CN103233040A

CN103233040A - 一种培育抗病毒罗汉果的方法

Info

Publication number: CN103233040A
Application number: CN2013101470546A
Authority: CN
Inventors: 张继贤; 张会新
Original assignee: HUAIHUA BOYA HUINONG TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Huaihua Xing Chong Biotechnology Co. Ltd.
Priority date: 2013-04-01
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2033-04-25
Also published as: CN103233040B

Abstract

本发明是从大量种植罗汉果的种植园中采集感染花叶病毒的罗汉果叶片组织，有针对性地克隆在我国侵染罗汉果的病毒基因，采用RNAi干扰的策略抑制罗汉果花叶病毒在罗汉果组织中的复制与表达，从而实现抗病毒的目标。为了增加抗性谱和抗性效果，将多种病毒基因或多个不同功能基因片段拼接在一起作为RNAi的靶位点，并应用组成型表达启动子和增强子构建于植物表达载体。同时该载体还具有抗线虫和抗除草剂的功能，并采用可以获得不含有筛选标记的双T-DNA策略，不仅可以解决生产实践中的多种问题，而且还为转基因安全生产奠定基础。

Description

一种培育抗病毒罗汉果的方法

技术领域

本发明涉及两个由侵染罗汉果的病毒基因组中多个基因拼接而成的DNA片段，用于构建抗罗汉果病毒RNAi载体。本发明的载体应用于罗汉果抗病品种培育中，建立了一套培育和筛选抗病毒转基因罗汉果种质的系统，该种质具有抗线虫和抗除草剂的功能。

背景技术

罗汉果(Siraitia grosvenorii)为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)植物,是我国传统的药食同源植物，已有300多年的历史。它具有润肺止咳、清热凉血、生津止咳、滑肠排毒、润肺化痰等功效。它富含罗汉果甜甙，主要成分是罗汉果甙V，是世界最强甜味物质之一，甜度是蔗糖的300倍。罗汉果甜甙不含热量，口感清爽甘甜，理化性能稳定，水溶性好，无任何毒副作用，适合所有人群长期食用，尤其适合糖尿病、高血压以及心血管患者食用。罗汉果中还含有大量氨基酸、果糖、维生素和矿物质,具有很好的保健效果。近些年来，罗汉果的种植与产品开发受到国际社会的广泛关注，国内有多家企业进行甜苷提取，大部分产品销往国外，很多企业也加大了罗汉果产品开发的投入。罗汉果的市场开发前景十分广阔(李锋等,2004;李典鹏等,2000)。但罗汉果在栽培过程中容易受到花叶病、根结线虫病等病害的危害,严重影响了罗汉果的产量和品质。因此,培育高抗病品种以适应生产的需要已成为一个亟待解决的问题。

据报道，在罗汉果开花之后至果实成熟之前，田间罗汉果的病毒感染率几乎达到100%，组培苗种植罗汉果病毒病发病率达63%，受害植株减产严重的达50%以上(林纬等，2003)。目前通过血清学、生物学及分子生物学等方法对罗汉果花叶病病原进行鉴定研究认为，罗汉果花叶病病原病毒有ZYMV、PRSV和WMV-2。

小西葫芦黄化花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）为马铃薯Y病毒科Y病毒属(Potyvirus)成员，是葫芦科作物重要的病毒病病原之一，也是罗汉果病毒病的主要病原病毒(Liao,Gan et al.2005,秦碧霞等，2005)。自1973年在意大利首次发现ZYMV以来，已有50多个国家相继有报道(Lisa,1981)。在短短几十年里，ZYMV已经迅速成为葫芦科作物最重要病原之一。ZYMV的寄主范围广，已报道ZYMV可侵染葫卢科、番杏科、览科、藜科、菊科、唇形科、豆科、毛茛科、玄参科和伞形科等10个科植物，且在葫芦科以外的植物上通常表现为潜伏侵染(Gracia，2000；朱英芝等，2011)。

番木瓜环斑型花叶病毒病(Papaya ringspot virus，PRSV)是马铃薯Y病毒科Y病毒属成员，为害番木瓜面积最大、损失最为严重的一种病毒病。20世纪40年代美国首次报道PRSV的发生，随后大多数番木瓜主要生产国陆续报道这一病害的发生与为害(肖艳等，2006)。

西瓜花叶病毒(Watermelon mosai cvirus,WMV)是马铃薯Y病毒属成员,主要危害西瓜和甜瓜,引起花叶病。在田间,该病害主要由蚜虫以非持久性方式传播。西瓜和甜瓜花叶病在国内陕西、山东、云南、辽宁、山西、新疆、河南和黑龙江等地广泛发生。从20世纪80年代中期开始发生,逐渐上升为普遍发生的主要病害。我国大部分地区因西瓜和甜瓜病毒病造成的损失为30%～50%,甚至会绝产,西瓜花叶病毒已经成为制约西瓜和甜瓜高产稳产最主要的因素之一(罗朝鹏，2007)。

小西葫芦花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑型花叶病毒病(PRSV)和西瓜花叶病毒(WMV)都是马铃薯Y病毒科Y病毒属成员，为弯曲线状病毒粒子，单分子线形正义ssRNA，长约9.7kb，它们的基因结构具有高度的相似性，RNA的5’端为VPg，3’端为Poly（A）。基因组编码一个长的多聚蛋白，随后切割产生8～10个产物，包括外壳蛋白（在多聚蛋白C端）。马铃薯Y病毒的基因组长9700nt，编码的多聚蛋白切割产生10个蛋白，分别为：32.4kDa的P1蛋白（功能未知），51.9kDa的HC-Pro蛋白（即辅助成分，与蚜虫传播有关），41.5kDa的P3蛋白（功能未知），6.0kDa的6K1蛋白（功能未知），71.4kDa的CI蛋白（即柱状内含体蛋白，可能与病毒的胞间运动有关），5.5kDa的6K2蛋白（功能未知），21.7kDa的NIa-VPg蛋白（即VPg蛋白），27.7kDa的NIa-Pro蛋白（核内含体蛋白酶），59.8kDa的NIb蛋白（核内含体复制酶）和29.8kDa的外壳蛋白。该属有近30种病毒的RNA全序列已测定。

