WO2007069643A1 - 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 - Google Patents

粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 Download PDF

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Yuji Ishida
Yukoh Hiei
Jun Ueki
Takeshi Yamamoto
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Japan Tobacco Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently introducing a gene into a plant material via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • the gene transfer method using bacteria belonging to the genus Agrobacterium is universally used as a method for transforming dicotyledonous plants.
  • the host of agrobacterium was limited to dicotyledonous plants and not to monocotyledonous plants (De Cleene, M. and De Ley, J., (1 976) Bot. Rev.
  • Non-Patent Document 24 Hoekema, A., et al., (1983) Nature, 303: 179-180
  • the presence of powder means a state in which powder is present when inoculating plant material with Agrobataterium bacteria. Therefore, after the Agrobataterium bacterial suspension is premixed with the powder, the mixture may be inoculated into the plant material; after the plant material is premixed with the powder, the mixture Terium bacteria may be inoculated; or plant material may be inoculated with agrobacterium at the same time by mixing agar butterium suspension, powder, and plant material at the same time May be. In the present invention, it is sufficient to mix so as to be moderately homogeneous, and it is not necessary to stir strongly. For example, when mixing using a device that stirs with a relatively strong force such as a vortex mixer, the mixing is performed for a short mixing time, for example, 1 minute or less, preferably 45 seconds or less, more preferably 30 seconds or less.
  • a desired gene to be introduced into a plant can be incorporated into a restriction enzyme site in the T DNA region of the plasmid by a conventional method, and PPT (phosphinoslysin) incorporated simultaneously or separately into the plasmid.
  • PPT phosphinoslysin
  • selection can be made based on an appropriate selection marker such as a gene having resistance to drugs such as hygromycin, kanamycin, and paromomycin. Larger ones with many restriction sites may not always be easy to introduce the desired DNA into the T-DNA region using conventional subcloning techniques.
  • the target DNA can be introduced by utilizing the homologous recombination in the cells of a bacterium belonging to the genus Agrobacterium by the three-line hybridization method.
  • the size of the introduced gene is preferably about lOObp to 200 kbp.
  • step (c) infecting the plant material prepared in step (a) with the agrobacterium prepared in (b) in the presence of powder;
  • the present invention provides a method for gene transfer and transformation of a plant by the agrobacterium method with high gene transfer efficiency and transformation efficiency.
  • phosphate buffer pH 6.8 containing 0.1% Triton X-100 and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. After removal of agrobatterium with phosphate buffer, add phosphate buffer containing 1. OmM 5 bromo 4 black mouth 3-indolinole- ⁇ -D glucuronic acid (X-Glue) and 20% methanol. Added. After treatment at 37 ° C for 24 hours, the structure showing blue color was observed under a microscope.
  • the immature embryos after co-cultivation were cultured in a medium containing PPT, and the obtained callus was placed on a re-seed medium containing PPT and cultured.
  • GUS analysis was performed on PPT-resistant plants that had been subdivided. GUS-positive plants were obtained from both immature embryos, but in both inoculated and inoculated seeds, the immature embryos inoculated with powder added to the inoculation source were compared to the immature embryos with no powder added compared to the control immature embryos to which no powder was added. It was clear that the transformation efficiency was improved by adding powder (Table 1).
  • HA hydroxyapatite
  • S G silica gel

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Abstract

　本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、粉体の存在下でアグロバクテリウム属細菌を植物材料に接種することを特徴とする、前記方法を提供する。本発明の方法において、粉体は、少なくとも生体組織に対し悪影響を及ぼさず、かつ、水に不溶性である；生体組織に対する親和性を有する；吸着特性を有するおよび、表面極性を有する；からなる群より選択される１またはそれより多くの特性を有する粉体である。また、本発明は、本発明の遺伝子導入方法を用いることを特徴とする形質転換植物の製造方法を提供する。

Description

明 細 書
粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法
技術分野
[0001] 本発明は、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を効率よく 行う方法に関する。
背景技術
[0002] 主要穀類であるトウモロコシ、イネなどの単子葉植物の形質転換方法としては、エレ タトロポレーシヨン法、パーティクルガン法などが知られている。し力し、これらの物理 的遺伝子導入方法は多コピーの遺伝子が導入されてしまう、遺伝子の挿入がインタ タトな形でなされない、形質転 ^¾物に奇形や不稔が多くみられるなどの問題を有 する。
[0003] ァグロバタテリゥム法による遺伝子導入は、ァグロバタテリゥムの機能を利用した植 物の形質転換方法である。土壌細菌ァグロバタテリゥム (Aerobacterium tumefaciens) は、植物に感染すると、ァグロバタテリゥムの病原性に関与している Ti (tumor-inducin g)プラスミドの一部である T—DNAが植物ゲノムに組み込まれる機能を有して 、る。 ァグロバタテリゥム法による植物の形質転換方法は、 Tiプラスミドの T—DNA領域を 植物ゲノムに導入を所望する遺伝子に置き換えた形質転換用プラスミドを調製し、当 該形質転換用プラスミドを Tiプラスミドの代わりに有するように調製したァグロパクテリ ゥムを用いて、上記のァグロパクテリゥムの機能を利用することにより当該植物ゲノム に導入を所望する遺伝子を植物ゲノム中に導入する方法である。
[0004] ァグロパクテリゥム属細菌を用いた遺伝子導入法は、双子葉植物の形質転換法とし て普遍的に用いられている。ァグロパクテリゥム属細菌の宿主は双子葉植物のみに 限られ、単子葉植物には寄生しないとされていた（De Cleene, M. and De Ley, J., (1 976) Bot. Rev., 42: 389-466)が、ァグロバタテリゥムにより単子葉植物を形質転換す る試みがなされてきた（Grimsley, N" et al., (1987) Nature, 325: 177-179; Gould, J" et al., (1991) Plant Physiol, 95: 426-434; Mooney, P.A., et al., (1991) Plant Cell, T issues and Organ Culture, 25: 209-218; Raineri, D. M., et al" (1990) Bio/technolog y, 8: 33-38)。これらの研究報告はイネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科の作物でもァ グロバタテリゥムによる遺伝子導入が可能であることを示唆していた力 S、何れも再現性 に問題があるほか、導入した遺伝子の確認についても不完全で、説得できる結果が 示されていなかった（Potrycus, I., (1990) Bio/technology, 8: 535-542)。
[0005] Chanらは、 2, 4— D (2, 4—ジクロロフエノキシ酢酸）共存下で 2日間培養したイネ 未熟胚に付傷後、ジャガイモ懸濁培養細胞を含む培地中で nptll遺伝子と GUS遺 伝子を持つたァグロバタテリゥムを接種した。処理した未熟胚を G418添加培地上で 培養したところ、誘導されたカルスから再分化植物体が得られた。再分化植物体およ びその後代の植物体での GUS遺伝子の所在をサザン分析で確認したところ、再分 化当代、後代いずれの植物体でも導入遺伝子の存在が認められたことを報告してい る（Chan, M-T., et al.， (1993) Plant Mol. Biol, 22: 491-506)。この結果は、ァグロバ クテリゥムによるイネの形質転換を支持するものであるが、形質転換効率は 1. 6%と 非常に低ぐ供試した未熟胚数 250に対し、正常な生長を示した再生植物体は 1個 体にすぎなかった。イネの未熟胚を摘出するには多大な労力を要するため、このよう に低 、形質転換効率では実用的なレベルにあるとは言 、難 、。
[0006] 近年、強病原性ァグロバタテリゥムの病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナ リーベクターの利用により、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても、安定して
、高効率で形質転換のなされることが報告された（Hiei, Y., et al, (1994) The Plant J ournal, 6: 271-282; Ishida, Y., et al., (1996) Nature Biotechnology, 14: 745—750)。 これらの報告では、ァグロパクテリゥムによる形質転換は、安定して、高効率で形質転 換がなされる他に、得られた形質転換植物に変異が少なぐ導入された遺伝子はコ ピー数が少なぐかつインタタトな形のものが多いという利点をもっとしている。イネ、ト ゥモロコシでの成功に続いて、主要な穀類であるコムギ（Cheng, M., et al., (1997) PI ant Physiol, 115: 971- 980)、ォォムギ（Tingay, S.， et al.,(1997) Plant J., 11: 1369-1 376)およびソルガム（Zhao, Z.- Y" et al., (2000) Plant Mol. Biol, 44: 789- 798)での ァグロバタテリゥムによる形質転換の報告がなされた。
[0007] Ishidaらは、トウモロコシインブレッド A188および A188に関連したインブレッドを材 料にァグロバタテリゥムによる形質転換を行った（Ishida, Y., et al., (1996) Nature Bio technology, 14: 745-750)。その後、ァグロバタテリゥムによるトウモロコシの形質転換 の報告がなされた力 いずれも A188および A188に関連したノヽイブリツドを用いたも のであった（Deji, A" et al, (2000) Biochim. et Biophys. Acta, 1492: 216—220; Negr otto, D" et al., (2000) Plant Cell Reports, 19: 798-803; Nomura, M., et al" (2000) Plant J., 22: 211-221; Nomura, M., et al" (2000) Plant Mol. Biol., 44: 99-106; Tani guchi, M., et al., (2000) Plant Cell Physiol, 41: 42—48; Zhao, Z.— Y.， et al., (2001) Mol. Breed., 8: 323-333; Frame, B. R" et al" (2002) Plant Physiol, 129: 13—22)。 ァグロバタテリゥムによるトウモロコシ形質転換の効率を改善する試みとしては、 N6基 本培地での形質転換細胞の選抜（Zhao, Z.-Y., et al., (2001) Mol. Breed., 8: 323-3 33)、培地への AgNOおよびカルべ-シリンの添カ卩（Zhao, Z.-Y., et al., (2001) Mol.
3
Breed., 8: 323—333; Ishida, Y., et al., (2003) Plant Biotechnology, 20: 57—66)、共 存培地へのシスティンの添加（Frame, B. R., et al., (2002) Plant Physiol, 129: 13-2 2)などがなされてきた。 Ishidaらは、共存培養後のトウモロコシ未熟胚を AgNOおよ
3 びカルべ-シリンを含む培地で選抜することにより A188以外の公的インブレッドであ る H99および W117の形質転^ ¾物の作出をするとともに、同方法により A188の形 質転換効率が向上することを報告した（Ishida, Y., et al., (2003) Plant Biotechnolog y, 20: 57-66) o
[0008] Singhおよび Chawlaは、シリコンカーバイドファイバー（SCF)の懸濁液中でコムギの 未熟胚をボルテックスミキサーで 2〜3分間撹拌した後、ァグロバタテリゥムを接種す ることにより、 GUS遺伝子を発現する未熟胚の数が増すことを報告した (Singh, N. an d Chawla, S.， (1999) Current Science, 76: 1483-1485)。これは SCFにより未熟胚が 付傷されたこと〖こよるもので、ァグロパクテリゥム接種前に組織を付傷する試みは、他 にパーティクルガンによる付傷 (Bidney et al, 1992)や超音波処理による付傷 (Trick, H. N. and Finer, J. J" (1997) Transgenic Res., 6 : 329- 336)などがある。
[0009] ァグロバタテリゥムによるトウモロコシの形質転換にお 、て形質転換効率を向上させ るために種々の試みがなされてきた（Negrotto, D., et al., (2000) Plant Cell Reports, 19: 798-803; Zhao, Z.-Y., et al., (2001) Mol. Breed., 8: 323—333; Frame, B. R.， et al" (2002) Plant Physiol, 129: 13-22; Ishida, Y" et al" (2003) Plant Biotechnology , 20: 57-66) oしかし、その効果は同じ単子葉植物であるイネに比べまだ低ぐ実用 的な形質転換トウモロコシを作出する場合のみならず新規な遺伝子の効果をトウモロ コシで確認する場合にもさらなる形質転換効率の向上が望まれている。さらに近年の ゲノミタス研究の進展にともない遺伝子の機能解明のための形質転換の必要性は高 まることから、効率のよい形質転換系が求められるであろう。
[0010] また、他の単子葉植物および双子葉植物においても現行の手法による形質転換効 率を上回る方法の開発は形質転換体を利用する種々の場面で有用である。
[0011] 本明細書に引用される文献は、いずれも本明細書に引用により完全に援用される。
特許文献 1 :特許第 2, 649, 287号公報
特許文献 2 :特許第 2, 329, 819号公報
特許文献 3：特開 2000 - 342256号公報
特許文献 4 :国際公開第 95Z06722号パンフレット
非特許文献 l : Bidney, D" et al" (1992) Plant Mol. Biol, 18: 301-313.
