KR101293654B1 - 아그로박테리아 형질전환 기법을 이용하여 벼의 형질전환율을 향상시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리아와 공동 배양하기 전에 형질전환 대상 식물체의 배유를 제거하는 단계를 포함하는 것에 특징이 있는 아그로박테리아를 이용한 식물체 형질전환 방법에 관한 것으로써, 본 발명에 따르면 대량의 형질전환을 고속고효율로 안정적으로 수행할 수 있다.

Description

아그로박테리아 형질전환 기법을 이용하여 벼의 형질전환율을 향상시키는 방법{Method for improving Oryza sativa transformation efficiency using Agrobacterium-mediated transformation}

본 발명은 아그로박테리아를 이용한 식물체, 특히 벼의 형질전환 방법에 관한 것이다.

세계 인구는 끊임없이 증가하여 1997년에는 60억, 2000년에는 62억에 이르렀으며, UN의 세계인구 예측에 따르면 2070년에는 100억에 이를 것으로 추정된다. 한편, 인구증가와 함께 세계의 식량수요도 계속 증가하여 왔다. 따라서 식량증산을 위하여 경지면적을 확대하고 화학비료와 농약을 사용하며 통일벼와 같은 다수확 품종을 재배하는 방법 등을 이용해 왔다. 그러나 이용할 수 있는 농지면적은 한정되어 있으며 화학비료나 농약 사용은 잔류농약 등에 의한 안전성문제도 있어 이러한 방법에 의한 식량증산에는 한계가 있었다. 또한 소비자의 식품기호에 대한 욕구도 증가하여, 식량자원의 품종개량에 대한 중요성과 필요성이 증가했다. 이에, 최근에는 새로운 품종을 효율적으로 개발하기 위하여 유전자재조합 기술을 이용하고 있다.

유전자재조합 방법에는 식물체를 숙주로 하는 경우 아그로박테리아 형질전환 기법(Hiei et al., 1994; Rashid et al., 1996; Lee et al., 1998; Rashid et al., 1996), 원형질세포법(Brewer et al.,1999; Dhir et al.,1998; Datta et al., 1990), 및 입자총(Particle-gun) 법(Kexuan et al., 1999; Synder et al., 1999; Christou et al., 1991) 등을 이용하며, 동물을 숙주로 하는 경우 미세주입법을 이용하고, 미생물을 숙주로 하는 경우 화학요법, 온도, 전기 조건 등을 이용하는 것이 일반적이다. 원형질세포법은 80년대 후반에 주로 사용되었으며 외래 DNA를 나출된 원형질체에 도입하기 위해 polyethylene glycol(PEG)법과 전기충격법(electroporation)을 이용하였다. 그러나 이들 방법은 원형질체에서 재분화 식물체를 분화시키는 과정이 복잡하고 시간이 오래 걸리며 숙련된 기술이 요구된다는 단점이 있다. 1990년대 이후부터는 입자총법과 아그로박테리아 형질전환 기법이 주로 사용되고 있다. 입자총법은 도입유전자(DNA)를 미세 텅스텐 입자나 금 입자에 코팅하여 헬리움(helium) 가스 압력에 의해 고속으로 목표 세포의 핵 속에 전이하는 방법으로, 재분화가 가능한 세포나 조직에 직접 외래 DNA를 도입하는 것이 가능하여 genotype(품종, 계통)에 따른 형질전환 효율의 차이와 관계없이 대부분의 세포에 형질전환이 가능하다는 장점이 있다. 그러나 식물 세포에 삽입되는 DNA copy 수가 많다는 점, 삽입되는 양상이 복잡하고 삽입 DNA가 절단된 형태로 전이되는 등의 문제점이 있다.

이러한 문제점으로 인해 최근에는 아그로박테리아 형질전환 기법이 가장 널리 사용되고 있다. 아그로박테리아 형질전환 기법은 토양 병원균인 아그로박테리아가 지니고 있는 Ti(tumor-inducing) 플라스미드 또는 Ri(Root-inducing) 플라스미드상의 T-DNA 영역이 식물 세포에 전이되는 특성을 형질전환에 이용하는 것이다. 이 방법으로 형질전환된 식물체의 경우 도입유전자의 copy 수가 적어 유전자총을 이용한 방법으로 얻어진 형질전환체에 비해 도입유전자의 고정이 용이하고 유전자침묵현상 등의 문제점을 줄일 수 있다는 장점이 있다.

