的として、形質転換しようとする目的遺伝子（ＧＯＩ遺伝子）の他に、植物に導入する遺伝子を意味する。限定されるものではないが、この選抜マーカー遺伝子の例として、除草剤抵抗性遺伝子、抗生物質抵抗性遺伝子、蛍光遺伝子などが挙げられる。
　形質転換植物の作成方法
　アグロバクテリウムによる形質転換植物の作成方法は、一般に以下のＩ～Ｖの工程の全部又は一部を含む。
　Ｉ．植物材料の調製工程
　ＩＩ．アグロバクテリウムの調製および接種工程
　ＩＩＩ．共存工程
　ＩＶ．カルス増殖工程
　Ｖ．再分化工程
　Ｉ．植物材料の調製工程
　本発明の対照となる植物はアグロバクテリウムを用いた形質転換導入方法が適用可能な植物である。好ましくは単子葉植物である。本発明の方法に供される単子葉植物には、好ましくはイネ科植物であり、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ソルガムその他が含まれるがこれらに限定されるものではない。本発明の方法に供される最も好ましい植物は、イネまたはトウモロコシである。
　本発明の方法において、「植物材料」とは、アグロバクテリウム法による植物の形質転換に供試するための当該植物の細胞、葉、根、茎、芽、花（雄蕊、雌蕊等含む）、実、種子、発芽種子もしくはその他いずれかの部位の植物組織、成長点、外植片、未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織（以下、本明細書においてカルス等、または単にカルスという）、または完全な植物体、などの植物のあらゆる態様を包含する。
　本発明の方法に用いる植物材料の形態として好ましいのは未熟胚またはカルスであり、最も好ましいのは未熟胚である。本明細書において、植物の細胞、組織、完全な植物体という表現は、技術分野において一般的に用いられる意味で用いられる。本明細書において、未熟胚とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚および胚盤をいう。また、本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受粉後２日以降のものが好ましい。後述の形質転換後、後述の方法により、増殖し、正常な個体を再生する能力を有するカルスを誘導できる未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未熟胚はインブレッド、インブレッド間のＦ１、インブレッドと自然受粉品種間のＦ１、市販Ｆ１品種の未熟胚であることが好ましい。本明細書において、カルスとは、無秩序に増殖する未分化状態の細胞塊をいう。カルスを得るためには、植物組織の分化した細胞をオーキシン（例えば、２，４－Ｄ）またはサイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地（脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得るための処理を脱分化処理といい、またこの過程を脱分化過程という。
　本工程において、必要に応じ、植物組織、未熟胚などを植物体、種子などから取り出し、形質転換に好適な植物材料を調製する。植物材料の調製は公知の方法によって行うことができる。また、所望により植物材料をアグロバクテリウムに感染させる前に培養してもよい。
　ＩＩ．アグロバクテリウムの調製および接種工程
　本発明において使用される植物材料はアグロバクテリウムを接種される。本明細書で使用する「接種する」とは、アグロバクテリウムを植物材料に接触することをいい、当該技術分野においては種々のアグロバクテリウムを接種する方法が公知である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウムを液体培地に懸濁した懸濁液に植物材料を加える方法、共存培地上の植物材料にアグロバクテリウムの懸濁液を直接滴下する方法、植物材料中にアグロバクテリウム菌懸濁液を注入する方法およびアグロバクテリウム懸濁液中に植物材料を浸漬し減圧する方法があげられる。しかしながら、本発明において使用されるアグロバクテリウムを接種された植物材料は、これらの方法によりアグロバクテリウムを接種された植物材料に限定されない。
　当該アグロバクテリウムの接種工程においては、アグロバクテリウムによる形質転換効率を改善するために、例えば、アセトシリンゴン、界面活性剤、多孔性セラミックス等の種々の添加剤をアグロバクテリウムの懸濁液中に含ませることが可能である。
　本発明に使用可能なアグロバクテリウムは公知のいずれのアグロバクテリウム属細菌であってよいが、好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓである。本発明の好ましい態様において、アグロバクテリウムは、例えば、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１およびＡＧＬ１、Ｃ５８Ｃ１等であるが、これに限定はされない。
　土壌細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が多くの双子葉植物に根頭癌腫病（ｃｒｏｗｎ　ｇａｌｌ　ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こすことは古くから知られており、１９７０年代には、Ｔｉプラスミドが病原性に関与すること、さらにＴｉプラスミドの一部であるＴ－ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後このＴ－ＤＮＡには癌腫の誘発に必要なホルモン（サイトカイニンとオーキシン）の合成に関与する遺伝子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。Ｔ－ＤＮＡの切り出しと植物への伝達にはＴｉプラスミド上のヴィルレンス領域（ｖｉｒ領域）に存在する遺伝子群が必要であり、またＴ－ＤＮＡが切り出されるためにはＴ－ＤＮＡの両端に存在するボーダー配列が必要である。他のアグロバクテリウム属細菌であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓもＲｉプラスミドによる同様なシステムを有している（例えば、特開２０００－３４２２５６の図３および図４）。
　アグロバクテリウムの感染によってＴ－ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれるので、Ｔ－ＤＮＡ上に所望の遺伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれることが期待された。しかしながら、Ｔｉプラスミドは１９０ｋｂ以上と巨大であるため、標準的な遺伝子工学的手法ではプラスミド上のＴ－ＤＮＡ上に遺伝子を挿入することは困難であった。そのため、Ｔ－ＤＮＡ上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。
　まず、腫瘍性のＴｉプラスミドのＴ－ＤＮＡからホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型の菌系（ｄｉｓａｒｍｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ）であるＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８３），　Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３０３，　ｐ．１７９－１８０参照）、Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ３８５０）、ＧＶ３Ｔｉ１１ＳＥなどが作製された。これらを用いることにより、所望の遺伝子をアグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ－ＤＮＡ中に、あるいは所望の遺伝子を有するＴ－ＤＮＡをアグロバクテリウムに導入する２種類の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が容易で所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製ができる中間ベクターを、アグロバクテリウムのディスアーム型ＴｉプラスミドのＴ－ＤＮＡ領域中に、三系交雑法（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ）を介して相同組換えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼ばれる。
　もう一つは、バイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ）法とよばれるもので、Ｔ－ＤＮＡの植物への組み込みにｖｉｒ領域が必要であるが、機能するために同じプラスミド上に存在する必要はないという結果に基づいている。このｖｉｒ領域にはｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧが存在し、（植物バイオテクノロジー事典（エンタプライズ株式会社発行（１９８９）））、ｖｉｒ領域とはこのｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧの全てを含むものをいう。バイナリーベクターは、Ｔ－ＤＮＡをアグロバクテリウムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これをディスアーム型Ｔｉプラスミドを有するアグロバクテリウムに導入して用いる。
　アグロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入は、エレクトロポレーション法や三系交雑法などの、公知の方法により行うことができる。バイナリーベクターには、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２などがあり、これらをもとに数多くの新たなバイナリーベクターが構築され、形質転換に用いられている。また、Ｒｉプラスミドのシステムにおいても、同様なベクターが構築され形質転換に用いられている。
　アグロバクテリウムＡ２８１は、強病原性（ｓｕｐｅｒ－ｖｉｒｕｌｅｎｔ）の菌系であり、その宿主範囲は広く、形質転換効率も他の菌系より高い。この特性は、Ａ２８１が有するＴｉプラスミドのｐＴｉＢｏ５４２によるものである。ｐＴｉＢｏ５４２を用いて、これまでに２つの新しいシステムが開発されている。一つはｐＴｉＢｏ５４２のディスアーム型のＴｉプラスミドを有する菌系ＥＨＡ１０１およびＥＨＡ１０５を用いたものであり、これらを上述のバイナリーベクターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の植物の形質転換に利用されている。
　もう一つは、スーパーバイナリーベクターシステムである。スーパーバイナリーベクター（’ｓｕｐｅｒ－ｂｉｎａｒｙ’　ｖｅｃｔｏｒ）については、例えば本明細書中に援用される以下の文献に記載されている。
　Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４），　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　Ｖｏｌ．６，　ｐ．２７１－２８２；
　Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６），　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．４，　ｐ．７４５－７５０；
　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｋｕｂｏ　Ｔ．，　（１９９９），　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｉｎ　Ｖａｓｉｌ，　Ｉ．　Ｋ．　（ｅｄ．）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｅｒｅａｌ　ｃｒｏｐｓ．，　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，　ｐ．４３－８２；および
　国際公開第９５／０６７２２号パンフレット
　スーパーバイナリーベクターシステムについては、例えば特開２０００－３４２２５６の図４に記載されている。
　このシステムは、ｖｉｒ領域（ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧ（以下、これらをそれぞれ「ｖｉｒ断片領域」ということもある。））を持つディスアーム型のＴｉプラスミドおよびＴ－ＤＮＡを有するプラスミドからなることから、バイナリーベクターシステムの一種である。しかしながら、Ｔ－ＤＮＡを有する側のプラスミド、即ちバイナリーベクターにｖｉｒ断片領域のうち、少なくとも一つのｖｉｒ断片領域を実質的に取除いたｖｉｒ領域の断片（このうち好ましくは少なくともｖｉｒＢまたはｖｉｒＧを含む断片、さらに好ましくはｖｉｒＢおよびｖｉｒＧを含む断片）を組み込んだスーパーバイナリーベクターを用いる点で異なる。なお、スーパーバイナリーベクターを有するアグロバクテリウムに、所望の遺伝子を組み込んだＴ－ＤＮＡ領域を導入するには、三系交雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる。
　本発明の方法においては、宿主となるアグロバクテリウム属細菌としては、特に限定されないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（例えば上述のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８３），　Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３０３，　ｐ．１７９－１８０を参照）およびＥＨＡ１０１）を好ましく用いることができる。
　本発明の方法によれば、アグロバクテリウム属細菌における病原性（ｖｉｒ）領域の遺伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることなく本発明の効果を得ることができる。
　例えば、上述した中間ベクター、バイナリーベクター、強病原性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターなどいずれのベクターシステムに対しても用いることができ、本発明による効果を得ることができるが、強病原性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターが、形質転換効率がより向上するため、好ましい。（特に導入先植物がトウモロコシの場合には、スーパーバイナリーベクターを使用することが好ましい）。これらのベクター類を改変した、異なるベクターシステムを用いた場合においても同様である（例えば、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒ領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミド中に組み込む、ｖｉｒ領域の一部または全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてアグロバクテリウムに導入するなど）。
　植物に導入しようとする所望の遺伝子は、上記プラスミドのＴ－ＤＮＡ領域中の制限酵素部位に常法により組み込むことができる。大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所望のＤＮＡをＴ－ＤＮＡ領域内に導入することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には、三系交雑法により、アグロバクテリウム属細菌の細胞内での相同組換えを利用することで目的のＤＮＡを導入することができる。限定されるわけではないが、導入される遺伝子の大きさは好ましくは約１００ｂｐないし２００ｋｂｐである。