非特許文献 2 : Chan, M- T" et al" (1993) Plant Mol. Biol, 22: 491-506.
非特許文献 3 : Cheng, M., et al., (1997) Plant Physiol, 115: 971-980.
非特許文献 4 : De Cleene, M. and De Ley, J" (1976) Bot. Rev., 42: 389-466.
非特許文献 5 : Deji, A., et al., (2000) Biochim. et Biophys. Acta, 1492: 216-220. 非特許文献 6 : Frame, B. R" et al" (2002) Plant Physiol, 129: 13-22.
非特許文献 7 : Gould, J" et al" (1991) Plant Physiol., 95: 426-434.
非特許文献 8 : Grimsley, N.， et al., (1987) Nature, 325: 177-179.
非特許文献 9 : Hiei, Y.， et al., (1994) The Plant Journal, 6: 271-282.
非特許文献 10 : Ishida, Y.， et al., (1996) Nature Biotechnology, 14: 745-750.
非特許文献 l l : Ishida, Y" et al" (2003) Plant Biotechnology, 20: 57-66.
非特許文献 12 : Mooney, P.A., et al., (1991) Plant Cell, Tissues and Organ Culture,
25: 209-218.
非特許文献 13 : Negrotto, D.， et al., (2000) Plant Cell Reports, 19: 798-803.
非特許文献 14 : Nomura, M., et al" (2000) Plant J., 22: 211-221.
非特許文献 15 : Nomura, M., et al" (2000) Plant Mol. Biol, 44: 99-106. 非特許文献 16 : Potrycus, I., (1990) Bio/technology, 8: 535-542.
非特許文献 17 : Raineri, D. M., et al.， (1990) Bio/technology, 8: 33-38.
非特許文献 18 : Singh, N. and Chawla, S.， (1999) Current Science, 76: 1483-1485. 非特許文献 19 : Taniguchi, M., et al, (2000) Plant Cell Physiol, 41: 42-48.
非特許文献 20 : Trick, H. N. and Finer, J. J., (1997) Transgenic Res., 6 : 329-336. 非特許文献 21 : Tingay, S.， et al.,(1997) Plant J., 11: 1369-1376.
非特許文献 22 : Zhao, Z.-Y., et al" (2000) Plant Mol. Biol, 44: 789-798.
非特許文献 23 : Zhao, Z.-Y., et al" (2001) Mol. Breed., 8: 323-333.
非特許文献 24 : Hoekema, A., et al., (1983) Nature, 303: 179-180
非特許文献 25 : Komari, T. and Kubo, T.， (1999) Methods of Genetic Transformation
： Agrobacterium tumefaciens. In Vasil, I. K. (ed.), Molecular improvement of cereal crops, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p.43— 82.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明は、従来のァグロパクテリゥム属細菌を介した植物への遺伝子導入方法に おける植物への遺伝子導入効率よりも高い効率で遺伝子導入がなされ、従って、従 来の形質転換効率よりも高!ヽ効率で形質転換のなされる方法を開発し、提供すること を目的とする。また、本発明は、前記方法を使用した形質転換植物の製造方法を開 発し、提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、粉体の存在下でァグ ロバクテリゥム属細菌を介した植物材料への遺伝子導入を行うことにより、粉体が存 在しない場合と比較して、高い効率で遺伝子導入のなされることを見いだした。また、 遺伝子導入された植物材料について、さらに形質転換体の選抜を行ったところ、粉 体の存在下で遺伝子導入を行った植物材料は、粉体が存在しな!、場合と比較して、 形質転換効率が向上することを見いだした。よって、本発明は、粉体の存在下でァグ ロバクテリゥム属細菌を植物材料に接種することにより、遺伝子導入効率および Zま たは形質転換効率を向上させる方法を提供する。 [0014] 本を用いる遣伝 導人 法
本発明は、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法 であって、粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌を植物材料に接種することを特 徴とする方法に関する。
[0015] 本発明の方法において、粉体の存在下、とはァグロバタテリゥム属細菌を植物材料 に接種する際に粉体が存在している状態を意味する。したがって、ァグロバタテリゥム 属細菌懸濁液をあらかじめ粉体と混合した後、その混合物を植物材料に接種しても よく；植物材料をあらかじめ粉体と混合した後、その混合物にァグロパクテリゥム属細 菌を接種してもよく；または、ァグロバタテリゥム属細菌懸濁液、粉体、および植物材 料を同時に混合することによりァグロバタテリゥム属細菌を植物材料に接種してもよい 。なお、本発明において、混合は、適度に均質になるように混ぜれば十分であり、強 く撹拌する必要はない。例えば、ボルテックスミキサーなど比較的強い力で撹拌する 機器を用いて混合する場合は、短い混合時間、例えば 1分以下、好ましくは 45秒以 下、さらに好ましくは 30秒以下の時間で行う。
[0016] したがって、本発明の方法の一態様は、ァグロバタテリゥム属細菌を介して植物材 料への遺伝子導入を行う方法であって、粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌を 植物材料に接種する工程を含むことを特徴とし、当該工程は：
(1)ァグロパクテリゥム属細菌懸濁液と粉体を混合する工程;および、
(2) (1)の混合物を植物材料に接種する工程；
を含む、前記方法である。
[0017] また、別の態様において本発明の方法は、ァグロバタテリゥム属細菌を介して植物 材料への遺伝子導入を行う方法であって、粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細 菌を植物材料に接種する工程を含むことを特徴とし、当該工程は：
( 1)植物材料と粉体を混合する工程；および、
(2) (1)の混合物にァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を接種する工程；
を含む、前記方法である。
[0018] また、さらに別の態様において本発明の方法は、ァグロバタテリゥム属細菌を介して 植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、粉体の存在下でァグロパクテリゥム 属細菌を植物材料に接種する工程を含むことを特徴とし、ここで当該工程は、ァグロ ノ クテリゥム属細菌懸濁液、粉体および植物材料を同時に混合することによりァグロ パクテリゥム属細菌を植物材料に接種することを含む、前記方法である。
[0019] 本発明の方法は、ァグロパクテリゥム属細菌を植物材料に接種する際に添加した粉 体の表面が、ァグロパクテリゥム属細菌の植物材料への感染のための反応場を提供 することにより、感染の効率が向上し、その結果遺伝子導入効率および形質転換効 率が向上するという技術思想に基づく。したがって、本発明の方法において、粉体は 、少なくとも生体組織に対し悪影響を及ぼさず、かつ以下の特性:水に不溶性である ；生体組織に対する親和性を有する；吸着特性を有する；および、表面極性を有する ；から成る群より選択される 1またはそれより多くの特性を有する粉体である。好ましく は、本発明の方法に用いる粉体は、上記の 4つの特性の 2以上を有している。より好 ましくは、本発明の方法に用いる粉体は、生体組織に対し悪影響を及ぼさず、かつ、 水に不溶性である粉体であり、所望によりさらに以下の特性:生体組織に対する親和 性を有する；吸着特性を有する；および表面極性を有する；からなる群より選択される 1またはそれより多くの特性を有する粉体である。
[0020] 生体組織に対し悪影響を及ぼさないとは、植物ゃァグロバタテリゥムの生命活動を 阻害しないことをいう。本発明の方法においては、粉体が、形質転換や形質転換後 の再分化、再分ィ匕後の成長等に実質的に悪影響を及ぼすような毒性等を有してい なければ、使用することが可能である。
[0021] 水に不溶性であるとは、水系の溶媒に不溶性または難溶性であることをいう。より具 体的には、本発明の方法に用いるノ ッファー、培地等に不溶性または難溶性である ことをいう。さらに具体的には、ァグロバタテリゥム属細菌懸濁液および植物材料調製 の際の条件、ならびに接種の条件において、不溶性または難溶性であることをいう。 本発明の方法に用いる粉体が水に不溶性であることにより、本発明の方法のいずれ の工程においても溶解することなぐ粉体として存在することができる。
[0022] 生体組織に対する親和性を有するとは、生体組織への吸着性を有することをいう。
生体組織に対する親和性を有する粒子は、ァグロバタテリゥム属細菌および Zまたは 植物材料を吸着することができるので、そのような粒子表面は効率のょ 、感染の反応 場を提供し得るであろう。
[0023] 吸着特性を有するとは、物質を吸着することができる特性をいう。本発明の方法に お!ヽてはァグロバタテリゥム属細菌および Zまたは植物材料力 添加した粉体に吸 着することにより、粉体表面が感染の反応場を提供してもよい。吸着特性を有する粉 体の例には多孔質の粉体が挙げられる。
[0024] 表面極性を有するとは、粉体表面が極性を有する、すなわち、粉体表面が比較的 親水性であることをいう。表面極性を有する粉体は、粉体表面に水膜を作ることがで き、その水膜中にァグロパクテリゥム属細菌および Zまたは植物材料を含むことがで きる。
[0025] 本発明の方法に使用可能な粉体は、例えば、多孔性セラミックス、グラスウール、お よび活性炭、ならびにそれらの混合物力 なる群より選択される粉体であるが、これら に限定されない。多孔性セラミックスには、例えば、ハイドロキシアパタイト、シリカゲ ルおよびゼォライトがある力 これらに限定されない。
[0026] 本発明の方法に使用可能な粉体の粒径は、限定するわけではないが、 1〜150 mであり、好ましくは 5〜75 /ζ πιである。これらの粒径の粉体は、例えば篩や様々な 分級機で分級することにより得ることができ、また一般にも市販されている。なお、粒 径の測定は、レーザー回折法や光学顕微鏡などを利用して行うことができる。
[0027] 本発明の方法に用いる粉体の量は、限定するわけではないが、ァグロバタテリゥム 属細菌を植物材料に接種する際の濃度が 30mgZml以上、好ましくは 60mgZml 以上となる量である。本発明の方法に用いる粉体の量の上限は、限定するわけでは ないが、ァグロバタテリゥム属細菌を植物材料に接種する際の濃度が 240mgZml以 下となる量である。
[0028] 本発明の方法において、ァグロバタテリゥム属細菌を植物材料に接種することは、 植物材料をァグロパクテリゥム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。接 種は、通常接種により行ってもよぐまた、滴下接種により行ってもよい。通常接種は、 植物材料とァグロパクテリゥム属細菌懸濁液 (接種源)を混合して植物材料を当該懸 濁液に浸漬し、浸漬した植物材料を取り出して、培地上に着床させて共存培養を行 うことにより接種を行う方法である。滴下接種は、培地上に着床させた植物材料上に ァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を滴下し、滴下した懸濁液が乾いた後、植物材料を 培地の別の場所あるいは別の培地上に着床させて共存培養を行うことにより接種を 行う方法である。
[0029] 共存培養の時間は、限定されるわけではないが、 1時間以上、好ましくは 1日以上、 3日以上、または 7日以上である。共存培養時間の上限は、限定されるわけではない 力 7日以下、 10日以下、または 14日以下であることが好ましい。
[0030] また、本発明の方法にぉ 、て、粉体と、ァグロバタテリゥム属細菌懸濁液、植物材料 、または、ァグロバタテリゥム属細菌懸濁液および植物材料とを混合する時間は、こ れらが十分に混合する限りにおいて特に限定はない。好ましい例として、 3分、 5分、 10分、または 30分の混合時間を挙げることができる。
[0031] 本発明の方法に供される植物は、単子葉植物および双子葉植物のいずれをも含 む。単子葉植物には、限定されるわけではないが、イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コム ギ、アスパラガス、ソルガム、サトウキビなどが含まれる。双子葉植物には、限定される わけではないが、タバコ、ダイズ、ミヤコダサ、ジャガイモ、ヮタ、ヒマヮリなどが含まれ る。好ましくは、本発明の方法に供される植物は単子葉植物であり、最も好ましいの はイネまたはトウモロコシである。
[0032] また、本発明の方法において、植物材料とは、ァグロバタテリゥム法による植物の形 質転換に供試するための当該植物の細胞、葉、根、茎、芽、花 (雄蕊、雌蕊等含む） 、実、種子、発芽種子もしくはその他いずれかの部位の植物組織、成長点、外植片、 未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織 (以下、本明細書においてカルス等、または単 にカルスという）、または完全な植物体、などの植物のあらゆる態様を包含する。本発 明の方法に用いる植物材料として好ま ヽのは未熟胚またはカルスであり、最も好ま しいのは未熟胚である。
