CN108300735B - 一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，其工艺步骤包括：通过体细胞胚发生技术体系诱导胚性愈伤组织；抗生素潮霉素和硫酸卡那霉素适宜浓度的筛选；农杆菌侵染液的制备；侵染和共培养；抗性愈伤组织的筛选和继代培养；抗性体细胞胚的萌发与成苗；转基因植株的GUS组织学染色和PCR检测。本发明以百合的胚性愈伤组织为受体材料，首次在遗传转化后诱导产生体细胞胚进而直接发育形成完整植株，转化效率比其他种类百合现有的报道显著提高，可达29.17%。其优势在于受体细胞基数大，转化后诱导的体细胞胚是单细胞起源，很好地避免嵌合体的产生，且转化后代外源基因遗传稳定性高，变异率低。
Description
技术领域
本发明属于球根花卉生物技术领域，具体涉及百合稳定遗传转化体系的建立，即以诱导出的胚性愈伤组织为受体，基于农杆菌介导法针对细叶百合建立一种稳定高效的遗传转化体系。
背景技术
植物遗传转化 (plant genetic transformation)，是一种独特的DNA跨界转移技术，是有针对性的将外源基因导入植物基因组中，让其在后代植株中遗传和稳定表达的植物遗传改良技术。这项技术是植物基因工程的核心，转基因技术的建立和发展，使人们能够根据需求将特定的基因导入不同植物之间进行表达，为植物遗传改良提供了新途径。百合(Lilium) 是重要的球根花卉, 花色丰富，株型优美，观赏价值高、市场需求量大、经济价值可观。我国具有丰富的野生百合资源，但目前国内生产中应用的百合种球大多依赖进口，我国具有自主知识产权的品种极少，种球生产技术体系亦不成熟，生产成本居高不下。伴随生物技术的快速发展, 建立稳定高效的遗传转化体系对百合种质资源保存、种球繁育以及通过基因工程技术进行遗传性状改良具有重要意义。
在百合遗传转化研究中，利用基因枪法已成功获得了一些转基因百合，但基因枪法转化效率低、形成的嵌合体多，且筛选量工作量大、成本高，转化效率较低。目前应用最广的转基因方法是农杆菌介导法，具有转化成本低，转化效率高的优点，但农杆菌介导法成功应用于百合遗传转化的案例尚少，这可能是由于百合对农杆菌的侵染不敏感、且基因型差异较大的缘故。Cohen (1992) 首次用农杆菌介导法转化百合 'Nellie White' 鳞片，在鳞片上观察到瘤状突起，并且在诱导产生的愈伤组织里检测出冠瘿碱基因的表达。Hoshi(2004) 等以东方百合花丝诱导产生的愈伤组织为受体，获得了6株携带目的基因的转化苗，转化效率为3%。Wang Yue (2012) 等以农杆菌菌株AGL0对20个百合品种花丝及花梗诱导产生的愈伤组织进行侵染，GUS瞬时表达率从0.3%-20.6%，但是稳定表达率仅为1.4%。Yinyan Qi (2014) 等分别以OT百合‘罗宾娜’（Liliumtenuifolium oriental×trumpet）的悬浮细胞团作为转化受体材料进行了农杆菌介导的遗传转化，从132株抗性植株中检测获得4个转基因株系。由此可见，关于农杆菌介导百合遗传转化的研究尚少，且转化效率低、遗传稳定性差、转化后受体材料再生困难，仍然无法适用于百合生产和分子育种的需求。利用体细胞胚发生建立百合遗传转化体系的研究尚未见报道。
细叶百合 (Lilium pumilum DC. Fisch.)，别名山丹，是我国原产的珍稀野生百合。细叶百合抗性较强，耐旱、耐寒、耐盐碱，引种无须驯化，加之花色艳丽、花型优美，可直接应用于家庭盆栽、庭院及城市园林绿化。然而，细叶百合植株茎秆细弱、花朵娇小、颜色单一，观赏性状有待于进一步改良。高效遗传转化体系的建立对于种质资源保存、基因工程育种以及百合发育、繁殖等领域的基因功能验证具有重要意义。当前对细叶百合的研究大多集中在分类学、生物学、无性繁殖技术等方面，陈丽静等 (2013) 曾以鳞片为外植体初步探讨了细叶百合的组织培养技术，关于细叶百合的遗传转化尚未见报道。因此，建立稳定、高效的细叶百合遗传转化体系迫在眉睫。
体细胞胚是一种由单细胞发育而成的胚状体，体细胞胚发生作为一种典型的植物再生方式具有取材少、遗传稳定性高、变异率低和再生率高等优点，因此基于体细胞胚发生过程建立遗传转化体系可有效减轻转基因植株后期繁重的筛选工作，而且，利用单细胞起源的体胚发生过程以初始的胚性愈伤组织为转化受体进行遗传转化能够很好地避免嵌合体的产生。另外，与其它外植体相比，胚性细胞更有利于T-DNA的摄入和整合，因而更适宜作高效的转化受体。
