KR100703569B1

KR100703569B1 - 이소플라본 생합성 형질전환 벼 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100703569B1
Application number: KR1020050107505A
Authority: KR
Inventors: 박향미; 남민희; 이기환; 정응기; 고종민; 최준호; 정영수
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2005-11-10
Filing date: 2005-11-10
Publication date: 2007-05-21
Also published as: KR20070050207A

Abstract

본 발명은 신팔달2호 콩에서 분리한 IFS(isoflavone synthase) 유전자를 유전자 조작 기술을 통해 유색벼에 도입하여 벼에는 존재하지 않는 항암·항산화 효과를 가지는 건강기능성 물질인 이소플라본을 생합성하도록 제조한 형질전환 벼 및 그 제조방법에 관한 것이다.

이소플라본 생합성 유전자(IFS), 항암·항산화성, 벼과식물, 형질전환

Description

이소플라본 생합성 형질전환 벼 및 그 제조방법{Isoflavone synthetic transgenic rice family(YTR-32) and the method for preparing thereof}

도 1은 서열번호 1의 서열을 갖는 이소플라본 생합성 유전자(IFS1)에 종자특이 발현 프로모터가 연결된 벼 형질전환용 벡터의 구조도이다.

도 2는 유색벼 품종별 이소플라본 전구물질 함량을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3은 유색벼 품종별 식물체 재분화율을 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 서열번호 1의 이소플라본 생합성 유전자(IFS1)가 혼입된 형질전환 벼의 PCR 분석 결과를 보여준다(M: 크기 마커, NT: 비형질전환체, 플라스미드(plasmid): 양성 대조군).

도 5는 서열번호 2의 이소플라본 생합성 유전자(IFS1)를 발현하는 형질전환 벼의 RT-PCR 분석 결과를 보여준다 (M: 크기 마커, NT: 비형질전환체).

도 6은 서열번호 2의 이소플라본 생합성 유전자(IFS1)를 발현하는 형질전환 벼 T₂ 세대에서 관찰되는 이소플라본 제니스테인 생합성을 나타낸 HPLC 분석 결과이다(상: 이소플라본 제니스테인 표준품, 중: 비형질전환 벼, 하: 형질전환벼).

도 7은 이소플라본 제니스테인의 LC/MS 분석 결과이다(상: 이소플라본 제니스테인 표준품, 하: 형질전환 벼).

도 8은 이소플라본 생합성 형질전환 벼의 동형접합(homozygous) T₂ 계통의 실물 사진이다.

이소플라본 생합성 유전자(IFS1)의 산물인 이소플라본류는 암이나 심장질환 및 골다공증 등에 대한 약리활성을 갖는 물질로 지난 10 년 동안 약 3,600건에 이를 정도로 많은 보문들이 보고 되어 왔다(Dixon and Ferreira, Molecules of interest genistein, Phytochemistry, 60:205-211, 2002). 특히, 건강기능성 식품으로서 주목받고 있는 이소플라본의 주 성분은 제니스테인이며, 최근 유전자 조작 기법을 이용하여 이들 이소플라본류를 신규로 생합성하는 건강기능성 식품 개발에 관한 우수한 연구 결과가 나오리라 기대되고 있다(Dixon, Phytoestrogens, Annu. Rev. Plant Biol. 55:225-261, 2004).

이러한 생리활성을 갖는 이소플라본류의 섭취원으로서 가장 좋은 작물이 대두(Glycine max L.)이다. 대두에는 이소플라본류가 건조 중량 당 약 1.5∼2.5% 정도 함유되어 있으며, 이들 중 배당체의 일종인 다이드진(daidzin)과 제니스틴(genistin)이 전체 이소플라보노이드류의 60∼70%로 가장 많은 부분을 차지하고 있다. 이에 비하여 배당체보다 생리활성이 다양하고 높은 기능성을 갖는 어글리콘(aglycone) 형태의 화합물, 즉 다이드제인(daidzein) 및 제니스테인의 함량은 각각의 배당체의 약 10∼30 분의 1에 불과한 것으로 알려져 있다(Wang and Murphy, Isoflavone composition of America and Japanese soybeans in Iowa : Effects of variety, crop years and location. J. Agr. Food Chem. 42:1674-677, 1994).

