KR101552140B1

KR101552140B1 - 콩 모자이크 바이러스에 대한 내성이 증진된 콩 형질전환 식물체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101552140B1
Application number: KR1020130127676A
Authority: KR
Inventors: 정영수; 김국형; 김혜정; 김미진; 박정훈; 이재헌; 이기정; 정민경; 임현희; 윤수영
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2015-09-10
Also published as: KR20150047787A

Abstract

본 발명은 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터로 형질전환되어, 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체 및 이의 종자, 및 상기 벡터를 식물에 형질전환하여, HC-Pro 유전자의 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

Description

콩 모자이크 바이러스에 대한 내성이 증진된 콩 형질전환 식물체 및 그 제조방법{Transgenic soybean plant with enhanced tolerance to Soybean mosaic virus and production method thereof}

본 발명은 콩 모자이크 바이러스에 대한 내성이 증진된 콩 형질전환 식물체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터로 형질전환되어, 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체 및 이의 종자, 및 상기 벡터를 식물에 형질전환하여, HC-Pro 유전자의 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

RNA 사일렌싱 (RNA silencing)은 바이러스 감염으로부터 보호할 수 있는 바이러스 방어 메커니즘으로 알려져 있다. 식물 바이러스는 RNA 게놈을 가지고 있고 RNA 사일렌싱의 유도 인자 및 전사 후 유전자 발현 억제 (post-transcriptional gene silencing, PTGS)의 타겟으로 알려져 있다. 반면에, 몇몇의 바이러스들은 RNA 사일렌싱을 억제하는 단백질들을 암호화한다. 포티바이러스 RNA 사일렌싱 억제 유전자인 HC-Pro(Helper - component proteinase)는 식물 바이러스에 의해 암호화되는 다기능적인 단백질로서, 바이러스 감염 사이클의 단계, 복제, 진딧물의 매개 그리고 바이러스의 전신성(systemic)과 세포에서 세포(cell-to-cell) 이동에 관련되어 있다. 특히, HC-Pro는 siRNA의 축적을 차단하는 PTGS의 억제 유전자로 확인된다.

RNA 간섭(RNAi)은 식물에서 유전자의 기능 분석을 위한 흥미로운 생명 공학적 접근 중에 하나이며, PTGS로도 알려진 바이러스 방어 메커니즘이다. RNAi의 중요한 열쇠는 PTGS의 개시 인자인 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 생산에 있다. dsRNA들은 다이서 (dicer)라 불리는 RNase III-유사 효소에 의해 21-23 뉴클레오타이드의 siRNAs(small interference RNAs)로 쪼개진다. 이 siRNA들은 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하게 된다. RISC는 이중-가닥 siRNAs를 풀고, siRNA를 가이드로 사용하여 목표 mRNA에 묶이게 되며, 특정 유전자 발현의 억제를 야기시키는 mRNA를 쪼갠다. 그러므로, RNAi는 목표 유전자를 녹다운 (knockdown)시키고 식물의 명확한 특성을 침묵시키는 중요한 도구가 될 수 있다. 그 결과, 식물의 바이러스 병은 조절될 수 있으며 작물은 바이러스와 곤충으로부터 보호받을 수 있다.

콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus, SMV)는 콩에서 발생하는 가장 잘 알려진 바이러스 병으로서, 약 10 kb의 양성-센스(positive sense) 단일-가닥 RNA 게놈을 가지고 있는 포티비리대(Potyviridae) 과에 속한다. 대부분의 바이러스 증상은 감염된 콩의 잎과 종자에서 발견된다. 잎의 경우에는 모자이크 패턴, 구부러짐, 괴사 등의 증상이 나타나며, 종자의 경우에는 반점 및 얼룩무늬가 종피에 뚜렷이 나타난다. 특히, 감염된 콩 식물은 두드러진 종자 수의 감소로 인해 수확량의 손실이 생기게 된다. 콩 모자이크 바이러스의 전염은 부모에서 자손으로 퍼질 뿐만 아니라 다른 종류의 진딧물의 이동에 의해서 발생하게 된다.

