CN113832176B

CN113832176B - 一种单细胞遗传转化方法及其应用

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Publication number: CN113832176B
Application number: CN202010586132.2A
Authority: CN
Inventors: 李来庚; 曹树民; 桂金山
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2040-06-24
Also published as: CN113832176A

Abstract

本发明涉及一种单细胞遗传转化方法及其应用。本发明人提供了优化的方法以制备木本植物悬浮细胞，所述悬浮细胞具有再生分化能力强、目的基因转化率高等特点。本发明还基于该悬浮细胞建立了高效遗传转化系统。本发明的方法和系统有利于实现高通量且高效的目的基因转化、编辑操作。

Description

一种单细胞遗传转化方法及其应用

技术领域

本发明属于植物学和分子生物学领域，更具体地，本发明涉及一种单细胞遗传转化方法及其应用。

背景技术

木本植物如杨树等转基因遗传操作主要采用农杆菌介导的叶盘转化法(如Fillatti，J.J.等，Molecular&General Genetics 206，192-199；Movahedi，A等(2014)，Anefficient Agrobacterium-mediated transformation system for poplar.Int J MolSci 15，10780-10793)。叶盘法的做法一般是利用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养，更具体的步骤例如：先将实验材料的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘；为了对叶盘进行接种处理，将它放在土壤农杆菌培养液中浸泡4～5min，然后用滤纸吸干，放在看护培养基上进行培养；叶盘在看护培养基上培养两天后，转移到含有适当抗生素的选择培养基上进行培养；经过数周后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化出幼苗；对这些幼苗的进一步检测可以确定它们是否含外源基因以及外源基因的表达情况。

叶盘转化法对转化叶片要求很高(因为不同部位叶片遗传转化效率存在很大差别)，单棵苗中可用于转化的叶片有限。同时，叶片切割及伤处理费时费力，从而限制规模化遗传转化工作的开展。近年来，利用植物悬浮细胞进行植物生理、生化和遗传修饰以及寄主和寄生物的相互作用的研究日益增多，遗传育种工作者们还把悬浮单细胞用于诱变、筛选和创造新类型的研究。尽管前人在杨树悬浮细胞诱导、遗传转化体系建立方面开展了一些工作，但是其悬浮细胞均来自于愈伤组织再培养，产生的悬浮细胞系易结块形成新的愈伤组织，影响细胞培养和转化。直接用叶片组织大量制备悬浮单细胞国内外报道很少。分离少数草木植物细胞和原生质体所采用的酶解法不能直接用于木本植物，酶解法分离的细胞或是破碎的，或是完全不能分离出来；用机械研磨法分离，所得完整单细胞数量很少，而且难以纯化，没有实用意义。

因此，建立木本植物如杨树的高效、稳定的悬浮细胞诱导和遗传转化体系是林木基础研究和林业产业发展的重要技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单细胞遗传转化方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种单细胞遗传转化方法，包括：

(1)从木本植物的组织获取悬浮细胞，包括将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，获得悬浮细胞；

(2)将步骤(1)的悬浮细胞与含有待遗传转化目的基因的转化菌混合培养，之后除去转化菌；

(3)继续培养步骤(2)的悬浮细胞，筛选发生重组转化的细胞。

在一个优选例中，所述遗传转化包括：将外源的目的基因转化入植物中。

在另一优选例中，(1)中，所述的持续光照条件为：每天光照超过20小时；较佳地超过22小时，如每天24小时光照。

在另一优选例中，(1)中，光照强度1000～3000Lux；较佳地1500～2500Lux；更佳地1800～2200Lux。

在另一优选例中，(1)中，在含有生长素或生长素类似物的MS培养基中培养；较佳地，所述的生长素或生长素类似物包括：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。

在另一优选例中，所述的2,4-二氯苯氧乙酸在培养基中的浓度为1.8～2.8mg/L；较佳地2～2.7mg/L；更佳地2.4～2.6mg/L。

在另一优选例中，(1)中，所述悬浮细胞为细胞内有红色物质沉淀的细胞；较佳地，所述悬浮细胞为椭圆状细胞或球状细胞；较佳地，所述细胞分化程度较低，活性强。

在另一优选例中，(1)中，所述植物组织为植物叶片，或，所述植物组织块为植物叶片剪成的块状组织。

在另一优选例中，(1)中，所述的植物为苗期植物；或所述的植物组织为苗期植物第3～5片叶片。

在另一优选例中，(1)中，所述的植物组织为无菌的植物组织。

在另一优选例中，(1)中，培养温度为25±2℃(较佳地25±1℃)；

在另一优选例中，(1)中，所述振荡培养为在120±50r/min振荡培养，较佳地在120±20r/min振荡培养。

在另一优选例中，(1)中，将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，当细胞规模生长后(较佳地，生长至5～12天后，如生长至6，7，8，9，10天后)，去除大的组织团块及细胞团(较佳地以200目细胞筛滤除)。

在另一优选例中，(1)中，当细胞生长至粘稠或对数期时，进行稀释；较佳地稀释2～8倍(如3～6倍)。

在另一优选例中，(1)中，每4～8天进行继代培养；较佳地每5±1天进行继代培养。

在另一优选例中，所述的当细胞生长至粘稠或对数期时，为细胞绝大多数或全部为球状并变红时。

在另一优选例中，培养基中添加蔗糖；较佳地蔗糖为20±5g/L(更佳地为20±3g/L或为20±2g/L)。

在另一优选例中，所述培养基的pH为5.8±0.3(较佳地为5.8±0.2；更佳地为5.8±0.1)。

在另一优选例中，(2)中，所述转化菌包括：农杆菌。

在另一优选例中，(2)中，所述悬浮细胞与转化菌混合培养的时间为5～20分钟；较佳地为10±3分钟(更佳地为10±2分钟，进一步更佳地为10±1分钟)。

在另一优选例中，所述悬浮细胞与转化菌混合培养为振荡培养。

在另一优选例中，(2)中，所述转化菌中，含有的待遗传转化目的基因包括(但不限于)选自下组的基因：基因编辑用工具酶基因、基因编辑用向导基因(如向导RNA)、供体基因(如用作基因编辑时的供体)、miRNA、siRNA、shRNA、结构基因、报告基因、筛选基因、功能基因，或含有选自上述分子的构建体(包括表达载体)。