이소플라본류의 식물체 내 생합성은 페닐프로파노이드 경로(phenylpropanoid pathway)의 일부 경로에서 이루어진다. 페닐프로파노이드 대사경로는 비콩과작물 뿐만 아니라, 콩과작물에서 나타나는 리그닌, 안토시아닌 및 많은 환경 스트레스에 대한 보호제로서의 기능을 하는 파이토알렉신류 화합물의 생성을 포함하는 다중 분지 경로이다(Dixon et al., The isoflavonoid phytoalexin pathway : from enzymes to genes to transcription factors. Physiol. Plant. 93: 385-392, 1995). 이 경로상의 효소들을 암호화하는 유전자군은 발달 단계 및 조직 특이적으로 조절되며, 양분 결핍, 저온, 병원균의 공격, 자외선 노출 등과 같은 각종 환경 스트레스에 의해 유도될 수 있다. 정상적인 경우 다이드제인 및 제니스테인과 같은 이소플라본 화합물은 말로닐 트랜스퍼라아제(malonyl transferase) 또는 글루코실 트랜스퍼라 아제(glucosyl transferase)와 같은 효소에 의해 수식되어 수송자의 작용으로 액포에 축적된다(Dixon and Paiva, Stress-induced phenylpropanoid metabolism. Plant Cell. 7:1085-1097, 1995). 이 경로 상에서의 유전자군은 Myb 유전자 집단(gene family)의 각각 다른 전사조절인자에 의해 발현이 조절되는 것으로 알려져 있다(Jin and Martin, Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family. Plant Mol. Biol. 41 : 577-585, 1999). 여기에 관여된 유전자군은 페닐알라닌 암모니아 라이아제(phenylalanine ammonia lyase; PAL), 칼콘 합성효소(chalcone synthase; c2), 칼콘 이성질화효소(chalcone isomerase; chi), 플라바논 3-수산화효소(flavanone 3-hydroxylase; f3h), 플라바논/다이히드로플라바놀 환원효소(flavanone/dihydroflavanol reductase; a1), 프로안토시아니딘 합성효소(proanthocyanidin synthase; a2), UDP-Glc:플라보노이드 3-O-글루코실트랜스퍼라아제(UDP-Glc:flavonoid 3-O-glucosyltransferase; bz1) 및 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(glutathione S-transferase; bz2) 이다.

특히, 이소플라본류의 생합성은 이소플라본 합성효소(isoflavone synthase; IFS)의 두 단계 반응에 의해 일어난다(Dixon, Phytoestrogens. Annu. Rev. Plant Biol. 55:225-261, 2004). 이소플라보노이드류는 플라보노이드 생합성 경로 상에서 분지를 형성하며, 식물에 일반적으로 존재하는 플라바논 중간생성물로부터 기원한다. 이소플라보노이드 생합성 경로로의 진입을 위해서는 우선 플라바논의 3번 탄소에 존재하는 수소 라디칼이 떨어지면서 2번 탄소에 연결된 B-고리(B-ring)가 3번 탄소 위치로 이동되고 C-2 라디칼은 수산화되면서 2-히드록시-이소플라바논으로 된 다. 이러한 반응은 NADPH와 산소분자를 필요로 하며, 마이크로솜의 사이토크롬(cytochrome) P450 효소(2-히드록시이소플라바논 합성효소(2-hydroxyisoflavanone synthase) 또는 2-HIS, 일반적으로 불리는 이소플라본 합성효소, 또는 IFS)가 촉매작용을 한다. 여기서 만들어진 2-히드록시이소플라바논은 매우 불안정하기 때문에 물 한 분자가 떨어지면서 나린게닌(naringenin)이나 리퀴리티게닌(liquiritigenin) [7,4'-다이히드록시플라바논]으로부터 제니스테인이나 다이드제인이 생합성된다.

이러한 IFS에 의해서 두 단계 반응 결과 생성된 이소플라본 어글리콘(isoflavone aglycone)은 고도의 기질 특이성을 가지고 O-메틸화(O-methlyation), 메틸렌다이옥시 브리지(methylenedioxy bridge) 형성 및 이소프레닐화(isoprenylation)와 같은 고리 변형(ring modification)이 일어남으로써 다양한 형태의 구조적 변이를 유도한다. 특히 정확한 기작이 밝혀지지는 않았으나, 알팔파(alfalfa)와 대두에서는 메디카르핀(medicarpin) 및 글리세올린(glyceollins)과 같은 피토알렉신(phytoalexin)류 화합물을 유도함으로써 병원성 미생물의 방어 작용에 관여하는 것으로 보고 되고 있다(Dixon, Isoflavonoids: biochemistry, molecular biology and biological functions. In Comprehensive Natural Products Chemistry, ed. U. Sankawa, pp. 773

823 Oxford : Elsevier, 1999).

이소플라본 제니스테인 생성을 위한 기질은 플라바논류, 플라본류, 플라보놀(flavonol)류, 프로안토시아닌(proanthocyanin)류 및 안토시아닌류를 포함하는 플라보노이드 생합성을 이끄는 페닐프로파노이드 대사경로 분지 상에서의 중간생성물인 나린게닌으로 대부분의 식물에 존재하는 효소인 칼콘 합성효소와 칼콘 이성질화 효소의 산물이다. 한편, 이소플라본 생합성에 필요한 또 다른 전구물질인 리퀴리티게닌은 다이드제인으로 전환되는데, 이는 콩과작물에 특이적으로 존재하며 칼콘 환원효소(CHR)의 활성이 필수적이다.