하지만 벼의 경우 밀, 콩, 옥수수 등의 작물처럼 genotype에 따른 형질전환효율의 변이가 심하여 일부 유망품종의 경우 많은 시도에도 불구하고 식물체 재분화 및 형질전환이 매우 어렵다는 한계가 있다. 또한 형질전환 과정에서 세포배양기간이 길어질 경우 Tos17과 같은 retortransposon이 활성화되어(Hirochika et al., 1996) 돌연변이가 일어날 가능성이 높다. 따라서 유전자재조합 방법 중 아그로박테리아 형질전환 기법의 형질전환율을 향상시키는 방법에 대한 요구가 지속적으로 제기되고 있다.

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 아그로박테리아를 이용한 식물체 형질전환 방법에 있어서 형질전환 효율을 향상시키기 위한 방법, 그 일환으로 아그로박테리아 균주 종류, 아그로박테리아 공동 배양 기간, 아그로박테리아 접종 농도, 및 슈트(shoot) 또는 뿌리 유도 배지 종류를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 아그로박테리아를 이용한 식물체 형질전환 방법에 있어서, 식물체의 배유를 제거하고 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리아와 공동 배양하는 단계를 포함하는 데에 특징이 있는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 아그로박테리아를 이용한 식물체 형질전환 방법에 있어서 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리아와 공동 배양하기 전에 형질전환 대상인 식물체의 배유를 제거함으로써, 아그로박테리아의 과도한 성장을 방지하고 형질전환 효율의 약 100% 정도가 향상되는 우수한 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다(도 5 참고).

본 명세서에 사용된 용어, "배유"는 종자식물의 배낭 내에서 형성된 영양조직으로 자엽 내 포함되어 있거나 배의 주변조직에 있는 것 내지는 어떠한 종류의 현화식물의 씨앗 속에 있어 배(胚)를 싸고 있으며 그 세포 속에 양분을 비축하고 씨앗이 발아하여 배가 생장하는데 필요한 양분을 공급하는 조직을 의미한다. 상기 배유 제거를 위해 다양한 물리적, 화학적 방법이 사용될 수 있으나, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 핀셋을 이용하여 물리적으로 배유를 제거하는 방법을 사용하였고, 이때 자엽과 뿌리 부분은 그대로 남겨두는 것이 바람직하다.

아그로박테리아를 이용한 식물체 형질전환 방법에 대해서는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 벼를 숙주로 한 아그로박테리아를 이용한 식물체 형질전환 방법은 다음 단계를 포함하여 수행될 수 있다:

형질전환에 사용될 식물(바람직하게, 배반(scutellum) 유래의 캘러스)을 유도하는 단계,

목적 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 포함된 아그로박테리아를 식물에 접촉시키는 접종(Inoculation)을 하고 아그로박테리아와 식물을 공동 배양하여 T-DNA의 전이가 이루어지게 하는 공동 배양(Co-cultivation) 단계, 및

아그로박테리아와 공동 배양한 식물로부터 재분화 숙주를 유도하는 단계.

본 발명에 따른 방법에서 보다 바람직하게, 식물의 배유를 제거하는 단계는 아그로박테리아와의 공동 배양 전, 더욱 바람직하게 형질전환에 사용될 식물을 유도하는 단계와 재조합 발현 벡터가 포함된 아그로박테리아를 접종하는 단계 사이에 수행되는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 용어 "형질전환에 사용될 식물, 형질전환 대상 식물체, 형질전환 숙주" 는 유전자가 도입될 식물을 의미하고 상기 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 배유를 가지는 식물이라면 모두 포함되며, 예를 들어 종자식물, 나자식물, 피자식물, 현화식물 등이 있으며, 예를 들어 벼, 밀, 보리 또는 옥수수일 수 있고, 가장 바람직하게는 벼의 캘러스이다. 상기 벼의 캘러스는 당업계 공지된 다양한 방법으로 유도할 수 있으나, 예를 들어 1~3 ㎎/ℓ, 특히 2 ㎎/ℓ 2,4-다이클로로페녹시아세트산(2,4-D)이 첨가된 N6 배지(Chu et al., Scin Sin(1975) 18:659-668)에서 분열조직으로부터 캘러스를 유도하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게 상기 N6 배지의 다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물과 28~32g/L sucrose, 0.4~0.6g/L proline, 0.4~0.6g/L glutamine, 0.2~0.4g/L casamino acids, 0.007~0.015g/L myo-inositol, 1~3mg/L 2,4-D, 3~5g/L phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.6~6.0)에서 캘러스를 유도하여 계대배양하는 것이 바람직하다. 상기 N6 배지는 바람직하게 FeNaEDTA 35~38mg/L, H₃BO₃ 1~2mg/L, KI 0.5~1mg/L, MnSO₄H₂O 3~4mg/L, ZnSO₄7H₂O 1~2mg/L, CaCl₂ 125~126mg/L, KH₂PO₄ 390~410mg/L, KNO₃ 2820~2840mg/L, MgSO₄ 90~91mg/L, (NH₄)₂SO₄ 462~464mg/L, Glycine 1~2mg/L, Thiamine HCl 0.5~2mg/L, Pyrioxine HCl 0.3~0.7mg/L, Nicotinic acid 0.3~0.7mg/L, 28~32g/L sucrose, 0.3~0.7g/L proline, 0.3~0.7g/L glutamine, 0.1~0.5g/L casamino acids, 0.3~0.7g/L mes, 0.005~0.015g/L myo-inositol, 1~3mg/L 2,4-D, 4g/L phytagel이 첨가된 고체 배지이다 (pH5.6~6.0)이고, 더욱 바람직하게 N6 배지의 혼합물의 양은 2~6g/L이다.