在另一优选例中，(3)中，先进行无抗生素的培养，之后进行抗性筛选，获得发生重组转化的细胞。

在另一优选例中，(3)中，利用添加或不添加抗生素的WPM培养基进行培养。

在另一优选例中，(3)中，还包括：培养发生重组转化的细胞，形成愈伤组织，进一步培养为植株；较佳地，对发生重组转化的细胞，每15天继代一次，获得愈伤组织；较佳地，获得愈伤组织后，进行芽诱导培养、分化出抗性芽，之后进行不定芽伸长培养，之后进行生根培养，获得幼苗(植株)。

在本发明的另一方面，提供一种获得活性悬浮细胞的方法，包括：从木本植物的组织获取悬浮细胞，包括将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，获得悬浮细胞。

在一个优选例中，所述的持续光照条件为：每天光照超过18小时；较佳地超过20小时；更佳地超过22小时，如每天24小时光照。

在另一优选例中，光照强度1000～3000Lux；较佳地1500～2500Lux；更佳地1800～2200Lux。

在另一优选例中，在含有生长素或生长素类似物的MS培养基中培养；较佳地，所述的生长素或生长素类似物包括：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。

在另一优选例中，所述悬浮细胞为胞质内有红色物质沉淀的细胞；较佳地，所述悬浮细胞为椭圆状细胞。

在另一优选例中，所述植物组织为植物叶片，或，所述植物组织块为植物叶片剪成的块状组织。

在另一优选例中，培养温度为25±2℃(较佳地25±1℃)。

在另一优选例中，所述振荡培养为在120±50r/min振荡培养，较佳地在120±20r/min振荡培养。

在另一优选例中，将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，当细胞规模生长后，去除大的组织团块及细胞团(较佳地以200目细胞筛滤除)。

在另一优选例中，当细胞生长至粘稠或对数期时，进行稀释；较佳地稀释2～8倍(如3～6倍)。

在另一优选例中，每4～8天进行继代培养；较佳地每5±1天进行继代培养。

在本发明的另一方面，提供前面所述的方法的用途，用于制备基因转化用的靶细胞；较佳地，所述基因转化包括基因编辑；较佳地，所述基因转化或基因编辑为高通量基因转化或高通量基因编辑。

在本发明的另一方面，提供一种分离的细胞或细胞系，其由所述的方法制备获得；较佳地，所述细胞为胞质内有红色物质沉淀的细胞；更佳地，所述悬浮细胞为椭圆状细胞或球状细胞。

在一个优选例中，所述的细胞或细胞系不包括植物品种。

在本发明的另一方面，提供一种进行基因编辑的方法，包括：

(a)利用所述的方法获得悬浮细胞；

(b)将(a)的悬浮细胞与含有待遗传转化目的基因的转化菌混合培养，之后除去转化菌；所述转化菌中，含有的待遗传转化目的基因包括选自下组的基因：基因编辑用工具酶基因、基因编辑用向导基因(如向导RNA)、供体基因(如用作基因编辑时的供体)；

(c)继续培养该悬浮细胞，筛选发生重组转化的细胞，所述的细胞为经基因编辑的细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、杨树无菌苗叶片悬浮细胞诱导过程。(a)用于诱导悬浮细胞的杨树无菌苗培养；(b)用于诱导悬浮细胞的杨树无菌苗叶片选取；(c)用于诱导悬浮细胞的杨树无菌苗叶片切块；(d)杨树无菌苗叶片切块置于悬浮培养基中培养；(e)杨树无菌苗叶片切块诱导出悬浮细胞；(f)分选出的优质悬浮细胞系再培养。图中bar＝0.5cm。

图2(a)～(h)、设计不同的光照周期条件，将通过对叶片诱导产生的悬浮细胞进行不同光照周期的振荡悬浮培养，观察其细胞形态。

图3、不同形态的悬浮细胞活力测定。(a)球状悬浮细胞形态观察；(b)纺锤状悬浮细胞形态观察；(c)持续光照悬浮细胞FDA细胞活力染色；(d)暗培养培养悬浮细胞FDA细胞活力染色；(e)不同颜色悬浮细胞活力统计。

图4、悬浮细胞生长曲线。悬浮细胞系培养不同时间后测定细胞鲜重，以细胞鲜重绘制悬浮细胞生长曲线。

图5、不同侵染时间对悬浮细胞诱导芽分化的影响。(a)悬浮细胞农杆菌侵染5分钟，芽分化阶段形态；(b)悬浮细胞农杆菌侵染10分钟，芽分化阶段形态；(c)悬浮细胞农杆菌侵染15分钟，芽分化阶段形态。

图6(a)～(k)、悬浮细胞遗传转化再生体系的建立。

图7、杨树悬浮细胞CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立。(a)杨树TMM基因编辑靶位点位置示意图；(b)杨树TMM基因胞外域氨基酸序列，蓝色部分(序列第3行的阴影部分)为gRNA靶点所在位置，红色部分(序列第8-9行阴影部分)为跨膜区域；(c)转基因阳性率和编辑率统计；(d)杨树TMM基因编辑突变体与野生型比较。野生型(左)，突变体(中、右)。