[0033] 粉体を用いる遺伝子導人方法を利用した、形皙転槺被物の製诰方法
また、本発明は、前記遺伝子導入方法を使用した形質転換植物の製造方法をも提 供する。
[0034] 本発明は、ァグロパクテリゥム属細菌を介した植物材料の形質転換による形質転換 植物の製造方法であって、以下の工程： (1)粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を植物材料に接種し；
(2)形質転換された植物材料を選抜し；そして、
(3)選抜された形質転換体を再分化する；
を含むことを特徴とする方法に関する。
[0035] 本発明の一態様において、上記工程（1)は、
(i)ァグロパクテリゥム属細菌懸濁液と粉体を混合し；そして、
(ii) (i)の混合物を植物材料に接種する；
こと〖こより達成される。
[0036] 本発明の別の態様において、上記工程（1)は、
(i)植物材料と粉体を混合し；そして、
(ii) (i)の混合物にァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を接種する；
こと〖こより達成される。
[0037] また、本発明のさらに別の態様において、上記工程（1)は、ァグロバタテリゥム属細 菌懸濁液、粉体、および植物材料を同時に混合することによりァグロバタテリゥム属 細菌を植物材料に接種することにより達成される。
[0038] 本発明の形質転鎌物の製造方法において用いることができる粉体の、特質、材 料、粒径、および量は、本発明の植物の遺伝子導入方法について上述したものと同 様である。
[0039] また、本発明の形質転換植物の製造方法において、ァグロパクテリゥム属細菌懸濁 液による植物細胞への接種は、上述した方法、混合時間、および共存培養時間で行 つてもよい。
[0040] さらに、本発明の形質転換植物の製造方法において、製造される形質転換植物は
、本発明の遺伝子導入方法に供される植物と同様である。
[0041] ァグロパクテリゥム皿糸田 ¾fを用いた遣伝 入および开^ ff転椽 法
ァグロパクテリゥム属細菌を用いた遺伝子導入は、一般的には以下の工程を含む：
(a)植物材料を調製する工程；
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むァグロパクテリゥム属細菌を調製する 工程； (c)工程 (a)で調製した植物材料を (b)で調製したァグロパクテリゥム属細菌に感染 させる工程。
[0042] さらに、形質転換体を得るために、上記工程 (c)に次、で
(d)形質転換細胞を選抜する工程；および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
を施してもよい。
[0043] 具体的には、単子葉植物においては、文献 (特許第 2, 649, 287号公報）に記載 されているように、上記（a)の工程でオーキシン（例えば、 2, 4-D (2, 4ージクロロフ エノキシ酢酸)）またはサイトカイニン等を含む培地で培養して植物材料を脱分ィ匕の 状態または脱分ィ匕過程にある状態にし、上記 (c)の工程でァグロパクテリゥム属細菌 に感染させることを特徴とする方法;または、文献 (特許第 3, 329, 819号公報）に記 載されているように、植物材料として当該植物の未熟胚を用い、上記 (a)の工程では 未熟胚を脱分化処理せず、上記 (c)の工程においてオーキシン (例えば、 2, 4-D) またはサイトカイニン等を含む培地で培養することを特徴とする方法を用いることがで きる。
[0044] 工程（a)について
本明細書において、遺伝子導入に供される「植物」は、単子葉植物および双子葉 植物のいずれも含む。本発明の方法に供される単子葉植物には、イネ、トウモロコシ 、ォォムギ、コムギ、アスパラガス、ソルガムその他が含まれるがこれらに限定されるも のではない。本発明の方法に供される双子葉植物にはタバコ、ダイズ、ミヤコダサ、ジ ャガイモ、ヮタ、ヒマヮリ、その他が含まれる力 これらに限定されるものではない。本 発明の方法に供される好ましい植物は、単子葉植物であり、最も好ましくはイネまた はトウモロコシである。
[0045] また、「植物材料」とは、非限定的に、ァグロバタテリゥム法による植物の形質転換に 供するための当該植物の細胞、葉、根、茎、芽、花 (雄蕊、雌蕊等含む)、実、種子、 発芽種子、もしくはその他いずれかの部位の植物組織、成長点、外植片、未熟胚、 カルス、または完全な植物体、など植物のあらゆる態様を包含する。
[0046] 本発明の方法に用いる植物の形態として好ま 、のは未熟胚またはカルスであり、 最も好ましいのは未熟胚である。本明細書において、植物の細胞、組織、完全な植 物体という表現は、技術分野において一般的に用いられる意味で用いられる。本明 細書において、未熟胚とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。また、本 発明の方法に供される未熟胚のステージ (熟期）は特に限定されるものではなぐ受 粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受粉後 2日以降のもの が好ましい。後述の形質転換後、後述の方法により、脱分化し、正常な個体を再生 する能力を有するカルスを誘導できる未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未 熟胚はインブレッド、インブレッド間の Fl、インブレッドと自然受粉品種間の Fl、巿販 F1品種の未熟胚であることが好ましい。本明細書において、カルスとは、無秩序に増 殖する未分ィ匕状態の細胞塊をいう。カルスを得るためには、植物組織の分化した細 胞をオーキシン (例えば、 2, 4— D)またはサイトカイニン等の植物成長調節物質を 含む培地 (脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得る ための処理を脱分化処理と!/ ヽ、またこの過程を脱分ィ匕過程と!/ヽぅ。
[0047] 工程 (a)にお 、て、必要に応じ、植物組織、未熟胚などを植物体、種子などから取 り出し、形質転換に好適な材料を調製する。また、所望により植物材料をァグロパク テリゥムに感染させる前に培養してもよい。
[0048] 工程 (b)について
十壌細菌ァグロパクテリゥム（Agrobacterium tumefaciens)が多くの双子葉植物に根 頭癌腫病（crown gall disease)を引き起こすことは古く力も知られており、 1970年代 には、 Tiプラスミドが病原性に関与すること、さらに Tiプラスミドの一部である T—DN Aが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後この T—DNAには癌腫の 誘発に必要なホルモン (サイトカイニンとオーキシン)の合成に関与する遺伝子が存 在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。 T— DNAの 切り出しと植物への伝達には Tiプラスミド上のヴィルレンス領域 (vir領域）に存在する 遺伝子群が必要であり、また T DNAが切り出されるためには T DNAの両端に存 在するボーダー配列が必要である。他のァグロパクテリゥム属細菌である Agrobacteri um rhizogenesも Riプラスミドによる同様なシステムを有して ヽる (例えば、特開 2000 — 342256の図 3および図 4)。 [0049] ァグロバタテリゥムの感染によって T—DNAが植物ゲノムに組み込まれるので、 T — DNA上に所望の遺伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれること が期待された。し力しながら、 Tiプラスミドは 190kb以上と巨大であるため、標準的な 遺伝子工学的手法ではプラスミド上の T DNA上に遺伝子を挿入することは困難で あった。そのため、 T DNA上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。
[0050] まず、腫瘍性の Tiプラスミドの T—DNAカゝらホルモン合成遺伝子が除去されたディ スアーム型の菌系（disarmed strains)である LBA4404 (Hoekema, A., et al.， (1983), Nature, Vol.303, p.179- 180参照）、 C58C1 (pGV3850)、 GV3Til lSEなどが作製 された。これらを用いることにより、所望の遺伝子をァグロバタテリゥムの Tiプラスミドの T—DNA中に、あるいは所望の遺伝子を有する T—DNAをァグロバタテリゥムに導 入する 2種類の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が容易で所望の 遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製ができる中間ベクターを、ァグロパクテリ ゥムのデイスアーム型 Tiプラスミドの T—DNA領域中に、三系交雑法（triparental ma ting)を介して相同組換えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼ばれる。
[0051] もう一つは、バイナリーベクター（binary vector)法とよばれるもので、 T—DNAの植 物への組み込みに vir領域が必要である力 機能するために同じプラスミド上に存在 する必要はないという結果に基づいている。この vir領域には vir A、 virB、 virC、 vir D、 virEおよび virGが存在し、（植物バイオテクノロジー事典 (ェンタプライズ株式会 社発行（1989) ) )、 vir領域とはこの vir A、 virB、 virC、 virD、 virEおよび virGの全 てを含むものをいう。バイナリーベクターは、 T—DNAをァグロバタテリゥムと大腸菌 の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これをデイスアーム型 Tiプラスミドを有するァグロバタテリゥムに導入して用いる。
[0052] ァグロバタテリゥムへのバイナリーベクターの導入は、エレクト口ポレーシヨン法や三 系交雑法などの、公知の方法により行うことができる。バイナリーベクターには、 pBIN 19、 pBI121、 pGA482など力あり、これらをもとに数多くの新たなバイナリーベクタ 一が構築され、形質転換に用いられている。また、 Riプラスミドのシステムにおいても 、同様なベクターが構築され形質転換に用いられている。
[0053] ァグロバタテリゥム A281は、強病原性（super-virulent)の菌系であり、その宿主範 囲は広ぐ形質転換効率も他の菌系より高い。この特性は、 A281が有する Tiプラスミ ドの pTiBo542によるものである。 pTiBo542を用いて、これまでに 2つの新しいシス テムが開発されている。一つは pTiBo542のデイスアーム型の Tiプラスミドを有する 菌系 EHA101および EHA105を用いたものであり、これらを上述のバイナリーべク ターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の植物 の形質転換に利用されて!、る。
[0054] ちう一つは、スーノ ーノイナジ一ベクター（'super— binary' vector) (Hiei, Y., et al, ( 1994), The Plant Journal, Vol.6, p.271-282; Ishida, Y" et al" (1996), Nature Biotec hnology, Vol.4, p.745- 750; Komari, T. and Kubo T., (1999), Methods of Genetic Tr ansformation: Agrobacterium tumefaciens. In Vasil, I. K. (ed.) Molecular improveme nt of cereal crops., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p.43- 82 ;および国際公 開第 95Z06722号パンフレットを参照）システムである（例：特開 2000— 342256の 図 4)。このシステムは、 vir領域（virA、 virB、 virC、 virD、 virEおよび virG (以下、こ れらをそれぞれ「vir断片領域」 t ヽうこともある。））を持つディスアーム型の Tiプラスミ ドおよび T—DNAを有するプラスミドからなることから、バイナリーベクターシステムの 一種である。しかしながら、 T— DNAを有する側のプラスミド、即ちバイナリーベクタ 一に vir断片領域のうち、少なくとも一つの vir断片領域を実質的に取除いた vir領域 の断片（このうち好ましくは少なくとも virBまたは virGを含む断片、さらに好ましくは vi rBおよび virGを含む断片）を組み込んだスーパーバイナリーベクターを用いる点で 異なる。なお、スーパーノイナリーベクターを有するァグロバタテリゥムに、所望の遺 伝子を組み込んだ T DNA領域を導入するには、三系交雑法を介した相同組換え が容易な手法として利用できる。
[0055] 本発明の方法においては、宿主となるァグロバタテリゥム属細菌としては、特に限定 れないか、 Agrobacterium tumefaciens (ザ列；^ J 上:！^の Agrobacterium tumefaciens L BA4404 (Hoekema, A., et al., (1983), Nature, Vol.303, p.179- 180を参照）および EH A101)を好ましく用いることができる。