IFS의 활성에 관한 연구는 오래 전에 대두 마이크로솜에서 확인되었지만, 분자 수준에서의 연구는 IFS 자체가 갖는 불안정성과 기주특이성 때문에 수년 동안 분자적인 특성이 구명되지 못하다가, 대두 및 다른 콩과작물에서 IFS를 암호화하는 cDNA가 클로닝된 것은 3대 그룹에 의해 1999년에 이르러서야 가능하게 되었다 (Jung et al., Identification and expression of isoflavone synthase, the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes. Nat. Biotechnol. 18:208-212, 2000; Steel et al., Molecular characterization of the enzyme catalyzing the aryl migration reaction of isoflavonoid biosynthesis in soybean. Arch. Biochem. Biophys. 367 : 147-150, 1999; Akashi et al., Identification of a cytochrome P450 cDNA encoding (2S)-flavanone 2-hydroxylase of licorice (Glycyrrhiza echinata L.; Fabaceae) which represents licodione synthase and flavone synthase Ⅱ. FEBS Lett. 431: 287-290, 1998). 세 연구그룹에서 분리된 유전자들은 효모 또는 바큘로바이러스 시스템(baculovirus system)을 이용한 이종 발현(heterologous expression) 실험에서 IFS(CYP93C)를 암호화함을 확인하였다. 대두로부터 분리한 IFS 효소의 한 형태인 CYP93C1v2를 곤충 세포내에서 발현시켜 본 결과, NADPH의 존재시 리퀴리티게닌과 나린게닌을 각각 다이드제인과 제니스테인으로 전환시킴을 확인하였다(Steel et al., Molecular characterization of the enzyme catalyzing the aryl migration reaction of isoflavonoid biosynthesis in soybean. Arch. Biochem. Biophys. 367: 147-150, 1999). 그러나, 추정의 2-히드록시이소플라바논 중간생성물의 탈수반응이 식물의 효소상에서 일어나는 것인지, 아니면 곤충세포내의 마이크로솜에서 내인성 탈수효소(endogenous dehydratase) 활성에 의해 일어나는 것인지에 대해서는 명확하지 않았다.

한편, 감초(Glycyrrhiza echinata)와 대두로부터 분리한 IFS를 효모에서 발현시켰을 때 2-히드록시이소플라바논 중간생성물이 획득됨으로써 IFS의 기능이 밝혀졌다. 지금까지 IFS 유전자들은 11 종의 콩과식물 및 사탕무에서 4 가지 타입이 클로닝되어 있다(Jung et al., Identification and expression of isoflavone synthase, the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes. Nat. Biotechnol. 18, 208-212, 2000; Overkamp et al., Cloning and characterization of eight cytochrome P450 cDNAs from chickpea (Cicer arietinum L.) cell suspension cultures. Plant Sci. 155(1):101-108, 2000 ; Kim et al., Cloning and expression of the isoflavone synthase gene (IFS-Tp) from Trifolium pratense. Mol. Cells. 15(3):301-306, 2003).

IFS는 이소플라보노이드류의 생합성에서 진입 점(entry point) 효소이므로 대사공학기법을 이용하여 이소플라보노이드 생합성 경로를 가지고 있지 않은 비콩과 작물에 도입하고자 할 때의 주요(key) 효소라고 할 수 있다. IFS는 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 옥수수 및 담배에 도입되었고, 대두의 IFS를 발현시킨 애기장대에서는 어글리콘(aglycone) 형태의 제니스테인은 축적되지 않았다. 그러나, 이소플라본은 글루코오스-람노오스-제니스테인과 람노오스-제니스테인으로 전환되었고, 아직 제니스테인 글루코사이드는 밝혀지지 않았다. 제니스테인의 글리코실화(glycosylation) 양상은 A-고리 7-히드록실에서 일어나며, 플라보놀류의 경우는 3-위치에서 글리코실화되기는 하지만, 애기장대의 캠프페롤(kaempferol) 및 퀘르세틴(quercetin)과 같은 내재성 잎 플라보놀(endogenous leaf flavonol)의 양상과 유사한 것으로 추정된다. 아직 외래의 이소플라본과 내재된 플라보놀의 글리코실화와 관련하여 같은 글리코실 트랜스퍼라아제(glycosyl transferase)를 사용하는지에 관해서는 알려진 바 없다.

형질전환 애기장대에서 제니스테인 배당체의 생성량에 대해서는 IFS 활성에 따라 다른 것으로 보고되었으나, 기질 이용성, 기질 채널링(substrate channelling), 또는 생산물 턴오버(product turn over) 등에 의해서도 달라질 수 있을 것이다. 대두의 IFS를 발현하는 옥수수 BMS(black mexican sweet) 세포주의 세포배양에서 플라보노이드 생합성 대사경로의 과발현을 위하여 옥수수의 색소 집적과 관련된 전사인자인 C1 및 R 코딩 영역(CRC)을 동시 발현시켰을 때는 낮은 수준의 제니스테인이 생성되었지만, CRC 발현이 없을 때에는 제니스테인이 생성되지 않았다.

지금까지 주곡작물인 벼 및 벼과작물에서 이소플라본 생합성이 가능하다는 보고는 알려져 있지 않다. 특히, IFS 유전자를 주곡작물인 벼에 도입하여 성공한 사례는 아직 없으며, 이를 위하여 이소플라본의 기질이며 페닐프로파노이드계 대사경로 상에서의 중간대사산물인 플라바논류 화합물을 많이 함유하고 있는 유색벼에 도입하는데 착안하였다.

