JP2003274953A - 植物細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子導入用の植物細胞処理装置 - Google Patents

植物細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子導入用の植物細胞処理装置

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物細胞にアグロバクテリウムが良好に感染
して該植物細胞に遺伝子を導入できる実用性に秀れた植
物細胞への遺伝子導入技術を提供するものである。 【解決手段】 アグロバクテリウム法により植物細胞１
に遺伝子を導入する方法であって、鋭利な微細凹凸を有
する微細凹凸面２に植物細胞１を当接させて該植物細胞
１の表面に傷７を付け、この植物細胞１にアグロバクテ
リウム法で遺伝子を導入するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物細胞に外来の
遺伝子を導入して遺伝子操作する技術に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】植物細
胞に外来の遺伝子を導入することによって、交雑育種で
は付加できない有用な形質を植物に付与することは、今
後の農作物の改良と農業の発展に極めて意義がある。
【０００３】この遺伝子を導入する技術には、微小な金
属粒子に外来の遺伝子を付着しておき、この金属粒子を
空気銃で植物細胞に打ち込むパーティクルガン法（例え
ば、特表平５−５０８３１６号）等の物理的な方法や、
土壌細菌であるアグロバクテリウムの感染作用を利用し
たアグロバクテリウム法（例えば、特開昭６０−７００
８０号や特開平６−２０９７７９号）等の生物的な方法
が提案されている。
【０００４】上記の方法の内、物理的な方法は、遺伝子
の導入の際、所望の遺伝子以外の遺伝子の断片が植物細
胞に導入されてしまうおそれがあり、植物を目的通りと
することができない場合が多い。従って、植物細胞に遺
伝子を導入する際には、生物的な方法であるアグロバク
テリウム法が採用される場合が多い。
【０００５】このアグロバクテリウム法について説明す
る。
【０００６】先ず、アグロバクテリウムに物理的な方法
によって目的の遺伝子を導入しておく。
【０００７】一方、遺伝子を導入したい植物にメス等で
傷を付けておく。この傷は植物細胞壁を損傷させる程度
としておく。
【０００８】続いて、アグロバクテリウムと植物細胞と
を一緒に培養する。この際、前記植物細胞の傷にアグロ
バクテリウムが接近して感染し、該植物細胞の細胞膜を
通して内部の染色体に目的の遺伝子が組み込まれる。
【０００９】これにより、植物細胞の遺伝子に目的の遺
伝子を導入することができる。
【００１０】ところで、このアグロバクテリウム法にも
下記の問題点がある。
【００１１】アグロバクテリウムは双子葉植物の細胞に
は感染し易いという性質を有しているが、単子葉植物
（例えば、ユリ科植物）の細胞には感染しにくい。従っ
て、単子葉植物にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入
しようとする場合、成功率が低いという問題点がある。
【００１２】更に、前述のようにアグロバクテリウムを
感染させる為には植物にメス等で傷を付けなければなら
ないが、細胞が非常に弱い場合、例えば、ユリ科植物の
場合、この傷が原因で植物細胞が死んでしまうことがあ
る。
【００１３】尚、細胞が非常に弱い場合は、物理的な方
法による遺伝子の導入も、当然難しい。
【００１４】本発明は、上記問題点を解決するもので、
植物細胞にアグロバクテリウムが良好に感染して該植物
細胞に遺伝子を導入できる実用性に秀れた植物細胞への
遺伝子導入技術を提供するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】添付図面を参照して本発
明の要旨を説明する。
【００１６】アグロバクテリウム法により植物細胞１に
遺伝子を導入する方法であって、鋭利な微細凹凸を有す
る微細凹凸面２に植物細胞１を当接させて該植物細胞１
の表面に傷７を付け、この植物細胞１にアグロバクテリ
ウム法で遺伝子を導入することを特徴とする植物細胞へ
の遺伝子導入方法に係るものである。
【００１７】また、アグロバクテリウム法により植物細
胞１に遺伝子を導入する方法であって、植物細胞１から
カルスを誘導し、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２
に該カルスを擦り付けることで前記植物細胞１の表面に
傷７を付け、この植物細胞１にアグロバクテリウム法で
遺伝子を導入することを特徴とする植物細胞への遺伝子