[0056] 本発明の方法によれば、ァグロバタテリゥム属細菌における病原性 (vir)領域の遺 伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることなく有意な効果 を得ることができる。したがって、上述の中間ベクター、バイナリーベクター、強病原 性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターなど 、ずれのベクターシステム に対しても用いることができ、本発明による効果を得ることができる。これらのベクター 類を改変した、異なるベクターシステムを用いた場合においても同様である（例えば、 ァグロバタテリゥム属細菌の vir領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミド 中に組み込む、 vir領域の一部または全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてァ グロパクテリゥムに導入するなど)。また、本発明の方法によれば、野生型のァグロバ クテリゥム属細菌においても、植物へ野生型の T DNA領域の導入効率を高め、事 実上感染効率を向上することができる。
[0057] 植物に導入しょうとする所望の遺伝子は、上記プラスミドの T DNA領域中の制限 酵素部位に常法により組み込むことができ、当該プラスミドに同時に若しくは別途組 込んだ PPT (フォスフィノスライシン）、ハイグロマイシン、カナマイシン、パロモマイシ ン等の薬剤に対する耐性を有する遺伝子等の適当な選抜マーカーに基づいて選抜 することができる。大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローユングの 手法では所望の DNAを T—DNA領域内に導入することが必ずしも容易でないこと がある。このような場合には、三系交雑法により、ァグロパクテリゥム属細菌の細胞内 での相同組換えを利用することで目的の DNAを導入することができる。限定されるわ けではないが、導入される遺伝子の大きさは好ましくは約 lOObpないし 200kbpであ る。
[0058] また、プラスミドを Agrobacterium tumefadens等のァグロパクテリゥム属細菌に導入 する操作は従来法により行うことができ、例としては、上記した三系交雑法やエレクト 口ポレーシヨン法、エレクト口インジェクション法、 PEGなどの化学的な処理による方法 などが含まれる。
[0059] 植物に導入しょうとする遺伝子は、従来の技術と同様に基本的には T DNAの左 右境界配列の間に配置されるものである。しかし、プラスミドが環状であるため、境界 配列の数は 1つでもよぐ複数の遺伝子を異なる部位に配置しょうとする場合には、 境界配列が 3個以上あってもよい。また、ァグロバタテリゥム属細菌中で、 Tiまたは Ri プラスミド上に配置されてもよぐまたは他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには 、複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
[0060] (c)について
ァグロパクテリゥム属細菌を介して遺伝子導入を行う方法は、植物材料をァグロパク テリゥム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。例えば、 106〜： LOucfu/ ml程度の細胞濃度のァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に植 物材料を 3〜10分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行う ことができる。
[0061] 好ましくは、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させると同時に、あるいは感染後、 ァグロバタテリゥムを除去する前に、植物材料をァグロバタテリゥムと共存培養させる。 共存培養には公知の培地を使用できる。例えば、実施例で使用した LS— AS培地、 nN6— AS培地、あるいはその他、 N6S3— AS培地、 2N6— AS培地（Hiei, Y., et a 1., (1994), The Plant Journal, Vol.6, p.271-282を参照）等の培地が知られている。
[0062] 本発明の方法が、一般的なァグロパクテリゥム法による遺伝子導入 Z形質転換に 対して有する特色は、植物材料をァグロパクテリゥムに感染させる上記工程 (c)を粉 体の存在下で行うことである。
[0063] 工程（d)および（e)について
さらに所望により、形質転換体を得るためには、上記工程 (c)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程；および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
が必要である。即ち、一般に植物の形質転換を行うためには、植物細胞に外来遺伝 子を導入した後に、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれた植物細胞を選抜 することが必要である。
[0064] 形質転換された細胞を選抜する工程は、表現型のデータおよび Zまたは物理的デ ータにより、目的の形質を有する細胞を選抜することを意味する。
[0065] 表現型のデータは、例えば、形質転換効率は植物への導入を所望する遺伝子と共 に、マーカー遺伝子および Zまたは選抜マーカー遺伝子を導入してその発現を評 価することで行うことで得ることができる。マーカー遺伝子および Zまたは選抜マーカ 一遺伝子としては、例えば、 GUS ( |8—ダルク口ニダーゼ)遺伝子、および Zまたは、 抗生物質耐性遺伝子 (例えば、 PPT (フォスフィノスライシン)耐性遺伝子、ハイグロマ イシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子)など、を 用いることができる。マーカー遺伝子として GUS遺伝子を用いた場合、形質転換効 率の評価は X— Glue (5—ブロモ 4—クロ口一 3—インドリノレ一 β—D グノレクロン 酸)の GUSによる切断に伴う発色力も評価することができる。選抜マーカー遺伝子と して抗生物質耐性遺伝子を用いた場合には、形質転換した後、抗生物質を加えた 選抜培地上での成長の度合 、から評価することができる。
[0066] さらに、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれたことを確認するために、サザ ンブロット等の物理的データを得てもよい。また、有性生殖による子孫への伝達、並 びに子孫集団への遺伝的および分子的分析に基づく選抜、の工程を行ってもょ 、。
[0067] 所望により選抜された形質転換体の再分化を行 ヽ、再分化個体を生育させ、そし て完全な植物体を得てもよ!ヽ。選抜した形質転換細胞から完全な植物体を再生する には、公知の方法（例えば、 Hiei, Y" et al.， (1994), The Plant Journal, Vol.6, p.271- 282;および、 Ishida, Y., et al, (1996), Nature Biotechnology, Vol.4, p.745- 750)に より行うことができる。
[0068] 本発明の方法は、粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌を用いる植物材料の 遺伝子導入を行った場合に、粉体の非存在下で行った場合と比較して、遺伝子導入 効率および Zまたは形質転換効率を向上させる。遺伝子導入効率は、例えば、導入 した遺伝子のトランジェント（一過性)な発現の範囲を評価することにより行うことによ つて評価できる。後述の実施例では、未熟胚での GUS遺伝子のトランジェントな発現 を評価した。
[0069] 形質転換効率は、例えば、接種した未熟胚力 得られた再分化植物のうち GUS遺 伝子の発現を示したものを形質転換体として数え、その総数を接種した未熟胚の数 で除すことによって算出できる。あるいは、再分化植物のうち、選抜圧に対して抵抗 性を示したものを形質転換体として数え、その総数を接種した未熟胚の数で除するこ とにより算出することちできる。
[0070] 上述のように、本発明の方法は、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる上記 工程 (c)を粉体の存在下で行うことを特色とする。従って、本発明の遺伝子導入およ び zまたは形質転換方法は、以下のように記載してもよ 、ことは理解されるであろう。
[0071] 本発明の方法は、ァグロパクテリゥム属細菌を用いた植物の遺伝子導入および Z または形質転換方法であって、以下の工程：
(a)植物材料を調製する工程；
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むァグロパクテリゥム属細菌を調製する 工程；および
(c)粉体の存在下で、工程 (a)で調製した植物材料を (b)で調製したァグロパクテリ ゥム属細菌に感染させる工程；
を含み、所望により、形質転換体を得るために、上記工程 (c)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程；および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程；
を含む、前記方法である。
[0072] 一態様において、本発明の方法は、ァグロバタテリゥム属細菌を用いた植物の遺伝 子導入および Zまたは形質転換方法であって、以下の工程：
(a)植物材料を調製する工程；
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むァグロパクテリゥム属細菌を調製する 工程；
(c- 1) (b)で調製したァグロパクテリゥム属細菌の懸濁液と粉体を混合する工程； および
(c- 2) (c— 1)の混合物を (a)で調製した植物材料に接種することにより、植物材 料をァグロバタテリゥム属細菌に感染させる工程；
を含み、所望により、形質転換体を得るために、上記工程 (c 2)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程；および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程；
を含む、前記方法である。
[0073] 別の態様において、本発明の方法は、ァグロバタテリゥム属細菌を用いた植物の遺 伝子導入および Zまたは形質転換方法であって、以下の工程：
(a)植物材料を調製する工程； (b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むァグロパクテリゥム属細菌を調製する 工程；
(c- 1) (a)で調製した植物材料と粉体を混合する工程;および
(c- 2) (c - 1)の混合物に (b)で調製したァグロパクテリゥム属細菌の懸濁液を接 種することにより、植物材料をァグロバタテリゥム属細菌に感染させる工程； を含み、所望により、形質転換体を得るために、上記工程 (c 2)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程；および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程；
を含む、前記方法である。
[0074] さらに別の態様において、本発明の方法は、ァグロバタテリゥム属細菌を用いた植 物の遺伝子導入および Zまたは形質転換方法であって、以下の工程：
(a)植物材料を調製する工程；
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むァグロパクテリゥム属細菌を調製する 工程；および
(c) (a)で調製した植物材料、（b)で調製したァグロパクテリゥム属細菌の懸濁液、 および粉体を同時に混合することにより、植物材料をァグロバタテリゥム属細菌に感 染させる工程；
を含み、所望により、形質転換体を得るために、上記工程 (c)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程；および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程；
を含む、前記方法である。
[0075] 本発明の植物の遺伝子導入および Zまたは形質転換方法において用いることがで きる粉体の、特質、材料、粒径、および量は、本発明の植物の遺伝子導入方法につ
Vヽて上述したものと同様である。
[0076] また、本発明の植物の遺伝子導入および Zまたは形質転換方法にぉ 、て、ァグロ パクテリゥム属細菌懸濁液による植物細胞への接種は、上述した方法、混合時間、 および共存培養時間で行ってもょ ヽ。
[0077] さらに、本発明の植物の遺伝子導入および Zまたは形質転換方法において、製造 される形質転換植物は、本発明の遺伝子導入方法に供される上述した植物と同様で ある。
発明の効果
[0078] 粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌 (接種源）を植物材料に接種することによ り、粉体が存在しない従来の方法よりも高い効率で遺伝子導入のなされることを見出 した。また、同方法により形質転換カルスの形成率および形質転換植物の作出され る効率が向上することを確認した。よって、本発明は、遺伝子導入効率および形質転 換効率の高 ヽ、ァグロパクテリゥム法による植物の遺伝子導入および形質転換方法 を提供する。
図面の簡単な説明
[0079] [図 1]図 1は、イネにおける形質転換効率に及ぼす粉体添加の効果を示すグラフであ る。各区5未熟胚に接種を行った。縦軸は、接種未熟胚当たり得られたハイグロマイ シンマシン抵抗性植物の数を表し、横軸の SGはシリカゲルを HAはハイドロキシァパ タイトをそれぞれ表す。
[図 2]図 2は、イネにおける形質転換効率に及ぼす粉体の粒径の効果を示すグラフで ある。各区 9〜12未熟胚に接種を行った。縦軸は、接種未熟胚当たり得られた再分 化カルスの数を表し、横軸は、添加した粉体の粒径を表す。 Cont.は粉体無添加の 対照を表す。
[図 3]図 3は、イネにおける導入遺伝子のトランジェント発現に及ぼす粉体の量の効果 を示すグラフである。各区 10未熟胚に接種を行った。縦軸は未熟胚における GUS遺 伝子の発現を表す。その値は、共存培養後の未熟胚を X— Glueで染色後、胚盤の 7 5%以上の部位で GUS遺伝子の発現を示した未熟胚を 3、 25〜74%の部位で発現 を示したものを 2、 5〜24%の部位で発現を示したものを 1、 5%未満の部位で発現を 示したものを 0. 5、発現のみられな力つたものを 0、として評価した値である。横軸は 添加した粉体の量を表す。
