JP6062074B2 - 組換え植物細胞、これの製造方法及びこれを利用した目的タンパク質の生産方法 - Google Patents
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Description
(a)植物形成層由来幹細胞(CMC)またはカルスを含む植物細胞の集団(population)に目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、目的タンパク質をコードする遺伝子に安定的形質転換または、一時的発現させる工程;及び
(b)前記アグロバクテリウムで感染させた植物細胞培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
(a)目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体を生長させる工程;
(b)前記形質転換された植物体から形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)を分離する工程;
(c)前記分離された形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)を培地で培養する工程;及び
(d)前記形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する:
(項目1)
目的タンパク質を発現する植物細胞で、前記植物細胞には目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されていて、前記植物細胞は、植物形成層由来幹細胞(CMC:Cambial Meristematic Cells)またはカルスを含み、ここで、前記植物形成層由来幹細胞(CMC)は、植物から分離した先天的に未分化の細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経なかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする目的タンパク質発現用植物細胞。
(項目2)
前記植物細胞は、植物形質転換形成層由来幹細胞(CMC)に目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されていることを特徴とする項目1に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
(項目3)
前記目的タンパク質をコードする遺伝子は、植物細胞で形質感染されて前記目的タンパク質が一時的に発現されることを特徴とする項目2に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
(項目4)
前記目的タンパク質をコードする遺伝子は、植物形成層由来幹細胞(CMC)で安定的に形質転換されることを特徴とする項目2に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
(項目5)
前記植物形成層由来幹細胞(CMC)は、目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体から分離されることを特徴とする項目2に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
(項目6)
前記目的タンパク質は、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、保存タンパク質、移動タンパク質(movement protein)、エックスプロイティブプロテイン(exploitive protein)及びレポータータンパク質で構成される群から選択されるいずれか一つ以上の目的タンパク質であることを特徴とする項目2に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
(項目7)
前記植物は、トマト、タバコ、ニンジン、櫟及び山参で構成される群から選択されることを特徴とする項目2に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
(項目8)
植物形成層由来幹細胞(CMC)またはカルスを含む植物細胞の集団(population)に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、植物細胞を目的タンパク質をコードする遺伝子で形質感染または形質転換する工程を含む目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法として、ここで、前記植物形成層由来幹細胞(CMC)は、植物から分離した先天的に未分化の細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経なかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
(項目9)
前記製造方法は、植物形成層由来幹細胞(CMC)に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、植物細胞を目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換することを特徴とする項目8に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
(項目10)
前記形質感染または形質転換する工程は、静置培養(stationary culture)工程をさらに含むことを特徴とする項目8に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
(項目11)
前記形質感染または形質転換する工程は、単回または間欠的静置培養工程をさらに含むことを特徴とする項目8に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
(項目12)
前記共培養は、前記植物細胞と前記目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムの培養物を1分乃至48時間撹はんして培養した後、1分乃至96時間静置培養した後、再び1乃至14日間撹はん培養することを特徴とする項目8に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
(項目13)
前記添加されるアグロバクテリウムのOD 600 は、0.00001乃至2.0であることを特徴とする項目8に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
(項目14)