利用植物基因工程技术培育抗病毒品种一直是人类对付病毒危害的主要方法。目前植物基因工程培育抗病毒品种的策略主要有利用病毒来源基因和非病毒来源的抗性基因。以非病毒来源的抗性基因起步较晚，成功的例子也较少。番茄中的Tm-1或Tm-2和Tm-22基因能赋予转基因烟草番茄花叶病毒（ToMV）的抗性(姜国勇等，2003)。利用病毒来源的基因介导病毒抗性的策略的研究较早，也取得了不少成果。将西瓜花叶病毒外壳病毒基因、小西葫芦黄花叶病毒复制酶基因和西瓜花叶病毒复制酶基因的三价植物表达载体导入到西瓜中，获得具有抗病毒特性的植株(黄学森等,2007)。通过在植物体内过量表达病毒的外壳蛋白（coat protein,CP）基因，抑制了病毒的脱壳，实现抗病毒的效果。但是，转基因植物抗病毒的能力受到CP蛋白的表达量、接种的病毒浓度和病毒状态的影响，而且大量表达的外源蛋白有可能存在生物安全隐患。

RNA沉默是一种通过序列特异性对基因表达抑制机制的现象，在这里21-24个核苷酸长度的小RNA分子（siRNA或miRNA)决定目标序列的特异性，RNA沉默是一种古老的机制，广泛存在动物、植物、线虫和真菌中。RNA干涉（RNAinterference,RNAi)是近年来发现的一种RNA沉默现象，是指通过dsRNA的介导，特异性降解同源mRNA，从而特异性调控某些基因表达的一种方式，也是植物抵抗入侵病毒和转座子的机制之一。在RNAi现象中，基因在细胞核中被正常转录，但是转录物在进入细胞质中后被同源的dsRNA特异性降解，因此RNAi又称为转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing,PTGS)。当病毒侵入植物体内后，首先在植物细胞质中脱衣壳，随后利用依赖于RNA的RNA聚合酶进行复制并形成大量病毒dsRNA，大量dsRNA激发了植物降解dsRNA的活性。Dicer属于RNAase lll家族，能够识别dsRNA，当大量的病毒dsRNA在植物体内积累时可激发Dicer活性，Dicer将其切割为21-25nt的小干扰RNA(small interferent siRNA)。siRNA随后结合到RNA引起的沉默复合体上（RNA-induced silencing complexes,RISC),并且作为一个向导去识别互补的RNA并切割，切割后的RNA可被细胞质中的核酸内切酶进一步的降解。此外，siRNA还可以做为引物，在依赖于RNA的RNA酶的作用下转录目标RNAs生成次级dsRNAs,扩大siRNAs库，放大PTGS信号，从而增强沉默效应。通过向植物体内引入siRNA或在植物体内表达部分病毒的dsRNA引起植物基因沉默功能，最终使寄主植物获得抵抗病毒的能力，是一种新的抗病毒防治策略。研究表明，这些植物的抗性可能不是由于病毒蛋白介导的，而是由RNA介导的，进一步的研究表明这种途径与病毒引起的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS)机制是一样的，这种抗性称为RNA介导抗性。VIGS是保护植物免受病毒侵染的主要机制之一，是植物抵抗入侵病毒的一种机制。根据VIGS途径的原理，通过在植物中表达病毒基因dsRNA引起基因沉默从而获得抗病毒品种是一种有效的获得转基因抗病毒的品种的方法。通过转基因植物来获得抗病毒品种这种策略己获得广泛的应用，已获得抗PVY、BYDV-PAV、CMV、PPV、CGMMV等的转基因植物。Ferdinand等对表达ZYMV、WMV两种病毒的外壳蛋白转基因南瓜ZW-20H、ZW-20B进行接毒实验，结果表明，转基因植株都没有表现系统侵染，但部分表现斑点症状,说明已获得抗性植株。Li等通过农杆菌转化的方法，把不翻译的ZYMV和PRSVW的部分CP基因转入到西瓜栽培种，并且获得了对病毒免疫的转基因植株，对这些株系检测发现，没有蛋白表达被检测到，但是能够检测到siRNA，说明这些株系抗病毒机理是PTGS。Wu等向西瓜内转入ZYMV CP和3’端非编码区的片断，也获得了对ZYMV免疫或是抵抗的转基因西瓜。研究还发现dsRNA引起的RNA沉默比正义或是反义的RNA引起的沉默更有效。因此通过向植物导入可形成发卡RNA的结构是可更容易获得抗病的转基因植株。朱英之以ZYMV Nib和CP基因的保守区域为目的基因，分别构建植物双元表达载体，通过农杆菌介导的方法把含有反向目的基因片段的片段转入到罗汉果中，获得抗ZYMV的罗汉果抗性苗(Lisa,1981)。

根结线虫病害是严重制约世界农作物产量的重要病原线虫。它的适应范围广、危害严重、寄主范围达2000多种植物、传播途径多、种类繁多,是植物一种极难防治的土传性病害。目前国际已经报道的根结线虫有80多种,我国报道的根结线虫有25种,广泛地危害我国许多粮食和经济作物,如水稻、花生、香蕉、柑桔、烟草、甘薯、大豆、棉花、西瓜、马铃薯,以及花卉(月季等)、果树及中药材等,还严重危害我国南方露地和北方保护地大棚的蔬菜,如番茄、黄瓜、丝瓜、茄子、辣椒等,一般每年引起产量损失达10%～15%,严重时损失达30%～40%,甚至绝产。种植抗性品种是防治番茄根结线虫病最经济有效的方法,国外从20世纪40年代开展应用番茄中的抗性基因控制根结线虫的危害,目前在美国和欧洲国家应用的番茄品种几乎都携带有抗线虫的Mi基因。罗汉果的根结线虫病害严重，是导致减产或绝产的重要病害之一，而且防治困难。

病毒病和线虫病是罗汉果生产过程中重要的病害。本发明通过植物基因工程技术，解决这两种严重影响罗汉果产量和品质的问题。

发明内容

本发明提供两个用于抑制罗汉果病毒基因表达的多基因拼接片段，同时构建了两个具有抗罗汉果病毒病、线虫病和具有除草剂抗性的罗汉果植物表达载体。另外，本发明还提供了一套培育抗病毒和线虫病转基因罗汉果和筛选系统，同时还获得抗除草剂或者无筛选标记的转基因罗汉果种质资源。