아울러, 바람직한 캘러스 유도 온도는 25~32℃이고 보다 바람직하게 27~29℃이고, 4~7일간 수행하는 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 4.5~5.5일간 배양할 수 있으며, 암처리하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법에서, 목적 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 포함된 아그로박테리아를 배유를 제거한 식물체에 접종할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 상기 아그로박테리아는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 아그로박테리움속에 포함되는 어떠한 종도 포함될 수 있으며 예를 들어, 아그로박테리움 리조젠스(Agrobacterium rhizogenes), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 있고, 바람직하게 아그로박테리움 튜머파시엔스를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404(Agrobacterium thumefacience strain LBA4404)일 수 있다. 본 발명자들은 아그로박테리움 튜머파시엔스 EHA105에 비하여 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404가 캘러스 및 슈트 모두에서 2배 이상의 형질전환 효율을 나타냄을 확인하였다(도 2 참고).

상기 아그로박테리아의 식물체 접종시 아그로박테리아는 현탁액 상태로 접종될 수 있는바 아그로박테리아 현탁액에 배유를 제거한 식물체를 침지시키는 방식으로 접종할 수 있다. 접종되는 아그로박테리아의 균주 종류 및 목적 유전자 등에 따라 적절한 접종 조건(현탁액 농도, 접종 시간, 현탁용 액체, 및 pH 등을 포함) 등이 선택될 수 있으나 아그로박테리아 튜머파시엔스 LBA4404 접종 농도는 바람직하게는 OD₅₉₅에서 0.005 내지 0.05, 더욱 바람직하게는 0.008 내지 0.02 농도로 접종할 때 형질전환 효율이 현저히 향상될 수 있다. 본 발명자들은 아그로박테리아 튜머파시엔스 LBA4404를 OD₅₉₅에서 0.001 및 0.1 농도로 접종한 경우에 비하여 0.01 농도로 접종한 경우에, 캘러스 및 분화한 슈트 모두가 하이그로마이신(hygromycin) 저항성 및 형질전환 효율 면에서 현저히 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다(도 4 참고). 또한, 현탁용 액체로는 240~270mg/L MgSO₄7H₂O, 130~170mg/L CaCl₂2H₂O, 130~170mg/L NaH₂PO₄2H₂O, 3g/L KCl, 30~50mg/L Fe-EDTA, 7~13mg/L MnSO₄4-6H₂O, 1~3mg/L ZnSO₄7H₂O, 0.023~0.026g/L CuSO₄5H₂O, 0.023~0.026mg/L CoCl₂6H₂O, 0.73~0.77mg/L KI, 1~5mg/L H₃BO₃, 0.03~0.27mg/L Na₂MoO₄2H₂O, 98~103mg/L Myo-inositol, 0.7~1.3mg/L Nicotinic acid, 0.7~1.3mg/L pyridoxine-HCl, 7~13mg/L Thiamine-HCl, 495~505mg/L casamino acids, 7.3~7.7mg/L glycine, 176.4~177mg/L L-Arginine, 895~905mg/L L-Glutamine, 295~305mg/L L-Aspartic acid, 67~70g/L sucrose, 33~39g/L glucose, 97~103uM acetosyringone이 첨가된 AAM 액체 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 적정 pH는 5.5~6.0이고 보다 바람직하게 pH5.7~5.9이다. 아울러, 접종 시간은 바람직하게 1분-5분, 더욱 바람직하게 1-3분이다. 접종이 완료되면 아그로박테리아 현탁액을 제거한다. 현탁액 제거를 위해 다양한 방법이 사용될 수 있고 예컨대 여과지를 이용하여 여액을 제거할 수 있다.