자연계에서 존재하지 않는 이소플라본 생합성 벼를 개발하기 위해서는 콩과작물에 특이적으로 존재하는 IFS 유전자를 분리하고, 이를 가식부위인 종자에 특이적으로 집적시키기 위하여 종자특이발현 프로모터를 연결한 후 이소플라본 전구물질이 존재하는 유색벼에 도입하여야 한다. 이렇게 이소플라본의 전구물질인 플라바논류 화합물이 많이 들어 있는 유색벼를 대상으로 IFS 유전자를 도입한다면, IFS 단일 유전자의 도입만으로도 이소플라본 제니스테인의 생합성 및 축적을 통한 건강기능성의 증진을 기대해 볼 수 있을 것이다.

그러나, 벼의 형질전환을 위해서는 주로 현미배양에서 배 또는 배반조직으로부터 유래된 캘러스 조직을 이용하며 이러한 캘러스로부터 식물체가 재분화되는 데에는 배지조성이나 배양환경의 영향에서부터 모식물의 유전자형의 차이까지 여러 가지 요인에 의해 제한받는 것으로 알려져 있다(Henry et al., Genetic analysis of in vitro plant tissue culture responses and regeneration capacities. Euphytica79 : 45-58, 1994). 그러므로, 조직배양 효율이 높으면서 이소플라본의 전구물질 함량이 많은 유색벼의 품종을 선발하는 것이 이소플라본 생합성 기능성 벼 개발을 위한 필수적인 과정이라 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 IFS1 유전자의 중요성에 주목하여 종래 알려져 있지 않은 신규 기술 과제를 해결하기 위해서 이소플라본 전구물질을 많이 함유하고 있으 면서 유전자의 도입이 쉬운 유색벼 품종의 선정, 벼 형질전환용 유전자 도입 벡터에 대한 제작을 연구한 결과, 이소플라본 생합성 유전자를 콩으로부터 분리하여 종자특이발현 프로모터에 연결한 뒤 이소플라본 전구물질이 많이 존재하면서 조직배양 효율이 높은 유색벼에 도입하여 벼에는 존재하지 않던 새로운 기능성 물질인 이소플라본을 생합성시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 콩 유래의 이소플라본 생합성 유전자에 종자특이발현 프로모터를 연결하여 도입한 형질전환 벼 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 항암·항산화 및 항골다공증 기능을 갖는 이소플라본의 건강기능성 성분으로서의 중요성에 주목하고, 콩과작물에 특이적으로 존재하는 천연물인 이소플라본을 유전자 조작 기술에 의해 세계 인구의 1/3 이상이 주식으로 이용하는 벼에 도입함으로써 이소플라본 생합성 기능이 도입된 형질전환 벼 및 그 제조방법을 제공한다.

본 발명의 벼과식물에는 이소플라본 생합성 효소 단백질을 암호화하는 유전자가 도입되어 있으며 이 구성에 의해 항암·항산화성 이소플라본이 생합성되는 벼과식물을 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 벼과식물로부터 수확된 성숙 종자, 특히 벼의 종자는 복수 세대에 걸쳐 이소플라본 생합성 능력을 유지할 수 있는 가능성을 가지는 것이 특징이다.

또한 본 발명은 벼 및 벼과 식물을 대상으로 하며, 벼과 식물에 속하는 식물 이면 특별히 제한은 없다. 벼과 식물에 속하는 식물의 예로서는 벼, 옥수수, 밀 등이 있다. 본 발명은 특히 벼에, 그 중에서도 유색벼에 보다 더 적합하게 적용시킬 수 있다.

서열번호 1은 신팔달2호 콩으로부터 분리한 이소플라본 생합성 유전자(IFS1) 오픈 리딩 프레임의 염기 서열이다. 서열번호 2는 상기 서열번호 1의 유전자에서 인트론을 제외한 부분을 표시한 것이다. 서열번호 3은 신팔달2호 콩으로부터 분리한 이소플라본 생합성 유전자(IFS1) 오픈 리딩 프레임으로부터 추론된 아미노산 서열이다.

본 발명에서는 신팔달2호 콩의 IFS1 유전자(서열번호 1)를 벼과 식물에 도입하였으며, 본 발명에서 사용하는 벡터는 서열번호 1의 IFS1 유전자에 벼 종자특이발현 유전자 프로모터가 연결된 유전자가 혼입되어 있으며, 그 구조를 도 1에 도시하였다.

본 발명에 의한 형질전환 벼과식물은 하기 방법에 의해 얻을 수 있다:

1) 성숙한 유색벼 종자의 왕겨를 박리한 다음 70% 에탄올로 5∼10 분간 및 3% 차아염소산나트륨으로 0.2∼1 시간 살균한 후 멸균수로 3회 이상 세정하고 NB 배지에서 23∼26℃의 암조건에서 3∼5일간 배양하여 캘러스를 준비하는 단계;

2) 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여 도 1에 도시된 벡터를 상기 캘러스에 도입하는 단계;

3) 선발마커인 하이그로마이신 B(Hygromycin B) 50 mg/l가 포함된 NB 배지에서 2∼4주 배양하면서 갈변되지 않고 증식하는 캘러스를 선발하는 단계; 및

4) 증식시킨 캘러스로부터 식물체를 재분화시키는 단계;

를 포함한다.