图8、杨树TMM基因CRISPR/Cas9基因编辑位点及编辑类型统计。(a-e)杨树TMM基因编辑靶位点突变类型测序鉴定；(f)杨树TMM基因编辑靶位点突变类型及其效率统计。

图9、悬浮细胞CRISPR/Cas9多基因编辑的建立。(a)木质部中显著地高表达的部分RLKs的筛选；(b)载体构建示意图；(c)突变体植株表型。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，建立了一种基于木本植物悬浮细胞的高效遗传转化系统，包括利用优化的方法获得悬浮细胞，进行目的基因(外源基因)的转化，以及收获转化体。本发明的技术方案可以获得具有高活性(包括再生分化能力强，目的基因转化率高等)的悬浮细胞，有利于实现高通量的目的基因转化、目的基因编辑操作。

悬浮细胞的制备及应用

本发明中，建立了利用木本植物外植体直接诱导优质悬浮细胞系的方法，本发明人考虑了外植体选择、悬浮细胞诱导与悬浮细胞系建立、转化菌侵染、悬浮细胞植株再生及激素浓度、培养条件、侵染时间等方面，在此基础上对于一些关键性条件加以优化。本发明以木本植物叶片直接悬浮培养诱导产生悬浮细胞，并对悬浮细胞进行过筛分选出生长迅速且细胞状态均一性好的优质细胞系，并以该悬浮细胞系为受体开展农杆菌介导的遗传转化，建立了便捷、高效的遗传转化系统，为植物遗传操作提供了一种新途径。本发明克服了传统愈伤组织生产悬浮细胞存在细胞成团结块、再生分化能力差、转化效率低、转化周期长等问题。

本发明的制备悬浮细胞的方法，包括：从木本植物的组织获取悬浮细胞，包括将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，获得悬浮细胞。

本发明中，所述的“木本植物”指根和茎因增粗生长形成大量的木质部、而细胞壁也多数木质化的坚固的植物。例如，所述的“木本植物”可以是：杨柳科(Salicaceae)、桑科(Moraceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、(Selaginellaceae)、银杏科(Ginkgoaceae)、松科(Pinaceae)、苏铁科(Cycadaceae)、天南星科(Araceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、悬铃木科(Platanaceae)、榆科(Ulmaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、桦科(Betulaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、椴树科(Tiliaceae)、柽柳科(Tamaricaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、景天科(Crassulaceae)、苏木科(Caesalpinaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、石榴科(Punicaceae)、珙桐科(Nyssaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、八角枫科(Alangiaceae)、卫矛科(Celastraceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、黄杨科(Buxaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、小盘木科(Pandaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、漆树科(Anacardiaceae)，橄榄科(Burseraceae)、桔梗科(Campanulaceae)、红树科(Rhizophoraceae)、檀香科(Santalaceae)、木犀科(Oleaceae)或玄参科(Scrophulariaceae)的植物。作为本发明的优选方式，所述的木本植物是指杨柳科(如杨属，更特别如杨树)或桑科(如构树属，更特别如光叶楮)、桃金娘科(如桉属，更特别如桉树)的木本植物。

本发明的方法所用的起始材料为植物的外植体，较佳地所述植物外植体来自植物的叶片，更佳地为植物叶片剪成的块状组织。所述的植物较佳地为苗期植物。在特别优选的方式中，所述的植物组织为苗期植物第3～5片叶片。用于本发明的方法时，所述的植物组织为无菌的植物组织。

以往在利用植物外植体获取细胞时，人们一般采取暗培养的方式。然而，本发明人较为意外地发现，将木本植物的组织置于培养基后，在持续光照条件下进行培养，可以获得活性更为理想的细胞，该细胞再生分化能力强，目的基因转化率高，有利于高通量的重组操作。

所述的“持续光照”，包括全天处于光照条件下的情形，也包括全天绝大多数或大多数时间处于光照条件下的情形。在本发明的优选方式中，所述的持续光照条件为：每天光照超过18小时；较佳地超过20小时；更佳地超过22小时，如每天24小时光照。

在本发明的优选方式中，所述的光照条件，是光照强度在1000～3000Lux；较佳地1500～2500Lux；更佳地1800～2200Lux的条件。

所述的植物外植体为来自于植物的特定组织，本发明中优选地将所述外植体职称较小的组织块，以利于获得细胞。所述的组织块被置于培养基中培养。所运用的基础培养基为本领域用于培养植物外植体或植物细胞的基础培养基，例如可以选自：MS培养基、改良MS培养基或改良1/2MS培养基等。所述的MS培养基、改良MS培养基或改良1/2MS培养基可以自行配制或商购获得。应理解，在这些基础培养基基础上作适当改良(例如部分大量或微量成分的微调或替换)、但保留其作为基础培养基功能的培养基也被包含在本发明中。作为本发明的优选方式，以MS培养基为基础培养基。用于本发明的方法时，所述的培养基为经灭菌的培养基。

作为本发明的优选方式，本发明所运用的培养悬浮细胞的培养基中，还添加生长素或生长素类似物；较佳地，所述的生长素或生长素类似物包括：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等。本发明人发现，2,4-D能够有效地促进悬浮细胞的产生，且有利于获得所需的高活性悬浮细胞。尽管其它的浓度也是可以运用的，但在本发明的更为优选的实施方式中，所述的2,4-D在培养基中的浓度为1.8～2.8mg/L；较佳地2～2.7mg/L；更佳地2.3～2.6mg/L。根据本发明的实施例的研究结果显示，在所述优选的2,4-D的浓度范围内，诱导细胞出现时间最快，细胞平均增长量也最快，分裂能力最强。