導入方法に係るものである。
【００１８】また、アグロバクテリウム法により植物細
胞１に遺伝子を導入する方法であって、内壁に鋭利な微
細凹凸を有する微細凹凸面２が設けられた容器３を用意
し、この容器３に植物細胞１と培養液とを収納して震盪
することにより前記微細凹凸面２に植物細胞１を擦り付
けて該植物細胞１の表面に傷７を付けることを特徴とす
る植物細胞への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１９】また、請求項３記載の植物細胞への遺伝子
導入方法において、微細凹凸面２は、容器３の内壁に紙
ヤスリ４を付設することで形成されていることを特徴と
する植物細胞への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２０】また、請求項１〜４いずれか１項に記載の
植物細胞への遺伝子導入方法において、植物細胞１の表
面に付ける傷７は、植物細胞１が細胞分裂可能な程度の
浅い擦り傷７であることを特徴とする植物細胞への遺伝
子導入方法に係るものである。
【００２１】また、請求項１〜５いずれか１項に記載の
植物細胞への遺伝子導入方法において、植物細胞１が単
子葉植物の細胞であることを特徴とする植物細胞への遺
伝子導入方法に係るものである。
【００２２】また、請求項１〜６いずれか１項に記載の
植物細胞への遺伝子導入方法において、植物細胞１がユ
リ科植物の細胞であることを特徴とする植物細胞への遺
伝子導入方法に係るものである。
【００２３】また、植物細胞１に傷７を付け、この植物
細胞１にアグロバクテリウム法により遺伝子を導入する
際に使用する遺伝子導入用の植物細胞処理装置であっ
て、開口部５を有する容器３の内壁には鋭利な微細凹凸
を有する微細凹凸面２が設けられていることを特徴とす
る遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２４】また、請求項８記載の遺伝子導入用の植物
細胞処理装置において、容器３の内壁には紙ヤスリ４が
付設され、この紙ヤスリ４のヤスリ面が微細凹凸面２に
設定されていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細
胞処理装置に係るものである。
【００２５】また、請求項８，９のいずれか１項に記載
の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、容器３の
開口部５を閉塞する蓋体６が設けられていることを特徴
とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものであ
る。
【００２６】また、請求項１０記載の遺伝子導入用の植
物細胞処理装置において、容器３は筒状であり、蓋体６
は容器３の開口部５に螺着脱自在に設けられていること
を特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るも
のである。
【００２７】
【発明の作用及び効果】本発明は繰り返した実験の結
果、得られた効果を請求項としてまとめたものである。
【００２８】植物細胞を表面に鋭利な微細凹凸が設けら
れた微細凹凸面２に当接すると、該植物細胞の表面に多
数の傷７が形成される。
【００２９】植物細胞は、この多数の傷７の修復にエネ
ルギーを消費し、細胞全体としての感染抵抗力が低下す
る。
【００３０】この感染抵抗力が低下した状態の植物細胞
は、アグロバクテリウムに感染し易く、よって、アグロ
バクテリウム法により該植物細胞に遺伝子を良好に導入
することができる。
【００３１】また、この植物細胞に形成される傷７は、
擦り傷と呼べるものであり、該植物細胞の致命傷とはな
りにくく、よって、植物細胞が死ぬこと（細胞分裂不能
な状態になること）は可及的に防止されることになる。
【００３２】本発明は上述のようにするから、植物細胞
にアグロバクテリウムが良好に感染して該植物細胞に遺
伝子を導入できる実用性に秀れた植物細胞への遺伝子導
入技術となる。
【００３３】
【発明の実施の形態】図面は本発明の一実施例を図示し
たものであり、以下に説明する。
【００３４】本実施例は、アグロバクテリウム法により
植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、鋭利な微
細凹凸を有する微細凹凸面２に植物細胞１を当接して該
植物細胞１の表面に傷７を付け、この植物細胞１にアグ
ロバクテリウム法で遺伝子を導入するものである。
【００３５】植物細胞１の表面に付ける傷７は、植物細
胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７とする。具体