　また、プラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ等のアグロバクテリウム属細菌に導入する操作は従来法により行うことができ、例としては、上記した三系交雑法やエレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法などが含まれる。
　植物に導入しようとする遺伝子は、従来の技術と同様に基本的にはＴ－ＤＮＡの左右境界配列の間に配置されるものである。しかし、プラスミドが環状であるため、境界配列の数は１つでもよく、複数の遺伝子を異なる部位に配置しようとする場合には、境界配列が３個以上あってもよい。また、アグロバクテリウム属細菌中で、ＴｉまたはＲｉプラスミド上に配置されてもよく、または他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには、複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
　アグロバクテリウム属細菌を植物材料に接種することは、例えば、植物材料をアグロバクテリウム属細菌と単に接触させることによって行ってもよい。接種は、通常接種により行ってもよく、また、滴下接種により行ってもよい。
　通常接種は、植物材料とアグロバクテリウム属細菌懸濁液（接種源）を混合して植物材料を当該懸濁液に浸漬し、浸漬した植物材料を取り出して、培地上に着床させて共存培養を行うことにより接種を行う方法である。例えば、１０6～１０11ｃｆｕ／ｍｌ程度の細胞濃度のアグロバクテリウム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に植物材料を３～１０分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。滴下接種は、培地上に着床させた植物材料上にアグロバクテリウム属細菌懸濁液を滴下し、滴下した懸濁液が乾いた後、植物材料を培地の別の場所あるいは別の培地上に着床させて共存培養を行うことにより接種を行う方法である。
　ＩＩＩ．共存工程
　本工程は、上記のようにアグロバクテリウムを接種した植物細胞を、アグロバクテリウムの共存下にて、オーキシン類を含む培地で培養することにより、植物細胞へのアグロバクテリウムからＤＮＡの導入を確実にする工程である。好ましくは、植物材料をアグロバクテリウムに感染させると同時に、あるいは感染後、アグロバクテリウムを除去する前に、植物材料をアグロバクテリウムと共存培養させる。
　本工程で使用される培地は、本明細書中では「共存培地」という。共存培養には公知の培地を使用できる。例えば、ＬＳ－ＡＳ培地、ｎＮ６－ＡＳ培地、あるいはその他、Ｎ６Ｓ３－ＡＳ培地、２Ｎ６－ＡＳ培地（Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４），　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　Ｖｏｌ．６，　ｐ．２７１－２８２を参照）等の培地が知られている。
　本発明において好ましくは、共存培地中にオーキシン類を添加する。オーキシン類は一般に植物材料を脱分化させる作用を有するために、本工程において、ほとんどの植物材料は一部または全部が脱分化組織（カルス）となる。オーキシン類としては、例えば、３，６－ジクロロ－ｏ－アニシン酸（ダイカンバ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－D）、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－T）、および／またはトリヨード安息香酸 (ＴＩＢＡ)が挙げられる。本発明の好ましい態様においては、共存培地中にダイカンバ、ピクロラム、２，４－Ｄ、２，４，５－Ｔ以外のオーキシン類は含まない。
　限定されるわけではないが、ダイカンバ、ピクロラム、２，４Ｄ、２，４，５－Ｔなどのオーキシン類の共存培地中における総量は、好ましくは、０．１－５．０ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは、０．５－３．０ｍｇ／ｌ、より好ましくは、１．０－２．０ｍｇ／ｌ、最も好ましくは、１．５ｍｇ／ｌである。
　本発明者らは、植物材料がトウモロコシの場合、オーキシン類の中でも特にベンゾイック系除草剤に属するオーキシン活性を示す物質を共存培地に添加することにより、形質転換効率が一層向上し、選抜マーカー遺伝子を導入することなく、形質転換植物を得られることを見出した。
　ベンゾイック系除草剤はその基本構造から、（ｉ）安息香酸型、（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型、（ｉｖ）テレフタール酸型に分けられる（Ｔａｋｅｍａｔｓｕ、１９８２）。しかしながら、（ｉｖ）テレフタール酸型はオーキシン活性を示さないため、（ｉ）安息香酸型、（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型のいずれかに属する除草剤が好ましく、より好ましくは（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型のいずれかである。さらに好ましくは、ダイカンバ（Ｄｉｃａｍｂａ）（３，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－ｏ－ａｎｉｓｉｃ　ａｃｉｄ）あるいはピクロラム（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）（４－ａｍｉｎｏ－３，５，６－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）である。従って、トウモロコシの場合には、共存培地にベンゾイック系除草剤に属するオーキシン活性を示す物質を添加することが最も好ましい。
　あるいは、植物材料がイネの場合は、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－D）を添加することが好ましい。
　本工程における「培養」とは、固化した共存培地の上または液体状の共存培地の中に植物材料を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。共存培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース等が知られている。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日－１０日、より好ましくは７日である。
　ＩＶ．カルス増殖工程
　アグロバクテリウムによる植物の形質転換方法においては、一般にはカルス増殖工程は必要と考えられてきた。
　カルス増殖培地上に移し、カルス増殖させることにより、「形質転換した細胞の集団を含む細胞塊」を得ることができる。カルス増殖培地とは「脱分化状態の細胞を分裂、増殖するのに適当な植物ホルモンおよび栄養素を含む培地であり、一般的な形質転換試験では、形質転換していない細胞の増殖を阻害する薬剤（選抜圧）を添加し形質転換細胞を選択的に増殖させる“選抜培地”としても用いられる。よって本カルス増殖工程は、一般には上記共存工程を経た植物材料を、オーキシン類を含む培地で培養し、形質転換体を遺伝子の導入の有無により選抜する工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「選抜培地」といい、遺伝子の導入の有無により選抜するために選抜薬剤等を含んでいる。
　本工程は、従来法においては、培地の成分組成を変更して、複数回繰り返して行われている。例えば、複数回の選抜工程では、選抜薬剤の濃度を各選抜工程で上昇させることにより、薬剤選抜の確実性が増し、形質転換をした植物体を得られる可能性を上昇させることが可能となる。本選抜工程は、好ましくは少なくとも２回、より好ましくは３回行われる。複数回本工程が行われる場合、本工程は１回につき１０日－３週間程度の期間を要し、複数回の選抜工程全体で５－１０週間程度を要する。よって、アグロバクテリウムによる植物の形質転換方法において、本工程は最も時間を要する工程である。