次の工程を含む、目的タンパク質発現用植物体から目的タンパク質を製造する方法:
(a)目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体を生長させる工程;
(b)前記形質転換された植物体から形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)を分離する工程;
(c)前記分離された形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)を培地で培養する工程;及び
(d)前記形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
(項目15)
次の工程を含む、目的タンパク質発現用植物細胞から目的タンパク質を製造する方法:
(a)植物形成層由来幹細胞(CMC)またはカルスを含む植物細胞の集団(population)に目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、目的タンパク質をコードする遺伝子に安定的形質転換または、一時的発現させる工程;及び
ここで、前記植物形成層由来幹細胞(CMC)は植物から分離した先天的に未分化された細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスロの脱分化過程を経ない分裂組織的連続性を持って、
(b)前記アグロバクテリウムで感染させた植物細胞培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
下記の工程を含む、目的タンパク質発現用植物細胞から目的タンパク質を製造する方法に関する:
(a)植物形成層由来幹細胞(CMC)またはカルスを含む植物細胞の集団(population)に目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、目的タンパク質をコードする遺伝子に安定的形質転換または、一時的発現させる工程;及び
(b)前記アグロバクテリウムで感染させた植物細胞培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
(a)目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体を生長させる工程;
(b)前記形質転換された植物体から形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)を分離する工程;
(c)前記分離された形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)を培地で培養する工程;及び
(d)前記形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
1−1:トマト植物材料の準備
ナス科リコペルシクム属のトマト(Lycopericum esculentum、(株)世宗(セジョン)種苗)から形成層由来幹細胞を収得するために、幹と小枝(図1のA)を採取した後、直ちに抗酸化剤100mg/Lアスコルビン酸(L−ascorbic acid,DUCHEFA,The Netherlands)溶液に沈積して運送・保管した。
前記実施例1−1の殺菌過程を経た幹を切って牧夫から分裂能が旺盛な形成層を含んだ師部(phloem)皮層(cortex)及び表皮(epidermis)組織を剥いだ。
前記実施例1−2で準備した形成層を含む片体は、表1の形成層由来幹細胞(CMC)誘導培地(培地1)に種まきして培養した。
トマトのカルス(PC10623)は、生物資源センターで購入して、毎3週目継代培養した。
前記実施例1−3から分離したトマト形成層由来幹細胞(CMC)を下記表2の液状培地が含まれたフラスコに入れて、暗条件で25±1℃で100rpmの回転攪拌機(shaker)で培養した。持続的な培養のために、増殖培養が完了したトマト形成層由来幹細胞(CMC)は、細胞対培地体積比を1:10にして7日間懸濁培養した。
2−1:山参の形成層由来幹細胞(CMCs)の製造
滑らかで傷がない山参を選別して細根を全部除去した後、2stepで表面殺菌して準備して、殺菌処理した組織の褐変化防止のために抗酸化剤が含まれた表5のBIM(browning inhibition medium)に殺菌された主根を入れて、30分乃至1時間程度振とう培養した後、滅菌されたろ過紙で水気を除去した。
前記培地7で培養して形成層以外の他の組織が壊死された後、培地3−1で継代培養して形成層細胞だけを増殖させた。
ニンジン(Daucus carota L.)を用意して、前記実施例2−1と同じ方法で表面殺菌して準備した。その後、準備された試料に対して、実施例2−1と同じ方法で浸透ストレス処理後、形成層細胞株を誘導した。
その結果、前記実施例2−1と同様に形成層以外の他の組織は壊死されて、分裂能を持つ形成層由来幹細胞(CMC)が誘導されることを確認した。ニンジンの形成層が含まれる切片体に対しも前記実施例2−1と同じ方法で増殖させた。
一方、対照群としてニンジンカルスを培養するために、ニンジンの根を採取した後、前記実施例2−1の方法で表面殺菌後、切片体を作って表10のカルス誘導培地に播種して21±1℃に調節された暗室で培養した。無定形のカルスを獲得後、毎14日目継代した。
前記実施例1から分離した山参形成層由来幹細胞(CMC)を表2の液状培地が含まれたフラスコに入れて、暗条件で21±1℃で100rpmの回転攪拌機(shaker)で培養した。持続的な培養のために、増殖培養が完了した山参形成層由来幹細胞(CMC)は、細胞対培地体積比を1:10にして14日間懸濁培養した。また、前記実施例2−1で分離した山参のカルスも同じ条件で培養して、液状培地も山参形成層由来幹細胞(CMC)培養に使用した液状培地と同じである。
GFP遺伝子を含む植物発現用binary vector(pBINmGFP5ER)を用いて、Takara Korea Biomedicalから購入したAgrobacterium tumefaciens LBA4404を用いて下記の実験を進行した(LBA4404 Electro cells,cat no.9115,Korea)。
植物形成層由来幹細胞(CMC)にアグロバクテリウムを介した形質転換のために、前記アグロバクテリウムを懸濁培養した。
固体培地で培養されたアグロバクテリウムのsingle colonyを取って5mlYEP液体培地(表12、培地10)に解いて6〜18時間28℃、200rpmで暗培養した後、培養液1〜5mlをYEP培地100mlに入れて、6〜24時間28℃、200rpmで培養した。
植物形成層由来幹細胞(CMC)形質転換のために、前記実施例3のようにアグロバクテリウムを用意して、形成層由来幹細胞(CMC)は、実施例1及び2の対数生長期のcellを用意して、細胞対培地体積比率が1:10になるようにした。