的には、植物細胞１の表面に存在する細胞壁10には傷７
が付き、この細胞壁10の内側に存在する細胞膜11には傷
７が付かない程度に設定する。
【００３６】また、植物細胞１の表面に傷７を付ける際
には、該植物細胞１からカルス（植物細胞１の塊）を誘
導し、このカルスを前記微細凹凸面２に擦り付けること
で前記植物細胞１の表面に傷７を付ける方法を採用する
と良い。
【００３７】また、植物細胞１の表面に傷７を付ける際
には、以下に説明する植物細胞処理装置を使用すると良
い。
【００３８】この植物細胞処理装置は、開口部５を有す
る容器３の内壁には鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面
２が設けられているものである。
【００３９】容器３は筒状のものが採用されている。
【００４０】また、容器３の開口部５には、該開口部５
を閉塞する蓋体６が螺着脱自在に設けられている。
【００４１】微細凹凸面２は、容器３の内壁に紙ヤスリ
４が付設されることで形成されている。
【００４２】この紙ヤスリ４は、耐水性のものを採用す
ると良い。また、この紙ヤスリ４は、＃１５０乃至８０
０程度のものを採用すると良い。また、傷７を付けよう
とする植物細胞１の細胞壁10の厚さに対応して使用する
紙ヤスリ４を適宜選択すると良い。
【００４３】植物細胞１に傷７を付ける際には、前記容
器３に植物細胞１と培養液とを収納し、蓋体６を取り付
けた後、震盪することにより前記微細凹凸面２に植物細
胞１を擦り付ける方法を採用すると良い。この方法によ
れば、培養液の存在により、植物細胞１が微細凹凸面２
に強く擦り付けられることがなく、植物細胞１の表面に
該植物細胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７が多
数良好に付けられることになる。
【００４４】また、震盪の際には、ボルテックス等の撹
拌装置を用いると良い。また、震盪時間は、植物細胞や
カルスによって適宜設定する。
【００４５】植物細胞１の表面に傷７を付けた後は、該
植物細胞１とアグロバクテリウムとを一緒に培養して該
植物細胞１にアグロバクテリウムを感染させ、該植物細
胞１の染色体に遺伝子を導入する。
【００４６】この際、前記微細凹凸面２に植物細胞１を
擦り付けることにより、植物細胞１の表面には多数の傷
７が付けられており、よって、植物細胞１の感染抵抗力
が低下し、アグロバクテリウムが良好に感染して植物細
胞１に遺伝子を導入する。
【００４７】本実施例は上述のようにするから、植物細
胞１にアグロバクテリウムが良好に感染して該植物細胞
１に遺伝子を導入できる実用性に秀れた植物細胞への遺
伝子導入技術となる。
【００４８】以下、本実施例の効果を確認した実験例に
ついて説明する。
【００４９】実験例１（ユリへの遺伝子導入） １．植物細胞処理装置の作製 ＃１５０の耐水性紙ヤスリ４を縦８．５ｃｍ横９ｃｍに
切断して円筒状とし、遠沈管（容量５０ｍｌ、容器３）
の内壁に配設した。
【００５０】２．導入遺伝子とアグロバクテリウム 遺伝子導入用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子，
イントロンを含んだβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ遺
伝子（以下、ＧＵＳという。）及びハイグロマイシン耐
性遺伝子を植物に導入される部位に含むｐＩＧ１２１−
Ｈｍを用いた（図４参照）。このベクターを保持するア
グロバクテリウムＥＨＡ１０１株を用いて遺伝子操作を
行った。
【００５１】３．ユリのカルス誘導 ユリ（Ｌｉｌｉｕｍ ’Ａｃａｐｕｌｃｏ’）の一部を
切り出し、２ｐｐｍＰｉｃｌｏｒａｍ及び０．３％ Ｇ
ｅｌｌａｎ Ｇｕｍを含むＭＳ培地に置き、カルスを誘
導した。
【００５２】４．カルスの傷付け 上記３．で誘導したカルス３０個（１個は約０．０７
ｇ）を、２ｐｐｍ Ｐｉｃｌｏｒａｍ及び２０ｐｐｍ
ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅを含むＭＳ液体培地（２
０ｍｌ）と共に前記１．で作製した植物細胞処理装置に
入れ、ボルテックスミキサーを用いて１０秒間激しく撹
拌震盪した。
【００５３】５．アグロバクテリウムとカルスの共培養 前記４．で傷７を付けたカルスを前記２．で得たアグロ
バクテリウムと混合し、２ｐｐｍ Ｐｉｃｌｏｒａｍ及
び０．３％ Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍを含むＭＳ培地に置
き、７日間培養した。
【００５４】６．ＧＵＳ染色 前記５．の共培養後、Ｋｏｓｅらの方法（Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ，２（１９９０）３７９−３９２）により、カ