[図 4]図 4はイネにおける形質転換効率に及ぼす粉体の量の効果を示すグラフである 。各区 9〜10未熟胚に接種を行った。縦軸は、接種未熟胚当たり得られた再分化力 ルスの数を表し、横軸は、添加した粉体の量を表す。 [図 5]図 5はイネにおける導入遺伝子のトランジェント発現に及ぼすゼォライトの効果 を示すグラフである。各区 14〜15未熟胚に接種を行った。縦軸は未熟胚における G US遺伝子の発現を表す。その値は、共存培養後の未熟胚を X— Glueで染色後、胚 盤の 25%以上の部位で GUS遺伝子の発現を示した未熟胚を 3、 10〜24%の部位 で発現を示したものを 2、 10%未満の部位で発現を示したものを 1、発現のみられな 力つたものを 0、として評価した値である。横軸は添加したゼォライトの粒径を表す。 無添カ卩は粉体無添加の対照を表す。
圆 6]図 6は導入遺伝子のトランジェント発現に及ぼす接種源への混合した粉体添カロ の効果を示すグラフである。各区 12〜13未熟胚に接種を行った。縦軸は未熟胚に おける GUS遺伝子の発現を表す。その値は、共存培養後の未熟胚を X— Glueで染 色後、胚盤の 75%以上の部位で GUS遺伝子の発現を示した未熟胚を 3、 25〜74 %の部位で発現を示したものを 2、 5〜24%の部位で発現を示したものを 1、 5%未 満の部位で発現を示したものを 0. 5、発現のみられなカゝつたものを 0、として評価した 値である。横軸の SGはシリカゲルを、 HAはハイドロキシアパタイトを、 GWは摩砕グ ラスウールをそれぞれ表す。無添カ卩は粉体無添加の対照を表す。
[図 7]図 7はイネカルスでの導入遺伝子のトランジェントな発現に及ぼす接種源への 粉体添加の効果を示すグラフである。各区 6カルスに接種を行った。縦軸は接種カル スにおける GUS遺伝子の発現を表す。その値は、共存培養後のカルスを X— Glue で染色後、全体の 75%以上の部位で GUS遺伝子の発現を示したカルスを 3、 25〜 74%の部位で発現を示したものを 2、 5〜24%の部位で発現を示したものを 1、 5% 未満の部位で発現を示したものを 0. 5、発現のみられな力つたものを 0、として評価し た値である。横軸の HAはハイドロキシアパタイトを、無添加は粉体無添加の対照を それぞれ表す。
[図 8]図 8はイネにおける形質転換効率に及ぼす接種源への粉体添加の効果を示す グラフである。各区 6カルスに接種を行った。縦軸は、接種カルス当たり得られた再分 化カルスの数を表し、横軸の HAはハイドロキシアパタイトを、無添加は粉体無添カロ の対照をそれぞれ表す。
[図 9]図 9はノーマルバイナリーベクターを接種したイネ未熟胚での導入遺伝子のトラ ンジヱント発現に及ぼす接種源への混合した粉体添加の効果を示すグラフである。 各区 11— 12未熟胚に接種を行った。縦軸は、未熟胚における GUS遺伝子の発現 を表す。その値は、共存培養後の未熟胚を X— Glueで染色後、胚盤の 75%以上の 部位で GUS遺伝子の発現を示した未熟胚を 3、 25〜74%の部位で発現を示したも のを 2、 5〜24%の部位で発現を示したものを 1、 5%未満の部位で発現を示したも のを 0. 5、発現の見られなかったものを 0、として評価した値である。横軸の GWは摩 砕グラスウールを、 HAはノヽイドロキシアパタイトをそれぞれ表す。無添加は粉体無添 加の対照を表す。
実施例
[0080] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力 これらは本発明の技術的範 囲を限定するためのものではな 、。当業者は本明細書の記載に基づ 、て容易に本 発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
[0081] 実施例 1：粉体存在下でのイネの形皙転椽
材料および方法
(1)ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロバタテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pSB134)を用いた。 LB A4404 (pSB134)は以下のように作成した。 pIG221 (Ohta, S., et al.， (1990) Plant Cell Physiol., 31: 805-813)由来の GUS発現ユニットを pKY205 (Kuraya, Y.， et al. , (2004) Mol. Breed., 14: 309-320)のトウモロコシュビキチンプロモーターで制御さ れた HPT遺伝子の上流の Hindlll制限部位に挿入した。このプラスミドを LBA4404 (pSBl) (Komari, T., et al., (1996) Plant J., 10: 165—174)に導入し、 LBA4404 (p SB 134)を得た。
[0082] (2)供試品糠および鉬.織
供試品種として、 日本稲品種ゆきひ力りを用いた。開花後 8〜14日目の未熟種子 の穎を除去し、 70%エタノールで数秒、ツイーン 20 (和光純薬工業株式会社)を含 む 1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で 15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄 後、長さ 1. 5〜2mmの未熟胚を摘出し供試組織とした。
[0083] (3)接糠源の調製 粉体としてハイドロキシアパタイト（Bio- Rad)およびシリカゲル（ICN Pharmaceuticals )を供試した。 80〜： LOOmgの粉体をチューブに入れ、オートクレープにより滅菌処理 を行った。 AB培地 (Chilton, M- D, et al" (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 36 72-3676) 上で 3〜5日間培養したァグロバタテリゥムのコロニーを白金耳で力き取り、 修正 AA培地（AA主要無機塩類、 AAアミノ酸および AAビタミン類（Toriyama K., e t al" (1985) Plant Sci., 41: 179-183) 、 MS微量塩類 (Murashige, T. and Skoog, F.， (1962) Physiol. Plant, 15: 473-497) 、 1. OgZlカザミノ酸、 100 Mァセトシリンゴン 、 0. 2Mショ糖、 0. 2Mグルコース）に Ixl08〜lxl09cfu/mlの濃度で懸濁した。粉 体を入れたチューブに lmlのァグロバタテリゥム懸濁液をカ卩え、接種源とした。
[0084] (4)接糠および共存培着
無菌的に摘出した未熟胚を 2N6— AS培地に置床した。粉体が細菌懸濁液に均等 に分散するようにボルテックスミキサーで数秒間撹拌した後、 1未熟胚にっき、 5 1の 懸濁液を未熟胚上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、未熟胚を同培地上の 別の場所に移動した。培養容器をシールした後、 25°C、暗黒下で 7日間共存培養を 行った。一部の未熟胚について X— Glueを処理することによる GUS発現を調査した (Hiei et al., 1994)。すなわち、共存培養処理直後、組織を 0. 1% Triton X- 100を含 む 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 8) に浸漬し、 37°Cで 1時間静置した。リン酸緩衝液 でァグロバタテリゥムを除去した後、 1. OmM 5 ブロモ 4 クロ口一 3—インドリノレ - β—D グルクロン酸 (X— Glue)および 20%メタノールを含むリン酸緩衝液を添 加した。 37°Cで 24時間処理した後、青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察した
[0085] (5)撰抜および再分化
共存培養後の未熟胚をメスで 4〜6分割し、 nN6CC培地 (N6無機塩、 N6ビタミン 、 0. 5g/l カザミノ酸、 0. 5g/l L プロリン、 lmg/1 2, 4— D、 0. 5mg/l N AA、 0. lmg/1 6BA、 20g/l シユークロース、 55g/l ソルビ卜ール、 250mg/ 1 セフオタキシム、 250mgZl カルべ-シリン、 5gZl ゲルライ卜、 ρΗ5. 8)あるい は NBK4CC (NBK4主要無機塩、 B5微量無機塩、 B5ビタミン、 AAアミノ酸、 0. 5g /\ カザミノ酸、 0. 5g/l L プロリン、 lmg/1 2, 4— D、 0. 5mg/l NAA、 0. lmg/1 6BA、 20g/l マルトース、 55g/l ソルビトール、 250mg/l セフォタキ シム、 250mgZl カルべ-シリン、 5gZl ゲルライト、 ρΗ5. 8)に置床した。照明下 28°Cで 1週間培養後、カルスを 5分割し、ハイグロマイシン 50mgZlを含む nN6CC 培地あるいは NBK4CC培地に置床し、同条件で 10日間培養した。増殖した細胞塊 をハイグロマイシン 50mgZlを含む再分化培地（N6無機塩、 N6ビタミン、 AAァミノ 酸、 lgZl カザミノ酸、 0. 5mg/l 力イネチン、 20g/l シユークロース、 30g/l ソ ルビトール、 4gZl ゲルライト、 ρΗ 5. 8)あるいは（ΝΒΚ4主要無機塩、 Β5微量無 機塩、 Β5ビタミン、 ΑΑアミノ酸、 lg/1 カザミノ酸、 2mgZl 力イネチン、 20g/l マ ル卜ース、 30g/l ソルビトール、 5g/l ゲルライ卜、 pH 5. 8)に置床し、同条件で 約 2週間培養した。
[0086] (6)形皙転橼効率の
ァグロバタテリゥムを接種したイネ未熟胚では、胚盤の広 、範囲で GUS遺伝子のト ランジェント発現を示すスポットが観察される。 1つの胚盤でも離れた部位で観察され るスポットは個々に遺伝子導入のなされた独立の形質転換細胞に由来するものであ ると考えられる。共存培養後およびレスティング培養後に増殖した未熟胚を 4カゝら 6の 塊に分割した場合、由来は 1つの未熟胚であっても分割して得られた 20〜30の細胞 塊力 ハイグロマイシン存在下で増殖してきたカルスおよびその再分化植物はそれ ぞれ独立の形質転換体であると考えられる。
[0087] 分割して得られた細胞塊カゝら増殖したノヽィグロマイシン抵抗性カルスを 1細胞塊か ら 1カルス選び、ハイグロマイシンを含む再分ィ匕培地に置床した。そこ力も得られたノヽ イダロマイシン抵抗性再分化植物を形質転換体として数え、その総数を接種した未 熟胚の数で除し、形質転換効率を算出した。
[0088] S
(7)導入遣伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚を X— Glueにより処理した。 Vヽずれの未熟胚でも GUS遺伝 子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられた力 接種源に粉体を添加し 、接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に比べ青色を呈する部位が広範 にみられ、粉体の添加により遺伝子導入が促進されていることが示された。 [0089] (8)形質転換効率
共存培養後の未熟胚をノヽィグロマイシンを含む培地で培養し、得られたカルスをノヽ イダロマイシンを含む再分ィ匕培地に置床し培養した。ハイグロマイシン抵抗性再分ィ匕 植物は 、ずれの未熟胚カゝらも得られたが、接種源に粉体を添加し接種した未熟胚で は粉体無添加の対照の未熟胚に比べハイグロマイシン抵抗性再分化植物の数は多 く、粉体の添加により形質転換効率の向上がみられた（図 1)。
[0090] 実施例 2：粉体存在下でのトウモロコシの形皙転椽
材料および方法
(1)ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロバタテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pSB131) (Ishida, Y.， et al" (1996) Nature Biotechnology, 14: 745- 750)を用いた。
[0091] (2)供試品糠および鉬.織
供試品種として、トウモロコシインブレッド A188を用いた。交配後 8〜14日目の雌 穂から大きさ 1. 0〜1. 2mmの未熟胚を無菌的に取り出し、供試組織とした。
[0092] (3)榇糠源の調製
粉体としてハイドロキシアパタイト（Bio- Rad)、シリカゲル（ICN Pharmaceuticals)およ び乳鉢で磨砕したグラスウールを供試した。 80〜： LOOmgの粉体をチューブに入れ、 オートクレーブにより滅菌処理を行った。 YP培地（5gZl 酵母エキス、 lOgZl ぺプ トン、 5gZl NaCl、 pH6. 8)上で 3〜5日間培養したァグロバタテリゥムのコロニーを 白金耳でかき取り、 LS— inf培地（Ishida, Y., et al., (1996) Nature Biotechnology, 14 ： 745-750)に lxl08〜lxl09cfuZmlの濃度で懸濁した。粉体を入れたチューブに lmlのァグロバタテリゥム懸濁液をカ卩え、接種源とした。
[0093] (4)接種および共存培着
接種は通常接種と滴下接種の 2種類の方法で行った。
[0094] 通常接種は以下の通り行った。無菌的に摘出した未熟胚を 46°Cで 3分間処理した 後、 15, 000rpm、 4°Cで 10分間遠心処理した。熱および遠心処理した未熟胚を接 種源と混合し、ボルテックスミキサーで 30秒間撹拌した。未熟胚を 5 M AgNOお
3 よび 5 μ M CuSOを含む LS— AS培地に置床し、培養容器をシールした後、 25°C 、暗黒下で 7日間共存培養を行った。
[0095] 滴下接種は以下の通り行った。熱および遠心処理した未熟胚を 5 μ M AgNOお
3 よび 5 μ M CuSOを含む LS— AS培地に置床した。粉体が細菌懸濁液に均等に
4