本发明提供一个干扰侵染罗汉果的小西葫芦花叶病毒HC-pro、NIa、NIb、CP及3`端非翻译区的多基因拼接片段ZY（SEQ ID NO:1）。

本发明还提供了一个干扰侵染罗汉果的小西葫芦花叶病毒HC-pro、NIa、NIb基因和番木瓜环斑病毒CP基因的多基因拼接片段PRZY（SEQ ID NO:2）。

本发明提供一个抗侵染罗汉果的小西葫芦花叶病毒的植物双元表达载体pLuo-Anti1，所述载体pLuo-Anti1如图1所示，该载体的T-DNA区含有一个RNAi结构，所述RNAi结构将多基因拼接片段ZY反向插入到构成茎环结构的两侧，由来源于拟南芥的组成型启动子AtEF1-a启动表达，所述启动子还与一个FMV增强子相连。上述载体的T-DNA区还含有另一个表达盒，所述表达盒含有一个根特异表达的KT630启动子（SEQ ID NO:7）和一个抗线虫基因Mi（SEQ ID NO:3）。为了最终获得一个不含筛选标记的转化植株，上述载体还含有另外一个T-DNA区，该T-DNA区含一个用于组织培养时期筛选的抗卡那霉素基因NPT II和苗期筛选的抗草甘膦基因OEPS。

本发明提供一个抗侵染罗汉果的小西葫芦花叶病毒、番木瓜环斑病毒和线虫病的植物双元表达载体pLuo-Anti2，所述载体如图2所示，该载体含有两个T-DNA区，其中一个T-DNA区含有一个RNAi结构，所述RNAi结构将多基因拼接片段PRZY反向插入到构成茎环结构的两侧，由来源于拟南芥的组成型启动子AtEF1-a启动表达，所述启动子连有一个FMV增强子，该T-DNA区还有一个表达盒，所述表达盒含有一个根特异表达的KT630启动子，和一个抗线虫基因Mi。为了最终获得一个不含筛选标记的转化植株，上述载体还含有另外一个T-DNA区，该T-DNA区含一个用于组织培养时期筛选的抗卡那霉素基因NPT II和苗期筛选的抗草甘膦基因OEPS。本发明提供一套培育转基因罗汉果的技术体系（图3-7），以罗汉果新生叶片为转基因受体，采用根癌农杆菌介导的方法，将目标基因导入。经PCR分子检测，获得转基因株系（图8）。经病毒感染实验检测，获得具有罗汉果病毒抗性的植株，所述转基因罗汉果的抗病毒功能检测结果如表4所示，转pLuo-Anti1和pLuo-Anti2载体分别获得高抗病性植株18和25株，以非转基因罗汉果植株作为负对照，全呈现易感症状。

本发明所提供的载体和方法在大规模培育抗罗汉果病毒、抗线虫的种质资源中具有重大的应用价值。

附图说明

图1为抗罗汉果病毒植物表达载体pLuo-Anti1。FMV：增强子；AtEF1-α：来源于拟南芥的启动子；ZY：多基因拼接片段；Intron：RNAi茎环结构的环区域；T-E9:来源于豌豆的终止子；KT630：来源于水稻的根特异表达启动子；Mi：抗线虫基因；T-ocs：终止子；OEPS：抗草甘膦基因；TS：定位于叶绿体的信号肽；NPTⅡ：卡那霉素抗性基因；RB：T-DNA右边界；LB：T-DNA左边界。

图2为抗罗汉果病毒植物表达载体pLuo-Anti2。FMV：增强子；AtEF1-α：来源于拟南芥的启动子；PRZY：多基因拼接片段；Intron：RNAi茎环结构的环区域；T-E9:来源于豌豆的终止子；KT630：来源于水稻的根特异表达启动子；Mi：抗线虫基因；T-ocs：终止子；OEPS：抗草甘膦基因；TS：定位于叶绿体的信号肽；NPTⅡ：卡那霉素抗性基因；RB：T-DNA右边界；LB：T-DNA左边界。

图3为罗汉果外植体预培养的照片。

图4为罗汉果外植体与农杆菌共培养的照片。

图5为筛选培养转基因罗汉果愈伤组织的照片。

图6为转基因罗汉果愈伤组织分化培养的照片。

图7为转基因罗汉果苗再生的照片。

图8为抗病毒和线虫基因转基因罗汉果苗T₀代PCR检测电泳图。左边第一泳道是Trans2K Plus DNA Marker（TransGen Biotech），泳道1-4是以转载体pLuo-Anti1罗汉果DNA为模板PCR结果，泳道5-8是以转载体pLuo-Anti2罗汉果DNA为模板PCR结果，泳道“-”是负对照，以非转基因罗汉果为模板，泳道“+”是正对照，以载体质粒pLuo-Anti1为模板。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、抑制病毒基因表达的RNAi片段的获得

（1）从田间采集严重感染病毒病的罗汉果植株叶片，提取病毒RNA，以oligo(dT)₁₈为引物，反转录获得cDNA。根据NCBI数据库中ZYMV、PRSV的基因组序列设计引物，分别克隆编码51.9kDa的辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)、27.7kDa的NIa-Pro蛋白（核内含体蛋白酶）、59.8kDa的NIb蛋白酶（核内含体复制酶）、29.8kDa的外壳蛋白和3’UTR编码非翻译区基因序列，上述基因的克隆引物序列见表1。

表1克隆ZYMV和PRSV各功能基因引物

（2）不同功能基因RNAi片段的拼接

ZY RNAi片段的获得：

根据ZYMV的DNA序列，选取ZYMV基因组中Hc-Pro、NIa、NIb和CP基因的保守序列作为RNAi的靶点，根据ZYMV基因组中1649-1857bp区域（包含HC-Pro基因部分序列）、6850-7076bp（包含NIa基因的3’端和NIb基因5’端序列），8383-8532bp（包含NIb基因3’端序列）和9169-9525bp（包含CP基因片段及3’′UTR区的DNA序列）设计引物，为了便于序列的PCR拼接，各基因片段引物之间彼此重叠，所述引物序列如表2所示。以ZYMV的HC-Pro基因为模板，RZY-1F和RZY-1R为引物，PCR获得片段R1；以ZYMV的NIa基因为模板，RZY-2F和RZY-2R为引物，PCR获得片段R2；以ZYMV的NIb基因为模板，RZY-3F和RZY-3R为引物，PCR获得片段R3；以ZYMV的NIb基因为模板，RZY-4F和RZY-4R为引物，PCR获得片段R4；以ZYMV的CP基因及3’UTR区为模板，RZY-5F和RZY-5R为引物，PCR获得片段R5。将片段R1-R5等量混合，以RZY-1F和RZY-5R为引物，PCR获得4个基因拼接而成的955bp ZY RNAi片段（所述序列如SEQ ID NO:1所示），并在两端引入XbaI和BamHI酶切位点。