実施例4のように実行後、3〜21日間250ml flaskでトマト形成層由来幹細胞(CMC)とアグロバクテリウムを共培養(25℃、100rpm)して、GFP発現が最も高い時点でアグロバクテリウムを除去するために、表2のsuspension medium(培地3)で5〜20分間2回洗浄した。3回目にkanamycin(TCI,Japan) 300mg/Lとcefotaxime(TCI,Japan)500mg/Lを処理して1週間懸濁選抜培養(25℃、100rpm shaking)した。この後、形成層由来幹細胞(CMC)を沈積させて、培地を最大限注いで捨てた後、フィルターペーパー(70mm,Toyo Roshi Kaisha,Japan)で残りの培地をほとんど吸収させて、トマト形成層由来幹細胞(CMC)を固体選抜培地(表I4、培地11)に移した。これを25±1℃暗培養して、GFPを発現する形質転換された形成層由来幹細胞(TCMC)を取得した。ニンジンの形成層由来幹細胞(CMC)も全て前記のような方法で処理して、山参は培地11中ホルモンを抜いた培地にプレーティングした。
実施例4で90%以上のGFP発現率を確認した250mLフラスコ(flask)に沈積された細胞ボリューム(settled cell volume)70mlを3Lエアリフト型バイオリアクター(3L air−lift bioreactor)に細胞:培地(cell:media)の体積比率が1:30になるべく接種した。乾燥細胞重量(dry cell weight)は、0.6g/Lである。3Lバイオリアクターのワーキングボリューム(working volume)は、2,100mlで、バイオリアクターの体積使用率は全ボリューム(total volume)の70%である。この時用いられた培地は、250mLフラスコで用いられた培地と同じで、抗生剤(antibiotics)で5〜25mg/LのG418を添加した後、通気率(aeration rate)は、0.1〜0.15vvm(volume/volume/minute)で7〜10日間25℃±1、癌条件下で培養した。3Lバイオリアクターで継代培養(subculture)は、7〜10日間隔に進行されて、好ましくは7日毎に継代培養された。
7−1.アグロバクテリウム培養
pBINmGFP5ER/LBA4404 single colonyのアグロバクテリウムを取って5ml YEP培地に入れて、6h、28℃培養後、YEP培地50mlに1:50〜1:100で添加して、18h、計24hr内に培養した後、アグロバクテリウム培養液のODを測定した。Conical tubeにアグロバクテリウム培養液を入れて、遠心分離機を利用して、cellを4℃でspin downさせた。集められたアグロバクテリウムペレットにタバコ培養培地(MS+2mg/L BA+0.1mg/L NAA+pH5.8)を入れて解いた後、すでに測定されたアグロバクテリウムODを使ってタバコ培養培地とアグロバクテリウム培養液を混ぜて、acetosyringone 10−200uMを添加して250rpmで2hr、28℃で培養した。
ピンセットで機内植物体の葉柄を取って葉を引き離して、予め準備しておいたpetri dishに置いた。ナイフで葉柄寄りの主脈部位を含んだ1.0cm×1.0cm(〜0.5cm×0.5cm)の切片体を作った。
Positive control(PC)切片体を別に分離して、ひっくり返して共培養培地(MS+2mg/L BA+0.1mg/L NAA+pH5.8+0.8% agar)に播種した後、3日間25℃で暗培養した。前記7−2で製造した切片体(positive control除外)を前記7−1で準備した培養液に入れて、5min毎にそっと振りながら20min間漬けてagro−inoculationさせた。切片体を取り上げてfilter paperの上に置いてfilter paperを上げて水気を切った後、切片体を共培養培地(MS+2mg/L BA+0.1mg/L NAA+pH5.8+0.8% agar+100uM AS)にひっくり返して播種して、3日間25℃で暗培養した。
共培養が完了した切片体を滅菌数を利用して、3回washingした後、filter paperで水気を切って、PC中negative control(NC)で用いる切片体を分離して、PCは再生培地(MS+2mg/L BA+0.1mg/L NAA+pH5.8+0.8% agar)に、NCは選抜培地(MS+2mg/L BA+0.1mg/L NAA+pH5.8+0.8% agar培地+kan 100mg/L+cef 500mg/L)にひっくり返して播種して、残りの切片体は選抜培地にひっくり返して播種した。
3週間暗培養した後、16h/8h光周期で明培養して、新枝を形成させて、新枝が形成されると、1個の新枝だけを取り出して、根形成培地(MS+kan 100mg/L + cef 500mg/L pH5.8+0.8% agar)に移して根を形成させた。形質転換されたN.benthamianaを純化して植木鉢に生育させた結果を図14に示した。
生育3〜6ヶ月の幹を採取して形態を観察した。cross section,radial sectionを行って、組織区別のためにxylem特異染色試薬であるphloroglucinol−HClで染色して観察した。図15を参照すると、Xylemは赤く染色されて真上の形成層が2〜4(Nicotiana tabacum cv.Xanthiの場合、3〜6)層存在することを確認することができる。
また、GFPが形質転換されたタバコ植物体をcross sectionして、GFP filter(excitation/barrier):460−490/520nmの条件で観察した結果、図16に示したように形成層zoneで他の組織より明るい蛍光が確認された。
培養4日目N.benthamianaの形成層部位で細胞分裂が観察された。培養2週後図17のAのように、増殖形成層以外師部組織をピンセットで取り外した。図17のBに示したように、分離以後師部以外組織観察時、他組織の細胞分裂様子や組織損傷は観察されなかった。Nicotiana tabacum cv.XanthiもN.benthamianaと同じ方法で形成層由来幹細胞分離して、図18に示したようにNicotiana tabacum cv.Xanthiでも同じ結果を得た。
GFP遺伝子が形質転換されたタバコ形成層由来幹細胞(TCMC)とタバコ植物体、そして形質転換されなかったタバコ植物体からそれぞれ全水溶性タンパク質を分離した。
分離した全水溶性タンパク質は、2枚のポリアクリルアミドゼリにSDS−PAGEをして、semi−dry transfer cell(BIO−RAD社)を使ってニトロセルロース(nitrocellulose)ペーパーにトランスファー(transfer)した。