이러한 방법으로 제조된 형질전환 벼과 식물로부터 수확된 성숙 종자, 특히 벼의 종자는 복수 세대에 걸쳐 이소플라본 생합성 능력을 유지해 간다. 또한 상기의 형질전환 벼과 식물과 교잡(cross)하여 얻어진 벼과 식물에서도 이소플라본 생합성 능력이 유지될 수 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물 및 그 제조 방법을 실현하는 예를, 벼를 대표적인 예로 들어 하기 순서에 따라 상세히 설명한다. 하기에 설명하는 순서는 벼 이외의 벼과 식물에도 각종 조건을 그대로 또는 변경하여 적용할 수 있다.

[실시예 1] 벡터 제작

< 유전자의 클로닝 >

콩 유묘(soybean seedling)로부터 이소플라본 생합성 유전자 특이 프라이머를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하였다. 이 게놈 DNA에 벼 배유특이발현 유전자 프로모터(glb)를 연결하여 플라스미드로 이루어진 벡터에 연결하고, 이를 숙주 미생물(E. coli)에 도입하여 재조합 DNA를 제조하였다. 이 재조합 DNA가 도입된 형질전환체는 PCR에 의해 스크리닝하였다. 콩의 이소플라본 생합성 유전자의 서열은 이미 보고되어 있기 때문에(Park et al. Cloning and characterization of soybean IFS genes from Korean cultivar, Sinpaldalkong. J. Life Science 14(1); 38-44, 2004; Jung et al., Identification and expression of isoflavone synthase, the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes. Nat. Biotechnol. 18; 208-212, 2000), 이를 바탕으로 프라이머를 설계하고 PCR에 의해 스크리닝하여 목적으로 하는 형질전환체를 선별하였다. 얻어진 형질전환체로부터 목적하는 플라스미드를 단리하고, 필요하면 적당한 제한 효소로 절단하여 클로닝을 위한 플라스미드 벡터에 서브클로닝하였다.

<유전자 도입 벡터의 제작>

클로닝된 IFS1 유전자를 적당한 제한 효소로 잘라낸 후, 이를 도 1에 나타낸 바와 같이 pCAMBIA1301 벡터를 변형시킨 벼용 종자특이발현 프로모터 Glb 뒤에 연결하였다. 도 1에 있어서 RB는 우측 경계, Glb는 벼 종자특이발현 유전자의 프로모터, IFS1은 이소플라본 생합성 유전자, Nos는 노팔린(nopaline) 합성효소 유전자의 터미네이터, Hyg는 하이그로마이신 내성 유전자, LB는 좌측 경계(left border)를 각각 나타내고 있다. 또한 화살표는 유전자의 센스 방향을 나타내고 있다.

도 1은 RB-35S-GUS-Tnos-Glb-IFS1-Tnos-35S-Hyg-Tnos-LB의 순으로 배열된 벡터 (작제물)를 제작한 예를 나타낸 도면이다.

Glb 프로모터는 벼 종자 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터로서 잘 알려져 있다 (Pan and Reeck, Isolation and characterization of rice α-globulin, Cereal Chem. 65: 316-319, 1988). 또한 유전자가 혼입되는 방향은 센스방향으로 연결하였다. 그리고 유전자가 연결된 벡터는 전기천공법에 의해 아그로박테리움 투 메파시엔스 EHA 105 균주에 도입하였다. 작제물(도 1)이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스는 박토 펩톤(10 g/l), 박토 효모 추출물(10 g/l), 염화나트륨(5 g/l), 하이그로마이신 B(50 mg/l)를 포함하는 YEP 배지에 28℃에서 배양하여 증식시켰다. 유전자 도입은 작제물(도 1)이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼의 캘러스 세포에 감염시킴으로써 행하였다.

또한 작제물에는 HPT(하이그로마이신 내성) 유전자가 연결되어 있지만, 이것은 도입 유전자의 효과를 해석하는 기초 연구용으로서 형질전환된 세포 및 식물체를 효율적으로 선별하기 위한 것이므로 실제 이소플라본 생합성 벼를 개발할 경우에는 혼입시킬 필요가 없다.

[시험예 1] 이소플라본 전구물질 고함유 유색벼 품종 선발

안토시아닌 생합성 경로가 잘 발달되어 있으면서 도입할 유전자인 IFS1의 산물이 생성되기 위해서는 이소플라본 전구물질인 플라바논류 화합물, 나린게닌과 리퀴리티게닌의 함량이 높은 품종을 대사공학 재료로 선발하는 것이 필수적이다. 도 2는 유색벼 품종별 이소플라본의 전구물질인 플라바논류 화합물의 함량을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

[시험예 2] 조직배양 고효율 유색벼 품종 선발

유색벼의 경우 조직배양 효율이 품종에 따라 크게 영향을 받게 되므로, 유색벼 10개 품종을 대상으로 N6 대량원소(macroelement), B5 미량원소(microelement), B5 비타민, MS-Fe-EDTA, 300 mg/l CEH, 30g/l 수크로오스, 2mg/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 2 g/l의 겔라이트(Gelrite)를 포함한 pH 5.8 NB 배지에 현미를 치상하여 캘러스를 유기한 후, 호르몬이 첨가된 재분화배지(1/2 N6-염, B5 비타민, 2g/l CEH, 아미노산 용액 50ml (50×stock), 말토오스 40g, NAA 1mg, 카이네틴(Kinetin) 5mg/l)에서 식물체 재분화율을 조사하였다. 도 3은 유색벼 품종별 식물체 재분화율을 조사한 결과를 나타낸 도면이다.