培养所述悬浮细胞时，所运用的培养温度可以根据所述木本植物的种类及其适合的温度来确定，在本发明中没有特别的限制。在本发明的优选方式中，培养所述悬浮细胞时，培养温度为25±2℃；较佳地25±1℃。

所述振荡培养为在120±50r/min振荡培养，较佳地在120±20r/min振荡培养。

在本发明的优选方式中，将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，当细胞生长至一定浓度后，去除大的组织团块及细胞团。可以运用本领域已知的方法来进行这种分选，较佳地以200目细胞筛滤除大的组织团块及细胞团，保留小团块或单个细胞。在本发明的进一步的优选方式中，当细胞生长至粘稠或对数期时，进行稀释，以避免生长受限；较佳地稀释2～8倍，如3～6倍。所述的当细胞生长至粘稠或对数期时，一般可以根据细胞的颜色来判断；也即，当细胞绝大多数(如70％以上，80％以上，90％以上，95％以上)或全部变红时，可以判断为适合于进行稀释的时候。

在本发明的优选方式中，培养所述细胞时，每4～8天进行继代培养；较佳地每5±1天进行继代培养，获得均一稳定且状态良好的悬浮细胞。

利用本发明的方法，优选地所述悬浮细胞为胞质内有红色物质沉淀的细胞；优选地所述悬浮细胞为椭圆状细胞或球状细胞，本发明人建立的悬浮细胞系具有细胞分散度高、细胞分裂能力强、转化效率高等特点，可提高多基因编辑的效率。本发明的方法克服了现有技术中细胞成团结块、再生分化能力差、转化效率低、转化周期长等问题，从而可解决现有技术中木本植物如杨树遗传转体系无法规模化操作的技术瓶颈。

基于本发明人的新发现，本发明还包括一种分离的细胞或细胞系，其由本发明的上述方法制备获得。本发明的细胞或细胞系不具有植物品种的特征。

基于本发明人的新发现，本发明还包括一种培养物，其中包括本发明的方法所制备获得细胞。

基于本发明人的新发现，本发明还包括一种试剂盒，其中包括本发明的方法所制备获得细胞；或者，其中包括本发明的培养物。作为本发明的优选方式，所述试剂盒中还包括一些植物培育用的基础培养基，包括：MS培养基、改良MS培养基或改良1/2MS培养基。此外，所述试剂盒中还包括使用说明书，其中描述了各个培养基的使用方法，或还描述了使用培养基之前或之后对于植物或植物组织的处理方法，从而有利于指导本领域技术人员以恰当的方法使用该试剂盒。

单细胞遗传转化

本发明前述方法获得的悬浮细胞，可被应用于进行遗传转化，获得发生基因遗传改造的细胞。

进行遗传转化时，将本发明的悬浮细胞与转化菌相接触，从而将外源的目的基因转入到本发明的悬浮细胞中。所述的转化菌包括农杆菌或其它具有侵染功能的生物材料。

在本发明的优选方式中，所述悬浮细胞与转化菌混合培养的时间为5～20分钟；较佳地为10±3分钟，更佳地为10±2分钟，进一步更佳地为10±1分钟。较佳地，所述悬浮细胞与转化菌混合培养为振荡培养。

应用于本发明中的遗传转化目的基因没有特别的限制，可以选自本领域人员感兴趣的多种多样的基因。例如，所述的用于遗传转化的包括但不限于选自下组的基因：基因编辑用工具酶基因、基因编辑用向导基因(如向导RNA)、供体基因(如用作基因编辑时的供体)、miRNA、siRNA、shRNA、结构基因、报告基因、筛选基因、功能基因，或含有选自上述分子的构建体(包括表达载体)。

在本发明的优选方式中，在进行基因转化后，对细胞先进行无抗生素的培养，之后进行抗性筛选。

在本发明的优选方式中，对发生重组转化的细胞，每15天继代一次，获得愈伤组织。进一步地，获得愈伤组织后，进行芽诱导培养、分化出抗性芽，之后进行不定芽伸长培养，之后进行生根培养，获得幼苗(植株)。这些过程可以运用本领域中已知的一些芽诱导、抗性芽分化、不定芽培育以及诱导生根的技术来进行，而本发明人尤为优选的培育方法已被披露于本发明所提供的实施例中。

尽管CRISPR/Cas(包括Cas9)基因编辑技术给林木遗传改良带来革命性突破，但是现有基因编辑技术还是基于农杆菌介导的叶盘转化法，尚无基于悬浮细胞遗传转化体系的相关研究报道。本发明的方法可一次性获得大量的高活性悬浮细胞，且所述悬浮细胞均匀分散、细胞分裂能力强，尤其适合应用于大规模或高通量的基因编辑。因此，在建立木本植物悬浮细胞高效遗传转化系统的基础上，本发明人进一步建立了悬浮细胞CRISPR/Cas(包括Cas9)基因编辑技术体系。本发明为木本植物如杨树的遗传改良、新品种培育提供关键技术支撑。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明以杨树叶片为材料直接诱导生长迅速、细胞均一性好的优质悬浮细胞系，克服了传统方法通过愈伤组织生产的悬浮细胞易结块、再生分化能力差等问题。

(2)本发明建立的悬浮细胞系具有细胞分散度高、细胞分裂能力强，农杆菌介导的遗传转化效率高等特点。与现有的杨树转化方法相比更加便捷、高效，为杨树规模化遗传操作提供技术支撑。

(3)现有杨树基因编辑基于农杆菌介导的叶盘转化法，尚无基于悬浮细胞的基因编辑技术体系。本发明的悬浮细胞具有细胞分散度高、细胞分裂能力强、转化效率高等特点，可实现多基因高效编辑，为林木基因编辑突变体库创制奠定基础。因此，本发明建立的悬浮细胞CRISPR/Cas9基因编辑技术体系为杨树遗传改良、新品种培育提供关键技术支撑，为林木遗传改良带来革命性技术突破。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、杨树悬浮细胞的高效遗传转化方法