Claims (14)
- 目的タンパク質発現用の植物形成層由来幹細胞(CMC:Cambial Meristematic Cells)で、前記植物形成層由来幹細胞には目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されていて、ここで、前記植物形成層由来幹細胞(CMC)は、植物から分離した先天的に未分化の細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経なかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞。
- 前記目的タンパク質をコードする遺伝子は、植物細胞で形質転換されて、前記目的タンパク質が前記植物細胞で一時的に発現されることを特徴とする請求項1に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞。
- 前記目的タンパク質をコードする遺伝子は、植物形成層由来幹細胞(CMC)で安定的に形質転換されることを特徴とする請求項1に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞。
- 前記植物形成層由来幹細胞(CMC)は、目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体から分離されることを特徴とする請求項1に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞。
- 前記目的タンパク質は、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、保存タンパク質、移動タンパク質(movement protein)、エックスプロイティブプロテイン(exploitive protein)及びレポータータンパク質で構成される群から選択されるいずれか一つ以上の目的タンパク質であることを特徴とする請求項1に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞。
- 前記植物は、トマト、タバコ、ニンジン、櫟及び山参で構成される群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞。
- 植物形成層由来幹細胞(CMC)の集団(population)に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して撹はんして共培養し、そして、静置培養して、撹はんさせずに細胞を沈積させることによって、植物形成層由来幹細胞(CMC)の集団を目的タンパク質をコードする遺伝子で形質感染または形質転換する工程を含む、目的タンパク質発現用の植物由来の植物形成層由来幹細胞の製造方法として、ここで、前記植物形成層由来幹細胞(CMC)は、植物から分離した先天的に未分化の細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経なかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞の製造方法。
- 前記製造方法は、植物細胞が目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換されて、前記目的タンパク質が前記植物細胞で一時的に発現されることを特徴とする請求項7に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞の製造方法。
- 前記目的タンパク質をコードする遺伝子が、植物形成層由来幹細胞(CMC)に安定的に形質転換されることを特徴とする請求項7に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞の製造方法。
- 前記形質感染または形質転換する工程は、単回または間欠的静置培養工程をさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞の製造方法。
- 前記共培養は、前記植物細胞と前記目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムの培養物を1分乃至48時間撹はんして培養した後、1分乃至96時間静置培養した後、再び1乃至14日間撹はん培養することを特徴とする請求項7に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞の製造方法。
- 前記添加されるアグロバクテリウムのOD600は、0.00001乃至2.0であることを特徴とする請求項7に記載の目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞の製造方法。
- 次の工程を含む、目的タンパク質発現用植物体の形質転換された植物形成層由来幹細胞(TCMC)から目的タンパク質を製造する方法:
(a)目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体を生長させる工程;
(b)前記形質転換された植物体から形質転換された植物形成層由来幹細胞(TCMC)を分離する工程;
(c)前記分離された形質転換された植物形成層由来幹細胞(TCMC)を培地で培養する工程;及び
(d)前記形質転換された植物形成層由来幹細胞(TCMC)培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。 - 次の工程を含む、目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞(CMC)から目的タンパク質を製造する方法:
(a)植物由来の植物形成層由来幹細胞(CMC)の集団(population)に目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して撹はんして共培養し、そして、静置培養して、撹はんさせずに細胞を沈積させることによって、目的タンパク質をコードする遺伝子を安定的に形質転換または、一時的に発現させる工程であって、ここで、前記植物形成層由来幹細胞(CMC)は植物から分離した先天的に未分化された細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経ない分裂組織的連続性を持っている工程;及び
(b)共培養によって前記アグロバクテリウムで感染させた植物細胞培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
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