본 발명에서는 재조합 발현 벡터가 포함된 아그로박테리아를 배유를 제거한 식물체에 접종한 다음, 공동 배양할 수 있다.

접종되는 아그로박테리아의 균주 종류 및 목적 유전자 등에 따라 적절한 배양 조건(배양 배지, 배양 시간, 배양 온도 등을 포함)이 선택될 수 있으나, 아그로박테리아 튜머파시엔스 LBA4404는 2N6-AS배지를 사용하는 것이 바람직하며, 이의 적정 pH는 4-6이고 보다 바람직한 pH는 5-5.5이다. 바람직한 배양 온도는 20-30℃, 더욱 바람직하게 23-27℃이며, 배양 일수는 목적 유전자가 도입되기에 충분한 시간이어야 하는바, 바람직하게 7일 이상, 더욱 바람직하게 7-10일이다. 암배양하는 것이 바람직하다. 아울러, 아그로박테리아가 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지지 않도록 하는 것이 바람직하나, 이러한 조건에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어, "형질전환"은 유전자를 숙주로 도입하여 유전자가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미하고 이에는 형질감염도 포함한다. 상기 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "형질전환된 숙주, 형질전환된 식물체 또는 형질전환체" 는 상기 "형질전환에 사용될 식물, 형질전환 대상 식물체, 형질전환 숙주"에 목적 유전자가 도입된 식물을 의미한다.

목적 유전자로는 동식물, 미생물 등 다양한 종으로부터 유래된 유전자를 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 제초제 저항성, 해충 저항성, 곰팡이 저항성, 바이러스 저항성, 세균 저항성, 선충 저항성, 비 생물적 스트레스 저항성(염해, 한발, 저온 등), 광합성 효율 증진, 영양 증진, 또는 유용 물질 생산에 관련된 유전자 등 다양한 유전자를 이용할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 유전자 발현을 실시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부의 경우 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 용어, "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호교환적으로 사용된다. 조절 서열은 특정한 숙주에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다. 본 발명에 사용하기 위한 재조합 발현 벡터 제조에 가능한 벡터로는 예를 들면, 파지 벡터 또는 플라스미드 벡터로부터 유래할 수 있다. 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서는, 예를 들면 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, Charon21A 등을 들 수 있고, 플라스미드 벡터로서는, 예를 들면 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pET계, pMal계, pQE계 등을 들 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, pGA2897 벡터를 사용하였고, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터에 의해 조절되는 hygromycin phosphotransferase (HPT)유전자와 Maize ubiquitine 프로모터와 NOS terminator 그리고 pGA1611의 T-DNA부위로 구성되어 있다(도 1 참고).

본 발명에 따른 방법에서는, 선발된 세포로부터 재분화 식물체를 유도하는 단계가 포함될 수 있고, 보다 구체적으로 식물체의 슈트(shoot)를 유도하는 단계가 포함될 수 있는 바, 당업계 공지된 다양한 조건에서 수행될 수 있으나 본 발명자들은 MSR(modified super rich) 배지에서 유도하는 것이 REIII 배지에서 유도하는 것에 비해 약 2배의 형질전환 효율 향상 효과를 나타냄을 확인하였다(도 5). 따라서 MSR 배지에서 줄기를 유도하는 것이 바람직하다. 상기 MSR 배지에는 식물체의 종류, 목적 유전자의 종류 등에 따라 기타 탄소원, 질소원, 무기염류, 생장소, 한천, 활성탄 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 목적 유전자의 종류, 식물체의 종류 등에 따라 당업계 공지된 적절한 온도, 시간 등이 선택될 수 있다. 바람직하게, 상기 MSR 배지는 Murashige & Skoog가 개발한 MS 배지의 다량원소, 미량원소, 비타민(문헌 [Murashig et al., Plant Physiol. (1962) 15: 473-497]) 혼합물과 27~33g/L sorbitol, 17~23g/L maltose, 0.4~0.6g/L mes, 0.07~0.13mg/L α-naphthalenacetic acid(NAA), 1.7~2.3mg/L Kinetin, 197~203mg/L cefotaxime, 37~43mg/L hygromycin, 3.7~4.3g/L phytagel을 첨가하여 고체배지(pH5.6~6.0)로 만들 수 있다. 상기 MS배지는 보다 바람직하게 CoCl₂6H₂O 0.02~0.03mg/L, CuSO₄5H₂O 0.02~0.03mg/L, FeNaEDTA 36~38mg/L, H₃BO₃ 6~7mg/L, KI 0.8~0.9mg/L, MnSO₄H₂O 16~18mg/L, Na₂MoO₄2H₂O 0.2~0.3mg/L, ZnSO₄7H₂O 8~10mg/L, CaCl₂ 330~335mg/L, KH₂PO₄ 165~175mg/L, KNO₃ 1890~1910mg/L, MgSO₄ 180~182mg/L, NH₄NO₃ 160~170mg/L, Glycine 1~3mg/L, myo-inositol 95~105mg/L, Nicotinic acid 0.3~0.7mg/L, Pyrioxine HCl 0.3~0.7mg/L, Thiamine HCl 0.05~0.15mg/L로 이루어질 수 있고 더욱 바람직하게 MS배지의 혼합물의 양은 4~5g/L일 수 있다.