分散するようにボルテックスミキサーで軽く撹拌した後、 1未熟胚にっき、 5 1の懸濁 液を未熟胚上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、未熟胚を同培地上の別の 場所に移動した。培養容器をシールした後、 25°C、暗黒下で 7日間共存培養を行つ た。
[0096] 一部の未熟胚について X— Glueを処理することによる GUS発現を調査した（Hiei, Y., et al., (1994) The Plant Journal, 6: 271-282)。すなわち、共存培養処理直後、組 織を 0. 1 % Triton X-100を含む 0. 1M リン酸緩衝液 (pH6. 8)に浸漬し、 37°Cで 1時間静置した。リン酸緩衝液でァグロバタテリゥムを除去した後、 1. OmM 5—プロ モ一 4—クロ口一 3—インドリル一 β—D—グルクロン酸 (X— Glue)および 20%メタノ ールを含むリン酸緩衝液を添加した。 37°Cで 24時間処理した後、青色の呈色を示 す組織を顕微鏡下で観察した。
[0097] (5)撰 および苒分化
未熟胚を 5mgZl フォスフィノスライシン（PPT)を含む改良 LSD1. 5培地 （Ishida , Y., et al., (2003) Plant Biotechnology, 20: 57-66)に置床した。暗黒下 25°Cで 10 〜14日間培養後、 10mg/l PPTを含む改良 LSD1. 5培地で培養した。増殖した 細胞塊を 5mgZl PPTおよび 10 /z M CuSOを含む LSZ再分化培地（Ishida, Y.，
4
et al., (1996) Nature Biotechnology, 14: 745-750)に置床し、照明下 25°Cで約 2週 間培養した。再分ィ匕した植物の葉の一部を切り取り、 X— Glueを処理することによる GUS発現を調査した。
[0098] S
(6)導入遣伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚を X— Glueにより処理した。 Vヽずれの未熟胚でも GUS遺伝 子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、通常接種、滴下接種と もに、接種源に粉体を添加し接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に比 ベ青色を呈する部位が広範にみられ、粉体の添加により遺伝子導入が促進されてい ることが示された。
[0099] (7)形質転換効率
共存培養後の未熟胚を PPTを含む培地で培養し、得られたカルスを PPTを含む再 分ィ匕培地に置床し培養した。再分ィ匕のみられた PPT抵抗性植物にっ ヽて GUS分析 を行った。 GUS陽性植物はいずれの未熟胚からも得られたが、通常接種、滴下接種 ともに、接種源に粉体を添加し接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に 比べ GUS陽性植物の数は多く、粉体の添加により形質転換効率の向上することが 明らかとなった (表 1)。粉体の添カ卩による形質転換効率の向上は、未熟胚をァグロバ クテリゥムおよび粉体と共存下で撹拌した後、共存培地に置床した場合 (通常接種） だけでなぐ粉体とァグロパクテリゥムの混合液を未熟胚上に滴下した場合 (滴下接 種）にも見られた。このことは、形質転換効率の向上は粉体による植物組織の付傷に よるものではな ヽことを示す。
[0100] [表 1]
表 1 トウモロコシ形質転換効率に及ぼす粉体添加の効果
未熟胚数
接種方法 粉体 接種 再分化 再分化 （¾) GUS陽性 GUS陽性 (¾) 通常接種 なし 31 1 1 35. 5 4 12. 9
GW 32 13 40. 6 7 21. 9
SG 28 12 42. 9 5 17. 9
HA 27 13 48. 1 5 18. 5 滴下接種 なし 13 6 46. 2 1 7. 7
GW 13 7 53. 8 4 30. 8
SG 12 9 75. 0 2 16. 7
HA 12 5 41. 7 2 16. 7
GW, 磨碎グラスウール； SG, シリカゲル； HA, ハイドロキシアパタイト
実施例 3：粉体 (シリカゲル)の粒径の効
材料および方法
(1)ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロバタテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pSB134)を用いた。 [0102] (2)供試品種および組織
供試品種として、日本稲品種ゆきひ力りを用いた。開花後 8〜14日目の未熟種子 の穎を除去し、 70%エタノールで数秒、ツイーン 20を含む 1%次亜塩素酸ナトリウム 水溶液で 15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄後、長さ 1. 5〜2mmの未 熟胚を摘出し供試組織とした。
[0103] (3)接糠源の調製
粉体として異なる粒径のシリカゲル 5種 (粒径： 5〜20 μ m、 20〜40 μ m、 45〜75 ^ m, 75〜150 /ζ πι、 150〜425 mのちの；禾 Ρ光純薬工業株式会社;)を供試した。 120mgの粉体をチューブに入れ、オートクレーブにより滅菌処理を行った。 AB培地 (Chilton, M-D., et al, (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3672- 3676)上で 3〜 5日間培養したァグロバタテリゥムのコロニーを白金耳でかき取り、修正 AA培地 (AA 主要無機塩類、 AAアミノ酸および AAビタミン類（Toriyama, K., et al., (1985) Plant Sci., 41: 179- 183)、 MS微量塩類（Murashige, T. and Skoog, F.， (1962) Physiol. Pla nt, 15: 473-497)、 1. Og/1カザミノ酸、 100 M ァセトシリンゴン、 0. 2M ショ糖 、0. 2M グルコース）に Ixl08〜lxl09cfu/mlの濃度で懸濁した。粉体を入れた チューブに lmlのァグロバタテリゥム懸濁液をカ卩え、接種源とした。
[0104] (4) 形皙転槺被物の作出
接種、共存培養、選抜、再分化および形質転換効率の算出は実施例 1の方法に従 つて行った。
[0105] S
(5)導入遣伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚を X— Glueにより処理した。粉体無添加の対照を含め、いず れの処理区でも GUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられた 力 粒径 150 m以下のシリカゲルを接種源に添加し接種した未熟胚では、粉体無 添加の対照および 150 μ m以上の粉体を接種源に添加し接種した未熟胚に比べ、 青色を呈する部位が広範にみられ、粉体の粒径により遺伝子導入を促進する程度の 異なることが示された
(6)形皙転椽効率 共存培養後の未熟胚をノヽィグロマイシンを含む培地で培養し、得られたカルスをノヽ イダロマイシンを含む再分ィ匕培地に置床し培養した。ハイグロマイシン抵抗性再分ィ匕 植物はいずれの未熟胚カもも得られた力 粒径 150 m以下のシリカゲルを接種源 に添加し接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に比べハイグロマイシン 抵抗性再分化植物の数は多ぐ形質転換効率の向上がみられた（図 2)。
[0106] 実施例 4：粉体 (活件炭およびシリ力ゲル)の量の効果
材料および方法
(1)ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロバタテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pSB134)を用いた。
[0107] (2)供試品糠および鉬.織
供試品種として、 日本稲品種ゆきひ力りを用いた。開花後 8〜14日目の未熟種子 の穎を除去し、 70%エタノールで数秒、ツイーン 20を含む 1%次亜塩素酸ナトリウム 水溶液で 15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄後、長さ 1. 5〜2mmの未 熟胚を摘出し供試組織とした。
[0108] (3)榇糠源の調製
粉体として活性炭およびシリカゲル (和光純薬工業株式会社)を供試した。 0〜240 mgの粉体をチューブに入れ、オートクレーブにより滅菌処理を行った。 AB培地（Chil ton, M-D., et al" (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3672— 3676)上で 3〜5日 間培養したァグロバタテリゥムのコロニーを白金耳で力き取り、修正 AA培地 (AA主 要無機塩類、 AAアミノ酸および AAビタミン類（Toriyama, K., et al., (1985) Plant Sci ., 41: 179- 183)、 MS微量塩類（Murashige, T. and Skoog, F" (1962) Physiol. Plant, 15: 473-497) , 1. Og/1カザミノ酸、 100 /z M ァセトシリンゴン、 0. 2M ショ糖、 0. 2M グルコース）に lxl08〜lxl09cfuZmlの濃度で懸濁した。粉体を入れたチュ ーブに lmlのァグロバタテリゥム懸濁液をカ卩え、接種源とした。
[0109] (4)接糠、共存焙着および形皙転槺被物の作出
接種、共存培養、選抜、再分化および形質転換効率の算出は実施例 1の方法に従 つて行った。
[0110] S (5)導入遣伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚を X— Glueにより処理した。粉体無添加の対照を含め、いず れの処理区でも GUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられた が、接種源 1ml当たり 60mg以上の活性炭を接種源に添加し接種した未熟胚では、 粉体無添加の対照および 30mg以下の粉体を接種源に添加し接種した未熟胚に比 ベ、青色を呈する部位が広範にみられ、接種源に添加する粉体の量により遺伝子導 入を促進する程度の異なることが示された（図 3)。
[0111] (6)形皙転椽効率
共存培養後の未熟胚をノヽィグロマイシンを含む培地で培養し、得られたカルスをノヽ イダロマイシンを含む再分ィ匕培地に置床し培養した。ハイグロマイシン抵抗性再分ィ匕 植物は 、ずれの未熟胚カもも得られた力 30mg以上のシリカゲルを接種源に添カロ し接種した未熟胚では、粉体無添加の対照の未熟胚に比べ、ハイグロマイシン抵抗 性再分化植物の数は多ぐ形質転換効率の向上がみられた（図 4)。
[0112] ¾施例 5 :ゼオライトの効巣
材料および方法
( 1)ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロバタテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pSB131)を用いた。
[0113] (2)供試品糠および鉬.織
供試品種として、トウモロコシインブレッド A188を用いた。交配後 8〜14日目の雌 穂から大きさ 1. 0〜1. 2mmの未熟胚を無菌的に取り出し、供試組織とした。
[0114] (3)接糠源の調製
粉体として 2種の粒径のゼォライト（5 μ m、 75 m;和光純薬工業株式会社)を供 試した。粉体の滅菌および接種源の調製は実施例 2に記載の方法に従って行った。
[0115] (4)接種および共存培着
接種は実施例 2に記載の滴下接種方法で行った。共存培養後の未熟胚での GUS 未熟胚での調査は実施例 2に記載の方法により行った。
[0116] S
(5)導入遣伝子のトランジェント発現 共存培養後の未熟胚を X— Glueにより処理した。 Vヽずれの未熟胚でも GUS遺伝 子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、ゼォライトを接種源に 添加し、接種した未熟胚では対照の未熟胚に比べ GUS遺伝子の発現部位が広範 囲でみられた。粒径 5 μ mのゼオライトに比べ 75 μ mのゼオライトではより広い範囲 での GUS遺伝子の発現が観察された（図 5)。
[0117] 実施例 6：混合した粉体による効果
材料および方法
( 1)ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロバタテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pSB134)を用いた。
[0118] (2)供試品糠および鉬.織
供試品種として、 日本稲品種ゆきひ力りを用いた。供試組織の調製は実施例 4に記 載の方法に従って行った。
[0119] (3)榇糠源の調製
粉体としてシリカゲル、ハイドロキシアパタイトおよび磨砕グラスウールを供試した。 総量 120mgの粉体をチューブに入れ、オートクレーブにより滅菌処理を行った。 2種 の粉体を混合した時は各粉体を約 60mgずつ、 3種の粉体を混合した時は各粉体を 約 40mgずつチューブに入れ滅菌した。ァグロバタテリゥム懸濁液の調製は実施例 4 に記載の方法に従って行った。粉体を入れたチューブに lmlのァグロバタテリゥム懸 濁液を加え、接種源とした。
[0120] (4)接種および共存培着
接種、共存培養方法および GUS発現の調査は実施例 1に記載の方法に従って行 つた o
[0121] S
(5)導入遣伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚を X— Glueにより処理した。粉体無添加の対照を含め、いず れの処理区でも GUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられた 力 粉体を接種源に添加し接種した未熟胚では、粉体未添加の対照に比べ青色を 呈する部位が広範に見られた。 1種類の粉体と 2種類または 3種類の混合粉体の間 では遺伝子導入を促進する程度に大きな差は見られな力つた（図 6)。
[0122] 実施例 7：粉体存在下でのイネカルスの形皙転椽