콩(Glycine max (L.) Merr.)은 전 세계적인 주된 작물로 음식과 음료에 있어서 최고의 식물성 기름과 단백질을 제공해 준다. 콩을 중요한 작물로 고려해 볼 때, 형질전환기술은 콩에서 가치 있는 유전적 특징을 향상시키기 위해 널리 사용되고 있다. 다양한 유용한 유전자들을 도입한 콩 형질전환 식물체는 CN(cotyledonary-node) 방법을 바탕으로 아그로박테리움을 매개로 한 형질전환 시스템을 이용하여 발달되어 왔고, 최근에는 반-종자 외식체(half-seed explants)를 이용하여 시스템이 향상되었다. 게다가, 추가적인 티올 화합물(thiol compound) 혼합의 사용과 초음파 분해 및 진공 처리의 적용은 형질전환 효율에 긍정적인 향상을 가져다주었다.

본 발명은 콩 모자이크 바이러스의 억제자 HC - Pro (suppressor HC - Pro) 유전자를 RNAi 원리에 적용시키기 위해 아그로박테리움을 매개로 한 형질전환 기술을 콩에 도입하여 형질전환체를 만들었으며, 그 결과 콩 모자이크 바이러스 저항성을 보이는 콩 형질전환체를 개발하기 위해 연구를 주력하였다.

바이러스 저항성 작물은 육종을 통해서도 만들어질 수 있지만 육종이 아닌 생명공학기법을 이용한 특정 바이러스 저항성 작물의 생산은 시도된 적이 없다. 갈수록 병저항성 육종소재가 고갈되어가고 있는 현실을 고려할 때, 육종 이외의 방법 개발은 매우 고무적인 일이다. 그리하여 본 발명에서는 생명공학기술을 이용하여 교잡육종적인 방법이 아닌 다른 방법으로 콩 모자이크 바이러스의 억제자 HC-Pro 유전자를 RNAi 원리에 이용하여 도입하였고, 그 결과 콩 모자이크 바이러스에 저항성을 나타내는 콩 형질전환체가 생산되는지를 확인하고자 한다.

한국공개특허 제2012-0041608호에서는 콩에서 유용 유전자의 기능 분석을 위한 콩 황반 모자이크 바이러스 유래의 재조합 VIGS 벡터 및 이의 용도이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 콩 모자이크 바이러스에 대한 내성이 증진된 콩 형질전환체 식물체 및 그 제조방법에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 HC-Pro 유전자의 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 식물에 형질전환하여, 형질전환 식물체가 콩 모자이크 바이러스에 대해 야생형 식물체에 비해 상당한 내성의 증진을 보이는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 이용한 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 식물에 형질전환하여, HC-Pro 유전자의 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 유효성분으로 함유하는, 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 콩 모자이크 바이러스의 HC-Pro 유전자를 RNAi 벡터에 도입하였고, 아그로박테리움을 매개로 한 형질전환기술을 이용하여 콩에 도입하면 콩 모자이크 바이러스에 저항성을 나타내는 콩 형질전환체를 생산시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 콩 형질전환 벡터 {HC -Pro(RNAi)}의 모식도를 나타낸 것이 다.
도 2는 HC - Pro(RNAi)를 이용하여 형질전환시킨 콩 식물체의 생장 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 HC-Pro(RNAi) T₀ 형질전환체에서 삽입 유전자를 확인하기 위해 수행한 PCR 결과를 나타낸 것이다. NT: 광안콩 (야생형), EV: 공벡터, 1-9: 형질전환체.
도 4는 HC-Pro(RNAi) T₂ 형질전환체에서 삽입 유전자를 확인하기 위해 수행한 서던 블로팅 (Southern blotting) 결과를 나타낸 것이다. NT: 광안콩 (야생형), EV: 공벡터, #1-6: T₂ 형질전환체.
도 5는 바이러스를 인위적으로 감염시킨 HC-Pro(RNAi) T₂ 형질전환체에서 콩 모자이크 바이러스의 병징 검정을 나타낸 것이다. NT: 광안콩 (야생형), NT(M): 바이러스를 감염시킨 광안콩 (야생형), EV(M): 바이러스를 감염시킨 공벡터, 1-6: 바이러스를 감염시킨 형질전환체, R: 바이러스 저항성, mM: 마일드 모자이크 증상, M: 모자이크 증상.
도 6은 바이러스를 인위적으로 감염시킨 HC-Pro(RNAi) T₂ 형질전환체에서 바이러스 발현 분석을 위해 수행한 노던 블로팅 (Northern blotting) 결과를 나타낸 것이다. NT: 광안콩 (야생형), NT(M): 바이러스를 감염시킨 광안콩 (야생형), EV(M): 바이러스를 감염시킨 공벡터, #1-6: 바이러스를 감염시킨 형질전환체, R: 바이러스 저항성, mM: 마일드 모자이크 증상, M: 모자이크 증상.
도 7은 바이러스를 인위적으로 감염시킨 HC-Pro(RNAi) T₂ 형질전환체에서 바이러스 발현 분석을 위해 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. NT: 광안콩 (야생형), NT(M): 바이러스를 감염시킨 광안콩 (야생형), EV(M): 바이러스를 감염시킨 공벡터, #1-6: 바이러스를 감염시킨 형질전환체, R: 바이러스 저항성, mM: 마일드 모자이크 증상, M: 모자이크 증상.
도 8은 바이러스를 인위적으로 감염시킨 HC - Pro(RNAi) T₂ 형질전환체에서 수확한 T₃ 종자의 형태를 나타내는 것이다. NT: 광안콩 (야생형), NT(M): 바이러스를 감염시킨 광안콩 (야생형), EV(M): 바이러스를 감염시킨 공벡터, #1-6: 바이러스를 감염시킨 형질전환체, R: 바이러스 저항성, mM: 마일드 모자이크 증상, M: 모자이크 증상.
도 9는 바이러스를 인위적으로 감염시킨 HC - Pro(RNAi) T₂ 형질전환체에서 수확한 T₃ 종자의 바이러스 발현 분석을 위해 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. NT: 광안콩 (야생형), NT(M): 바이러스를 감염시킨 광안콩 (야생형), EV(M): 바이러스를 감염시킨 공벡터, #1-6: 바이러스를 감염시킨 형질전환체, R: 바이러스 저항성, mM: 마일드 모자이크 증상, M: 모자이크 증상.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 제공한다.

