KR101595866B1

KR101595866B1 - 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 벼 유래 miR399f 전구체 DNA 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101595866B1
Application number: KR1020140037798A
Authority: KR
Inventors: 김민균; 이민경; 김주곤; 전혜성
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2016-02-19
Also published as: KR20150113602A; WO2015152471A1

Abstract

본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsmiR399f 전구체를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 상기 OsmiR399f 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 야생형에 비해 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsmiR399f 전구체 DNA를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 벼 유래 miR399f 전구체 DNA 및 이의 용도{miR399f precusor DNA from rice increasing drought stress tolerance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 벼 유래 miR399f 전구체 DNA 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 miR399f 전구체를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 상기 miR399f 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 야생형에 비해 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 miR399f 전구체 DNA를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.

앱시스산(ABA, abscisic acid)은 식물의 생장 및 발달의 주요 양상을 조절하는 식물 스트레스 호르몬이다. 앱시스산은 종자 휴면 및 유묘 생장을 조절하며, 수분 스트레스 동안에 기공의 작동에 영향을 미친다. 또한, 앱시스산은 가뭄, 고염 및 저온과 같은 다양한 비생물적 스트레스에 대한 식물의 반응을 매개한다.

식물은 그들의 생활사를 통해 적합하지 않은 생장 조건에 지속적으로 노출된다. 가뭄, 고염, 고온 및 양분 결핍과 같은 비생물적 스트레스는 식물의 생장 및 발달에 불리하게 영향을 미치며, 곡물의 생산성을 결정하는 중요한 요인이기도 하다. 식물의 생장 및 생산성을 유지하기 위해서, 식물은 스트레스 조건에 적응해야만 하며, 특별한 내성 기작을 작동시켜야만 한다. 스트레스에 적응하기 위한 조절 기작 중 하나는 소형 리보핵산(small RNA)들에 의한 전사 후 조절(post-transcriptional regulation)이다. miRNA(microRNA)는 내생의 소형 리보핵산들의 하나의 큰 패밀리로, 전사 후 음성 조절자로서 기능하는 것으로 보고되었다(Reinhart et al., 2002, Genes Dev. 16:1616-1626). 식물에서, miRNA들은 RNA 중합효소Ⅱ에 의해서 일반적으로 전사되는 초기 miRNA 전사체(pri-miRNA)로부터 생성된다. 상기 pri-miRNA는 RNase Ⅲ 유사 효소인 DCL1(Dicer-like 1)과 이와 연관된 RNA 결합 보조 인자들 HYL1(HYPONASTY LEAVES 1, double stranded RNA binding protein) 및 SE(SERRATE, C₂H₂-type zinc finger protein)에 의해서 처리되어 더 짧은 스템-루프(stem-loop) 모양의 전구체 전사체(pre-miRNA)와 miRNA/miRNA 이중체(duplex)를 순차적인 방법으로 생산한다. 상기 이중체는 그 후에 3' 말단이 HEN1(HUA ENHANCER 1)에 의해 메틸화되고, HST1(HASTY1)에 의해 세포질로 내보내어진다. 세포질에서, 이중체의 한 가닥이 RISC(RNA-induced silencing complex) 내로 포함되어 진다. 대부분의 식물 miRNA들은 완벽한 또는 거의 완벽한 상보성을 통해 그들의 목표들과 상호작용하여 목표 mRNA를 분해하게 된다.

몇몇의 식물 miRNA들은 환경적인 스트레스에 대한 반응에 역할하는 것으로 보고되었다. 벼에서 가뭄 스트레스에 반응하여, miR169g가 DREB 전사 인자에 의해 상향조절되며, miR167 및 miR319가 벼의 유묘에서 저온 스트레스에 의해 하향 조절된다. 게다가, miR172는 AP2 유사 패밀리 전사 인자를 코딩하는 전사체의 타겟팅을 통해서 개화 시기의 조절과 꽃 기관 발달에 관여한다. 유황 기아(sulfur starvation) 동안에, 애기장대 및 벼에서 miR395의 발현은 상당히 상향조절된다.