1、获取、杨树悬浮细胞

为了有效建立杨树悬浮细胞诱导体系，本发明人通过大量的技术分析和实验探索，确立了利用无菌叶片直接诱导悬浮细胞的诱导过程，该过程主要分为以下阶段：首先是杨树无菌苗的培养，紧接着对叶片进行剪切处理，放入液体培养基中振荡悬浮培养，直至诱导出悬浮细胞；待细胞出现至一定浓度后，进行细胞筛选分离即可(图1)。整个诱导周期不到20天。更具体地如下：

(1)取杂交杨(Populus×euramericana cv；“南林895(Nanlin895)”)无菌苗，在无菌操作下选择其第3～5片叶片剪成1cm×0.2cm左右的长方形，放入装有40mL MS附加2.5mg/L的2,4-D液体培养基的100mL三角瓶中，25℃、持续光照、120r/min振荡培养。其中，所有诱导悬浮细胞的MS液体培养基均添加20g/L蔗糖，且pH为5.8，121℃，灭菌15min。

(2)待细胞出现至一定浓度后，通过200目细胞筛，去掉大的组织团块及细胞团，将含有单细胞和小细胞团转移到无菌三角瓶，在持续光照条件下(光照强度为2000Lux)继续振荡培养。

(3)当细胞绝大多数或全部变红，将粘稠的、对数期的红色细胞用新的培养基稀释3～5倍，继续振荡培养，直至得到一定数量的均一稳定且状态良好的悬浮细胞。其中，所有继代用MS液体培养基均添加2.5mg/L 2,4-D，20g/L蔗糖，且pH为5.8，121℃，灭菌15min。每5天继代一次。

2、用于侵染的农杆菌的制备

(1)基于靶基因基因组序列，利用在线工具ZiFiT Ta rgeter Version 4.2(http://zifit.partners.org/zifit/choicemenu.aspx)查找潜在的Cas9靶点，根据靶点的位置和GC含量选择设计sgRNA。根据分析获得的靶点序列，体外合成表达sgRNA的DNA片段。载体系统包含了双元的植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-DN(获自华南农业大学刘耀光实验室)和sgRNA表达盒中间载体，前者以35S超表达Cas9，后者分别以AtU3b、AtU3d、AtU6-1和AtU6-29四个启动子分别驱动sgRNA的表达。载体构建采用Golden Gate Cloning方法。然后将CRISPR-Cas9质粒文库转化农杆菌获得大量的农杆菌菌落。

(2)从平板中挑取单菌落(含有待遗传转化目的基因的农杆菌)，接种到附加卡那霉素(Kanamycin)10mg/L的10mL YEB液体培养基中，28℃、220rmp振荡培养24h，之后做菌液PCR，确定菌液中含有目的基因。再取已经PCR检测的阳性菌液1mL转接到50mL含相应抗生素的YEB培养基中，培养12～18h左右至OD600值达到特定的浓度，菌液在5000rpm、4℃下离心10min收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体，用于侵染。

3、侵染及筛选转化子

基于建立的悬浮细胞诱导体系，本发明人创建了有效的遗传转化再生体系。该体系总共包括若干个步骤：先将细胞集聚物抽滤接入固体培养基上光照共培养两天。对共培养后的悬浮细胞成小团状转移至有抗生素的筛选培养基中光下培养，继代培养，期间部分悬浮细胞团聚物在抗生素的筛选下会出现褐色或黑色细胞死亡现象，直到白色愈伤组织长出。继代培养至分化出抗性芽，将抗性芽移入不定芽伸长筛选培养基中，继代培养。待芽伸长至一定长度，将芽分离独立接入至生根筛选培养基中直至长出根，移植到土中壮苗培养(图6)。更具体地如下：

(1)将1中悬浮培养状态良好的红色悬浮细胞离心弃上清液后置于预先制备好的菌液(2中含有用于侵染的菌体的菌液)中，震荡共培养10min，用高压蒸汽灭菌过的滤纸抽滤除去多余菌液，连同滤纸一起转入WPM(0.5mg L^-1kinetin，0.75mg L^-1 2-4D，无抗生素)培养基上光照共培养2d。

(2)对共培养后的悬浮细胞成小团状转入有抗生素的WPM(0.5mg L^-1kinetin，0.75mg L^-1 2-4D，50mg L^-1Kanamycin，100mg L^-1Ticarcillin，250mg L^-1Carbenicillin)培养基上培养，每15天继代一次，直到白色愈伤组织长出。

(3)将状态良好的愈伤转移至芽诱导筛选培养基(WPM 0.2mg L^-1thidiazuron，50mg L^-1Kanamycin，100mg L^-1Ticarcillin，250mg L^-1Carbenicillin)中光下培养，继代培养至分化出抗性芽。

(4)将抗性芽移入WPM(50mg L^-1Kanamycin，100mg L^-1Ticarcillin，250mg L^- ¹Carbenicillin)不定芽伸长筛选培养基中，继代培养。

(5)待芽伸长至一定长度，将芽分离独立接入至WPM(50mg L^-1Kanamycin，100mg L^-1Ticarcillin，250mg L^-1Carbenicillin)生根筛选培养基中直至长出根，移植到土中培养。

(6)转基因幼苗均种植于人工气候室，温度22℃；光照周期为16h光照，8h黑暗；湿度70±5％。

实施例2、悬浮细胞诱导及细胞活力测定

1、光照时间对悬浮细胞的影响

与现有悬浮细胞诱导不同，本发明人利用无菌叶片直接诱导悬浮细胞并在体系中引入持续光照条件。持续光照的好处在于能增强细胞活力，维持细胞形态。具体的，选取无菌苗第3～5片叶片剪成1cm×0.2cm左右的长方形，放入装有40mL MS附加2.5mg/L的2,4-D液体培养基的100mL三角瓶中，25℃、持续光照、120r/min振荡培养(图1a-d)。