상기 HC-Pro 유전자는 HC-Pro 유전자 내 시스테인 단백질 가수분해효소 도메인(cysteine proteinase domain)을 포함하는 서열을 말하며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 식물 RNAi 발현 벡터는 예를 들면, 도 1에 기재된 pB7GWIWG2(I)::HC-Pro 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 7274; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 10991102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

본 발명의 HC-Pro 융합유전자로 형질전환된 식물은 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 탁월한 내성을 갖는다.

상기 식물은 바람직하게는 콩 모자이크 바이러스의 기주 식물이며, 완두콩, 강낭콩 등의 콩 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 1로 표시된 염기서열로 이루어지는 HC-Pro 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 식물에 형질전환하여, HC-Pro 유전자의 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.

HC-Pro 유전자의 유전자 침묵을 유도하는 방법으로는 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 본 발명에서는 식물 바이러스 유전자 쪽으로 향하는 유전자 침묵 구축물로서 식물을 형질전환함으로써 식물체가 바이러스에 대한 내성을 가지는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 유효성분으로 함유하는, 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 함유하며, 상기 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시킬 수 있는 것이다. 상기 식물은 바람직하게는 콩일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 콩 모자이크 바이러스의 억제자 HC - Pro 가 도입된 RNAi 벡터 제작

HC - Pro는 콩 모자이크 바이러스 균주 G7H에서 유래한 유전자이며 서울대학교 김국형 교수로부터 제공받았다. 서브클로닝을 위한 cDNA 절편은 PCR에 의해 준비되었다. 증폭하여 얻어진 유전자를 pENTR/D-TOPO 벡터 (Invitrogen사, 미국)에 서브클로닝을 하여 염기 서열을 확인하였다. 확인한 pENTR-HC - Pro를 최종 목적 벡터인 pB7GWIWG2(I)에 구축하기 위해서 인비트로진사의 GatewayLR Clonase^TM Enzyme mix Kit를 사용하였고, 인비트로진사의 DH5α를 컴피턴트 세포(competent cell)로 사용하여 형질전환하였다. 구축된 pB7GWIWG2(I)- HC - Pro 벡터 (도 1)는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 EHA105에 형질전환하였다.