PRZY RNAi片段的获得：以PRSV的CP基因为模板，RCP-5F和RCP-5R为引物，克隆PRSV基因组的9523-9893bp区域（含CP基因片段），获得371bp的R6片段。将R1、R2、R3、R4和R6片段等量混合，以RZY-1F和RCP-5R为引物，PCR获得4个基因拼接而成的979bp PRZYRNAi片段（SEQ ID NO:2），并引入XbaI和BamHI酶切位点。该片段包含ZYMV基因HC-Pro、NIa、NIb和PRSV基因CP的部分序列，所述引物序列分别如下表2所示。

表2合成ZY和PRZY片段引物

（3）拼接好的RNAi片段经纯化，分别用XbaI、BamHI双酶切后，反向插入双元载体pCAMBIA1300-35s-Intron-PterisButterfly中内含子的两端，分别获得pV6和pPRV6载体。

实施例2、抗线虫基因的获得

提取番茄仙客5号植株RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板，扩增引物为Xmi-F（SEQ ID NO:48）和Xmi-R（SEQ ID NO:49），克隆Mi基因，并在基因两侧引入Xmal和AscI酶切位点，扩增后获得的Mi基因序列如SEQ ID NO:3所示。

实施例3、抗病毒病和线虫病的罗汉果转基因植物表达载体构建

（1）入门载体的改造：按照表3中的序列合成接头ad1（BglII—SalI—KpnI—EcoRI—PstI—BamHI）和ad2（BstXI—SpeI—KpnI—XbaI），将ad1插到植物表达载体pDTL-nptII的BglII酶切位点中引入SalI、kpnI、EcoRI、PstI酶切位点，获得载体的BstXI和SpeI酶切位点之间插入接头ad2以删除暂时不用的酶切位点，得到载体pV2；用XhoI和EcoRI酶切下pCAMBIA1300-35s-Intron-PterisButterfly质粒上1320bp的CaMV35S启动子-poly（A）终止子片段，与经SalI和EcoRI酶切的pV2载体连接得到载体pV3；SmaI和PstI双酶切下载体pTG2-OEPS（专利《一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用》201210220299.2）中1597bp的信号肽TS和抗草甘膦基因OEPS，与经salI酶切并平端化后再用PstI酶切的载体pV3连接，获得入门载体pV4。

（2）抗病毒元件的组装：按照表3中的序列合成接头ad3并插入到经SpeI和KpnI双酶切的pV4载体中，引入酶切位点PstI、Sma I、MfeI、HindIII，获得载体pV7。以拟南芥基因组为模板，用引物PEF1a-F（SEQ ID NO:36）和PEF1a-R（SEQ ID NO:37）克隆启动子AtEF1-α，人工合成FMV增强子，并通过PCR的方式拼接于AtEF1-α启动子前，并在5’和3’端分别引入SpeI和PstI酶切位点，获得FMV-PEF1α片段（序列4）。SpeI和PstI双酶切片段FMV-PEF1α和载体pV7后，连接获得载体pV8。以豌豆基因组DNA为模板，以E9-F（SEQ ID NO:38）和E9-R（SEQ ID NO:39）为引物，克隆终止子T-E9（SEQ ID NO:5）。XmaI和EcoRI双酶切T-E9后与经XmaI和MfeI酶切的载体pV8连接获得pV9。pV6和pPRV6先经salI酶切并平端化后用PstI酶切，获得的片段分别与经PstI和SmaI双酶切的载体pV9连接，分别获得pV10和pPRV10。

（3）抗线虫基因的组装：人工合成ocs终止子并在5’端依次引入酶切位点Hind III、ApaI、Sbf I、Asc I，3’端引入酶切位点BspEI和KpnI（序列6），HindIII和KpnI双酶切ocs片段后与载体pV10和pPRV10分别连接，获得pV11和pPRV11。以水稻基因组为模板，P630-F（SEQ ID NO:40）和P630-R（SEQ ID NO:41）为引物，克隆具有根特异性表达的启动子KT630（SEQ ID NO:7）并插入到克隆载体pEasy-T1(TransGen Biotech)，测序正确后用PCR的方法分别在5’端和3’端引入HindIII和PstI酶切位点，经双酶切后与经HindIII和SbfI双酶切的载体pV11和pPRV11分别连接，获得pV12和pPRV12。XmaI和AscI双酶切Mi基因，载体pV12和pPRV12，分别连接后获得抗小西葫芦花叶病毒和线虫载体pLuo-Anti1（图1）和抗小西葫芦花叶病毒、番木瓜环茎病毒、线虫的载体pLuo-Anti2（图2）。

表3载体构建中合成的引物

引物名称	引物序列（5’-3’，SEQ ID NO：）
		ad-1F	GATCTGTCGACGGTACCGAATTCCTGCAGG(42)
ad-1R	GATCCCTGCAGGAATTCGGTACCGTCGACA(43)
		ad-2F	GTGGACTAGTGGTACCT(44)
ad-2R	CTAGAGGTACCACTAGTCCACCATG(45)
		ad-3F	CTAGTCTGCAGCCCGGGCAATTGAAGCTTGGTAC(46)
ad-3R	CAAGCTTCAATTGCCCGGGCTGCAGA(47)
		Xmi-F	CTTCCCGGGATGGAAAAACGAAAAGATATTGAAG(48)
Xmi-R	AACGGGCGCGCCCTACTTAAATAAGGGGATATTCTTCTGG(49)

实施例4、转基因罗汉果的创制和筛选

（1）外植体的选取：将植株嫩芽消毒处理后，去掉叶片并切成茎段，放在腋芽诱导培养基（MS+0.5mg/L6BA+0.05mg/L NAA）上培养，当腋芽长出2-3片新叶，再切取叶片作为农杆菌侵染的转化受体材料。

（2）预培养：将无菌叶片，剪掉叶缘和中间主叶脉，然后分剪成0.5×0.5c㎡的叶盘，置于pH=5.6预培养平板中（MS+1mg/L6BA+0.5mg/L IBA），每板100个叶盘，放入培养盒，28℃暗培养1天。

（3）菌液的制备：将含正确表达质粒的农杆菌菌液取出，用接种环沾取菌液，在含有抗生素（kana50mg/L、Rif25mg/L）的YEB固体培养基上划线，28℃恒温箱培养2天，直到有清晰的单菌落出现；从平板上挑取农杆菌单菌落3-6个，接种于25ml含抗生素（kana50mg/L、Rif25mg/L）的YEB液体培养基中，200rpm、28℃条件下培养16-20小时，至菌液浓度OD₆₀₀=2.0左右；根据初菌液的生长状态，按1:100的比例将初菌液在加好抗生素的YEB液体中扩大培养，培养条件200rpm、28℃摇床上摇2.5-3小时左右，当OD₆₀₀值在0.1-0.2时停止培养；将菌液倒在离心瓶中，在4℃条件下以3000rpm离心10min，去除上清液后，收集菌体。用等比例的含激素AA培养液（0.25mg/L IBA,0.1mg/L6BA，20mg/LAs）在28℃摇床以150rpm转悬浮培养10min。