待细胞出现至一定浓度后，通过200目细胞筛，去掉大的组织团块及细胞团，将含有单细胞和小细胞团转移到无菌三角瓶，在持续光照条件下继续振荡培养(图1e，f)。

本发明人还研究了每天给予不同光照长度下细胞的状态，如图2，针对光照周期条件，通过对叶片诱导产生的悬浮细胞进行不同光照周期的振荡悬浮培养，观察其细胞形态，发现有意思的现象：黑暗条件培养下的悬浮细胞成长条状，16比8(16小时光照，8小时黑暗)的光照周期条件下细胞呈短条状或纺锤状，而持续光照条件下培养的细胞呈球状或椭圆状。同时，观察到随着光照时间的增加，细胞内会出现不同程度的红色物质沉积。

之后，本发明人分析不同光照周期产生的细胞形态的差异与悬浮细胞的分化程度的相关性。分别取相同体积的叶片在不同光照时间直接诱导产生的纺锤状悬浮细胞与持续光照条件下产生的球状红色悬浮细胞，将细胞悬浮液摇匀后取1mL，静置弃上清，用去离子水冲洗3次，利用二乙酰荧光素(Flurescein diacetate，FDA)双染色剂(5mg FDA溶解在lmL丙酮中，避光贮藏在4℃的冰箱中，使用时取0.4mL FDA贮藏液加入到5mL 0.65mol/L甘露醇中，按此比例获FDA染色溶液，混匀)在室温黑暗染色40min。随后使用PBS缓冲液或蒸馏水洗涤3次，每次5min，去除多余的染料。利用激光共聚焦扫描显微镜(LSM 510；Zeiss，德国)进行观察并拍照，激发光和检测光波长分别为485nm和530nm。在明场条件下，可以看到白色细胞和红色细胞在细胞形态上有明显的区别，白色细胞多为纺锤状或长条状，而红色细胞多为椭圆状，且在胞质内有红色物质的沉积(图3a，b)。这种形态上的差异提示细胞分化的程度不同。在荧光条件下，85％以上的红色细胞都能够观察到明显的荧光；相反，白色细胞只有22％。该结果表明，与细胞形态的差异一致，呈椭圆状的红色细胞分化程度较低，活性更强，故确定红色椭圆状细胞作为状态良好细胞的筛选标准和稳定材料，并用于后续的继代培养、植株再生和遗传转化(图3c-e)。

光照时间的细胞状态简要说明结如表1。

表1、光照时间的细胞状态

	细胞状态
		每天持续光照	球状或椭圆状，细胞活性理想
每天光照16小时	纺锤状，细胞活性低于每天持续光照的细胞
		暗培养	长条状，细胞活性相对低

实施例3、激素浓度对叶片诱导产生悬浮细胞的影响

利用幼嫩的无菌苗子叶组织进行悬浮细胞诱导，培养基中激素配比对悬浮系的建立有影响。根据上文提到的基本培养基类型(MS)，分别设置1.5mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L，3.0mg/L四个不同梯度的2,4-D浓度，进行培养条件的优化筛选。取相同数量和相近大小叶片按规则剪切放入液体培养基中。每个浓度都设置3个重复，于25℃、持续光照下、120r/min震荡培养，观察并记录悬浮细胞分别出现的时间以及称量统计初始和第10天的总鲜重。

结果发现，在2.5mg/L 2,4-D浓度梯度的培养条件下，诱导细胞出现时间最快，只需5天，且10天内细胞平均增长量也是最快速，分裂能力最强(表2)。该结果表明，2.5mg/L2,4-D的激素浓度是南林895杨树叶片最佳的诱导条件。

表2、不同2,4-D浓度对叶片诱导产生悬浮细胞的影响

实施例4、培养时间对悬浮细胞生长的影响

悬浮细胞经过25℃、持续光照、120r/min振荡培养一段时间后，处于稳定期。此时进行悬浮细胞系的继代培养，分别取5ml悬浮细胞接到20ml的培养液中，共计培养30瓶。同时取20ml的悬浮细胞进行抽滤，称重得到的重量是0.15g，即换算后得出接种到每一个小瓶中的5ml悬浮细胞量为(0.15/20)*5＝0.0375g。每隔24小时将细胞悬浮液摇匀后取5mL真空抽滤，称其鲜重，共取11个时期的细胞测量，每个时期鲜重测量进行3次重复，计算悬浮细胞的增长量。悬浮细胞培养中细胞生长曲线呈S形(图4)。悬浮细胞在继代初期时，需要一定的适应力，细胞会进入一个0～4天的生长延迟期；细胞经过适应后，在第4天时进入一个快速生长对数期，细胞鲜重大量增加；随着培养天数的增加，细胞不断增殖，营养物质逐渐消耗殆尽；继而细胞生长进入稳定期(10-11d)，最终停止生长、褐化或死亡。

因此，需要通过定期继代来维持悬浮细胞系的生长和稳定。优选地为5天继代一次。

实施例5、农杆菌侵染时间对悬浮细胞产生抗性芽的影响

本发明人在实践中发现，农杆菌侵染时间是影响遗传转化效率的重要因素。合适地掌握外植体与农杆菌接触的时间，不仅可以降低外植体对农杆菌的过度敏感而造成的毒害作用，而且可以减少后期培养过程中农杆菌的过度污染。外植体的每个细胞只能结合一定数量的细菌，过长的侵染时间使农杆菌遭毒害缺氧而软腐，从而导致转化率降低。