아울러, 더욱 바람직하게 형질전환된 세포를 선발마커가 포함된 배지에서 선발하고 증식하고, 세포 선발 단계를 거쳐, 선발된 세포로부터 재분화 식물체를 유도할 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 식물체 형질전환 방법은 종래의 아그로박테리아 형질전환 기법에 비해 현저히 향상된 형질전환율을 나타내는바, 효과적인 식물체 형질전환 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 pGA2897 벡터의 유전자지도를 나타낸 것이다.
도 2는 아그로박테리아 균주에 따른 형질전환 효율을 비교한 것이다.
도 3은 아그로박테리아와 캘러스를 공동 배양하는 기간에 따른 형질전환 효율을 비교한 것이다.
도 4는 아그로박테리아 공동 배양시 아그로박테리아의 접종농도에 따른 형질전환 효율을 비교한 것이다.
도 5는 아그로박테리아와의 공동 배양 후 벼의 배유 부위를 제거한 경우와 제거하지 않은 경우의 형질전환 효율을 비교한 것이다.
도 6은 벼의 줄기 유도 배지 종류에 따른 형질전환 효율을 비교한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다.　 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 형질전환용 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스의 배양

하이그로마이신 저항성 마커를 갖는 pGA2897 벡터를 제작하였다. 본 벡터는 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터에 의해 조절되는 hygromycin phosphotransferase (HPT) 유전자와 Maize ubiquitine 프로모터와 NOS terminator 그리고 pGA1611의 T-DNA부위로 구성되어있다. 이 벡터를 전기 충격법에 의하여 아그로박테리움 튜머파이시엔스 LBA4404에 형질전환시켜 Tetracyclin이 들어있는 LB 배지에서 형질전환체를 선발하였다.

선발된 아그로박테리아를 1g/L NH₄Cl, 1.3g/L NaH₂PO₄2H₂O, 3g/L K₂HPO₄, 296mg/L MgSO₄7H₂O, 10mg/L CaCl₂2H₂O, 150mg/L KCl, 2.5mg/L FeSO₄7H₂O, 5g/L glucose, 15g/L bacto agar가 첨가된 AB 고체배지(pH7.2)에서 배양하였다. 증식 목적으로 상기 아그로박테리아를 또한 10g/L yeast extract, 10g/L pepton, 5g/L sodium chloride, 15g/L bacto agar가 첨가된 고체배지(pH7.5)에서 배양하였다. 28℃에서 총 3일간 배양하였다.

AB 고체배지에서 자란 아그로박테리아를 250mg/L MgSO₄7H₂O, 150mg/L CaCl₂2H₂O, 150mg/L NaH₂PO₄2H₂O, 3g/L KCl, 40mg/L Fe-EDTA, 10mg/L MnSO₄4-6H₂O, 2mg/L ZnSO₄7H₂O, 0.025g/L CuSO₄5H₂O, 0.025mg/L CoCl₂6H₂O, 0.75mg/L KI, 3mg/L H₃BO₃, 0.25mg/L Na₂MoO₄2H₂O, 100mg/L Myo-inositol, 1mg/L Nicotinic acid, 1mg/L pyridoxine-HCl, 10mg/L Thiamine-HCl, 500mg/L casamino acids, 7.5mg/L glycine, 176.7mg/L L-Arginine, 900mg/L L-Glutamine, 300mg/L L-Aspartic acid, 68.5g/L sucrose, 36g/L glucose, 100uM acetosyringone이 첨가된 AAM 액체 배지(pH5.8)에 백금이를 이용하여 모았다. 균들이 뭉치지 않고 균일하게 풀어지도록 잘 흔들어서 현탁액을 만들었다. 현탁액에서 아그로박테리아의 농도는 흡광도기계(PerkinElmer, VICTOR3^TM)의 595nm파장에 의해 측정하며, OD₅₉₅=0.1이 되도록 아그로박테리아 현탁액을 만든 후 AAM 액체 배지로 1/10배, 1/100배 희석하여 OD₅₉₅=0.01 현탁액과 OD₅₉₅=0.001 현탁액을 준비하였다.