이상의 분석을 통하여 IFS1 유전자 도입을 위한 형질전환 재료로서 적합한 유색벼 품종은 이소플라본의 전구물질인 플라바논 함량이 높고 안토시아닌 생합성 경로가 잘 발달되어 있으면서 조직배양이 잘 되는 밀양 188호인 것으로 판단되어 차후의 유색벼 형질전환 재료로 사용하게 되었다.

[실시예 2] 형질전환 벼의 제조

<유전자 도입용 벼 캘러스의 유도>

성숙한 벼 종자는 왕겨를 박리한 후 70% 에탄올로 10 분간, 3% 차아염소산 나트륨으로 1 시간 살균하였다. 살균 후 종자를 멸균수로 3회 이상 세정하고 NB 배지에 넣어, 25℃의 암조건에서 3 내지 5 주간 배양하였다.

<벼 캘러스로의 유전자 도입>

상기에서 유도한 벼 캘러스 중 직경이 1 내지 3 mm 정도의 것을 다시 NB 배지에 넣어 25℃의 암조건에서 3 내지 4일간 배양하였다. 이에 따라 캘러스 세포의 분열 활성을 높일 수 있었다. 유전자 도입은 배양된 캘러스와 YEP 배지에서 증식한 작제물이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 용액(균의 농도를 OD 660 nm로 측정하여 0.1이 되도록 희석한 것)을 혼합하여 감염시킴으로써 행하였다. 그 후 캘러스를 표면에 붙은 여분의 균을 수회 세정 살균하고, 멸균한 킴와이프스 타올 등으로 닦아 낸 후, 250 mg/l의 크라포란(cefotaxime), 50 mg/l의 하이그로마이신 B를 포함하는 NB 배지에 넣어 25℃의 암조건에서 1 주 간격으로 새 배지로 옮겨가면서 2 주간 배양하였다.

<형질전환된 캘러스의 선별과 식물체의 재분화>

그 후, 캘러스를 말토오스 40g/l, CEH 2g/l, 나프탈렌 아세트산 (NAA) 2 mg/l, 카이네틴(kinetin) 5 mg/l, 크라포란 250 mg/l, 하이그로마이신 B 50 mg/l, 겔라이트 4 g/l를 포함하는 pH 5.8의 N6 배지(재분화 유도 배지)에 옮겨 28℃의 명조건에서 5주간 배양하였다. 유전자가 도입된 캘러스는 그린 스폿(green spot)을 형성하였고, 거기에서 싹(shoot)과 뿌리가 분화되었다. pH 5.8의 N6 배지(식물체 형성 배지)에 분화된 유식물을 옮겨 28℃의 밝은 곳에서 수 주 동안 배양함으로써 식물체를 더욱 크게 생육시켰다.

<형질전환 벼 식물체의 생육과 종자형성>

재분화된 벼는 샤알레 안에서 약 4 내지 5 cm 정도의 크기가 되면 병 배지에 옮겨 조도 약 2만 룩스, 28℃ 정도의 명배양실 내에서 4∼5엽기까지 생육시켰다. 그 후, 유묘를 더욱 적절하게 비료를 가한 토양을 넣은 와그너 포트로 옮겨 온실 내에서 종자가 여물때까지 생육시켰다. 재분화된 당대의 식물체를 T₀ 세대, 이 식물체로부터 취할 수 있는 종자를 T₁ 세대로 가정하고, T₂ 내지 T₃ 세대까지 세대진전시켰다. 실제 농가에 보급하기까지는 많은 세대를 진전시켜 여러 가지 안전성 평가 시험을 거쳐 안전성을 확인한 후, 시장에 낼 필요가 있다.