　従来のアグロバクテリウムによる植物の形質転換方法においては、本工程は必須の工程であると考えられてきた。しかしながら、本発明者らは「形質転換向上処理」により、カルス増殖工程中を含む、共存から再分化までのいずれの工程においても選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わなくても形質転換が上手くいくことを初めて見いだし、本願発明を想到した。よって、本発明においては、好ましくは本工程を省略できる。即ち、共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まない。これにより、作業効率が一層向上し、また形質転換工程をより短期間で行なえるため、より効率的に形質転換植物を得られることを見出した。本明細書中の実施例１－４、６－７では特にトウモロコシの場合に、カルス増殖工程を省略し植物形質転換に成功した例が記載されている。
　あるいは、カルス増殖培地に選抜薬剤を添加せずに、カルス増殖工程を行ってもよい。この場合、カルス増殖は生じるが形質転換体の「選抜」は行われなない。
　Ｖ．再分化工程
　得られた細胞塊の再分化を行い、再分化個体を生育させ、そして、所望により完全な植物体を得る工程である。得られた形質転換細胞から完全な植物体を再生するには、公知の方法（例えば、Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４），　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　Ｖｏｌ．６，　ｐ．２７１－２８２；　および、Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６），　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．１４，　ｐ．７４５－７５０）により行うことができる。
　本工程は、従来法および本発明のいずれにおいても必須の工程である。従来、再分化工程においても選抜薬剤による形質転換体の選抜が必須と考えられてきた。形質転換植物の選抜は、選抜薬剤を含む再分化培地で、共存工程を経た植物材料を培養し、選抜薬剤に対する耐性の有無により行われる。しかしながら、本発明は、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程でも、選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないことを特徴とする。よって、本発明においては、再分化工程においても選抜薬剤を用いた選抜を行わない。
　本工程で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」といい、その特徴としてオーキシン類を含まないことが挙げられる。再分化培地として使用可能な培地は、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＬＳＺ培地等が使用可能である。しかしながら「再分化培地」は、選抜薬剤を含まない。
　本発明における「再分化」とは、全部または一部が脱分化していた植物材料が、再び元の植物材料または植物体の性質を獲得することをいう。再分化工程に供することにより、脱分化組織が再分化し、完全な形質転換植物体を得ることが可能となる。植物が再分化したか否かは植物の形態を観察することにより容易に決定可能である。例えば、脱分化組織から茎や葉のような特定の分化した植物器官が現れるか否かにより決定することが可能である。
　本明細書において、「ビガー」とは、再分化した植物の生育の旺盛さをいう。植物のビガーは当該技術分野で行われる公知の測定方法を用いて測定することが可能である。例えば、トウモロコシの場合は、再分化工程後に、再分化の見られなかった形質転換植物組織を０点、再分化した茎葉の最大長が５ｍｍ未満の形質転換植物組織を１点、再分化した茎葉の最大長が５ｍｍ以上２ｃｍ未満の形質転換植物組織を２点、そして再分化した茎葉の最大長が２ｃｍ以上の形質転換植物組織を３点、とスコアリングしすべての形質転換植物組織の平均値を計算することにより求めることが可能である。ビガーの評価方法はこれに限定されることなく評価対象等に依存して、適当な修正を周知の方法に加えることも可能である。
　本工程における「培養」とは、固化した再分化培地の上または液体状の再分化培地の中に植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。再分化培地の固化は、上記のように例えば寒天等により行うことが可能である。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは１６－２４時間／日の照明下で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは７日－２１日、より好ましくは１４日である。
　本工程の後においては、当該技術分野において公知の方法を用いることにより容易に完全な形質転換植物体を得ることが可能である。得られた再分化個体について、導入遺伝子の有無を確認し、形質転換個体を特定する工程である。限定するものではないが、ＰＣＲやサザン分析などを好ましく用いることができる。また導入遺伝子の表現型を確認することにより、容易に選択することができる。
　本発明により、単子葉植物の形質転換方法において、所望の植物に、植物選抜マーカー遺伝子を導入することなく、安定で効率的な形質転換を行うことができる。
図１は、無選抜形質転換により得られたゆきひかり再分化植物体のサザンブロット解析の結果を示す。
　アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）で形質転換し、無選抜得た再分化植物体よりゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供したのち、ＧＵＳプローブとハイブリダイゼーションした。種子由来ゆきひかり（対照）（レーンＣ）、ＧＵＳ陽性発現（ＧＵＳを一様に発現）再分化植物体（レーン１－１１）、ＧＵＳドット状発現再分化植物体（レーン１２－１７）。
図２は、無選抜形質転換により得られたＡ１８８再分化植物体のサザンブロット解析の結果を示す。
　アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１２４）で形質転換し、無選抜で得た再分化植物体（トウモロコシ）よりゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供したのち、ＧＵＳプローブとハイブリダイゼーションした。種子由来Ａ１８８（対照）（レーンＣ）、ＧＵＳ陽性発現（ＧＵＳを一様に発現）再分化植物体（レーン１－１３）。
図３は、無選抜形質転換により得られたＡ１８８再分化当代植物体およびＴ１後代植物体のサザンブロット解析の結果を示す。
　アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１２４）で形質転換し、無選抜で得た再分化当代植物体（トウモロコシ）および形質転換していないＡ１８８植物の花粉を交配することにより得られたＴ１後代植物体よりゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供したのち、ＧＵＳプローブとハイブリダイゼーションした。系統番号１９５当代（Ｔ０）植物体（レーン１）、系統番号１９５のＧＵＳ陽性発現の後代（Ｔ１）植物体（レーン２－６）、系統番号１９５のＧＵＳ陰性の後代（Ｔ１）植物体（レーン７）。系統番号１６９当代（Ｔ０）植物体（レーン８）、系統番号１６９のＧＵＳ陽性発現の後代（Ｔ１）植物体（レーン９－１３）、系統番号１９５のＧＵＳ陰性の後代（Ｔ１）植物体（レーン１４）。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　実施例１　通常法で接種したトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現
　　１．材料および方法