miR399는 인 결핍에 의해 유도되어지는 것으로 잘 연구되어 있다. 애기장대에서 miR399의 상향 조절은 목표 전사체인 유비퀴틴 컨쥬게이팅 E2 효소 24(UBC24, ubiquitin-conjugating E2 enzyme 24)를 코딩하는 PHO2 유전자를 음성적으로 조절한다. 애기장대 PHO2 유전자의 추정상의 벼 오쏘로그(ortholog)인 LTN1(LEAF TIP NECROSIS1)은 miR399의 하류(downstream)의 중요한 인(Pi) 기아 시그날링 요소로 확인되었다. 벼에서 miR399-LTN1의 조절은 애기장대의 miR399-PHO2와 유사하게 miR399에 의해 조절되는 것으로 예상되었다. 그러나 흥미롭게도, 애기장대는 단지 6개의 miR399를 가지고 있는 반면, 벼는 11개의 miR399 유전자를 가지고 있으며, 그들의 성숙한 서열들은 각각이 서로 조금씩 상이하다. 또한, 상기 11개의 벼 miR399에 의한 벼 전사체 표적들 모두 아직까지 확실하게 확인되지 않았다.

한편, 한국등록특허 제1350167호에는 애기장대 유래 microRNA를 이용한 '식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 miR399 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 미국공개특허 제2012-0011623호에는 'MICRORNA POLYMORPHISMS CONFERRING ENHANCED DROUGHT TOLERANCE IN A PLANT'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 벼 유래 miR399f 전구체 DNA 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 특이 miR399 유전자들 중 몇몇이 환경적인 스트레스에 관계없이 어린 벼 식물체의 전체 부분에서 지속적으로 발현되고 있음을 확인하고, 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해서 상기 벼 특이 miR399 유전자들 중 miR399f(microRNA 399f) 유전자로부터 만들어지는 전구체 전사체를 지속적으로 과발현하는 형질전환 벼 식물체를 제작하였다. 본 발명의 결과를 통해 벼 특이 miR399f 전구체 전사체를 지속적으로 과발현하는 형질전환 식물체가 야생형 식물체에 비해 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 miR399f 전구체 전사체를 지속적으로 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래 miR399f 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 야생형에 비해 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래 miR399f 전구체 DNA를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 이용하면 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 증가된 식물체를 제조할 수 있으므로, 작물의 생산량 증대 및 식량 수요의 충족에 유용할 것으로 사료된다.

도 1은 본 발명의 벼 형질전환에 사용된 PGD1 :: OsmiR399f 전구체 DNA 재조합 벡터의 구조를 보여주는 그림이다.
도 2는 2주령의 야생형 벼 식물체에 100μM 농도의 앱시스산(ABA)를 처리하고, 뿌리 및 줄기 조직에서 시간별 OsmiR399 전구체 전사체의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 OsmiR399f 전구체 전사체를 과발현하는 형질전환 벼 식물체에서 이식 유전자의 복제수를 분석한 결과이다. PC는 벼 게놈에 3' Nos 유전자를 1 카피 포함하고 있는 양성 대조구 형질전환 계통을 나타내며, 시료번호 1, 2, 4, 6, 10, 15, 18~21, 23~27, 29, 33, 34, 38, 44~49는 벼 게놈 내로 3' Nos의 1 카피가 삽입된 것으로 분석된 OsmiR399f 형질전환 계통을 나타낸다. 시료번호 3, 5, 7, 8, 11~14, 16, 17, 22, 28, 30~32, 35~37, 39, 41, 43은 벼 게놈 내에 2 카피 이상의 3' Nos를 가지고 있는 OsmiR399f 형질전환 계통을 나타낸다.
도 4는 야생형과 T₁ OsmiR399f 전구체 전사체 과발현 형질전환 식물체의 줄기 조직에서 OsmiR399f 전구체 전사체의 수준을 반-정량적 역전사 중합효소연쇄반응(Semi-quantitative RT-PCR) 분석을 통해 비교한 결과이다. OsActin은 각 레인에 동량의 RNA를 로딩하였음을 증명하기 위한 대조구로 사용되었다.
도 5는 가뭄 스트레스 조건에서 야생형과 두 개의 OsmiR399f 전구체 전사체 과발현 형질전환 식물체의 표현형적 변화를 관찰한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 miR399f 전구체 전사체를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 벼 유래 miR399f 전구체 DNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DNA일 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 DNA는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 벼 유래 miR399f 전구체 DNA 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

벼 유래 miR399f 전구체 DNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 PGD1, CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 벼 유래 miR399f 전구체 DNA는 전술한 바와 같다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로 벼 유래 miR399f 전구체 DNA 또는 상기 miR399f 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 벼 유래 miR399f 전구체 DNA 또는 상기 miR399f 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 것이다. 바람직하게는 상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물 재료