(4)转化、共培养:将预培养的外植体置于250ml的无菌三角瓶中，加入预先处理好的100ml农杆菌菌液，28℃、150rmp摇床中培养5min，迅速倒掉菌液，取出外植体，放在铺有无菌滤纸的平板中，阴干5min，在pH5.2的共培养基（MS+1mg/L6BA+0.5mg/L IBA）平板上放一张滤纸，把阴干的叶盘均匀铺在上面，封好平皿，25℃暗培养5天。

(5)筛选分化:将经过共培养的外植体置于无菌三角瓶中，用加有300mg/L头孢的无菌水清洗3遍，再用MS培养液摇2次，倒掉液体，放在无菌滤纸上阴干2min，然后将外植体平铺在含筛选剂的分化培养基上，使其与培养基充分接触，每瓶5块，25℃光培养30天。当外植体的转化细胞开始分化出抗性不定芽点，将不定芽点转入新的筛选培养基中，继续筛选，选出能成活的抗性芽。

(6)芽苗生根:当筛选成活的抗性苗长至2-3cm时，切下并分别标记为独立的株系，转入含筛选剂的生根培养基中，培养10-15天使其生根。

(7)移栽炼苗:把生根的抗性苗从恒温培养室移出，置于常温中，使其逐渐适应外界环境，3天后打开培养瓶的盖子，并在培养基表层覆一层水，进一步炼苗，1天后，取出生根苗，洗净根上的培养基，移栽到育苗基质中，保持土壤湿润，直至苗长出新叶。

实施例5、转基因罗汉果T₀代苗的分子检测

提取转基因罗汉果T₀代苗叶片基因组DNA作为PCR检测的模板，以Pucc-nF（SEQ ID NO:50）和RZY-3R(SEQ ID NO:29)为引物。94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸40sec，35个循环，扩增获得567bp的目标片段。以质粒pLuo-Anti1和pLuo-Anti2DNA为阳性对照模板，非转基因罗汉果DNA为阴性对照模板。电泳检测结果见图8，证明目的片段已经成功导入罗汉果基因组中。目前获得pLuo-Anti1转基因罗汉果35株，pLuo-Anti2转基因罗汉果42株。

实施例6、转基因罗汉果抗病毒病功能检测

罗汉果植株生长至6-8片叶时，取生长健壮的叶片做抗病毒功能检测。用无菌水冲洗被病毒感染的罗汉果叶片表面，晾干后取适量叶片，加少量石英砂在缓冲液中(K₂HPO₄10g/L，Na₂SO₃1g/L)研碎成糊状。用研磨棒蘸取少量病叶汁液，在供接种的植物叶面从叶基向叶尖方向轻抹2-3次，不要弄破叶片。接种后用洗瓶将叶面的病汁液和石英砂冲洗干净。用不含病毒汁液（只含有石英砂）的缓冲液涂抹叶片，作为对照。接种7周后，筛选具有高抗病毒的株系。其中抗病毒的情况分为三种：（1）易感株系：接种14天后有严重花叶病症为易感病株；（2）延迟抗性株系：比对照组（非转基因罗汉果）有1至2星期延迟病症者为延迟抗性株系；（3）高抗性株系：在接种28天后无病症发生为高抗性株系。检测结果如表4所示，转pLuo-Anti1载体获得18株高抗株系，转pLuo-Anti2载体获得25株高抗株系。说明本发明所提供的方法和载体可以获得高抗病毒的罗汉果株系。