실시예 2. 캘러스 유도 및 배유 제거

벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용하였다. 볍씨를 70% 에탄올에서 1분간 침지시킨 후 락스 30mL당 10uL Tween 20을 떨어뜨린 것을 50% 소독한 용액에서 40분간 소독하였다. 소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척하였다. 소독액을 잘 세척하고 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 2N6 배지에 볍씨를 치상하였다. 이때 볍씨는 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하며 씨눈은 위로 향하도록 하였다. 2N6 배지는 문헌에 기재한 N6 배지에 일부 수정된 배지로 만든다. (Chu et al., Scin Sin(1975)18:659-668). 즉 FeNaEDTA 36.7mg/L, H₃BO₃ 1.6mg/L, KI 0.8mg/L, MnSO₄H₂O 3.33mg/L, ZnSO₄7H₂O 1.5mg/L, CaCl₂ 125.33mg/L, KH₂PO₄ 400mg/L, KNO₃ 2830mg/L, MgSO₄ 90.27mg/L, (NH₄)₂SO₄ 463mg/L, Glycine 2mg/L, Thiamine HCl 1mg/L, Pyrioxine HCl 0.5mg/L, Nicotinic acid 0.5mg/L, 30g/L sucrose, 0.5g/L proline, 0.5g/L glutamine, 0.3g/L casamino acids, 0.5g/L mes, 0.01g/L myo-inositol, 2mg/L 2,4-D, 4g/L phytagel이 첨가된 고체 배지이다 (pH5.8). 배양온도는 28℃로 하고 암처리하였다.

2N6에서 5일간 배양하며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거하였다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어 캘러스가 훼손되는 것을 방지하였다.

실시예 3. 아그로박테리아를 이용한 벼 형질전환

상기 실시예 1에서 준비한 아그로박테리아 현탁액에 실시예 2에서 준비한 배유를 제거한 캘러스를 2분간 침지시켜 아그로박테리아를 접종하여, 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어 주었다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리며 여과지를 이용하여 신속히 여액을 제거하여 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의하였다. 캘러스는 2N6-AS 배지에 옮겨서 공동 배양하였다. 2N6-AS배지는 2N6 배지에 10g/L glucose와 100uM acetosyringone을 추가하여 만든 배지로 pH5.2로 조정하였다. 배지 위에는 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 올려놓았다. 여과지는 공동 배양 기간 동안 아그로박테리아가 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 25℃에서 7일간 암배양을 통해 공동 배양하였다.

공동 배양이 끝나면 캘러스에 유용 유전자를 삽입하는 기능을 맡았던 아그로박테리아가 더 이상 필요 없으므로 세척 작업을 통해 제거하였다. 세척은 멸균증류수 1L에 항생제인 carbenicillin을 500mg을 넣은 용액으로 수행하며, 캘러스를 3회 정도 세척한 뒤 여과지를 사용하여 여액까지 모두 제거하였다. 다만, 아그로박테리아 LBA4404 균주를 사용하는 경우에는 공동 배양 기간 동안 아그로박테리아의 과도한 성장이 이루어지지 않았기 때문에 위의 세척 작업을 하지 않았다. 캘러스를 2N6 배지에 항생제인 cefotaxime 200mg/L, Hygromycin 40mg/L를 첨가한 2N6-CH 배지로 옮겼다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2~3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양하였다. 28℃의 암배양기에서 14일간 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다.

14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 옮겨 계대배양하였다. 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 형질전환된 캘러스의 구분을 판단하여 갈변되어 죽은 캘러스는 버렸다.