本发明以细叶百合的胚性愈伤组织为受体材料，建立基于农杆菌介导法的细叶百合遗传转化技术体系。对常用抗生素潮霉素和卡那霉素进行亚致死浓度筛选，研究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间及共培养方式对转化效率的影响，以期建立高效稳定的细叶百合遗传转化体系，从而为细叶百合基于转基因技术的相关研究奠定基础。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明的目的是提出一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，采用细叶百合高效体细胞胚发生体系诱导出胚性愈伤组织，以胚性愈伤组织为转化受体材料，对胚性愈伤组织最适抗生素浓度、农杆菌侵染过程中最适预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间及共培养方式进行了研究，建立了高效稳定的细叶百合遗传转化技术体系。
本发明提供的技术方案，具体步骤如下：
1. 获得胚性愈伤组织
选取小鳞茎直径为1-1.2 cm的细叶百合无菌苗，将鳞片切为0.5 cm2小块，凹面向上、平铺接种于体胚诱导培养基 [MS + 1.0 mg·L-1 Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) ] 中。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，持续黑暗培养；接种6周时，形成亮黄色，颗粒性明显的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接至MS培养基中进行胚性细胞增殖，增殖4周时，筛选出长势好而快，没有褐化且质地致密的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中预培养15 d，作为转化的受体材料。
2. 抗生素敏感性测定
通过在体细胞胚诱导培养基 [MS + 1.0 mg·L-1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) ] 中添加不同浓度梯度的抗生素，测定硫酸卡那霉素和潮霉素对于细叶百合胚性愈伤组织的亚致死浓度，确立硫酸卡那霉素和潮霉素的抗性筛选使用浓度分别为100 mg·L-1和30 mg·L-1。
3. 优化遗传转化条件
比较转化过程中不同转化条件转化后的GUS瞬时表达率和抗性筛选2个月后的抗性愈伤发生率，确定转化条件如下：受体材料预培养15 d，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间10min，固体共培养48h。
4. 制备农杆菌侵染液
将携带目标基因的载体转入农杆菌EHA105中，利用载体相应的抗生素筛选和菌落PCR鉴定出阳性的转化子；挑取阳性的转化子克隆，接种于含相应抗生素的5 mL新鲜YEB液体培养基中200 rpm振荡培养至菌液较浓，吸取菌液按1：50的比例转接到50 ml液体YEB培养基，继续培养至OD600为0.6，5000 rpm离心10 min，收集菌体；用50 mL含有100 μM 乙酰丁香酮 (AS) 的MS液体培养基重悬菌体，将重悬液继续200 rpm振荡培养2 h，作为农杆菌侵染液备用。
5. 侵染和共培养
在超净工作台内，将生长状态良好的细叶百合胚性愈伤组织块浸没于农杆菌侵染液中10 min，期间不断轻轻摇晃以便使组织块与侵染液充分接触；从侵染液中取出组织块后，用无菌滤纸充分吸干组织块表面的残留菌液，再转移至共培养培养基[MS + 1.0 mg·L-1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) +100 μM AS (乙酰丁香酮) ]中，25±1℃进行持续黑暗培养48 h。
6. 抗性愈伤组织的筛选与继代培养
将共培养后的愈伤组织转接于脱菌培养基 [MS + 1.0 mg·L-1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) + 400 mg·L-1 cef (头孢霉素)+ 30 mg·L-1 Hyg (潮霉素) ]，于25±1℃暗培养条件下进行脱菌培养和筛选培养，2周后将完全脱菌的愈伤组织转接至抗性愈伤筛选培养基 [MS + 1.0 mg·L-1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA(萘乙酸) + 30 mg·L-1 Hyg(潮霉素) ] 中继续培养，此后每2周转接一次，培养4周抗性愈伤组织上会新生出体细胞胚。
7. 体细胞胚萌发和成苗
将长出体细胞胚的胚性培养物转于体胚萌发培养基 [MS + 0.5 mg·L-16-BA(6-苄氨基腺嘌呤)] 上，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m-2·s-1。培养4周可形成具有子叶和根的成熟体细胞胚，将成熟体细胞胚转接至MS基本培养基中进行培养，2周后发育形成完整的转化植株。