벼(Oryza sativa L. spp. Japonica cv. Ilmi)의 종자를 본 발명의 야생형 식물로 사용하였다. 식물 생장을 위해서, 종자는 50% 표백제 용액(bleach solution) 및 70% 에탄올을 사용하여 멸균하고, 3% 수크로스, 0.05% MES-KOH(pH 5.7) 및 0.6% 파이토한천이 첨가된 1/2 MS 배지에 플레이팅하였다. 멸균된 종자는 종자 휴면을 깨우기 위해 4℃의 암실에서 4일 동안 층상으로 둔 다음, 장일 조건(16시간 명/8시간 암, 100μEm^-2s^-1의 조도)의 28℃의 생장 챔버로 옮겼다. 앱시스산 처리를 위해, 1/2 MS 배지에서 생장시킨 2주령의 벼 유묘를 100μM의 앱시스산으로 처리하였다.

벼 형질전환용 PGD1 :: OsmiR399f 전구체 DNA 재조합 벡터 클로닝

2주령의 벼 식물체로부터 게노믹 DNA를 수동의 방법으로 분리하였다. 벼 OsmiR399f의 전구체 DNA 부위는 벼 게노믹 DNA와 KpnI 제한효소 자리를 포함하는 정방향 프라이머(KpnI-MIR399f; 5'-TATAGGTACCTGCATATGGATGCTTGC-3'; 서열번호 2, 밑줄 KpnI 제한효소 자리) 및 BamHI 제한효소 자리를 포함하는 역방향 프라이머(MIR399f-BamHI; 5'-GGATCCAGAAATCACCAGAATTGCAA-3'; 서열번호 3, 밑줄 BamHI 제한효소 자리)를 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 반응의 전 과정은 다음과 같다: 95℃에서 5분 초기 변성, 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 30초 증폭의 35 사이클 PCR 반응 및 72℃에서 10분 최종 증폭. PGD1 :: OsmiR399f 전구체 DNA 재조합 벡터는 바이너리 벡터인 pZPI-AP26(김주곤 교수, 서울대학교, 한국)를 사용하여 제조하였다. 우선, pZPI-AP26 벡터로부터 KpnI과 BamHI 제한효소를 이용하여 AP26 유전자를 제거하였고, OsmiR399f 유전자 전구체 DNA를 상기 KpnI과 BamHI 제한효소를 처리하여 잘라내고 AP26 유전자가 제거된 플라스미드 내로 삽입하였다. 그런 후에, 상기 플라스미드의 3'Nos 터미네이터를 BamHI 및 EcoRI 제한효소 처리를 통해 제거하고, 최종적으로 BamHI 및 EcoRI 제한효소 자리를 이용하여 선별 마커인 bar 유전자를 포함하는 DNA 카세트를 삽입하였다(도 1).

아그로박테리움 매개 벼 형질전환

아그로박테리움 매개 형질전환을 위해서, 성숙한 벼의 종자는 껍질을 벗기고 70% 에탄올에 담궈 5분 동안 흔들어주면서 멸균하였다. 상기 에탄올을 버리고, 종자를 50% 세제(Clorax)를 사용하여 30분 동안 흔들어주면서 추가로 멸균하였다. 상기 종자를 멸균된 물을 이용하여 철저하게 헹구어주고, 2N6 배지에 플레이팅하고 지속적인 광 조건 및 28℃의 온도 조건에서 1주일동안 생장시켜 캘러스들을 유도하였다. 그런 후에, 플레이트를 암 조건으로 옮겼다. 3주 후에, 남아있는 종자의 배반(scutella)으로부터 유도된 증식된 캘러스들을 신선한 2N6 배지에서 4~5일 동안 계대배양하였다. 노르스름하고 활동적으로 생장하고 있는 캘러스의 일부를 형질전환 실험에 사용하였다. PGD1::OsmiR399f 재조합 벡터로 형질전환시킨 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 EHA101을 50㎍/㎖의 스펙티노마이신(spectinomycin) 및 50㎍/㎖의 카나마이신을 첨가한 AB 배지에서 3일 동안 배양하였다. 배양된 박테리아를 모으고, AAM 배지에서 OD₆₀₀ 값 1~3으로 맞춰주었다.