2. 콩 형질전환체 및 T ₁ 종자 생산

2-1. 종자 소독 및 침지

종자는 강염산(12N HCl 5 mL)에 락스(12% 나트륨 치아염소산염 100 mL)를 혼합하여 발생시킨 염산가스에 20시간 소독을 한 뒤 1% 나트륨 치아염소산염(sodium hypochlorite)에 10분간 현탁배양하면서 2차 소독을 하였고, 10분 간격으로 멸균수로 3회 수세하였다. 소독한 종자를 50 mL 코니컬 튜브에 넣고 멸균수를 부어 20시간 동안 상온에서 침지시켰다.

2-2. 접종 균 (Agrobacterium tumefaciens) 준비

콩 형질전환 실험에는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 EHA105에 구축된 pB7GWIWG2(I)-HC-Pro 벡터를 사용하였으며 PPT^R를포함하고 있다. 고체 YEP 배지 [카나마이신 100 ㎎/L, 리팜피신 25 ㎎/L, 펩톤 10 g/L, NaCl 5 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 1.5%(w/v) 아가 (pH 7.0)]에 긁은 후 25℃에서 배양하여 생성된 단일 콜로니를 같은 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 10 mL에 넣고 OD₆₅₀이 0.6~0.8이 될 때까지 25℃에서 250 rpm으로 교반하였다. 다 자란 배양균에 30% 글리세롤 스톡 10 mL을 넣고 섞은 뒤, 1.5 mL 튜브에 1 mL씩 분주하여 액체 질소로 급속 냉각하여 -70℃에서 보관하였다. 접종 하루 전에 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 200 mL에 -70℃에서 보관해 놓은 아그로박테리움 튜머파시엔스 스톡 (competent cell)을 1 ml 넣고 OD₆₅₀이 0.6~0.8이 될 때까지 25℃에서 250 rpm으로 배양기에서 흔들어 주었다.

접종 당일에 액체 YEP 배지 200 mL를 50 mL씩 나눠서 20℃, 3270 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 각각의 튜브에 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스 펠렛을 액체 CCM (co-cultivation medium; B5 염 0.32 g/L, BA 1.67 ㎎/L, MES 20 mM, GA₃ 0.25 ㎎/L, 아세토시린콘 0.2 mM, L-Cysteine 3.3 mM, 소듐 티오설페이트 1.0 mM, DTT 1.0 mM, 수크로스 3%, pH 5.4) 15 mL을 넣어 준비하였다.

2-3. 접종과 공배양

침지해 놓은 종자의 양 떡잎 사이로 외과용 메스를 넣어 하배축까지 수직으로 자르고 종피를 제거하였다. 배축을 떡잎 밑 약 1 ㎝되는 곳에서 자른 후 배축( embryonic axis)이 붙어있는 한쪽을 외과용 메스 (＃11 blade)로 7·8회 정도 상처를 내었다. 이때 외과용 메스에 15 mL 농축액을 묻힌 다음 목표 부위에 상처를 내었다. 대략 50개 정도의 절편체를 15 mL 공동배양/아그로박테리움 튜머파시엔스에 넣고 초음파 분해 처리(sonication)를 20초 하였고, 클린벤치 안에서 데시게이터｛250 ㎜ (가로)×250 ㎜ (세로)×300 ㎜ (높이)}와 다이어프램펌프 (GAST사)를 이용해 진공(vacuum) 30초 (500 mm.Hg) 처리를 한 뒤 30분 동안 접종시켰다. 각각의 절편체를 튜브에서 꺼내 멸균한 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤, 고체 CCM (액체와 동일, 아가 0.7%)에도 여과지를 한 장 깔고 10개체를 올려두었다 {향축(adaxial) 부분이 아래로 향하도록 둔다}. 마이크로포어(Micropore)로 봉한 뒤 25℃, 18시간 광주기에 5일 동안 공배양하였다.

2-4. 세척 및 신초 유도

5일간 공배양을 한 후에 제균을 위해서 액체 1/2 SIM (신초 유도 배지)에 10분 동안 간단히 세척하였다. 각각의 절편체를 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤 선발항생제가 없는 SI-① (shoot induction medium; B5 염 3.2 g/L, BA 1.67 ㎎/L, MES 3 mM, 아가 0.8%, 수크로스 3%, 세포탁심 250 ㎎/L, 밴코마이신 50 ㎎/L, 티카르실린 100 ㎎/L, pH 5.6)에 한 플레이트 (plate)당 6개체씩 배축 부분이 배지에 고착되고 재분화될 부분이 30°정도의 각도로 위로 향하도록 치상하였다. 각각의 플레이트를 마이크로포어로 봉한 뒤 25℃, 18시간 광주기에서 배양시켰다.