8. 转化植株的转基因鉴定
（1）GUS组织学染色：对转化植株的叶片、鳞片、根分别进行常规GUS组织染色，以未转化的野生型植株作为对照，如果成功染色说明携带标记基因的载体成功整合到植株基因组中。
（2）PCR检测：对成功染色的植株提取基因组DNA，针对载体T-DNA区域内的DNA序列设计特异引物，以细叶百合基因组DNA为模板进行PCR扩增，以野生型植株作对照，若转化植株的PCR结果为阳性，则表明外源基因整合到了植株的基因组中。
进一步的，携带目标基因的载体为pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pRI201、pTCK303。
本发明的优点和积极效果：
1.本发明以百合的胚性愈伤组织为受体材料，首次在遗传转化后诱导产生体细胞胚进而直接发育形成完整植株，转化效率比其他种类百合现有的报道显著提高。其优势在于受体细胞基数大，胚性细胞分化再生能力强，转化诱导产生的体细胞胚是单细胞起源，可以很好地避免大量嵌合体的产生，减少了转化植株的筛选工作。且本发明建立在稳定高效的体胚发生体系的基础之上，细叶百合胚性细胞诱导率高，保存效果好，再生能力强，且对常用抗生素敏感性强，是提高其遗传转化效率的有效前提。
2. 本发明获得的转基因植株遗传稳定性高，转化后代外源基因可以稳定遗传，能够高效的获得大量转基因植株。 通过本发明建立的遗传转化体系，可用于百合的分子遗传改良、种质资源创制、基因工程育种以及百合发育、繁殖等领域的基因功能验证。
附图说明
图1为细叶百合转化过程中抗性愈伤形成与抗性体胚的萌发成苗；
图2为细叶百合转基因植株鉴定。
其中图1中包括：抗性愈伤筛选新生出的胚性细胞a，抗性愈伤组织萌发b，萌发过程中形成抗性芽c，形成转化植株d；
其中图2中包括：未转化的愈伤组织GUS组织学染色结果A；抗性愈伤组织GUS组织学染色结果B；细叶百合的根GUS组织学染色结果C（C中：未转化植株C-1，转化植株C-2），细叶百合的叶片GUS组织学染色结果D（D中：未转化植株D-1，转化植株D-2），细叶百合的鳞片GUS组织学染色结果E（E中：未转化植株E-1，转化植株E-2），转基因植株的PCR检测F（F中：DL2000Marker M，未转化植株对照1，抗性植株2-13，其中2、3、5、7、8、9、11、12为GUS阳性植株；4、6、10、13为假阳性植株）。
具体实施方式
实例1对携带目标基因pTCK-S1-Ri的植物双元表达载体进行转化获得转基因植株
pTCK-S1-Ri是在pTCK303载体基础上构建的植物表达载体，含潮霉素磷酸转移酶基因和GUS报告基因，目的条带长269 bp。本实施例中细叶百合购于苗木种子销售处购买得到，实施例中各生物化学制剂均从市场购买得到。
1. 胚性愈伤组织的获得
选取小鳞茎直径为1-1.2 cm的细叶百合无菌苗，将鳞片切为0.5 cm2小块，凹面向上、平铺接种于体胚诱导培养基 [MS + 1.0 mg·L-1 Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) ] 中。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，持续黑暗培养；接种6周时，形成亮黄色，颗粒性明显的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接至MS培养基中进行胚性细胞增殖，增殖4周时，筛选出长势好而快，没有褐化且质地致密的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中预培养15 d，作为转化的受体材料。
2. 抗生素敏感性试验
本发明过程中，首先对细叶百合的胚性愈伤组织进行了潮霉素和卡那霉素两种抗生素的敏感性试验，通过在体细胞胚诱导培养基 [MS + 1.0 mg·L-1 Picloram (毒莠定)+ 0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) ] 中添加不同浓度梯度的抗生素，得出卡那霉素和潮霉素对于细叶百合胚性愈伤组织的亚致死浓度分别为125 mg·L-1和40 mg·L-1，但由于在该抗生素浓度下，筛选后期的愈伤组织褐化严重，几乎不增殖，因此优化后确立硫酸卡那霉素和潮霉素的抗性筛选使用浓度为100 mg·L-1和30 mg·L-1。
3. 遗传转化影响因子探究
为了提高细叶百合遗传转化效率，本发明对影响遗传转化效率的关键因子进行了探究，包括预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间以及共培养方式对转化的影响，综合以上因子确定了最适的转化条件。转化过程中比较了不同转化条件转化后的GUS瞬时表达率和抗性筛选2个月后的抗性愈伤发生率，结果表明：在受体材料预培养15 d，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间10 min，固体共培养48 h的条件下更有利于转化。