表4转基因罗汉果抗病毒功能检测

SEQUENCE LISTING

<110> 怀化博雅惠农科技有限公司

<120> 一种培育抗病毒罗汉果的方法

<160> 50

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 955

<212> DNA

<213> 感染花叶病毒的罗汉果

<400> 1

gatatctaga tatgtgataa ccaattggac aagaatggaa attttgtctg gggagaaaga 60

gggtatcatt ccaagcggtt attcaagaac ttctttgagg aagtaatacc aagtgaagga 120

tatacgaaat acgtagtgcg aaactttcca aatggtactc gtaagttggc cataggctct 180

ttgattgtac cactcaactt ggatagggca cgcactgcac tctcacatgg actcaacatt 240

ggctatggca acctagtaaa atcgcgtggg gcacgcttaa cttagttgat gaacaaccag 300

ggcctgaatt tcgtatttca aatctagtaa aggatttgtt cacttctggt gttgaaacac 360

agagcaagcg agaaagatgg gtctacgaaa gctgtgaagg gaaccttcga gctgttggaa 420

ctgcacaatc agcgctagtc accaaacacg agaattggct gccctcggaa aagctccata 480

tatagctgaa acagcacttc gtaagctata cactgacgag ggagcagaga caagtgaact 540

ggcacgctac ctacaagccc tccatcaaga tatcttcttt gaacaaggag acactgtagc 600

tttcgacttc tatgaagtca actctaaaac tcctgaaaga gcccgcgaag ctgttgcaca 660

gatgaaagca gcagctctta gcaatgtttc ttcaaggttg tttggccttg atggaaatgt 720

tgccaccact agcgaagaca ctgaacggca cactgcacgt gatgttaata gaaacatgca 780

caccttgtta ggtgtgaaca caatgcagta aagggtaggt cgcctaccta ggttatcgat 840

tcgctgccga cgtaattcta atatttaccg ctttatatga tgtctttaga ttttagtgtg 900

ggcctcccac ctttaaagcg taaagtttat gttagttgtc caggaggatc cgaga 955

<210> 2

<211> 979

<212> DNA

<213> 感染花叶病毒的罗汉果

<400> 2

gatatctaga tatgtgataa ccaattggac aagaatggaa attttgtctg gggagaaaga 60

gggtatcatt ccaagcggtt attcaagaac ttctttgagg aagtaatacc aagtgaagga 120

tatacgaaat acgtagtgcg aaactttcca aatggtactc gtaagttggc cataggctct 180

ttgattgtac cactcaactt ggatagggca cgcactgcac tctcacatgg actcaacatt 240

ggctatggca acctagtaaa atcgcgtggg gcacgcttaa cttagttgat gaacaaccag 300

ggcctgaatt tcgtatttca aatctagtaa aggatttgtt cacttctggt gttgaaacac 360

agagcaagcg agaaagatgg gtctacgaaa gctgtgaagg gaaccttcga gctgttggaa 420

ctgcacaatc agcgctagtc accaaacacg agaattggct gccctcggaa aagctccata 480

tatagctgaa acagcacttc gtaagctata cactgacgag ggagcagaga caagtgaact 540

ggcacgctac ctacaagccc tccatcaaga tatcttcttt gaacaaggag acactgtatc 600

atcttcttca gtataatccg caacaaattg acatctcaaa cactcgtgcc actcaatctc 660

aattcgaaaa gtggtatgag ggagtgagga atgattacgg tcttgatgat aacgaaatgc 720

aagtgatgtt aaatggtttg atggtttggt gtatcgaaaa tggtacatct ccagacatat 780

ctggtgtctg ggtaatgatg gatggggaaa cccaagttga ttatcccatc aaacctttga 840

ttgaacacgc aactccttcg ttcagacaaa tcatggctca cttcagtaac gcggcagagg 900

catacatcgc gaagaggaat gcaactgaga ggtacatgcc gcggtatgga atcaaaagga 960

atttgactgg gatccgaga 979

<210> 3

<211> 3774

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Miller)