　受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０－１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ－ｉｎｆ液体培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、１０分間の遠心処理）を行った（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ－ｉｎｆ液体培地に約１．０ｘ１０9　ｃｆｕ／ｍｌでアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４　（ｐＳＢ１３４）（Ｈｉｅｉ　ａｎｄ　Ｋｏｍａｒｉ，　２００６）を懸濁し接種源とした。
　熱・遠心処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４－Ｄ（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）を除き、５μＭ　ＡｇＮＯ3および５μＭ　ＣｕＳＯ4を含むＬＳ－ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に１．５ｍｇ／ｌの濃度でダイカンバ（Ｄｉｃａｍｂａ）（３，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－ｏ－ａｎｉｓｉｃ　ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。
　２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ　ＣｕＳＯ4を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－ｇｌｕｃ）および２０％メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
　以下に、実施例１の条件をまとめた。
　　材料：　トウモロコシ　未熟胚
　　方法：　通常法でアグロバクテリウム接種
　　形質転換向上処理：　熱及び遠心処理、培地にＡｇ+、Ｃｕ2+イオンを添加する処理
　　共存培地へのオーキシンの添加：　ダイカンバ
　　共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
　　ベクター：　ｐＳＢ１３４　ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
　　選抜処理：　全工程においてなし
　　２．結果
　ＬＳＺ培地に置床した１６の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。４から１３枚の葉片を各未熟胚から再分化した植物より採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
　２つの未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの１４の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現を示す葉片は５つの未熟胚でみられた。ストライプ状にＧＵＳ遺伝子を発現する葉片は６つの未熟胚でみられた。ドット状、ストライプ状に発現する葉片を両方有した未熟胚は２つみられた。ここで、ストライプ状に発現したものは、形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラであること、ドット状に発現したものは、一部の形質転換細胞でジーンサイレンシングが起こっていることが推測される。切り口が一様に青く染色されるＧＵＳ陽性の葉片は１つの未熟胚から得られた。
　本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。
　実施例２　滴下法で接種したトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現
　　１．材料および方法
　実施例１と同様の方法で調整したアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４　（ｐＳＢ１３４）の接種源１ｍｌに約８０ｍｇのハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を添加した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、１０分間の遠心処理）を行った。
　上記処理後未熟胚（品種Ａ１８８）を２，４－Ｄを除き、５μＭ　ＡｇＮＯ3および５　μＭ　ＣｕＳＯ4を含むＬＳ－ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に１．５ｍｇ／ｌの濃度でダイカンバを添加した共存培地に胚盤が上になるように置床した。
　接種源中のハイドロキシアパタイトが均等に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌した後、５μｌの接種源を未熟胚上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、未熟胚を同培地上の別の場所に移動した。培養器をシールした後、２５℃、暗黒下で７日間共存培養を行った。共存培養後の未熟胚を実施例１と同様の方法で培養し、再分化植物を得るとともに再分化植物の葉でのＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
　以下に実施例２の条件をまとめた。
　　材料：　トウモロコシ　未熟胚
　　方法：　滴下法でアグロバクテリウム接種
　　形質転換向上処理：　粉体処理、熱及び遠心処理、培地にＡｇ+、Ｃｕ2+イオンを添加する処理
　　共存工程へのオーキシン添加：　ダイカンバ
　　共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
　　ベクター：　ｐＳＢ１３４　ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
　　選抜処理：　全工程においてなし
　　２．結果
　ＬＳＺ培地に置床した１２の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。３から１７枚の葉片を各未熟胚から再分化した植物より採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。３つの未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの９の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現を示す葉片は３つの未熟胚でみられた。ドット状、ストライプ状に発現する葉片を両方有した未熟胚は４つみられた。切り口が一様に青く染色されるＧＵＳ陽性の葉片は２つの未熟胚から得られた。
　本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。
　実施例３　共存培地中のオーキシンがトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現に及ぼす効果
　　１．材料及び方法
　受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０－１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ－ｉｎｆ液体培地で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理）を行った。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ－ｉｎｆ液体培地にアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４　（ｐＳＢ１２４）（Ｋｏｍａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）を懸濁し接種源とした。