ルスの染色を行った。その結果、カルス表面積の約４０
乃至５０％が青色に変色した。この変色した部分の植物
細胞１に遺伝子が導入されているから、この実験例１に
よれば、カルスの約４０乃至５０％にアグロバクテリウ
ム法によって遺伝子を組み込めることが確認された。
【００５５】即ち、実験例１によれば、アグロバクテリ
ウムに感染しにくいといわれる単子葉植物のユリの植物
細胞１に、アグロバクテリウム法によって良好に遺伝子
を組み込めることが確認された。
【００５６】比較例１（従来のアグロバクテリウム法に
よるユリへの遺伝子導入） ＧＵＳ染色によるカルスの変色面積は約１乃至２％であ
った。即ち、アグロバクテリウムが殆ど感染せず、効率
が非常に悪いことが確認された。
【００５７】実験例２（ベゴニアへの遺伝子導入） １．植物細胞処理装置の作製 ＃１５０の耐水性紙ヤスリ４を縦８．５ｃｍ横９ｃｍに
切断して円筒状とし、遠沈管（容量５０ｍｌ、容器３）
の内壁に配設した。
【００５８】２．導入遺伝子とアグロバクテリウム 遺伝子導入用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子，
イントロンを含んだＧＵＳ及びハイグロマイシン耐性遺
伝子を植物に導入される部位に含むｐＩＧ１２１−Ｈｍ
を用いた。このベクターを保持するアグロバクテリウム
ＥＨＡ１０１株を用いて遺伝子操作を行った。
【００５９】３．ベゴニアの無菌培養 ベゴニア（Ｂｅｇｏｎｉａ ｓｅｍｐａｒｆｌｏｒｅｎ
ｓ）の葉片を０．１ｐｐｍ ＮＡＡ，１ｐｐｍ ＢＡ及
び０．４％ Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍを含む１／２ＭＳ培
地（ＫＮＯ3とＮＨ4ＮＯ3の濃度を通常より１／２に希
釈）上で無菌的に培養し、得られた不定芽を０．４％
Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍを含むＭＳ培地上で無菌的に栽培
した。
【００６０】４．葉片の傷付け 前記３．で培養した葉片を１ｃｍ角で切り出し、２ｐｐ
ｍ ＮＡＡ及び１ｐｐｍ ＢＡを含む１／２ＭＳ液体培
地（２０ｍｌ）と共に前記１．で作製した植物細胞処理
装置に入れ、ボルテックスミキサーを用いて５秒間激し
く撹拌震盪した。
【００６１】５．アグロバクテリウムと葉片の共培養 前記４．で傷を付けた葉片を前記２．で得たアグロバク
テリウムと混合し、０．１ｐｐｍ ＮＡＡ，１ｐｐｍ
ＢＡ及び０．４％ Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍを含む１／２
ＭＳ培地に置き、４日間培養した。
【００６２】６．ＧＵＳ染色 前記５．の共培養後、前記Ｋｏｓｅらの方法により、葉
片の染色を行った。その結果、葉片表面積の約５０乃至
６０％が青色に変色した。この変色した部分の植物細胞
１に遺伝子が導入されているから、この実験例２によれ
ば、葉片の約５０乃至６０％にアグロバクテリウム法に
よって遺伝子を組み込めることが確認された。
【００６３】即ち、実験例２によれば、双子葉植物であ
りながらアグロバクテリウムに感染しにくいといわれる
ベゴニアの植物細胞１に、アグロバクテリウム法によっ
て良好に遺伝子を組み込めることが確認された。
【００６４】比較例２（従来のアグロバクテリウム法に
よるベゴニアへの遺伝子導入） ＧＵＳ染色による葉片の変色面積は約１乃至２％であっ
た。即ち、アグロバクテリウムが殆ど感染せず、効率が
悪いことが確認された。
【００６５】以上の実験結果によれば、本実施例を採用
することにより、これまでアグロバクテリウムの感染効
率が悪い為に、アグロバクテリウム法による遺伝子導入
効率が低かった植物においても、遺伝子導入効率が向上
し、形質転換体を作出できることが確認された。
【００６６】従って、本実施例によれば、これまでより
も多くの植物に交雑育種では得られない新規な有用形質
を付与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施例の植物細胞１の説明図である。
【図２】本実施例の植物細胞処理装置の説明側断面図で
ある。
【図３】本実施例の植物細胞処理装置の説明平断面図で
ある。
【図４】ｐＩＧ１２１−Ｈｍのマップである。
【符号の説明】
１ 植物細胞 ２ 微細凹凸面 ３ 容器 ４ 紙ヤスリ ５ 開口部 ６ 蓋体 ７ 傷