<400> 3

atggaaaaac gaaaagatat tgaagaagca aacaactcat tggtgttatt ttctgctctt 60

agcaaggaca ttgccaatgt tctaattttc ctagagaatg aggaaaatca aaaagctctt 120

gacaaagatc aagttgaaaa gctaaaattg aaaatggcat ttatttgtac atatgttcag 180

ctttcttatt ccgattttga gcagtttgaa gatataatga ctagaaatag acaagaggtt 240

gagaatctgc ttcaatcact tttggatgat gatgtcctta ctagcctcac cagtaatatg 300

gatgactgta tcagcttgta tcatcgttct tataaatcag atgccatcat gatggatgag 360

caattggact tcctcctctt gaatctgtat catctatcca agcatcacgc tgaaaagata 420

tttcctggag tgactcaata tgaagttctt cagaatgtat gtggcaacat aagagatttc 480

catgggttga tactgaatgg ttgcattaag catgagatgg ttgagaatgt cttacctctg 540

tttcaactca tggctgaaag agtaggacac ttcctttggg aggatcagac tgatgaagac 600

tctcggctct ccgagctaga tgaggatgaa cacaatgata gagactctcg actcttccag 660

ctaacacatc tactcttgaa gattgttcca actgaactgg aggttatgca catatgttat 720

acaaatttga aagcttcaac ttcagcagaa gttggacgct tcattaagaa gctcctggaa 780

acctcaccgg atattctcag agaatatatc attcaactac aagagcatat gttaactgtt 840

attcccccta gcactttagg ggctcgaaac attcatgtca tgatggaatt cctattactt 900

attctttctg atatgcccaa ggactttatt catcatgaca aactttttga tctcttggct 960

catgttggaa cacttaccag ggaggtatcg actcttgtac gtgacttgga agagaaatta 1020

aggaataaag agggtaataa ccaaacaaat tgtgcaaccc tagacttgct ggaaaatatt 1080

gaactcctca agaaagatct caaacatgtt tatctgaaag ccccaaattc atctcaatgt 1140

tgcttcccca tgagtgatgg accactcttc atgcatcttc tacacatgca cttaaatgat 1200

ttgctagatt ctaatgctta ttcaatttct ttgataaagg aagaaatcga gttggtgagt 1260

caagaactgg aattcataag atcattcttt ggggatgctg ctgagcaagg attgtataaa 1320

gatatctggg cacgtgttct agatgtggct tatgaggcaa aagatgtcat agattcaatt 1380

attgttcgag ataatggtct cttacatctt attttctcac ttcccattac cataaagaag 1440

atcaaactta tcaaagaaga gatctctgct ttagatgaga acattcccaa ggacagaggt 1500

ctaatcgttg tgaactctcc caagaaacca gttgagagaa agtcattgac aactgataaa 1560

ataattgtag gttttgagga ggagacaaac ttgatactta gaaagctcac cagtggaccc 1620

gcagatttag atgtcatttc gatcaccggt atgccgggtt caggtaaaac tactttggca 1680

tacaaagtat acaatgataa gtcagtttct agacattttg accttcgtgc atggtgcacg 1740

gtcgatcaag gatatgacga caagaagttg ttggatacaa ttttcagtca agttagtggc 1800

tcagattcaa atttgagtga gaatattgat gttgctgata aattgcggaa acaactgttt 1860

ggaaagaggt atcttattgt cttagatgat gtgtgggata ctactacatt ggatgagttg 1920

acaagacctt ttcctgaagc taagaaagga agtaggatta ttttgacaac tcgagaaaag 1980

gaagtggctt tgcatggaaa gctgaacact gatcctcttg accttcgatt gctaagacca 2040

gatgaaagtt gggaactttt agataaaagg acatttggta atgagagttg ccctgatgaa 2100

ctattagatg tcggtaaaga aatagccgaa aattgtaaag ggcttccttt ggtggctgat 2160

ctgattgctg gagtcattgc tgggagggaa aagaaaagga gtgtgtggct tgaagttcaa 2220

agtagtttga gttcttttat tttgaacagt gaagtggaag tgatgaaagt tatagaatta 2280

agttatgacc atttaccaca tcacctcaag ccatgcttgc ttcactttgc aagttggccg 2340

aaggacactc ctttgacaat ctatttgttt actgtttatt tgggtgctga aggatttgtg 2400

gaaaagacgg agatgaaggg tatagaagaa gtggtgaaga tttatatgga tgatttaatt 2460

tccagtagct tggtaatttg tttcaatgag ataggtgata tactgaattt ccaaattcat 2520

gatcttgtgc atgacttttg tttgataaaa gcaagaaagg aaaatttgtt tgatcggata 2580

agatcaagtg ctccatcaga tttgttgcct cgtcaaatta ccattgatta tgatgaggag 2640

gaggagcact ttgggcttaa ttttgtcatg ttcgattcaa ataagaaaag gcattctggt 2700

aaacacctct attctttgag gataaatgga gaccagctgg atgacagtgt ttctgatgca 2760

tttcacctaa gacacttgag gcttattaga gtgttggacc tggaaccctc tttaatcatg 2820

gtgaatgatt ctttgctgaa tgaaatatgc atgttgaatc atttgaggta cttaagaatt 2880

cggacacaag ttaaatatct gcctttctct ttctcaaacc tctggaatct agaaagtctg 2940

tttgtgtcta acaaaggatc aatcttggta ctattaccga gaattttgga tcttgtaaag 3000

ttgcgagtgc tgtccgtggg tgcttgttct ttctttgata tggatgcaga tgaatcaata 3060

ttgatagcaa aggacacaaa gttagagaac ttgagaatat taggggaact gttgatttcc 3120

tattcgaaag atacaatgaa tattttcaaa aggtttccca atcttcaggt gcttcagttt 3180

gaactcaagg agtcatggga ttattcaaca gagcaacatt ggttcccgaa attggattgc 3240

ctaactgaac tagaaacact ctgtgtaggt tttaaaagtt caaacacaaa ccactgtggg 3300

tcctctgttg tgacaaatcg gccgtgggat tttcacttcc cttcaaattt gaaagaactg 3360

ttgttgtatg actttcctct gacatccgat tcactatcaa caatagcgag actgcccaac 3420

cttgaaaatt tgtcccttta tgatacaatc atccagggag aagaatggaa catgggggag 3480

gaagacactt ttgagaatct caaatttttg aacttgcgtc tactgactct ttccaagtgg 3540

gaggttggag aggaatcctt ccccaatctt gagaaattaa aactgcagga atgtggtaag 3600

cttgaggaga ttccacctag ttttggagat atttattcat tgaaatttat caaaattgta 3660

aagagtcctc aacttgaaga ttctgctctc aagattaaga aatacgctga agatatgaga 3720

ggagggaacg atcttcagat ccttggccag aagaatatcc ccttatttaa gtag 3774

<210> 4

<211> 1706

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

actagtaatt ctcagtccaa agcctcaaca aggtcagggt acagagtctc caaaccatta 60

gccaaaagct acaggagatc aatgaagaat cttcaatcaa agtaaactac tgttccagca 120

catgcatcat ggtcagtaag tttcagaaaa agacatccac cgaagactta aagttagtgg 180

gcatctttga aagtaatctt gtcaacatcg agcagctggc ttgtggggac cagacaaaaa 240

aggaatggtg cagaattgtt aggcgcacct accaaaagca tctttgcctt tattgcaaag 300

ataaagcaga ttcctctagt acaagtgggg aacaaaataa cgtggaaaag agctgtcctg 360

acagcccact cactaatgcg tatgacgaac gcagtgacga ccacaaaaga attagcttga 420

gctcaggatt tagcagcatt ccagattggg ttcaatcaac aaggtacgag ccatatcact 480

ttattcaaat tggtatcgcc aaaaccaaga aggaactccc atcctcaaag gtttgtaagg 540

aaaagctagc ttggaagttt ctctcttgag ggaggttgct cgtggaatgg gacacatatg 600

gttgttataa taaaccattt ccattgtcat gagattttga ggttaatata tactttactt 660

gttcattatt ttatttggtg tttgaataaa tgatataaat ggctcttgat aatctgcatt 720

cattgagata tcaaatattt actctagaga agagtgtcat atagattgat ggtccacaat 780

caatgaaatt tttgggagac gaacatgtat aaccatttgc ttgaataacc ttaattaaaa 840

ggtgtgatta aatgatgttt gtaacatgta gtactaaaca ttcataaaac acaaccaacc 900

caagaggtat tgagtattca cggctaaaca ggggcataat ggtaatttaa agaatgatat 960

tattttatgt taaaccctaa cattggtttc ggattcaacg ctataaataa aaccactctc 1020

gttgctgatt ccatttatcg ttcttattga ccctagccgc tacacacttt tctgcgatat 1080

ctctgaggta agcgttaacg tacccttaga tcgttctttt tctttttcgt ctgctgatcg 1140

ttgctcatat tatttcgatg attgttggat tcgatgctct ttgttgattg atcgttctga 1200

aaattctgat ctgttgttta gattttatcg attgttaata tcaacgtttc actgcttcta 1260

aacgataatt tattcatgaa actattttcc cattctgatc gatcttgttt tgagatttta 1320

atttgttcga ttgattgttg gttggtggat ctatatacga gtgaacttgt tgatttgcgt 1380

atttaagatg tatgtcgatt tgaattgtga ttgggtaatt ctggagtagc ataacaaatc 1440

cagtgttccc tttttctaag ggtaattctc ggattgtttg ctttatatct cttgaaattg 1500

ccgatttgat tgaatttagc tcgcttagct cagatgatag agcaccacaa tttttgtggt 1560

agaaatcggt ttgactccga tagcggcttt ttactatgat tgttttgtgt taaagatgat 1620

tttcataatg gttatatatg tctactgttt ttattgattc aatatttgat tgttcttttt 1680

tttgcagatt tgttgaccag ctgcag 1706

<210> 5

<211> 655

<212> DNA

<213> 豌豆（Pisum sativum Linn）

<400> 5

cccgggagct ttcgttcgta tcatcggttt cgacaacgtt cgtcaagttc aatgcatcag 60

tttcattgcg cacacaccag aatcctactg agtttgagta ttatggcatt gggaaaactg 120

tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa tttactgtgt tttttattcg gttttcgcta 180

tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa gagttaatga atgatatggt ccttttgttc 240

attctcaaat taatattatt tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa tttgaaatta 300

taagagatat gcaaacattt tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg cctctaatga 360

ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg tagttgtacc attatgctta ttcactaggc 420

aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct gcaaatgtta ctgaatacaa gtatgtcctc 480