2주 후 신초가 나온 절편체를 선발항생제 PPT 10 ㎎ /L가 들어있는 SI-② (SI-①과 동일, DL-포스피노트리신 10 ㎎/L 첨가, pH 5.6)에 치상하였는데, 이때 신초을 제외한 나머지 부분은 잘라버리고 향축 (adaxial) 부분이 밑으로 향하도록 치상하였다.

2-5. 신초 신장

2주 후 갈변한 신초/신초 패드는 외과용 메스 (＃15 blade)로 깎아 선발항생제 PPT 5 ㎎/L가 들어있는 SEM (shoot elongation medium, 신초 신장 배지; MS salt 4.4 g/L, MES 3 mM, GA₃ 0.5 ㎎/L, 아스파라진 50 ㎎/L, 피로글루탐산 100 ㎎/L, IAA 0.1 ㎎/L, 지아틴 1 ㎎/L, 수크로스 3%, 아가 0.8%, 세포탁심 250 ㎎/L, 밴코마이신 50 ㎎/L, 티카르실린 100 ㎎/L, DL-포스피노트리신 5 ㎎/L, pH 5.6)에 치상하였다. 2주마다 새로운 SEM으로 옮겨주면서 신초의 갈변 부위는 외과용 메스 (＃15 blade) 윗면으로 쳐서 제거하고 신초 패드(pad)는 조금씩 계속 깎아내어 배지가 잘 흡수되도록 하였다.

2-6. 뿌리 형성, 순환 과정 및 PPT 잎 페인팅(leaf painting)

SEM에서 선발을 거치면서 신장된 신초가 4 cm 이상 일 때, 외과용 메스 (#11 blade)로 잘라 RM (rooting medium, 뿌리 유도 배지; MS 염 4.4 g/L, MES 3 mM, 수크로스 3%, 아가 0.8%, 세포탁심 50 ㎎/L, 밴코마이신 50 ㎎/L, 티카르실린 50 ㎎/L, 아스파라진 25 ㎎/L, 피로글루탐산 25 ㎎/L, pH 5.6)으로 옮겼다. 이때 잘라서 분리해낸 신장된 신초의 밑 부분을 1 ㎎/mL IBA에 3분 동안 담가뒀다가 빼내어 RM이 들어있는 테스트 튜브에 넣었다.

뿌리가 충분히 자라게 되면 3차 증류수로 배지를 씻어내고 상토 (바이오 프러그 2호, 흥농종묘)와 버미큘라이트를 2 : 1로 섞어 넣은 작은 폿트 (6 ㎝ × 6 ㎝ × 5.6 ㎝)에 심어서 마젠타 상자 (Magenta box) 안에 넣었다. 10일 정도 경과 후 잎 표면에 100 ㎎/L DL-포스피노트리신(phosphinothricin)으로 잎 페인팅(leaf painting)을 하였다.

2-7. T₁ 종자 생산

식물체가 충분히 자라게 되면 더 큰 폿트 (pot)로 옮겨 심고 투명한 플라스틱 덮개에 10개 정도의 구멍을 만들어 씌웠다. 10일 후 식물체에 바스타 (BAYER사, 53 ㎎/L) 처리를 하였다. 그 결과, 비형질전환체 (광안콩, NT)는 민감하게 반응하여 고사하였다. 반면에, 형질전환체는 아무런 변화가 없었으며 저항성을 나타내었다. 저항성을 나타내는 콩 형질전환체 9 개체를 온실로 옮겨 T₁ 종자를 수확하였다.