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 仁 新潟県長岡市長倉町857番地 新潟県農業 総合研究所アグリ・フーズバイオ研究部内 (72)発明者 松本 伊左尾 新潟県長岡市長倉町857番地 新潟県農業 総合研究所アグリ・フーズバイオ研究部内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 CA15 4B024 AA19 AA20 CA02 DA01 EA04 GA11 GA17 4B029 AA23 BB12 BB20 4B065 AA11X AA89X AB01 BA02 BD50 CA53

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アグロバクテリウム法により植物細胞に
    遺伝子を導入する方法であって、鋭利な微細凹凸を有す
    る微細凹凸面に植物細胞を当接させて該植物細胞の表面
    に傷を付け、この植物細胞にアグロバクテリウム法で遺
    伝子を導入することを特徴とする植物細胞への遺伝子導
    入方法。
  2. 【請求項２】 アグロバクテリウム法により植物細胞に
    遺伝子を導入する方法であって、植物細胞からカルスを
    誘導し、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面に該カルス
    を擦り付けることで前記植物細胞の表面に傷を付け、こ
    の植物細胞にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する
    ことを特徴とする植物細胞への遺伝子導入方法。
  3. 【請求項３】 アグロバクテリウム法により植物細胞に
    遺伝子を導入する方法であって、内壁に鋭利な微細凹凸
    を有する微細凹凸面が設けられた容器を用意し、この容
    器に植物細胞と培養液とを収納して震盪することにより
    前記微細凹凸面に植物細胞を擦り付けて該植物細胞の表
    面に傷を付けることを特徴とする植物細胞への遺伝子導
    入方法。
  4. 【請求項４】 請求項３記載の植物細胞への遺伝子導入
    方法において、微細凹凸面は、容器の内壁に紙ヤスリを
    付設することで形成されていることを特徴とする植物細
    胞への遺伝子導入方法。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４いずれか１項に記載の植物
    細胞への遺伝子導入方法において、植物細胞の表面に付
    ける傷は、植物細胞が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷
    であることを特徴とする植物細胞への遺伝子導入方法。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５いずれか１項に記載の植物
    細胞への遺伝子導入方法において、植物細胞が単子葉植
    物の細胞であることを特徴とする植物細胞への遺伝子導
    入方法。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６いずれか１項に記載の植物
    細胞への遺伝子導入方法において、植物細胞がユリ科植
    物の細胞であることを特徴とする植物細胞への遺伝子導
    入方法。
  8. 【請求項８】 植物細胞に傷を付け、この植物細胞にア
    グロバクテリウム法により遺伝子を導入する際に使用す
    る遺伝子導入用の植物細胞処理装置であって、開口部を
    有する容器の内壁には鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸
    面が設けられていることを特徴とする遺伝子導入用の植
    物細胞処理装置。
  9. 【請求項９】 請求項８記載の遺伝子導入用の植物細胞
    処理装置において、容器の内壁には紙ヤスリが付設さ
    れ、この紙ヤスリのヤスリ面が微細凹凸面に設定されて
    いることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装
    置。
  10. 【請求項１０】 請求項８，９のいずれか１項に記載の
    遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、容器の開口
    部を閉塞する蓋体が設けられていることを特徴とする遺
    伝子導入用の植物細胞処理装置。
  11. 【請求項１１】 請求項１０記載の遺伝子導入用の植物
    細胞処理装置において、容器は筒状であり、蓋体は容器
    の開口部に螺着脱自在に設けられていることを特徴とす
    る遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
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