캘러스들을 박테리아 현탁액에 30분 동안 담궈둔 후, 헹굼 없이 2N6-AS 배지로 옮기고, 암 조건의 28℃에서 5일 동안 배양하였다. 상기 공동배양(co-cultivation) 후, 캘러스들을 100㎕/ℓ 세포탁심이 들어있는 멸균된 물로 헹궈주고 2N6-C 배지에 놓고 10일 동안 키웠다. 그 후, 공동 배양된 캘러스들을 2㎎/ℓ의 포스피노트리신(phosphinotricin)을 포함하고 있는 MSR-CP 재생 배지로 옮겼다. MSR-CP 배지는 캘러스들로부터 줄기가 관찰될 때까지 매 2주 간격으로 교체해주었고, 재생된 줄기는 뿌리 유도 배지인 MSO로 옮겨주었다. 7~10일 후, 재분화된 식물체들을 토양으로 옮겨 심었다. 본 발명에 사용된 각 배지의 조성표는 하기 표 1과 같다.

배지 종류 및 조성표

배지 종류	조성표
2N6 배지	CHU (N6) medium 4g/ℓ, casamino acid 0.3g/ℓ, L-proline 0.5g/ℓ, L-glutamine 0.5g/ℓ, sucrose 30g/ℓ, 2,4-D 2mg/ℓ, gelrite 2.5g/ℓ, pH 5.8
AB 배지	20X AB buffer 50㎖/ℓ, 20X AB salt 50㎖/ℓ, glucose 5g/ℓ, agar 15g/ℓ, pH 7.0
AB buffer (20X)	K₂HPO₄ 60g/ℓ, NaH₂PO₄ 20g/ℓ
AB salt (20X)	NH₄Cl 20g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 6g/ℓ, KCl 3g/ℓ, CaCl₂·2H₂O 265mg/ℓ, FeSO₄·7H₂O 50mg/ℓ
AAM 배지	1X amino acid stock, 1X MS vitamin stock, casamino acids 500 mg/ℓ, sucrose 68.5g/ℓ, glucose 36.5g/ℓ, 1X iron stock, 1X micronutrient stock
Amino acid stock (20X)	Glutamine 17.7g/ℓ, Aspartic Acid 5.32g/ℓ, Arginine 4.56g/ℓ, Glycine 1.50g/ℓ
MS vitamin stock (1000X)	Nicotinic acid 500mg/ℓ, Thiamine.HCl 10mg/ℓ, Pyridoxine 50mg/ℓ, Myo-inositol 10g/ℓ
Iron stock (100X)	FeSO₄·7H₂O 2.8g/ℓ, Na₂EDTA 3.7g/ℓ
Micronutrient stock (100X)	MnSO₄·H₂O 1.69g/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 860mg/ℓ, H₃BO₃ 620mg/ℓ, CuSO₄·5H₂O 2.5mg/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 25mg/ℓ, CoCl₂·6H₂O 2.5mg/ℓ, KI 83mg/ℓ
2N6-AS 배지	CHU (N6) medium 2g/ℓ, casamino acid 0.3g/ℓ, L-proline 0.5g/ℓ, L-glutamine 0.5g/ℓ, sucrose 30g/ℓ, glucose 10g/ℓ, 2,4-D 2mg/L, gelrite 2.5g/ℓ, AS(3',5'-dimethoxy-4'-hydroxy acetophenone) 200μM, DTT(dithiothreitol) 1mM, ST(sodium thiosulfate) 1.6mM, AgNO₃ 60μM, pH 5.2
2N6-C 배지	2N6 medium plus cefotaxime 250mg/ℓ
MSR-CP 배지	MS salt 4.4g/ℓ, MES 0.5g/ℓ, sucrose 30g/ℓ, kinetine 5mg/ℓ, NAA (1-naphthaleneacetic acid) 1mg/ℓ, cefotaxim 100mg/ℓ, PPT(phosphinotricin) 2mg/ℓ, gelrite 4g/ℓ, pH 5.8
MSO 배지	MS salt 4.4g/ℓ, sucrose 30g/ℓ, gelrite 2.5g/ℓ, pH 5.8

이식 유전자의 복제 수 분석을 위한 정량적 중합효소연쇄반응

형질전환 벼의 이식 유전자 복제 수는 TaqMan^® 프로브를 사용하여 정량적 중합효소연쇄반응(quantitative PCR)을 통해 분석하였다. 게노믹 DNA는 Exgene^TM plant SV 키트(Geneall, 한국)를 사용하여 추출하였고, 동형접합체의 형질전환 벼 식물체의 게놈에 1 카피의 3'Nos가 삽입된 것이 확인된 게노믹 DNA는 내부 표준지표로 사용되었다.