　熱処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４－Ｄ（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）を除き、５μＭ　ＡｇＮＯ3および５μＭ　ＣｕＳＯ4を含むＬＳ－ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に６．８μＭの濃度でダイカンバ（３，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－ｏ－ａｎｉｓｉｃ　ａｃｉｄ）あるいはピクロラム（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）（４－ａｍｉｎｏ－３，５，６－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように、２４個の未熟胚を置床した。
　一方、５μＭ　ＡｇＮＯ3および５μＭ　ＣｕＳＯ4を含むＬＳ－ＡＳ培地に対し、オーキシンとして１．５ｍｇ／ｌ（６．８μＭ）の２，４－Ｄを含ませたものも実験した。２４個の未熟胚を置床した。
　２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ　　ＣｕＳＯ4を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
　以下に、実施例３の条件をまとめた。
　　材料：　トウモロコシ　未熟胚
　　方法：　通常法でアグロバクテリウム接種
　　形質転換向上処理：　熱処理、培地にＡｇ+、Ｃｕ2+イオンを添加する処理
　　共存培地へのオーキシンの添加：　ダイカンバ、ピクロラム又は２，４－Ｄ
　　共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
　　ベクター：　ｐＳＢ１２４　ＧＵＳ遺伝子を有するが、選抜マーカー遺伝子を有しない、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
　　選抜処理：　全工程においてなし
　　２．結果
　ダイカンバを含む共存培地で培養した未熟胚はＬＳＺ培地上で置床した２４の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。各未熟胚から再分化した植物より葉を採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。１３個の未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの１１の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現やストライプ状の発現など、不完全な発現をした個体も数えた。
　ピクロラムを含む共存培地で培養した未熟胚もすべてがＬＳＺ培地上で植物体の再分化がみられた。１５個の未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの９つの未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。
　２，４－Ｄを含む培地で共存培養を行った２４の未熟胚のうち、３つの未熟胚はＬＳＺ培地上で植物の再分化はみられなかった。再分化のみられた２１の未熟胚のうち、少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられたのは４未熟胚であった。
　このように、特にダイカンバおよびピクロラムを含む培地で共存培養を行った未熟胚では高い効率で植物体の再分化がみられ、かつ得られた再分化植物が導入遺伝子の発現を示す割合も高かった。２，４－Ｄを含む培地で共存培養を行った未熟胚でも導入遺伝子の発現が観察されたがやや低かった。
　本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。２，４－Ｄ、ダイカンバおよびピクロラムはいずれも除草活性を有する有機化合物のうちオーキシン活性を示す物質である。２，４－Ｄはフェノキシ系除草剤に属し、ダイカンバおよびピクロラムはベンゾイック系除草剤に属する点で異なる（竹松、１９８２）。このことは、トウモロコシでは、未熟胚から無選抜で効率よく形質転換植物を得るには、アグロバクテリウムを接種した未熟胚を共存培養する培地に含まれるオーキシンが、フェノキシ系除草剤に属する物質よりもベンゾイック系除草剤に属する物質の方が適していることを示す。
　実施例４　トウモロコシ未熟胚への熱及び遠心処理が無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現に及ぼす効果
　　１．材料および方法
　受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０－１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ－ｉｎｆ液体培地で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、４℃、１０分間の遠心処理）を行った。対照としてこれらの前処理を行わない未熟胚を供した。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ－ｉｎｆ液体培地にアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１２４）を懸濁し接種源とした。
　熱および遠心の前処理をした未熟胚と対照の前処理を行わない未熟胚にそれぞれ接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４－Ｄ（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）を除き、５μＭ　ＡｇＮＯ3および５μＭ　ＣｕＳＯ4を含むＬＳ－ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６、固化剤は８　ｇ／ｌアガロース）に６．８μＭの濃度でダイカンバ（３，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－ｏ－ａｎｉｓｉｃ　ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。前処理を行った未熟胚、行わない未熟胚をそれぞれ７５個を供試した。試験は２回行った。
　２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ　ＣｕＳＯ4を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
　以下に、実施例４の条件をまとめた。
　　材料：　トウモロコシ　未熟胚
　　方法：　通常法でアグロバクテリウム接種
　　形質転換向上処理：
　　　　（１）熱及び遠心処理、培地にＡｇ+、Ｃｕ2+イオンを添加する処理
　　　　（２）熱及び遠心処理なし、培地にＡｇ+、Ｃｕ2+イオンを添加する処理はあり
　　共存培地へのオーキシンの添加：　ダイカンバ
　　共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
　　ベクター：　ｐＳＢ１２４　ＧＵＳ遺伝子を有するが、選抜マーカー遺伝子を有しない、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
　　選抜処理：　全工程においてなし

　　２．結果
　１回目の試験では、熱及び遠心処理を行った７５の未熟胚から２９６のシュートが再分化した。このうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示したのは５個体であった。これに対し、前処理を行わない７５の未熟胚から再分化のみられた２９１のシュートのうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示した個体は０であった。２回目の試験では、熱・遠心処理を行った未熟胚から２４３のシュートが再分化し、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示すＧＵＳ陽性の個体が４個体得られた。