3. 유전자 도입 분석

3-1. PCR 및 서던 블로팅 분석

잠정적인 형질전환체들의 잎을 1 g 정량한 후 액체질소로 얼리고 막자사발에 얼린 잎을 넣고 곱게 갈아 준 후, CTAB 방법을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 유전자의 도입여부를 알아보기 위하여 도입 유전자와 선발항생제 유전자인 Bar 서열을 이용하여 PCR을 수행하였다. HC-Pro 유전자의 도입을 확인하기 위하여, HC -Pro (정방향 프라이머, 5'-GCAGCGGCAATAAGCCAGTCAATT-3' : 서열번호 2)와 인트론 (역방향 프라이머, 5'-TGATGGCCATAGGGGTTTAGATGC-3' : 서열번호 3) 사이의 DNA와 인트론 (정방향 프라이머, 5'-GCATCTAAACCCCTATGGCCATCA-3' : 서열번호 4)과 HC -Pro (역방향 프라이머, 5'-GCAGCGGCAATAAGCCAGTCAATT-3' : 서열번호 5) 사이의 DNA를 증폭하였다. 선발항생제 유전자인 Bar의 도입에 사용된 프라이머는 다음과 같다. Bar 정방향 프라이머 (5'-TGGCTGGTGGCAGGATATATTGTG-3' : 서열번호 6)와 Bar 역방향 프라이머 (5'-AGACAAGCACGGTCAACTTCCGTA-3' : 서열번호 7)이다. T-DNA의 삽입이 완벽하게 이루어졌는지 알아보기 위해 왼쪽 보더(left border) 부분을 PCR를 이용해 증폭하였다. 왼쪽 보더 부분은 왼쪽 보더 정방향 프라이머 (5'-TGGCTGGTGGCAGGATATATTGTG-3' : 서열번호 8)와 Bar 역방향 프라이머 (5'-AGACAAGCACGGTCAACTTCCGTA-3' : 서열번호 9)를 사용하였다.

서던 블로팅 (Southern blotting)을 분석하기 위해, 광안콩과 각각의 형질전환체를 라인(line)별로 약 10 μg 게놈 DNA를 HindIII로 밤새 효소절단 하였다. 절단한 DNA를 1 % 아가로스 겔에 전기영동 하였다. 분리된 DNA를 모세관 현상을 이용하여 나일론 막(Hybond-N⁺, Amersham, UK)으로 트랜스퍼하였다. 혼성화, 세척 그리고 검출은 DIG(digoxigenin)-라벨된 DNA 프로브와 화학 발광(chemiluminescent) 시스템 (Roche, Germany)을 이용하여 수행하였다. DIG-라벨된 DNA 프로브는 Bar 정방향 프라이머 (5'-AACTTCCGTACCGAGCCGCA-3' : 서열번호 10)와 Bar 역방향 프라이머 (5'-TCGTAGGCGTTGCGTGCCTT-3' : 서열번호 11)를 이용하여 PCR 증폭에 의해 준비되었다.

4. 형질전환체의 바이러스 접종 및 병징 분석

4-1. 형질전환체의 바이러스 접종

수확한 콩 종자를 파종하여 1주일 뒤 발아되면 콩 모자이크 바이러스 균주 G5를 접종하였다. 막자사발에 병징이 미리 발견된 콩 잎 샘플을 완충액(0.1M 포스페이트 버퍼, pH7.2)으로 갈아서 즙액을 준비하고 검정할 콩 전체 잎에 카보런덤 (carborundum, Nacalai tesque, 600mesh)을 골고루 뿌렸다. 준비된 즙액을 고무장갑을 낀 손가락에 묻혀서 카보런덤(carborundum)이 묻어있는 콩 잎 표면을 문질렀다. 접종이 끝난 후, 즙액이 충분히 마르게 되면 철가루를 제거하기 위해 물로 씻어주었다 (Zheng et al., 2005, Crop Prot., Vol.24, 49-56; Zheng et al., 2006, J. Hered., Vol. 97(5), 429-437). 일주일 간격으로 4주차까지 바이러스 병징을 분석하였다. 바이러스 병징의 경우, 바이러스에 저항성을 나타내는 형질전환체는 R (resistance), 약한 모자이크 증상은 마일드 모자이크 (mM, mild mosaic), 그리고 강한 모자이크 증상은 모자이크 (M, mosaic)로 분류하였다. 수확한 종자의 바이러스 증상은 다음과 같이 분류하였다. 깨끗한 종자는 저항성 (R, resistance), 옅은 종피 얼룩은 마일드 모자이크 (mM, mild mosaic), 그리고 짙은 종피 얼룩은 모자이크 (M, mosaic)로 분류하여 분석하였다.