(1)ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロバタテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pSB134)を用いた。
[0123] (2)供試品種および組織
供試品種として、 日本稲品種ゆきひ力りを用いた。開花後 8〜14日目の未熟種子 の穎を除去し、 70%エタノールで数秒、ツイーン 20を含む 1%次亜塩素酸ナトリウム 水溶液で 15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄後、長さ 1. 5〜2mmの未 熟胚を摘出し 2N6— AS培地に置床した。暗黒下、 25°Cで 1週間培養し、カルスの 増殖した未熟胚を供試材料とした。
[0124] (3)榇糠源の調製
粉体としてハイドロキシアパタイト (Bio-Rad)を供試した。接種源の調製は実施例 1 の方法に従って行った。
[0125] (4)
榇糠および共存谘着
導入遺伝子のトランジェント発現を確認するために、カルスを 2N6—AS培地に置 床した。粉体が細菌懸濁液に均等に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌した 後、 1カルスにつき、 10 1の懸濁液をカルス上に滴下した。滴下した接種源が乾い た後、カルスを同培地上の別の場所に移動した。共存培養方法および GUS発現の 調査は実施例 4に記載の方法に従って行った。
[0126] 形皙転槺被物の作出
形質転換効率を確認するために、カルスに対する接種、共存培養、選抜、再分ィ匕 および形質転換効率の算出を、実施例 1の方法に従って行った。細菌懸濁液の滴下 量は 10 1とした。
[0127] S
(5)導入遣伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚を X— Glueにより処理した。粉体無添加の接種源を接種した カルスに比べ、接種源にノ、イドロキシアパタイトを添カ卩し、接種したカルスでは青色を 呈する部位が広範にみられ、カルスを材料とした時にも接種源への粉体の添カ卩によ り遺伝子導入が促進されることが示された（図 7)。
[0128] (6)形質転換効率
共存培養後のカルスをハイグロマイシンを含む培地で培養し、増殖したカルスをノヽ イダロマイシンを含む再分ィ匕培地に置床し培養した。粉体無添加の接種源を接種し たカルスに比べ、接種源にハイドロキシアパタイトを添カ卩し、接種したカルスからは、 より多くのハイグロマイシン抵抗性植物の再分ィ匕がみられ、形質転換効率の向上が 認められた（図 8)。
[0129] 実施例 8：粉体存在下でのノーマルバイナリーベクターによる形質転換
(1)ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロバタテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pIG121Hm) (Hiei, et al. , 1994, The Plant Journal, 6: 271-282)を用いた。 LBA4404 (pIG121Hm)はスー パーバイナリーベクターの有する強病原性菌株の vir遺伝子の一部を持たないノー マルバイナリ一ベクターである。
[0130] (2)供試品糠および鉬.織
供試品種として、 日本稲品種ゆきひ力りを用いた。供試組織の調製は実施例 4に記 載の方法に従って行った。
[0131] (3)接糠源の調整
粉体として磨砕したグラスウールおよびハイドロキシアパタイトを供試した。接種源 の調製は実施例 1の方法に従って行った。
[0132] (4)接種および共存培着
接種、共存培養方法および GUS発現の調査は実施例 4に記載の方法に従って行 つた o
[0133] S
(5)導入遣伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚を X— Glueにより処理した。粉体無添加の対照を含め、いず れの処理区でも GUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられた 1S 紛体無添加の未熟胚に比べ、磨砕グラスウールおよびノヽイドロキシアパタイトを 接種源に添加し接種した未熟胚では青色を呈する部位が広範にみられ、ノーマルバ イナリーベクターを接種する場合も、接種源に粉体を添加することにより遺伝子導入 が促進されることが示された（図 9)。
実施例 9 :サザン分析
実施例 1で得られた形質転,物および接種源に磨砕グラスウールあるいは活性 炭を添加して実施例 1と同様の方法で得られた形質転 ^¾物カゝら小鞠らの方法 (Ko mari, et al., 1989; Theor. Appl. Genet., 77: 547-552)に従い DNAを抽出し、抽出し た DNAに制限酵素 Xbalを処理し、 GUS遺伝子をプローブとしたサザン法による導 入遺伝子の検出を行った。サザン法は Molecular Cloning (Sambrook, et al., 1989; C old Spring Harbor Laboratory Press)に記載の方法に従って行った。その結果、ハイ ブリダィズするバンドは 、すれも異なった位置にみられ、導入遺伝子がイネゲノム中 にランダムに挿入されていることが証明された。導入遺伝子のコピー数は 1から 4であ つた (表 2)。
[0134] [表 2] 表 2 サザン分析によるイネ形質転換当代における導入遺伝子のコピー数
Figure imgf000035_0001
各区、 独立の形質転換植物 6個体を解析した。
無添加は紛体無添加の対照、 HAはハイドロキシアパタイト、 S Gはシリカゲル、 GWは磨碎グラスウール、 A Cは活性炭， をそれぞれ表す。
[0135] ¾施例 10 :後代槭物への導人遣伝早の遣伝
実施例 1で得られた形質転,物および接種源に磨砕グラスウールを添加して実 施例 1と同様の方法で得られた形質転,物を自殖し、得られた T1種子を播種した 。播種後 10日目の幼苗力 葉の一部を切り取り、実施例 1の方法に従い、 GUS遺伝 子の発現を調査した。
[0136] その結果を表 3に示す。得られた結果を統計解析（ c二乗検定)すると、いずれの 系統でも Tl植物での GUS遺伝子の発現は GUS陽性：陰性の比が 3 : 1、あるいは 1 5 : 1に適合し、導入遺伝子はメンデルの法則に従い後代植物に遺伝することが明ら カゝとなった。
[0137] [表 3] イネ形質転換個体の次世代における導人遺伝子の発現
Figure imgf000036_0001
無添加は紛体無添加の対照、 HAはハイドロキシアパタイト、 S Gはシリカゲル、
GWは磨碎グラスウール、 をそれぞれ表す。
非形 ¾転換は形質転換していない品種ゆきひかりを表す。 産業上の利用可能性
[0138] 本発明は、従来のァグロパクテリゥム法よりも高い効率で遺伝子導入および形質転 換のなされる簡便な方法を提供する。本発明により、植物のァグロパクテリゥム法によ る遺伝子導入効率および形質転換効率が向上したことから、本発明は、多数の形質 転換植物を効率よく入手し、実用遺伝子を導入した品種を効率よく育成するのに貢 献する。

Claims

請求の範囲 [I] ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、 粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌を植物材料に接種することを特徴とする、 j記方法。 [2] 粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌を植物材料に接種する工程が、
(1)ァグロパクテリゥム属細菌懸濁液と粉体を混合し；そして、
(2) (1)の混合物を植物材料に接種する；
ことを含む、請求項 1に記載の方法。
[3] 粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌を植物材料に接種する工程が、
( 1)植物材料と粉体を混合し；そして、
(2) (1)の混合物にァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を接種する；
ことを含む、請求項 1に記載の方法。
[4] 粉体の存在下でァグロバタテリゥム属細菌を植物材料に接種する工程力 ァグロバ クテリゥム属細菌懸濁液、粉体、および植物材料を同時に混合することによりァグロ パクテリゥム属細菌を植物材料に接種することを含む、請求項 1に記載の方法。
[5] 粉体が、生体組織に対し悪影響を及ぼさず、かつ、水に不溶性である粉体である、 請求項 1な!、し 4の 、ずれか 1項に記載の方法。
[6] 粉体が、さらに以下の特性：生体組織に対する親和性を有する；吸着特性を有する
；および表面極性を有する；からなる群より選択される 1またそれより多くの特性を有す る粉体である、請求項 5に記載の方法。
[7] 粉体が、多孔質の粉体である、請求項 1な 、し 4の 、ずれか 1項に記載の方法。
[8] 多孔質の粉体が、多孔性セラミックスの粉体である、請求項 7に記載の方法。
[9] 粉体が、ハイドロキシアパタイト、シリカゲル、ゼォライト、その他の多孔性セラミック ス、グラスウールおよび活性炭、ならびにそれらの混合物、からなる群より選択される 粉体である、請求項 1な 、し 4の 、ずれか 1項に記載の方法。
[10] 粉体が 1〜150 μ mの粒径を有する、請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の方 法。
[II] 粉体が 5〜75 μ mの粒径を有する、請求項 1ないし 9のいずれ力 1項に記載の方法
[12] 植物材料が、植物細胞、葉、根、茎、芽、花 (雄蕊、雌蕊等含む)、実、種子、発芽 種子もしくはその他いずれかの部位の植物組織、外植片、成長点、未熟胚、カルスも しくは不定胚様組織、または完全な植物体力ゝらなる群より選択される、請求項 1ないし 11の!、ずれ力 1項に記載の方法。
[13] 植物が単子葉植物である、請求項 1ないし 12のいずれか 1項に記載の方法。
[14] 単子葉植物が、イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コムギ、アスパラガス、サトウキビおよ びソルガム力もなる群より選択される植物である、請求項 13に記載の方法。
[15] 植物が双子葉植物である、請求項 1ないし 12のいずれか 1項に記載の方法。
[16] 双子葉植物が、タバコ、ダイズ、ミヤコダサ、ジャガイモ、ヮタ、およびヒマヮリからな る群より選択される植物である、請求項 15に記載の方法。
[17] 以下の工程：
(1)ァグロパクテリゥム属細菌懸濁液と粉体を混合する工程;および、
(2) (1)の混合物を植物材料に接種する工程；
を含む、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であ つて、
ここで、該粉体は、ハイドロキシアパタイト、シリカゲル、ゼォライト、その他の多孔性 セラミックス、グラスウールおよび活性炭、ならびにそれらの混合物、力もなる群より選 択される粉体であって、粒径が 1〜150 μ mの粉体である、
j記方法。
[18] 以下の工程：
( 1)植物材料と粉体を混合する工程；および、
(2) (1)の混合物にァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を接種する工程； を含む、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であ つて、
ここで、該粉体は、ハイドロキシアパタイト、シリカゲル、ゼォライト、その他の多孔性 セラミックス、グラスウールおよび活性炭、ならびにそれらの混合物、力もなる群より選 択される粉体であって、粒径が 1〜150 μ mの粉体である、 前記方法。
[19] ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、 該方法は、ァグロパクテリゥム属細菌懸濁液、粉体、および植物材料を同時に混合 することによりァグロバタテリゥム属細菌を植物材料に接種する工程を含み、ここで、 該粉体は、ハイドロキシアパタイト、シリカゲル、ゼォライト、その他の多孔性セラミック ス、グラスウールおよび活性炭、ならびにそれらの混合物、からなる群より選択される 粉体であって、粒径が 1〜150 mの粉体である、前記方法。
[20] ァグロパクテリゥム属細菌を介した植物材料の形質転換による形質転換植物の製 造方法であって、以下の工程：
(1)粉体の存在下でァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を植物材料に接種し；
(2)形質転換された植物材料を選抜し；そして、
(3)選抜された形質転換体を再分化する；
を含むことを特徴とする、前記方法。
[21] 工程（1)が、
(i)ァグロパクテリゥム属細菌懸濁液と粉体を混合し；そして、
(ii) (i)の混合物を植物材料に接種する；
ことにより達成される、請求項 20に記載の方法。
[22] 工程（1)が、
(i)植物材料と粉体を混合し；そして、
(ii) (i)の混合物にァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を接種する；
ことにより達成される、請求項 20に記載の方法。
[23] 工程（1)が、ァグロパクテリゥム属細菌懸濁液、粉体、および植物材料を同時に混 合することによりァグロパクテリゥム属細菌を植物材料に接種することにより達成され る、請求項 20に記載の方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009122962A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
WO2011013764A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法
WO2012015039A1 (ja) 2010-07-29 2012-02-02 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法
WO2015085990A1 (de) 2013-12-15 2015-06-18 Kws Saat Ag Selektionsmarker-freies rhizobiaceae-vermitteltes verfahren zur herstellung einer transgenen pflanze der gattung triticum