<형질전환 벼로부터 IFS1 유전자 도입 확인 및 발현 분석>

형질전환 과정을 거쳐 선발배지 상에서 재분화된 유식물체를 대상으로 목표 유전자(IFS1)의 도입여부를 확인하기 위하여 IFS1 (1.7 kb) 유전자 특이적인 프라이머 쌍으로 서열번호 4의 정방향 프라이머인 5'-CACGATGTTGCTKGAACTTGCACT-3'와 서열번호 5의 역방향 프라이머인 5'-GTATATGATGATTACCTTAATTAAGAAAGGAG-3'을 이용하여 PCR을 수행한 결과 [Taq DNA 폴리머라아제 반응 완충액(50 mM KCl; 10 mM 트리스-HCl, pH 9.0; 1.5 mM MgCl₂; 0.01% 젤라틴; 0.1% 트리톤 X-100)에 0.2 mM dNTP mix, 100 pmol 센스 및 안티센스 프라이머, 100 ng 템플레이트 DNA 및 2유닛 Taq DNA 폴리머라아제(Takara)를 첨가하고, 반응은 i 사이클러(Cycler; Bio-Rad, U.S.A.)에서 35 사이클을 실시하였으며, 1 사이클은 변성(denaturation)을 98℃에서 30초간, 어닐링(annealing)을 55℃에서 30초간 그리고 확장(extension)을 72℃에서 1분간 실시하였다], 형질전환 식물체에서는 플라스미드와 같이 유전자 특이적인 DNA 단편이 증폭되었으나, 야생형(wild type) 식물체에서는 예상크기의 DNA가 증폭되지 않았다(도 4). 이는 신팔달2호콩에서 유래한 이소플라본 생합성 유전자가 유색벼인 밀양 188호의 게놈에 도입되었음을 추정할 수 있는 결과이다.

PCR 분석에 의해 유전자 도입이 확인된 T₀ 형질전환 식물체로부터 채종한 후 종자량이 충분한 계통을 기준으로 T₁ 세대의 종자를 선발하여 50 mg/L 하이그로마이신(hygromycin)이 포함된 MS 선발 배지 상에서 발아율을 분석한 후, 분리비가 3:1을 나타내는 계통을 선발하였다. 다음으로 형질전환 후대개체에서의 도입 유전자 발현 여부를 확인하기 위하여 개화 후 15일에서 25일 사이의 미숙종자로부터 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA의 분리는 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate; GTC) 법으로 실시하였다. 식물조직 1 g에 액체질소 200ml를 이용하여 유발과 유봉으로 파쇄한 다음, 4 ml의 GTC 추출 완충액(4.2 M GTC; 0.5% Na-라우릴 사르코시네이트(lauryl sarcosinate); 25 mM Na-시트레이트; 0.1% 안티폼(antiform) A 에멀젼)와 50 ㎕의 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 및 400 ㎕의 3 M Na-아세테이트(pH 5.2)를 첨가하여 완전히 혼합하였다. 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(isoamylalcohol) 추출을 5회 이상 실시하였다. 상층을 회수하여 2 부피(volume)의 에탄올을 첨가하여 혼합한 후, 15,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 침전물을 1 ml의 멸균수에 완전히 녹인 다음, 250 ㎕의 10 M LiCl을 첨가하여, 얼음에 30분간 정치하였다. 15,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 침전물을 회수하여 70% 에탄올로 2회 세정하고, 실온에서 건조한 후 DEPC 처리한 멸균수에 녹였다. 총 RNA를 이용한 RT-PCR 분석을 위하여 역전사 시스템(Promega #A3500)을 사용하였으며 분석조건은 다음과 같다. 역전사 반응을 위하여 1x 역전사 완충액(10mM 트리스-HCl [pH 9.0, 25℃], 50mM KCl, 0.1% 트리톤®X-100)에 5mM MgCl₂, 1mM 각각의 dNTP, 1u/μl 재조합 RNasin® 리보뉴클리아제(Ribonuclease) 억제제, 15u/㎍ AMV 역전사효소(High Conc.), 0.5㎍ 올리고(dT)15 프라이머 또는 랜덤 프라이머/㎍ RNA, 50ng/μl 총 RNA를 첨가하였으며, 반응은 42℃에서 30분, 92℃에서 5분, 4℃에서 5분 조건으로 cDNA를 합성한 다음, 합성된 cDNA를 1:5의 비율로 희석하여 PCR을 실시하였다[<10ng/μl 첫 번째 가닥 cDNA 반응, 200μM dNTPs, 2mM MgCl₂(첫 번째 가닥 cDNA 반응으로부터 기여), 1x 역전사 완충액(10mM 트리스-HCl [pH 9.0, 25℃], 50mM KCl, 0.1% 트리톤®X-100)]. 반응은 i 사이클러(Bio-Rad, U.S.A.)에서 40 사이클을 실시하였고, 1 사이클은 변성을 94℃에서 30초간, 어닐링을 55℃에서 1분간 그리고 확장을 72℃에서 2분간으로 하여 수행하였다. 그 결과 형질전환 식물체에서 예상크기의 cDNA 단편이 증폭되었으나, 야생형(wild type) 식물체에서는 증폭되지 않았다(도 5). 이는 신팔달2호 콩에서 유래한 이소플라본 생합성 유전자가 유색벼인 밀양 188호의 미숙종자에서 안정적으로 발현하고 있음을 추정할 수 있는 결과이다. 도 5는 T₂세대의 미숙종자에서 도입된 IFS1 유전자의 발현을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석 예를 나타낸 도면이다.