내생의 대조구를 위해, 프라이머들과 프로브들을 벼 알파-1 튜불린 유전자(Oryza sativa alpha -1 tubulin, GenBank accession no. AK102560)에 특이적으로 디자인하였다. 형질전환 벼의 이식 유전자 삽입의 복제 수 분석을 위해, 프라이머 및 프로브는 3'Nos 터미네이터 부위에 특이적으로 디자인하여 사용하였다(GenBank accession no. NC_003065, 표 2). 프로브는 5' 말단에는 리포터 형광단(fluorophore)을 그리고 3' 말단에는 비형광의 퀀처(quencher) MGB를 라벨링하였다.

정량적 PCR 분석을 위한 프라이머 및 프로브

프라이머 및 프로브	서열정보(5'→3')	염료
3'Nos-FP	CGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTT (서열번호 4)
3'Nos-RP	TGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCG (서열번호 5)
3'Nos-probe	FAM-TAGAGTCCCGCAATTAT-MGB (서열번호 6)	FAM

반응은 알파-1 튜불린과 3'Nos를 동시에 증폭하였다. 각 시료는 50ng/㎕의 추출된 게노믹 DNA와 10㎕의 2X TaqMan^® universal PCR master mix(Applied Biosystems, 미국), 최종 농도 900nM의 프라이머, 최종 농도 250nM의 프로브와 최종 부피 20㎕이 되도록 물을 사용하였다. PCR 반응은 ABI StepOne^TM Real-Time PCR system 장비를 사용하였으며, 다음의 조건을 따라 수행하였다: 50℃ 2분, 95℃ 10분에 이은 95℃ 15초 및 60℃ 1분의 40 사이클. 결과는 CopyCaller^® 소프트웨어 버전 2.0(Applied Biosystems, 미국)을 사용하여 분석하였다.

반-정량적 역전사 중합효소연쇄반응 ( Semi - quantitative RT - PCR ) 분석

총 RNA는 2주령의 벼 식물체의 줄기로부터 Trizol^® 용액(Invitrogen, 미국)을 이용하여 추출하였다. 랜덤 프라이머와 함께 총 RNA의 2㎍을 역전사 반응에 이용하였다. 그 후, 합성된 cDNA의 1㎕를 OsmiR399 프라이머와 함께 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 2 단계 RT-PCR 반응은 다음의 과정에 따라 진행되었다: cDNA 합성을 위해, 총 RNA는 65℃에서 5분동안 변성시킨 후, 얼음에서 5분간 차게 식혔다. 역전사 반응은 55℃에서 60분 동안 수행하였으며, 70℃에서 15분 처리하여 종결시켰다. cDNA의 PCR 증폭을 위해서는, 합성된 cDNA는 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 변성을 위한 94℃ 30초, 어닐링을 위한 55℃ 30초 및 연장을 위한 72℃ 30초의 세 단계를 총 35회 반복하여 증폭시켰다. 최종 종결 반응은 72℃에서 7분간 수행하였다. OsActin 유전자를 정량적인 대조구 반응으로 사용하였다. 본 발명의 역전사 PCR 반응에 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.

RT-PCR용 프라이머

프라이머	서열정보(5'→3') (서열번호)
MIR399a-FP	AGCAGTGTAGCCCAGGCG (7)
MIR399a-RP	GCCAAATCTGACAGTACTGAGCA (8)
MIR399b-FP	GTGACTGTGTGATGACTGATGAGG (9)
MIR399b-RP	CACGTTGGGACACTAGAGGATT (10)
MIR399c-FP	GCTCTAGATTTCAGATTCAGCCACA (11)
MIR399c-RP	GGATCCGATTGCATTATGGGA (12)
MIR399d-FP	CGTCTAGAGCCATGGTGCTACATTG (13)
MIR399d-RP	GGATCCAAGACAGTCGCAGGG (14)
MIR399e-FP	CTTACCCAGAAGCTTGCATGAG (15)
MIR399e-RP	GACTGTTGGAGATGCTCTAAGGC (16)
MIR399f-FP	GGTCTAGATGGTGGATTACCGGG (17)
MIR399f-RP	GGATCCATGTGGATTGCTGGG (18)
MIR399g-FP	ATGTGCATTGCAGGGCAACT (19)
MIR399g-RP	GAGTGAATCGCTGGGCAAAT (20)
MIR399h-FP	GGTGTCTCTGACTTTATGGGGC (21)
MIR399h-RP	GCACTATGGTAATATGATTACAAGGGA (22)
MIR399i-FP	GTGAGAATCACAGTGCAGTTCTCC (23)
MIR399i-RP	CACTGAATGGCAGGGCAGCT (24)
MIR399j-FP	AAAGGGTGAAACATCTCAAATAAGC (25)
MIR399j-RP	TTCACACTCCTTAGCCTTAAGCTG (26)
MIR399k-FP	CGTCTAGAAAATAGGTTGAGACCATG (27)
MIR399k-RP	GGATCCATCTTTTCTTGTGTGTGTT (28)
OsActin-FP	TCCATCTTGGCATCTCTCAG (29)
OsActin-RP	GTACCCTCATCAGGCATCTG (30)