4.农杆菌侵染液的制备
将携带目的基因的植物双元表达载体转入农杆菌EHA105中，根据双元载体上的抗性基因利用抗生素（50 mg·L-1硫酸卡那霉素+ 50 mg·L-1利福平）筛选和菌落PCR鉴定出阳性的转化子。挑取阳性的转化子克隆，接种于含抗生素（50 mg·L-1硫酸卡那霉素+ 50mg·L-1利福平）的5 mL新鲜YEB液体培养基中200 rpm振荡培养至菌液较浓，吸取菌液按1：50的比例转接到50 ml含抗生素（50 mg·L-1硫酸卡那霉素+ 50 mg·L-1利福平）的液体YEB培养基，继续培养至OD600为0.6，5000 rpm离心10 min，收集菌体。用50 mL含有100 μM AS的MS液体培养基重悬菌体，将重悬液继续200 rpm振荡培养2 h，作为农杆菌侵染液备用。
5.侵染和共培养
在超净工作台内，将生长状态良好的细叶百合胚性愈伤组织块浸没于农杆菌侵染液中10 min，期间不断轻轻摇晃以便使组织块与侵染液充分接触。从侵染液中取出组织块后，用无菌滤纸充分吸干组织块表面的残留菌液，再转移至共培养培养基 [MS + 1.0 mg·L-1 Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) +100 μM AS (乙酰丁香酮) ] 中，培养温度为25±1℃，暗培养48 h。
6.抗性愈伤组织的筛选与继代培养
将共培养后的愈伤组织转接于脱菌培养基 [MS + 1.0 mg·L-1 Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) + 400 mg·L-1 cef (头孢霉素)+ 30 mg·L-1 Hyg (潮霉素) ]，于25±1℃暗培养条件下进行脱菌培养和筛选培养，2周后将完全脱菌的愈伤组织转接至抗性愈伤筛选培养基 [MS + 1.0 mg·L-1 Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L-1 NAA(萘乙酸) + 30 mg·L-1 Hyg(潮霉素) ] 中继续培养，此后每2周转接一次，培养4周抗性愈伤组织上会新生出体细胞胚 (图1a)。
7.体细胞胚萌发和成苗
筛选培养结束后，切除愈伤基部坏死的组织，将长出体细胞胚的胚性培养物转于体胚萌发培养基 [MS + 0.5 mg·L-1 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)] 中，培养温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，光周期为：每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m-2·s-1。培养2周抗性愈伤组织变绿（图1b)，继续培养2周形成具有子叶和根的成熟体细胞胚（图1c），将成熟体细胞胚转接至MS基本培养基中进行培养，2周后发育形成完整的转化植株（图1d）。试验过程中，共获得120株转化植株。
8.转化植株的GUS组织学染色
对转化过程中形成的抗性愈伤组织、转化植株的叶片、鳞片、根分别进行GUS组织染色，以未转化的野生型植株作为对照（图2A,B,C,D,E）。叶片、鳞片和根均成功染色的说明携带标记基因的载体成功整合到植株基因组中。试验过程中对获得的120株转化植株均进行了染色，结果显示有52株植株不同部位均成功染色。
9.转化植株的PCR检测
对成功染色的植株提取基因组DNA，针对载体T-DNA区域内的GUS基因序列设计特异引物，以细叶百合基因组DNA为模板进行PCR扩增，以野生型植株作对照，若转化植株的PCR结果为阳性，则表明外源基因整合到了植株的基因组中。所述的用于转化植株PCR检测的引物序列为：
GUS F：5’-AGTTCTTTCGGCTTGTTG-3’
GUS R：5’-TTCTACTTTACTGGCTTTGG-3’
PCR反应程序为：94°C预变性5 min；94℃变性1min，58°C退火1 min，72°C延伸1min，35个循环；72°C延伸5 min。PCR产物的条带长269 bp（图2F）。
通过大量多次试验，所述的基于体细胞胚发生的细叶百合遗传转化效率稳定在29.17%，可用于大量获得转基因百合的各类工作中。
Claims (1)
1.一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，其特征在于：包括以下步骤：