[시험예 3] 형질전환 벼로부터의 이소플라본 추출과 정성 분석

이소플라본은 T₂ 세대의 형질전환 벼 종자로부터 추출하였다. 형질전환 유색벼 종자를 마쇄한 후 1g을 평량하여 뚜껑이 있는 병에 넣고, 1 N-HCl 10 ml을 첨가하고 마개를 닫은 다음 알루미늄 호일로 밀봉하여 105℃에서 180 분 동안 산-가수분해 반응시켜 배당체를 분해시켰다. 방냉 후 15 ml의 메탄올을 첨가하여 진탕하면서 방치한 다음 여과지로 여과 후 여액 1 ml을 취하고 메탄올 1 ml을 첨가하면 80% 메탄올 용액에 용해한 결과가 되며 막 여과기(membrane filter)로 여과하여 HPLC (Model Agilent 1100) 분석에 이용하였다. HPLC 분석 조건으로는 컬럼은 Merck (12.5 cm, ODs)를 이용하였고 용매로는 물과 메탄올을 60:40 (v/v)으로 이용하였으며, 1.0 ml/min 유속으로 40 ㎕를 주입하고 UV 254 nm 파장에서 측정하였다. 제니스테인의 피크는 표준품의 UV 스펙트럼, 잔존시간(retention time)을 기준으로 추정하였다.

한편, 형질전환 유색벼의 종자에서 생합성된 이소플라본 제니스테인의 분자량 확인을 위하여 HPLC/MS 분석을 실시하였다. 기종은 Waters LC/MS ZQ2000을 이용하였으며, 용매는 0.1% 포름산을 아세토니트릴과 증류수와 각각 혼합하여 70:30의 비율로 분당 0.3ml씩 기울기(gradient) 조건으로 하였고 시료의 주입은 20 ㎕로 하였다. 이온화모드는 전자 분무(electron spray)법으로 양성 이온화하였고, 원료 온도(source temperature)는 150℃, 가열 가스(heating gas)의 온도는 350℃로 두었으며, 증폭시의 전압은 650 V로 하여 제니스테인에 해당되는 270.9 m/z 값을 갖는 이온을 모니터링 하였다. 제니스테인의 확인은 표준품의 UV 스펙트럼, 잔존 시간과 m/z 값을 기준으로 동정하였다.

도 6(상)은 제니스테인 표준품을, 도 6(중)은 이소플라본 생합성 유전자가 혼입되지 않은 대조군을, 도 6(하)는 유전자를 도입한 재조합 벼에서의 이소플라본 제니스테인이 생합성된 결과를 나타낸 HPLC 분석 결과이며, 도 7(상)은 제니스테인 표준품의 m/z값을, 도 7(하)는 형질전환 벼의 종자에서 이소플라본 제니스테인에 해당하는 피크(peak)의 m/z 값을 나타낸 그림으로 두 물질이 일치함을 보여줌으로써 이소플라본 생합성 유전자 형질전환 벼에서 이소플라본이 생합성 되었음을 확인할 수 있었다.

<이소플라본 생합성 형질전환 벼의 동종접합 계통 선발 및 실물사진>

형질전환 식물체에 있어 도입된 유전자의 발현과 생화학적 수준에서의 이소플라본 축적을 통한 새로운 기능성 생물 자원의 창출을 위해서는 안정적인 재료의 공급과 균일화된 재료식물의 창출이 중요하며, 후대세대의 조기 고정을 위해서는 동종접합 계통의 선발이 중요하다. 도 8은 T₂ 세대 종자를 대상으로 PCR 분석을 통하여 선발한 동종접합 계통의 실물사진이다.

본 발명에 의해 제조된 벼는 유전자변형작물에 대한 안전성평가 등 상세한 분석을 거쳐 품종으로 보급될 경우 항암·항산화성 이소플라본을 주식인 쌀을 통해 섭취하게 됨으로써 국민건강 증진에 크게 기여할 수 있다.

본 발명에 의해서 이소플라본 생합성 벼의 제조가 가능해졌으며, 본 발명의 방법에 의해 제조된 벼는 항암·항산화성 이소플라본을 함유하고 있기 때문에 건강기능성 성분이 강화된 벼가 만들어 질 수 있게 되었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 콩 유래 이소플라본 합성효소(isoflavone synthase) 유전자에 배유특이발현 프로모터인 글로불린 프로모터가 연결되어 있는 도 1에 도시된 구조를 가지는 벡터.
제 1항에 의한 벡터를 캘러스에 도입하여 제조한 형질전환 벼.
1) 성숙한 유색벼 종자의 왕겨를 박리한 다음 70% 에탄올로 5∼10 분간 및 3% 차아염소산나트륨으로 0.2∼1 시간 살균한 후 멸균수로 3회 이상 세정하고 NB(nutrient broth) 배지에서 23∼26℃의 암조건에서 3∼5일간 배양하여 캘러스를 준비하는 단계;

2) 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여 도 1에 도시된 벡터를 상기 캘러스에 도입하는 단계;

3) 선발마커인 하이그로마이신 B(Hygromycin B) 50 mg/l가 포함된 NB(nutrient broth) 배지에서 2∼4주 배양하면서 갈변되지 않고 증식하는 캘러스를 선발하는 단계; 및

4) 증식시킨 캘러스로부터 식물체를 재분화시키는 단계;

를 포함하는 형질전환 벼의 제조방법.
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