가뭄 내성 시험

야생형과 T₁ 형질전환 벼의 종자를 암 조건의 28℃ 생장 챔버 내 1/2 MS 고체 배지에서 4일 동안 두고 발아시킨 후, 28℃의 비닐하우스 내 토양으로 옮기고 장일 조건(16시간 명/8시간 암)으로 생장시켰다. 야생형과 형질전환 계통으로부터 16개 유묘를 선택하여 4x4x4cm³ 규격의 포트에 한 포트에 두개의 식물체를 심어 가뭄 스트레스 실험 수행 전까지 4주 동안 배양하였다. 4주령의 야생형과 형질전환 식물체의 유묘에, 야생형 식물체의 유묘가 시들음과 백화(chlorosis) 현상이 관찰될 때까지 6일 동안 물 공급을 중단하였다. 그 후 식물체에 물을 재공급하였고, 7일 후에 식물체의 생존률을 측정하였다.

실시예 1. 벼 식물체에서 11개의 OsmiR399 유전자들의 발현 수준 비교

야생형의 벼 식물체에서 11개 OsmiR399 유전자들의 발현을 조사하기 위해서, 2주령의 벼 유묘로부터 추출한 총 RNA와 각 OsmiR399 전사체 특이 프라이머(표 3)를 이용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 벼 유묘의 뿌리와 줄기 조직은 100μM의 앱시스산을 처리한 후 3, 6 및 18시간째에 따로따로 모아 분석을 진행하였다. 도 2의 결과와 같이, OsmiR399 전구체의 전사체는 유묘의 뿌리 및 줄기 모두에서 각기 다르게 축적되어 있었다. 그러나, 각 전사체들은 앱시스산 처리에 대한 반응에 따라 두 그룹으로 나눌 수 있었다. 우선, OsmiR399 전구체의 몇몇의 전사체, 예를 들면 OsmiR399c, OsmiR399e, OsmiR399g, OsmiR399i 및 OsmiR399k는 유묘의 뿌리 또는 줄기에서 앱시스산 유도에 의한 축적을 보여주었다. 그러나 흥미롭게도, OsmiR399a, OsmiR399b 및 OsmiR399f를 포함하는 일부의 다른 OsmiR399 전구체의 전사체들은 앱시스산 처리와 상관없이 유묘의 뿌리 및 조직 모두에서 지속적으로 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 지속적으로 발현되는 OsmiR399 전구체의 전사체 중 OsmiR399f는 특별히 뿌리와 줄기 모두에서 높은 수준의 축적양상을 보여주었다. 게다가 성숙한 OsmiR399f의 전사체(UGCCAAAGGAGAUUUGCCCAG; 서열번호 31)는 오직 벼에서만 관찰되었고, 애기장대에서는 확인되지 않았다. 그래서, 앱스산에 의해 유도되지 않고, 벼 특이적으로 확인되는 OsmiR399f 전구체 DNA를 벼에서 전사체 수준을 증가시키고 가뭄과 같은 환경적인 스트레스에 대한 식물체의 내성을 확인하기 위한 벼 형질전환 벡터 구축을 위해 지속성의 PGD1 프로모터와 결합시켰다.