本发明人以OD600值为0.6时的农杆菌菌液进行实验，将悬浮培养状态良好的红色悬浮细胞离心弃上清液后置于预先制备好的菌液中，分别震荡共培养，设置侵染时间分别为5、10、15min，共3个处理时间。观察并记录悬浮细胞的诱导愈伤和发芽情况。

结果表明，侵染时间为10min最理想，其诱导出愈伤时间最快，数量最多，且所有的愈伤都产生了抗性芽，平均转化率为92％。侵染时间为5min或15min时，遗传转化效率明显降低(图5，表3)。因此，农杆菌侵染杨树悬浮细胞的最佳侵染时间为10min。

表3、不同侵染时间悬浮细胞转化诱导发芽统计

实施例6、CRISPR/Cas9在基于悬浮细胞遗传转化体系的单基因编辑效率验证

尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术给林木遗传改良带来革命性突破，已被用于修饰一些杨树的生长，发育以及生物和非生物胁迫中具有关键作用的基因。但所有已报道的研究都集中在基于叶盘法遗传转化体系的单载体上一个或几个基因，还未有关于基于悬浮细胞遗传转化体系的相关研究报道。本发明人经过反复的研究优化，改变了这一状况。

选取杨树木质部特异高表达RLK基因PtTMM作为目的基因(Potri.001G202100:TMM)，根据其基因组序列，利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2选择胞外域合适的sgRNA靶点序列(图7a-b)。

>Potri.001G202100:TMM(SEQ ID NO:17)

形成sgRNA序列的引物为：

PtTMM-sgRNA F：GTGGGTTGTCGCTAAAACAA(SEQ ID NO:18)

PtTMM-sgRNA R：TTGTTTTAGCGACAACCCAC(SEQ ID NO:19)

PtTMM-sgRNA F1：TCAGTTGCCCCAAAAATGAA(SEQ ID NO:20)

PtTMM-sgRNA R1：TTCATTTTTGGGGCAACTGA(SEQ ID NO:21)

取基于悬浮细胞遗传转化体系筛选再生的转基因植株叶片适量提取DNA。根据U3/U6和质粒自带的gRNA序列来设计、合成鉴定引物。采用PCR扩增该sgRNA片段，通过测序和查询sgRNA数据库获知该sgRNA的序列及其靶向基因，然后对编辑后的受体植物靶点(此处并非前面用于编辑的sgRNA)进行测序可获得转基因植株的编辑结果。

经统计分析，发现一共获得37个独立转基因株系，其中17株鉴定到了CAS9基因为阳性植株，阳性率为46％。对17个独立基因编辑株系中的突变事件进行了分析，结果显示17株阳性苗中有16株发生了纯合突变，1株为杂合突变，编辑效率为100％，且纯合编辑效率高达95％(图7c)。对纯合突变体的幼苗植株形态观察发现其植株生长受到明显抑制，叶片大小、植株高度都明显小于野生型(图7d)。纯合突变中一共出现了5种突变基因型，其中4种突变类型为插入造成的移码突变，1种突变类型两条染色体上分别插入和缺失造成的移码突变(图8a-e)。对不同突变类型进行分类统计，本发明人发现homozygous占比53％，biallic的比例为43％(图8f)。

实施例7、CRISPR/Cas9在基于悬浮细胞遗传转化体系的多基因编辑效率验证

进一步地，为了建立杨树悬浮细胞CRISPR/Cas9多基因编辑体系，本发明人首先对实验室之前通过质膜蛋白方法鉴定到的大量类受体蛋白激酶蛋白进行分析，筛选出在木质部中显著地高表达的部分RLKs(图9a)。选择其中的16个基因构建了含有17个不同U3/U6启动子驱动的sgRNA的5个双元载体，其中有1个载体靶向1个基因，1个载体靶向3个基因，3个载体靶向4个基因。均一混转杨树悬浮细胞后，得到很多T0代转基因植株。一些代表性的靶基因的sgRNA靶序列如表4。

表4

对T0代转基因植株编辑效率进行分析鉴定。结果显示，混转转基因植株阳性率为89.6％，5个双元载体都成功转入，转入效率为100％，其中发现不同载体见的转入效率有一定差别，靶向2个基因的载体转入效率最高，达44.1％。对阳性植株进行转入载体类别鉴定发现所有阳性转基因植株都是单载体转入，单载体转入效率达100％。对编辑基因数量进行统计发现转入的16个基因中有15个基因成功被编辑，发生了37种不同类型的编辑方式，编辑效率达72.09％，如表5。表6是代表性的基因的编辑效率统计。

表5

表6

以上结果表明，在杨树悬浮细胞中，可以实现基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对目的基因的高效编辑，为杨树等木本植物的遗传改良、新品种培育提供了关键技术支撑。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种单细胞遗传转化方法及其应用

<130> 201978

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

acttccactt gtgtacttct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

agaagtacac aagtggaagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

gtttatgaat acatgccccg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

cggggcatgt attcataaac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ggctcagcct gtggctgtca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

tgacagccac aggctgagcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

acgcctggct gatggcacat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

atgtgccatc agccaggcgt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

acacttccat tagccatgta 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

tacatggcta atggaagtgt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

cagtagggag catcaagcat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

atgcttgatg ctccctactg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

tggtagcatt ccagtggaat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

attccactgg aatgctacca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

tggtagcatt ccagtggaat 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

attccactgg aatgctacca 20

<210> 17

<211> 490

<212> DNA

<213> 杨树(PopulusL.)