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2848689A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control targeting pds
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UY34822A (es) 2012-05-24 2013-12-31 Seeds Ltd Ab Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética
US20150252356A1 (en) * 2012-08-28 2015-09-10 Bio Cube System Co., Ltd. Porous solid phase for rapidly isolating biological molecules for nucleic acid amplification reaction from biological sample, and use thereof
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
CN105263329B (zh) 2013-03-13 2020-09-18 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10609930B2 (en) 2013-03-13 2020-04-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP3608412A3 (en) 2013-07-19 2020-04-08 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling leptinotarsa
CA2929533C (en) 2013-11-04 2023-06-06 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
WO2015200223A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
RU2754955C2 (ru) 2014-07-29 2021-09-08 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями
MX2017009521A (es) 2015-01-22 2018-11-09 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
CN104823844A (zh) * 2015-01-27 2015-08-12 江苏省中国科学院植物研究所 一种莲属植物的组织培养方法
US10883103B2 (en) 2015-06-02 2021-01-05 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
AU2016270913A1 (en) 2015-06-03 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
CN110607323A (zh) * 2019-09-24 2019-12-24 四川育良生物科技有限公司 一种农杆菌介导水稻遗传转化方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006722A1 (fr) 1993-09-03 1995-03-09 Japan Tobacco Inc. Procede permettant de transformer une monocotyledone avec un scutellum d'embryon immature
JP2649287B2 (ja) 1992-07-07 1997-09-03 日本たばこ産業株式会社 単子葉植物の形質転換方法
JPH11290072A (ja) * 1998-04-08 1999-10-26 Mitsui Chem Inc 植物細胞への遺伝子導入方法
JP2000342256A (ja) 1999-06-04 2000-12-12 Japan Tobacco Inc 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
JP2002528047A (ja) * 1998-01-29 2002-09-03 ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー 植物細胞凝集体及び植物組織のホイスカー−媒介形質転換ならびにその植物の再生
JP2003274953A (ja) * 2002-03-27 2003-09-30 Niigata Prefecture 植物細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子導入用の植物細胞処理装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE398679T1 (de) * 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
CA2386125C (en) 2000-08-03 2010-07-13 Japan Tobacco Inc. Method of improving gene transfer efficiency into plant cells
CN1429904A (zh) * 2002-12-26 2003-07-16 中国农业大学 一种对玉米进行基因转化的方法
US20070283455A1 (en) * 2006-05-31 2007-12-06 Gray Dennis J Genetic Transformation of Grapevines

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2649287B2 (ja) 1992-07-07 1997-09-03 日本たばこ産業株式会社 単子葉植物の形質転換方法
WO1995006722A1 (fr) 1993-09-03 1995-03-09 Japan Tobacco Inc. Procede permettant de transformer une monocotyledone avec un scutellum d'embryon immature
JP3329819B2 (ja) 1993-09-03 2002-09-30 日本たばこ産業株式会社 未熟胚の胚盤を用いた単子葉植物の形質転換方法
JP2002528047A (ja) * 1998-01-29 2002-09-03 ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー 植物細胞凝集体及び植物組織のホイスカー−媒介形質転換ならびにその植物の再生
JPH11290072A (ja) * 1998-04-08 1999-10-26 Mitsui Chem Inc 植物細胞への遺伝子導入方法
JP2000342256A (ja) 1999-06-04 2000-12-12 Japan Tobacco Inc 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
JP2003274953A (ja) * 2002-03-27 2003-09-30 Niigata Prefecture 植物細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子導入用の植物細胞処理装置

Non-Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIDNEY, D. ET AL., PLANT MOL. BIOL., vol. 18, 1992, pages 301 - 313
CHAN, M-T. ET AL., PLANT MOL. BIOL., vol. 22, 1993, pages 491 - 506
CHENG, M. ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 115, 1997, pages 971 - 980
DE CLEENE, M.; DE LEY, J., BOT. REV., vol. 42, 1976, pages 389 - 466
DEJI, A. ET AL., BIOCHIM. ET BIOPHYS. ACTA, vol. 1492, 2000, pages 216 - 220
FRAME, B. R. ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 129, 2002, pages 13 - 22
GOULD, J. ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 95, 1991, pages 426 - 434
GRIMSLEY, N. ET AL., NATURE, vol. 325, 1987, pages 177 - 179
HIEI, Y. ET AL., THE PLANT JOURNAL, vol. 6, 1994, pages 271 - 282
HOEKEMA, A. ET AL., NATURE, vol. 303, 1983, pages 179 - 180
ISHIDA, Y. ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 14, 1996, pages 745 - 750
ISHIDA, Y. ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 4, 1996, pages 745 - 750
ISHIDA, Y. ET AL., PLANT BIOTECHNOLOGY, vol. 20, 2003, pages 57 - 66
KOMARI, T.; KUBO T.: "Molecular improvement of cereal crops.", 1999, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, article "Methods of Genetic Transformation: Agrobacterium tumefaciens.", pages: 43 - 82
MOONEY, P.A. ET AL., PLANT CELL, TISSUES AND ORGAN CULTURE, vol. 25, 1991, pages 209 - 218
NEGROTTO, D. ET AL., PLANT CELL REPORTS, vol. 19, 2000, pages 798 - 803
NOMURA, M. ET AL., PLANT J., vol. 22, 2000, pages 211 - 221
NOMURA, M. ET AL., PLANT MOL. BIOL., vol. 44, 2000, pages 99 - 106
POTRYCUS, I., BIO/TECHNOLOGY, vol. 8, 1990, pages 535 - 542
RAINERI, D. M. ET AL., BIO/TECHNOLOGY, vol. 8, 1990, pages 33 - 38
SINGH, N.; CHAWLA, S., CURRENT SCIENCE, vol. 76, 1999, pages 1483 - 1485
TANIGUCHI, M. ET AL., PLANT CELL PHYSIOL., vol. 41, 2000, pages 42 - 48
TINGAY, S. ET AL., PLANT J., vol. 11, 1997, pages 1369 - 1376
TRICK, H. N.; FINER, J. J., TRANSGENIC RES., vol. 6, 1997, pages 329 - 336
ZHAO, Z.-Y. ET AL., MOL. BREED., vol. 8, 2001, pages 323 - 333
ZHAO, Z.-Y. ET AL., PLANT MOL. BIOL., vol. 44, 2000, pages 789 - 798

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009122962A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
US8357836B2 (en) 2008-03-31 2013-01-22 Japan Tobacco Inc. Agrobacterium-mediated method for producing transformed maize or rice
AU2009232967B2 (en) * 2008-03-31 2015-04-02 Kaneka Corporation Agrobacterium-mediated method for producing transformed plant
WO2011013764A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法
US8884101B2 (en) 2009-07-29 2014-11-11 Japan Tobacco Inc. Method of gene introduction into Triticum plant using Agrobacterium, and a method of producing transformed Triticum plant
JP5766605B2 (ja) * 2009-07-29 2015-08-19 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法
WO2012015039A1 (ja) 2010-07-29 2012-02-02 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法
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