4-2. 바이러스 발현 분석

바이러스 RNA의 발현 여부를 알아보기 위하여 바이러스를 접종한 형질전환체와 수확한 종자로부터 RNA를 추출하였고, 노던 블로팅 (Northern blotting) 및 RT-PCR을 수행하였다. 바이러스를 접종한 형질전환체의 경우, 식물 RNA 정제 용액 (Invitrogen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 종자의 경우, 유발에 4℃로 냉각된 0.1M Tris-HCL(pH9.0)를 샘플 무게의 40배를 첨가하여 종자를 잘 마쇄하고 식물 RNA 정제 용액 (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리하였다.

바이러스를 접종한 형질전환체의 노던 블로팅 분석을 위해, 상기에서 분리된 20 μg의 RNA를 1.2% (w/v) 변성 포름알데히드 아가로스 겔에서 전기 영동하여 나일론 막 (Hybond-N⁺, Amersham, UK)에 RNA를 부착시켰다. 혼성화, 세척 및 검출은 DIG(digoxigenin)-라벨된 DNA 프로브와 화학발광 시스템 (Roche, Germany)을 이용하여 수행하였다. DIG-라벨된 프로브는 HC - Pro 정방향 프라이머 (5'-CACGAAGATGGTAAGGGATG-3' : 서열번호 12)와 HC - Pro 역방향 프라이머 (5'-GGTACCCAACTGTCAAGGAT-3' : 서열번호 13)를 이용하여 PCR 증폭에 의해 준비되었다.

종자에서 분리한 RNA를 Maxime RT-PCR PreMix (iNtRON, KOREA)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 도입 유전자인 HC - Pro의 전사 수준을 알아보기 위해 HC - Pro 정방향 프라이머 (5'-CACGAAGATGGTAAGGGATG-3' : 서열번호 12)와 HC - Pro 역방향 프라이머 (5'-GGTACCCAACTGTCAAGGAT-3' : 서열번호 13)를 RT-PCR에 사용하였다.

실시예 1: 형질전환체 벡터와 형질전환체 생산

SMV(Soybean mosaic virus) 균주 G7H에서 유래한 HC-Pro 유전자와 RNAi를 이용하여 형질전환용 벡터를 제작하였다(도 1). 형질전환체는 도 2와 같이 식물의 재분화 과정을 거쳐 9개체의 형질전환체를 생산하였다.

실시예 2: 형질전환체의 유전자 도입 확인을 위한 PCR 분석

상기에서 기술한 방법에 따라 HC - Pro(RNAi) T₀ 형질전환체에서 DNA를 분리하여 PCR을 수행한 결과, 도입 유전자인 HC - Pro, 선발 항생제 유전자인 Bar, 그리고 왼쪽 보더의 도입을 확인하였다(도 3). T₂ 형질전환체에서의 카피 수를 확인하기 위해 서던 블로팅(Southern blotting)을 수행한 결과, 대부분의 형질전환체에서 한 개 또는 두 개의 낮은 카피 수를 보였다(도 4).

실시예 3: 바이러스를 감염시킨 콩 형질전환체의 바이러스 병징 검정 및 바이러스 유전자의 발현 분석

HC - Pro(RNAi) T₂ 형질전환체의 바이러스 감염 증상을 관찰하기 위해 발아 일주일 후 초엽에 SMV (Soybean mosaic virus, 콩 모자이크 바이러스) 균주 G5을 접종하여 4주 동안 바이러스 병징 여부를 관찰하였다. 바이러스 병징의 경우, 바이러스에 저항성을 나타내는 형질전환체는 R (resistance), 약한 모자이크 증상은 마일드 모자이크 (mM, mild mosaic), 그리고 강한 모자이크 증상은 모자이크 (M, mosaic)으로 분류하였다. 바이러스에 감염된 잎에서는 옅고 진한 녹색의 모자이크 패턴이 발생하였고 잎이 구부러지는 현상을 관찰할 수 있었다. 형질전환체 라인 2, 5 그리고 6에서는 어떠한 바이러스 증상이 발견되지 않았고 저항성 (R)을 보였다. 반면에, 형질전환체 라인 1, 3 그리고 4에서는 마일드 모자이크 (mM) 또는 모자이크 (M) 증상을 보였다 (도 5). 바이러스 감염 증상에 따른 바이러스 HC-Pro 유전자의 발현 분석을 하기 위해 노던 블로팅 (Northern blotting)을 수행한 결과, 저항성 라인 2, 5 그리고 6에서는 바이러스 RNA가 발현되지 않았다. 반면에, 이병성 라인 1, 3 그리고 4에서는 바이러스가 강하게 발현되었다 (도 6). 게다가, RT-PCR(reverse transcriptase PCR) 분석을 통해 포티바이러스 RNA가 코딩하는 단백질인 HC-Pro, CP(coat protein) 그리고 CI 단백질 (CI)의 유전자 발현 분석을 수행한 결과, 노던 블로팅과 유사한 결과를 얻었다 (도 7).