<400> 17

gcaagaagcg gtctatgaca tcatgcgagc cactggcaac gactgggcaa ccgatatccc 60

tgatgtttgt cgtggccggt ggcacggtat cgagtgcatg ccggacaagg acaatgtgta 120

ccatgttgtt tcattgtcct tcggcacctt gtccgatgac actgctttcc ccacatgcga 180

cccggcaagg tcctacatct cagagtctat catgaagctt ccccacctca aaactttgtt 240

tttttaccgt tgttttagcg acaacccaca gcctatccct tcatttttgg ggcaactgag 300

cccaactttg caaaccttgg tgctcaggga aaacgggcat gtaggccttg ttcctgctga 360

attaggaaat cttacacgtc tgaaagttct tgatctccac aaaaacaatc ttaacggttc 420

aattcctgtt tcattgggcc ggctggccgg cctaaaatcg ttggatttga gtgggaataa 480

actgaccggt 490

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

gtgggttgtc gctaaaacaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

ttgttttagc gacaacccac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

tcagttgccc caaaaatgaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

ttcatttttg gggcaactga 20

Claims

1.一种单细胞遗传转化方法，包括：

(1)从木本植物的组织获取悬浮细胞，包括将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，所述的持续光照条件为每天光照超过20小时，获得胞内有红色物质沉淀的悬浮细胞；所述木本植物为杨柳科植物；

(3)继续培养步骤(2)的悬浮细胞，筛选发生重组转化的细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的持续光照条件为：每天光照超过22小时。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，光照强度1000～3000Lux。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，光照强度1500～2500Lux。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，(1)中，光照强度1800～2200Lux。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，在含有生长素或生长素类似物的MS培养基中培养；所述的生长素或生长素类似物为1.8～2.8 mg/L 的2,4-二氯苯氧乙酸。

7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的2,4-二氯苯氧乙酸在培养基中的浓度为2～2.7 mg/L。

8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的2,4-二氯苯氧乙酸在培养基中的浓度为2.4～2.6 mg/L。

9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述悬浮细胞为椭圆状细胞或球状细胞；所述细胞分化程度较低，活性强。

10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述植物组织为植物叶片，或，所述植物组织块为植物叶片剪成的块状组织；或

所述的植物为苗期植物；或

所述的植物组织为无菌的植物组织。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述植物组织为苗期植物第3～5片叶片。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，培养温度为25±2℃。

13. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述振荡培养为在120±50 r/min振荡培养。

14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，(1)中，所述振荡培养为在120±20 r/min振荡培养。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，当细胞规模生长后，去除大的组织团块及细胞团。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，当细胞生长至粘稠或对数期时，进行稀释。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，(1)中，稀释2～8倍。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，每4～8天进行继代培养。

19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，每5±1天进行继代培养。

20.如权利要求1或16所述的方法，其特征在于，培养基中添加蔗糖20±5g/L；或

所述培养基的pH为5.8±0.3。

21. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述转化菌包括：农杆菌。

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述悬浮细胞与转化菌混合培养的时间为5～20分钟；或

所述悬浮细胞与转化菌混合培养为振荡培养。

23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述悬浮细胞与转化菌混合培养的时间为10±3分钟。

24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述转化菌中，含有的待遗传转化目的基因包括选自下组的基因：基因编辑用工具酶基因、基因编辑用向导基因、miRNA、siRNA、shRNA、报告基因、筛选基因，或含有选自上述分子的构建体。

25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述转化菌中，含有的待遗传转化目的基因为供体基因。

26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述转化菌中，含有的待遗传转化目的基因为结构基因。

27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，含有的待遗传转化目的基因为功能基因。

28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，先进行无抗生素的培养，之后进行抗性筛选，获得发生重组转化的细胞。

29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，还包括：培养发生重组转化的细胞，形成愈伤组织，进一步培养为植株。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，对发生重组转化的细胞，每15天继代一次，获得愈伤组织。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，获得愈伤组织后，进行芽诱导培养、分化出抗性芽，之后进行不定芽伸长培养，之后进行生根培养，获得幼苗。

32.一种获得活性悬浮细胞的方法，包括：从木本植物的组织获取悬浮细胞，包括将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，所述的持续光照条件为每天光照超过20小时，获得胞内有红色物质沉淀的悬浮细胞；所述木本植物为杨柳科植物。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述的持续光照条件为：每天光照超过22小时。

34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，光照强度1000～3000Lux。

35. 如权利要求32所述的方法，其特征在于，在含有生长素或生长素类似物的MS培养基中培养；所述的生长素或生长素类似物为1.8～2.8 mg/L 的2,4-二氯苯氧乙酸。

36. 如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述的2,4-二氯苯氧乙酸在培养基中的浓度为2～2.7 mg/L。

37. 如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述悬浮细胞为椭圆状细胞；或

所述植物组织为植物叶片，或，所述植物组织块为植物叶片剪成的块状组织；或

培养温度为25±2℃；或

所述振荡培养为在120±50 r/min 振荡培养；或

将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，当细胞规模生长后，去除大的组织团块及细胞团；或

当细胞生长至粘稠或对数期时，进行稀释；或

每4～8天进行继代培养。

38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，稀释2～8倍。

39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，每5±1天进行继代培养。

40.权利要求32-39任一所述的方法的用途，用于制备基因转化用的靶细胞。

41.权利要求40所述的用途，其特征在于，所述基因转化包括基因编辑。

42.权利要求40或41所述的用途，其特征在于，所述基因转化或基因编辑为高通量基因转化或高通量基因编辑。

43.一种进行基因编辑的方法，包括：

(a)利用权利要求32-39任一所述的方法获得悬浮细胞；

(b)将(a)的悬浮细胞与含有待遗传转化目的基因的转化菌混合培养，之后除去转化菌；所述转化菌中，含有的待遗传转化目的基因包括选自下组的基因：基因编辑用工具酶基因、基因编辑用向导基因、供体基因；