　熱・遠心処理の前処理を行わない未熟胚では再分化のみられた２６６のシュートのうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示したＧＵＳ陽性の個体は１個体であった。これらの結果から、特に熱・遠心の処理をアグロバクテリウムを接種する前の未熟胚に行うことにより、無選抜により再分化した植物の組織全体で導入遺伝子を発現する個体が効率よく得られることが示された。ただし、１個体のみ遺伝子導入の結果が得られたのは、硝酸銀及び硫酸銅の共存培地への添加の効果と思われる。
　実施例５　イネの無選抜形質転換
　　１．材料および方法
　開花後８ないし１２日のイネ（品種：ゆきひかり）未熟種子を脱頴し、７０％エタノールで数秒、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を１滴含む１％次亜塩素酸ナトリウムで５分間処理した。未熟種子を滅菌水で数回洗浄し、１．３－１．８ｍｍの長さの未熟胚を採取した。ついで、形質転換向上処理として未熟胚に、遺伝子導入効率を高めるため、２０，０００ｘｇで１０分間の遠心処理を行った（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）。１００μＭアセトシリンゴンを含むＡＡ－ｉｎｆ液体培地（Ｈｉｅｉ　ａｎｄ　Ｋｏｍａｒｉ，　２００６）に約１．０ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度でアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）（Ｈｉｅｉ　ａｎｄ　Ｋｏｍａｒｉ，　２００６）を懸濁し接種源とした。遠心処理をした未熟胚をｎＮ６－Ａｓ培地（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）上に胚盤側を上向きにして置床した。各未熟胚に接種源を５μｌずつ滴下し、２５℃暗黒下で、７日間共存培養を行った。
　共存培養後、各々の未熟胚をメスで４ないし５分割した。分割した未熟胚を２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムと１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むｎＮ６培地（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）へ胚盤側を上向きにして置床し、３０℃　明条件下で約１０日間培養した。主に胚盤細胞の増殖により肥大した切片の各々をさらに４ないし５分割した。この段階で未熟胚あたり１８－２５個の切片を得た。切片を２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムと１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むｎＮ６培地（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）へ胚盤側を上向きにして置床し、３０℃明条件下で約２週間培養した。
　共存培養後、２回の培養を行うことによりカルス増殖させ、胚盤の個々の細胞はおよそ１４０倍に増殖し、切片はカルスで覆われた。なお、細胞の増殖比率は、各切片の大きさから推定された。切片に形成されたカルスの中から、切片毎に１カルスのみ（０．５－１ｍｍ大）を取り出し、Ｎ６Ｒ再分化培地（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）へ置床し、３０℃明条件下で２週間培養した。各切片から１カルスのみを再分化培地へ置床したのは、ランダムかつ独立な細胞に由来する植物体を得るためである。各カルスから再分化した苗条塊（ｓｈｏｏｔ　ｃｌｕｍｐ）をＮ６Ｆ発根培地（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）に移植し、３０℃　明条件下で約１０日間培養し、完全な再分化植物体を得た。なお上述した培地には、ハイグロマイシン、ビアラホスなどの選抜薬剤は一切含まれていない。
　得られた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－ｇｌｕｃ）および２０％　メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。なお、ＧＵＳ遺伝子の発現の調査は、１切片につき最大で１植物体からの１枚の葉において実施した。形質転換効率は、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した植物数に対するＧＵＳ陽性（ＧＵＳを一様に発現）を示した植物体数の割合で評価した。
　また、再分化植物体のゲノムに導入遺伝子が組み込まれているかどうかを確認するため、以下の方法により、サザンブロット解析を行った。再分化植物体の葉からＫｏｍａｒｉ（１９８９）の方法によりＤＮＡを抽出し、各植物体につき７μｇのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡは、０．７％　アガロースゲル電気泳動（１．５Ｖ／ｃｍ、１５時間）に供した。サザンハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の方法によって実施した。なお、プローブには、ＧＵＳ遺伝子断片であるｐＧＬ２－ＩＧ（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）のＳａｌＩ－ＳａｃＩ（１．９ｋｂ）断片を用いた。
　以下に実施例５の条件をまとめた。
　　材料：　イネ　未熟胚
　　方法：　通常法でアグロバクテリウム接種
　　形質転換向上処理：　遠心処理、培地にセファタキシム、カルベニシリンを添加する処理
　　共存工程へのオーキシン添加：　２，４－Ｄ
　　共存培養後、カルス増殖工程を経て、直接再分化工程へ。
　　ベクター：　ｐＳＢ１３４　ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
　　選抜処理：　全工程においてなし
　　２．結果
　試験は２回行った（試験１及び２）。試験１の結果を表１に示す。試験１では、５個の未熟胚より１００個の分割切片を得、それぞれから１００個のカルスを再分化培地に置床したところ、９２の植物体を得た。このうち７３の植物体について１枚ずつの葉でＧＵＳ遺伝子の発現を調査したところ、９個の植物体が、葉の組織全体でＧＵＳを一様に発現する（ＧＵＳ陽性）形質転換体であった。形質転換効率は、再分化植物体当たり１２．３％であった。
　試験２の結果を表２に示す。試験２では、５個の未熟胚より１０７個の分割切片を得、それぞれから１０７個のカルスを再分化培地に置床したところ、１００の植物体を得た。このうち９５の植物体について１枚ずつの葉でＧＵＳ遺伝子の発現を調査したところ、１６個の植物体がＧＵＳを一様に発現する形質転換体であった。その形質転換効率は、再分化植物体当たり１６．８％であった。以上のように選抜工程を全く経ることなく、再分化植物体当たり１０％以上という非常に高い効率で形質転換体が得られた。
　試験１および試験２ともにいくつかの植物体の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がドット状を呈した（表１および表２）。この異常な発現は、ジーンサイレンシングによるものと推測される。なお、このドット状の発現を示した植物体は形質転換体とは見なさなかった。
　サザンブロット解析の結果を、図１に示した。ＧＵＳ遺伝子の発現で陽性を示した再分化植物体は、調査した１１個体すべてにおいて導入ＧＵＳ遺伝子の存在が確認された（図１）。ＧＵＳ遺伝子の発現がドット状を示した再分化植物体においても、調査した６個体すべてでＧＵＳ遺伝子の存在が確認されたが、いずれの個体においても導入された遺伝子のコピー数が多い傾向があった（図１）。また、ＧＵＳ遺伝子の発現が陰性であった再分化植物体についても、サザンブロット解析を実施したが、供試した７植物体いずれにおいてもＧＵＳプローブとハイブリダイズするバンドは検出されなかった。