실시예 4: 바이러스를 감염시킨 콩 형질전환체에서 수확한 종자의 형태 및 바이러스 발현 분석

바이러스를 감염시킨 식물체의 바이러스 증상이 종자의 형태에도 영향을 미치는지를 확인하기 위해 수확한 T₃ 종자로부터 바이러스 병징 여부를 관찰하였다. 수확한 종자의 바이러스 증상은 다음과 같이 분류하였다. 깨끗한 종자는 저항성 (R, resistance), 옅은 종피 얼룩은 마일드 모자이크 (mM, mild mosaic), 그리고 짙은 종피 얼룩은 모자이크 (M, mosaic)로 분류하여 분석하였다. 그 결과, 저항성 라인 2, 5 그리고 6의 T₃ 종자들은 모두 깨끗하여 저항성을 나타내었고 종피 얼룩 (seed coat mottling)이 생성되지 않았다. 바이러스 저항성 콩 종자와 비교하였을 때, 이병성 라인 1, 3 그리고 4의 T₃ 종자들에서는 바이러스 증상인 갈색 또는 검정색의 종피 얼룩을 관찰할 수 있었다 (도 8). 이들 종자로부터 포티바이러스 RNA에 의해 코딩되는 단백질 유전자인 HC-Pro, CP, CI 발현을 분석하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과, 잎에서의 바이러스 발현 분석과 유사한 패턴을 보였다 (도 9). 저항성 라인 2, 5 그리고 6의 T₃ 종자에서는 바이러스 RNA가 발현되지 않았고 이병성 라인 1, 3 그리고 4의 T₃ 종자에서는 바이러스가 발현되었음을 확인하였다. 이를 통해 이병성 라인의 종자들은 바이러스에 감염된 식물체들로부터 크게 영향을 받았음을 알 수 있었다. 즉, 바이러스는 이병성 T₂ 식물체에서 T₃ 종자로 정확히 전이되었음을 확인할 수 있었다. 바이러스에 저항성을 나타내는 형질전환체에서는 바이러스가 분석되지 않았으며 세대가 진행되어도 저항성을 계속 유지하였다.

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Transgenic soybean plant with enhanced tolerance to Soybean mosaic virus and production method thereof <130> PN13331 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 305 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 1 atgcctccta atgtggagaa tcatgaatgc accattgatt tcacaaatga acaatgtggt 60 gaactggcag cggcaataag ccagtcaatt tttccagtta agaaactatc atgcaagcaa 120 tgtcggcagc acattaagca cctcagttgg aggagtataa acaattcctc ttggctcata 180 tgggctgcca tgggaccgaa tgggaaactt tccaagaaat tgacggcatg aagtatgtga 240 agagagtgat tgagacatca actgcggaaa acgcaagtct gcagacatca ctggagattg 300 tgcgt 305 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcagcggcaa taagccagtc aatt 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgatggccat aggggtttag atgc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcatctaaac ccctatggcc atca 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcagcggcaa taagccagtc aatt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tggctggtgg caggatatat tgtg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agacaagcac ggtcaacttc cgta 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tggctggtgg caggatatat tgtg 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agacaagcac ggtcaacttc cgta 24 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aacttccgta ccgagccgca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tcgtaggcgt tgcgtgcctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cacgaagatg gtaagggatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggtacccaac tgtcaaggat 20

Claims

삭제
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삭제
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터로 콩 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 콩 식물 세포로부터 형질전환 콩 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 콩 식물체의 제조 방법.
제4항의 방법에 의해 제조된, 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 콩 식물체.
삭제
제5항에 따른 콩 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 콩 식물에 형질전환하여, HC-Pro 유전자의 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 콩 식물의 내성을 증진시키는 방법.
삭제
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 유효성분으로 함유하는, 콩 모자이크 바이러스에 의한 바이러스병에 대한 콩 식물의 내성을 증진시키기 위한 조성물.
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