（1）获得胚性愈伤组织
选取小鳞茎直径为1-1.2 cm的细叶百合无菌苗，将鳞片切为0.5 cm2小块，凹面向上、平铺接种于体细胞胚诱导培养基中，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，持续黑暗培养；接种6周时，形成亮黄色，颗粒性明显的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接至MS培养基中进行胚性细胞增殖，增殖4周时，筛选出长势好而快，没有褐化且质地致密的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中预培养15 d，作为转化的受体材料；所述体细胞胚诱导培养基配方为：MS ＋1.0 mg·L-1 Picloram （毒莠定）＋0.2 mg·L-1 NAA （萘乙酸）；
（2）抗生素敏感性测定
通过在体细胞胚诱导培养基中添加不同浓度梯度的抗生素，测定硫酸卡那霉素和潮霉素对于细叶百合胚性愈伤组织的亚致死浓度，确立硫酸卡那霉素和潮霉素的抗性筛选使用浓度分别为100 mg·L-1和30 mg·L-1；
（3）优化遗传转化条件
比较转化过程中不同转化条件转化后的GUS瞬时表达率和抗性筛选2个月后的抗性愈伤发生率，确定转化条件如下：受体材料预培养15 d，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间10min，固体共培养48h；
（4）制备农杆菌侵染液
将携带目标基因的载体转入农杆菌EHA105中，利用载体相应的抗生素筛选和菌落PCR鉴定出阳性的转化子；挑取阳性的转化子克隆，接种于含相应抗生素的5 mL新鲜YEB液体培养基中200 rpm振荡培养至菌液较浓，吸取菌液按1：50的比例转接到50 ml液体YEB培养基，继续培养至OD600为0.6，5000 rpm离心10 min，收集菌体；用50 mL含有100 μM 乙酰丁香酮(AS) 的MS液体培养基重悬菌体，将重悬液继续200 rpm振荡培养2 h，作为农杆菌侵染液备用；所述的携带目标基因的载体包括pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pRI201、pTCK303、pTCK-S1-Ri；
（5）侵染和共培养
在超净工作台内，将生长状态良好的细叶百合胚性愈伤组织块浸没于农杆菌侵染液中10 min，期间不断轻轻摇晃以便使组织块与侵染液充分接触；从侵染液中取出组织块后，用无菌滤纸充分吸干组织块表面的残留菌液，再转移至共培养培养基中，25±1℃进行持续黑暗培养48 h；
所述共培养培养基配方为：MS＋1.0 mg·L-1Picloram (毒莠定) ＋0.2 mg·L-1 NAA(萘乙酸) ＋100 μM AS (乙酰丁香酮)；
（6）抗性愈伤组织的筛选与继代培养
将共培养后的愈伤组织转接于脱菌培养基，于25±1℃暗培养条件下进行脱菌培养和筛选培养，2周后将完全脱菌的愈伤组织转接至抗性愈伤筛选培养基中进行暗培养，此后每2周转接一次，培养4周抗性愈伤组织上会新生出体细胞胚；所述脱菌培养基配方为：MS＋1.0 mg·L-1Picloram (毒莠定) ＋0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) ＋400 mg·L-1 cef (头孢霉素) ＋30 mg·L-1 Hyg (潮霉素)；所述抗性愈伤筛选培养基配方包括：MS＋1.0 mg·L- 1Picloram (毒莠定) ＋0.2 mg·L-1 NAA (萘乙酸) ＋30 mg·L-1 Hyg(潮霉素)；
（7）体细胞胚萌发和成苗
筛选培养结束后，切除愈伤基部坏死的组织，将长出体细胞胚的胚性培养物转于体胚萌发培养基上，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m-2·s-1；培养4周可形成具有子叶和根的成熟体细胞胚，将成熟体细胞胚转接至MS基本培养基中进行培养，2周后发育形成完整的转化植株；所述体胚萌发培养基配方包括：MS＋0.5 mg·L-16-BA(6-苄氨基腺嘌呤)；
（8）转化植株的转基因鉴定
a. GUS组织学染色：对转化植株的叶片、鳞片、根分别进行常规GUS组织染色，以未转化的野生型植株作为对照，如果成功染色说明携带标记基因的载体成功整合到植株基因组中；
b. PCR检测：对成功染色的植株提取基因组DNA，针对载体T-DNA区域内的DNA序列设计特异引物，以细叶百合基因组DNA为模板进行PCR扩增，以野生型植株作对照，若转化植株的PCR结果为阳性，则表明外源基因整合到了植株的基因组中。
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