　本実施例では、遺伝子導入した未熟胚の胚盤細胞を増殖させ、その中からランダムに抽出したカルスより再分化植物体を得た。このうち１０％以上が形質転換した植物体であった。このことは、アグロバクテリウム感染により未熟胚の胚盤細胞の１０％以上が形質転換されていることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　実施例６　無選抜で得られた形質転換トウモロコシ当代植物でのサザン分析
　１．材料および方法
　実施例３および４で得られた形質転換トウモロコシ（品種：Ａ１８８）を温室で栽培した。これらの植物の葉からＫｏｍａｒｉらの方法（Ｋｏｍａｒｉら、（１９８９））の方法によりＤＮＡを抽出し、各植物体につき１０μｇのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。消化したＤＮＡは、０．７％　アガロースゲル電気泳動（１．５Ｖ／ｃｍ、１５時間）に供した。サザンハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．）によって実施した。なお、プローブには、ＧＵＳ遺伝子断片であるｐＧＬ２－ＩＧ（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）のＳａｌＩ－ＳａｃＩ（１．９ｋｂ）断片を用いた。
　２．結果
　いずれの形質転換体もＧＵＳプローブにハイブリダイズするバンドを示した。そのパターンは形質転換体ごとに異なり、導入遺伝子が植物の染色体上にランダムに挿入されていることが示された。このことから、無選抜法で得られたトウモロコシ植物が形質転換体であることが分子的手法によって確認された（図２）。
　実施例７　無選抜で得られた形質転換トウモロコシでの導入遺伝子の後代植物への遺伝
　１．材料および方法
　実施例３および４で得られた形質転換トウモロコシ（品種：Ａ１８８）を温室で栽培した。形質転換していないＡ１８８植物から花粉を採取し、形質転換植物の絹糸に交配し、後代種子（Ｔ１世代）を得た。
　得られた種子を培養土を入れたビニールポットに播種した。播種後１１日目の幼苗の葉を切り取り、０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
　形質転換当代植物および上述のＴ１植物の葉からＫｏｍａｒｉ（１９８９）の方法によりＤＮＡを抽出し、各植物体につき１０μｇのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。消化したＤＮＡは、０．７％　アガロースゲル電気泳動（１．５Ｖ／ｃｍ、１５時間）に供した。サザンハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の方法によって実施した。なお、プローブには、ＧＵＳ遺伝子断片であるｐＧＬ２－ＩＧ（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）のＳａｌＩ－ＳａｃＩ（１．９ｋｂ）断片を用いた。
　２．結果
　表３に、無選抜形質により得られたトウモロコシ形質転換植物の後代植物でのＧＵＳ遺伝子の分離を調べた結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　表３に示されるように、調査した４系統の形質転換植物のいずれもその後代植物でＧＵＳ遺伝子の発現が陽性および陰性の分離を示した。ＧＵＳ遺伝子の発現が陽性を示した植物体の数と陰性を示した植物体の数はいずれの系統も１：１あるいは３：１の比に適合し、無選抜形質転換により導入されたＧＵＳ遺伝子がメンデルの法則に従って後代植物に遺伝することが確認された。
　系統番号１９５の形質転換当代植物から抽出したＤＮＡは１本のハイブリダイズするバンドを示した。このＴ１後代植物のうちＧＵＳ陽性を示した５個体の植物から抽出したＤＮＡはいずれもＴ０植物と同じサイズの１本のバンドを示した。これに対し、ＧＵＳ陰性を示した植物から抽出したＤＮＡではハイブリダイズするバンドは検出されなかった。
　系統番号１６９の形質転換当代植物から抽出したＤＮＡは５本のハイブリダイズするバンドを示した。このＴ１後代植物のうちＧＵＳ陽性を示した５個体の植物から抽出したＤＮＡはいずれもＴ０植物と同じサイズのバンドを示したが、その数は１、４、５本と異なった。系統番号１６９のＴ１植物でのＧＵＳ遺伝子の発現は２因子の分離を示したことから、４コピーと１コピーのＧＵＳ遺伝子がそれぞれ別の染色体上に座上することが推定された。ＧＵＳ陰性を示した植物から抽出したＤＮＡではハイブリダイズするバンドは検出されなかった（図３）。
　以上より、無選抜形質により得られたトウモロコシ形質転換植物に導入された遺伝子は、メンデルの法則に従って後代植物に遺伝することが確認された。

Claims (10)

  1. 　　（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
    　　(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
    を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
    　１）形質転換向上処理を行うこと、及び
    　２）共存から再分化までのいずれの工程においても、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行なわないことを特徴とする、前記形質転換植物の作成方法。
  2. 　３）共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まないこと、をさらに特徴として有する、請求項１に記載の形質転換植物の作成方法。
  3. 　アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜が、選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた選抜である、請求項１又は２に記載の形質転換植物の作成方法。
  4. 　１）形質転換向上処理が、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、あるいは、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
  5. 　１）形質転換向上処理が以下からなるグループから選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
    　熱処理；
    　遠心処理；
    　熱及び遠心処理；
    　加圧処理；
    　硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加；
    　粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理；
    　共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加；
    　カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理；ならびに
    　共存培地にシステインを添加する処理
  6. 　共存工程において、ベンゾイック系除草剤に属する化合物を添加することを含む、請求項１ないし５に記載の形質転換植物の作成方法。
  7. 　ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、安息香酸型、サリチル酸型またはピコリン酸型のいずれかである、請求項６に記載の形質転換植物の作成方法。
  8. 　ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、３，６－ジクロロ－ｏ－アニシン酸、または４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸である、請求項６または７に記載の形質転換植物の作成方法。
  9. 　植物が単子葉植物である、請求項１ないし８に記載の形質転換植物の作成方法。
  10. 　植物がトウモロコシ又はイネである、請求項１ないし９に記載の形質転換植物の作成方法。
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