실시예 4. 슈트 및 뿌리 유도

2N6-CH 배지에서 유도된 캘러스는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양하여 슈트와 뿌리를 유도한다. MSR 배지는 Murashige & Skoog(1962)가 개발한 MS 배지의 다량원소, 미량원소, 비타민 혼합물 4.4g/L에 일부 수정된 배지로 만든다. 즉 CoCl₂6H₂O 0.025mg/L, CuSO₄5H₂O 0.025mg/L, FeNaEDTA 36.7mg/L, H₃BO₃ 6.2mg/L, KI 0.83mg/L, MnSO₄H₂O 16.9mg/L, Na₂MoO₄2H₂O 0.25mg/L, ZnSO₄7H₂O 8.6mg/L, CaCl₂ 332.02mg/L, KH₂PO₄ 170mg/L, KNO₃ 1900mg/L, MgSO₄ 180.54mg/L, NH₄NO₃ 165mg/L, Glycine 2mg/L, myo-inositol 100mg/L, Nicotinic acid 0.5mg/L, Pyrioxine HCl 0.5mg/L, Thiamine HCl 0.1mg/L, 30g/L sorbitol, 20g/L maltose, 0.5g/L mes, 0.1mg/L α-naphthalenacetic acid (NAA), 2mg/L kinetin, 200mg/L cefotaxime, 40mg/L hygromycin, 4g/L phytagel을 첨가한 고체배지(pH5.8)이다. 캘러스는 최대한 MSR 배지와 넓은 면적이 닿도록 계대배양하며 슈트와 뿌리가 분화될 때까지 2주에서 3주마다 계대배양해주며, 2주가 바람직하다. 배양온도는 28℃이며 16시간 광주기와 8시간 암주기를 가진 배양실에서 배양한다.

실험예 1. 아그로박테리아 균주에 따른 형질전환 효율 비교

아그로박테리아는 EHA105와 LBA4404 균주를 사용하였다. 두 균주에는 형질전환벡터인 pGA2897이 동일하게 삽입되어 있으며, AB 배지에 항생제인 Tetracycine가 5mg/L, Rifampicin 50mg/L가 첨가된 고체배지에서 배양하였다. 아그로박테리아의 현탁액을 만드는 방식은 동일하며, OD₅₉₅=0.01을 만들어 배유가 제거된 캘러스에 접종시켰다.

캘러스에서 배유를 제거하는 방식 및 접종과 공동 배양 과정은 두 균주에서 모두 동일하게 진행하였다. 형질전환된 캘러스는 항생제인 하이그로마이신에서 생존하여 분열하는 캘러스의 발생으로 판단하며, 이후 형질전환된 슈트는 마찬가지로 하이그로마이신에서 생존하여 발생하는 슈트의 발생으로 판단하였다.

형질전환 결과, EHA105 균주와 비교하여 LBA4404 균주를 사용한 경우에 하이그로마이신에서 생존하여 분열하는 캘러스가 약 2배가량 많이 관찰되어 형질전환된 캘러스의 비율이 높음을 알 수 있었고(도 2 좌측), 슈트 발생 역시 2배 이상으로 우수함을 알 수 있었다 (도 2 우측). 따라서 이를 통해 LBA4404 균주를 사용하는 것이 벼 형질전환에 효과적임을 알 수 있었다.

실험예 2. 아그로박테리아와 캘러스를 공동 배양하는 기간에 따른 형질전환 효율 비교

아그로박테리아 현탁액에서 2분간 접종을 한 캘러스에서 여액을 제거한 후 여과지가 한 장 깔려있는 2N6-AS 배지로 옮겼다. 이 단계는 아그로박테리아와 캘러스를 공동 배양하기 위함이며, 여과지는 아그로박테리아의 과도한 성장을 방지하기 위함이다. 배양 온도는 25℃가 적당하며 암배양하였다. 기간은 3일, 5일, 7일로 나누어 진행하였고 공동 배양이 끝나면 cefotaxime이 첨가된 캘러스 유도 배지 (2N6-CH)로 옮겨 아그로박테리아의 성장을 억제하였다. 이후 각 처리 조건에서 하이그로마이신에 저항성인 캘러스와 슈트의 발생을 관찰하여 공동 배양 기간의 차이에 따른 형질전환 효율을 비교하였다.

그 결과, 7일간 공동 배양하는 것이 최적 효율을 나타냄을 알 수 있었다(도 3).

실험예 3. 아그로박테리아 공동 배양시 아그로박테리아의 접종농도에 따른 형질전환 효율 비교

아그로박테리아는 AB 고체 배지에 배양하여 증식한 것을 사용하며, AAM 액체배지를 이용하여 현탁액을 만들었다. 현탁액에서 아그로박테리아의 농도는 흡광도 기계를 사용하여 측정하며 먼저 OD₅₉₅=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD₅₉₅=0.01을 만들고, 100배 희석하여 OD₅₉₅=0.001을 만들었다.

세 가지 종류의 현탁액을 이용하여 캘러스에 접종시켰을 때, 형질전환된 캘러스 발생 비율과 형질전환된 슈트 발생 비율을 비교하였다.