ttgtgtttta gacatttatg aactttcctt tatgtaattt tccagaatcc ttgtcagatt 540

ctaatcattg ctttataatt atagttatac tcatggattt gtagttgagt atgaaaatat 600

tttttaatgc attttatgac ttgccaattg attgacaaca tgcatcaatg aattc 655

<210> 6

<211> 232

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）

<400> 6

gaagcttggg ccccctgcag gggcgcgccc cctgctttaa tgagatatgc gagacgccta 60

tgatcgcatg atatttgctt tcaattctgt tgtgcacgtt gtaaaaaacc tgagcatgtg 120

tagctcagat ccttaccgcc ggtttcggtt cattctaatg aatatatcac ccgttactat 180

cgtattttta tgaataatat tctccgttca atttactgat tccggaggta cc 232

<210> 7

<211> 1001

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 7

gctatatgtg tacgtgatag tatatttaac aatgaatcaa atgatatgaa aataataaat 60

aattacttaa atattttgaa taagacgaat ggtcaaacac gtactaaaaa gtcaacggtg 120

tcaaacattt tgaaacggaa ggagtatatt cttttaactt tgtaatagtt atatataatt 180

gttcgtacct cgagtagtta tcataaaact attcaactat tcagaaaaaa aagagtacat 240

cttacgggag aaggccagcc aaaattagta catctcatgg tggatgccaa caatcaacaa 300

aacctaccaa tccacacatt attacacctg aaaacgatct ctagctctga ttaatttcaa 360

acttcgatta tggactagtc aacacttcct aatagcagtg aactttgatt tggccatatg 420

aatactccca actttcatac cgaaaatttt atcttcaaac tatgaattct aaggatattc 480

ccttttaggc cgatcactag ttcccctttt tatttgcaga gaggaaacat gcaaatttga 540

tatagaaata tacaaggggg aagcatacat atgatgccta tctgccatcc caggtacatg 600

cctatctgcc aaaacaatca actaacctac caagtaccaa tcctcccata attgaacagc 660

tggaccagga aaaatcatca tctgtgtaca tcttaattga ccatattcat gcaagctctg 720

atcaagttgt gcaatgtcag tattatatta ctaagttagt agctagttag ttaaatatca 780

gtctaataaa tgtctaatca gagctgttag taggaaagag taggtcacca atctctcaaa 840

gacttataca agctagattc catcaccaca ctatataaac acacacacac ctgaacacca 900

gtcacacaac caaatcaagc tcagcttaat caatcacctc atcacacact cttagctaag 960

ctaagctaag ctaagctaga gctaatacaa gagcaaatta a 1001

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tcgtcgcaac cggaagttca gt 22

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gccaactctg taatgcttca tctcgc 26

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

agagcaaatc catctacaaa gg 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ttctcgcttg ctctgtgttt ca 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gagcaagcga gaaagatggg t 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tgattggagc attacggtgt ct 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

caatcaggca ctcagccaac t 21

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cctacccttt actgcattgt gttca 25

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aatacaatga cgtggctgaa aaat 24

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cgccgacaat gtagtgcttc a 21

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

cacgaaggaa aaagtctttg tcaa 24

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

tttgctcgaa aacattcaat tga 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

agtggtggtc gttggctctt t 21

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gactgatgaa acacatgcgt attg 24

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

gcatgtgttt catcagtcca aga 23

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gttgcgcata cccaggagag a 21

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

gatatctaga tatgtgataa ccaattggac aagaa 35

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

tgcagtgcgt gccctatcca agttgagtgg tacaa 35

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

aacttggata gggcacgcac tgcactctca catggactca 40

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

tctcgcttgc tctgtgtttc aacaccagaa gtga 34

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

aaacacagag caagcgagaa agatgg 26

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

agccaattct cgtgtttggt gactagcgc 29

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

gctagtcacc aaacacgaga attggctgcc ct 32

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

atagaagtcg aaagctacag tgtctccttg ttcaaa 36

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

gaacaaggag acactgtagc tttcgacttc tatgaagtca 40

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

tctcggatcc tcctggacaa ctaacataaa ctttacgc 38

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

gaacaaggag acactgtagc tttcgacttc tatgaagtca 40

<210> 35

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

tctcggatcc tcctggacaa ctaacataaa ctttacgc 38

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

agcttggaag tttctctctt gagggagg 28

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

aacaaatctg caaaaaaaag a 21

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

cccgggagct ttcgttcgta tcatcggttt c 31

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

gaattcattg atgcatgttg tcaat 25

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

gctatatgtg tacgtgatag ta 22

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

ttaatttgct cttgtattag ct 22

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 42

gatctgtcga cggtaccgaa ttcctgcagg 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 43

gatccctgca ggaattcggt accgtcgaca 30

<210> 44

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 44

gtggactagt ggtacct 17

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 45

ctagaggtac cactagtcca ccatg 25

<210> 46

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 46

ctagtctgca gcccgggcaa ttgaagcttg gtac 34

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 47

caagcttcaa ttgcccgggc tgcaga 26

<210> 48

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 48

cttcccggga tggaaaaacg aaaagatatt gaag 34

<210> 49

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 49

aacgggcgcg ccctacttaa ataaggggat attcttctgg 40

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 50

gtgtcactca aaaccaga 18

Claims

1.一种培育抗病植物的方法，其特征在于所述抗病植物通过在植物中转入一个载体获得，所述载体的T-DNA区含有一个RNAi结构，所述RNAi结构中含有一个小西葫芦花叶病毒基因片段，所述小西葫芦花叶病毒的基因片段如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的RNAi结构由一个组成型表达的启动子驱动表达，所述组成型表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的T-DNA区还含有一个抗线虫基因，所述抗线虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.权利要求3所述的方法，其中所述的抗线虫基因由一个根特异表达启动子驱动表达，所述根特异表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

5.一种培育抗病植物的方法，其特征在于所述抗病植物通过在植物中转入一个载体获得，所述载体的T-DNA区含有一个RNAi结构，所述RNAi结构中含有部分小西葫芦花叶病毒和部分番木瓜环茎病毒的核苷酸拼接序列，所述拼接序列如SEQ ID NO:2所示。

6.权利要求5所述的方法，其中所述的RNAi结构还连有一个启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.权利要求5或6所述的方法，其中所述的T-DNA区还含有一个抗线虫基因，所述抗线虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

8.权利要求7所述的方法，其中所述的抗线虫基因由一个根特异表达启动子驱动表达，所述根特异表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

9.权利要求1-8之任一所述的方法，其中所述的植物是罗汉果。

10.一种载体，其特征在于所述载体含有一个小西葫芦花叶病毒基因片段和一个抗线虫基因，所述小西葫芦花叶病毒的基因片段如SEQ ID NO:1所示，所述抗线虫基因如SEQ ID NO:3所示。

11.权利要求10所述的载体，其中所述的小西葫芦花叶病毒基因片段连有一个组成型表达的启动子，所述组成型表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中所述的抗线虫基因连有一个根特异表达启动子，所述根特异表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

12.一种载体，其特征在于所述载体含有部分小西葫芦花叶病毒和部分番木瓜环茎病毒的核苷酸拼接序列和一个抗线虫基因，所述部分小西葫芦花叶病毒和部分番木瓜环茎病毒的核苷酸拼接序列如SEQ ID NO:2所示，所述抗线虫基因如SEQ ID NO:3所示。

13.权利要求12所述的载体，其中所述的小西葫芦花叶病毒基因片段连有一个组成型表达的启动子，所述组成型表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中所述的抗线虫基因连有一个根特异表达启动子，所述根特异表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。