실시예 2. OsmiR399f 전구체 과발현 형질전환 식물체의 제조

종자에서 유도된 벼 배발생의(embryogenic) 캘러스들을 상기에서 전술한 PGD1::OsmiR399f 전구체 DNA 재조합 벡터를 가지고있는 아그로박테리움 EHA101 균주와 공동배양하여 형질전환 벼 식물체를 제조하였다. 재분화된 식물체의 이식 DNA 복제 수는 정량적 PCR을 통해 분석하였다. 3'Nos에 대한 Ct 값이 알파-1 튜불린의 Ct 값보다 0.5배 크게 확인될 때, 그 시료를 단일 카피의 이식 DNA를 포함하고 있는 T₀ 벼 형질전환체로 간주하였다. 복제 수 분석에 근거하여 단일 카피의 이식 DNA를 가지고 있는 다중의 형질전환체들을 얻을 수 있었다(도 3).

실시예 3. OsmiR399f 전구체 과발현 형질전환 벼 식물체의 OsmiR399f 전구체 발현 수준 분석

OsmiR399f 전구체 과발현 형질전환 벼 식물체에서 OsmiR399f 전구체 전사체의 수준을 조사하기 위해서, 2주령의 T₁ 형질전환 식물체로부터 추출한 총 RNA와 OsmiR399f 특이적 프라이머를 이용하여 반-정량적 RT-PCR을 수행하였다. 도 4에서와 같이, OsmiR399f 전구체 과발현 형질전환 벼 식물체에서 OsmiR399f 전구체 전사체의 수준은 야생형 식물체에 비해 훨씬 높은 수준을 보여주었으며, 이는 형질전환 식물체 내에서 PGD1 프로모터의 작용에 의해 OsmiR399f 전구체가 높게 발현되고 있음을 의미하였다.

실시예 4. OsmiR399f 전구체 과발현 형질전환 벼 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성 분석

OsmiR399f 전구체의 과발현이 형질전환 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성과 연관성이 있는지 확인하기 위해서, 4주령의 T₁ 형질전환 벼 식물체와 야생형 벼 식물체를 가뭄 스트레스에 노출시켰다. 물 공급을 중단한 6일 후에, 형질전환 식물체는 가뭄 유도 손상(시들음과 백화)에 대해서 상당한 내성을 보여주었다(도 5). 식물체에 물을 재공급하고 7일 후, 대부분의 야생형 벼 식물체는 재수화(re-hydration) 후에 생존하지 못한 반면, OsmiR399f 전구체 과발현 형질전환 식물체는 가뭄 스트레스에 대한 높은 생존율을 보여주었다. 상기의 결과를 통해 야생형 식물체에 비해 OsmiR399f 전구체 과발현 형질전환 식물체가 가뭄 스트레스에 대해 보다 내성이 있음을 알 수 있었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> miR399f precusor DNA from rice increasing drought stress tolerance of plant and uses thereof <130> PN14041 <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 117 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 tggtggatta ccgggccatg tctccttggg cagaggtgat cagattgcac acttcacttc 60 aacctcttgc tctagcttgt tctctctgcc aaaggagatt tgcccagcaa tccacat 117 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tataggtacc tgcatatgga tgcttgc 27 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggatccagaa atcaccagaa ttgcaa 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgcatgacgt tatttatgag atgggtttt 29 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgcgcgctat attttgtttt ctatcg 26 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tagagtcccg caattat 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agcagtgtag cccaggcg 18 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccaaatctg acagtactga gca 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtgactgtgt gatgactgat gagg 24 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cacgttggga cactagagga tt 22 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gctctagatt tcagattcag ccaca 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggatccgatt gcattatggg a 21 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgtctagagc catggtgcta cattg 25 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggatccaaga cagtcgcagg g 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cttacccaga agcttgcatg ag 22 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gactgttgga gatgctctaa ggc 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggtctagatg gtggattacc ggg 23 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggatccatgt ggattgctgg g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atgtgcattg cagggcaact 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gagtgaatcg ctgggcaaat 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggtgtctctg actttatggg gc 22 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcactatggt aatatgatta caaggga 27 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gtgagaatca cagtgcagtt ctcc 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cactgaatgg cagggcagct 20 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 aaagggtgaa acatctcaaa taagc 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ttcacactcc ttagccttaa gctg 24 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cgtctagaaa ataggttgag accatg 26 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ggatccatct tttcttgtgt gtgtt 25 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tccatcttgg catctctcag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gtaccctcat caggcatctg 20 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Oryza sativa <400> 31 ugccaaagga gauuugccca g 21

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 miR399f 전구체를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제2항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체.
제3항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제3항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래 miR399f(microRNA 399f) 전구체 DNA를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 조성물.