그 결과, OD₅₉₅=0.1 및 OD₅₉₅=0.001인 경우에 비하여, OD₅₉₅=0.01인 경우에 하이그로마이신에서 생존하여 분열하는 캘러스가 다량 관찰되어 캘러스의 형질전환율이 높음을 알 수 있었고(도 4 좌측), 하이그로마이신에서 생존하여 분열하는 슈트 역시 다른 농도에 비하여 다량 관찰되어 슈트의 형질전환 효율 역시 우수함을 알 수 있었다(도 4 우측). 따라서 이를 통해 OD₅₉₅=0.01의 아그로박테리아 현탁액을 사용하는 것이 형질전환에 효과적임을 알 수 있었다.

실험예 4. 배유 부위 제거에 따른 형질전환 효율 비교

70% 에탄올에서 1분, 50% 락스에서 40분간 소독한 볍씨를 멸균증류수로 5회 세척한 뒤 여과지를 이용하여 여액을 제거한 뒤, 2N6 배지에 치상하였다. 이때 씨눈이 배지와 닿도록 하고 배양온도가 28℃인 암배양기에서 5일간 배양하였다. 5일 후 씨눈 부위에서 캘러스가 발생하는데, 캘러스가 발생한 볍씨를 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 그대로 놔두고 한 그룹에서는 핀셋을 이용하여 조심스럽게 배유를 제거하였다. 이때 자엽과 뿌리 부분은 그대로 남겨두어 캘러스가 훼손되지 않도록 하였다. 이 캘러스들을 아그로박테리아와 접종, 공동 배양하여 형질전환체를 만들고, 두 그룹에서 형질전환된 캘러스 발생 비율과 형질전환된 슈트 발생 비율을 비교하였다.

그 결과, 배유를 제거하지 않은 경우에 비하여, 배유를 제거한 경우에 하이그로마이신에서 생존하여 분열하는 캘러스가 다량 관찰되어 캘러스의 형질전환율이 높음을 알 수 있었고(도 5 좌측), 하이그로마이신에서 생존하여 분열하는 슈트도 배유를 제거하지 않은 경우에 비하여 다량 관찰되어 슈트의 형질전환 효율 역시 우수함을 알 수 있었다 (도 5 우측). 따라서 이를 통해 배유를 제거하는 것이 제거하지 않는 것에 비하여 형질전환에 효과적임을 알 수 있었다.

실험예 5. 벼의 슈트 유도 배지 종류에 따른 형질전환 효율 비교

볍씨를 소독한 뒤 2N6배지에 치상하여 캘러스를 유도하고 배유를 제거한 다음 유용 유전자를 가진 아그로박테리아와 공동 배양 시킨 뒤, 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스를 유도하였다.

형질전환된 캘러스는 두 그룹으로 나누어 재분화 배지인 MSR 배지와 ReIII 배지에 계대배양하였다.

캘러스는 최대한 MSR 배지와 넓은 면적이 닿도록 계대배양하며 슈트와 뿌리가 분화될 때까지 28℃에서 16시간 광주기와 8시간 암주기를 가진 배양실에서 2주마다 계대배양하였다.

두 그룹에서 형질전환된 캘러스 발생 비율과 형질전환된 슈트 발생 비율을 비교한 결과, ReIII 배지에서 계대배양한 경우에 비하여 MSR 배지에서 계대배양한 경우에 슈트의 형질전환 효율이 약 2배 이상으로 나타나, MSR 배지에서 계대배양하는 것이 우수한 효과를 가짐을 알 수 있었다(도 6).

Claims (7)

1. 아그로박테리아를 이용한 식물체 형질전환 방법에 있어서,
   배유가 제거되고 자엽은 포함하는 식물체에 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404(Agrobacterium thumefacience strain LBA4404) 현탁액을 OD595에서 0.005 내지 0.05의 농도로 접종하고 7-10일간 공동 배양하는 단계; 및
   형질전환된 식물체를 선발하여 MS 배지에 27~33g/L 소르비톨(sorbitol), 17~23g/L 말토스(maltose), 0.4~0.6g/L 메스(mes), 0.07~0.13mg/L 알파-나프탈렌아세트산(α-naphthalenacetic acid, NAA), 1.7~2.3mg/L 키네틴(Kinetin), 197~203mg/L 세포탁심(cefotaxime), 37~43mg/L 하이그로마이신(hygromycin), 및 3.7~4.3g/L 피타겔(phytagel)를 첨가한 배지에서 계대배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체 형질전환 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 식물체는 배유 제거 전에 1~3 ㎎/ℓ의 2,4-다이클로로페녹시아세트산이 첨가된 N6 배지에서 25~32℃의 온도로 4~7일 동안 배양한 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 식물체는 벼의 캘러스인 것을 특징으로 하는 방법.
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