CN103826440A - 马铃薯的马铃薯y病毒组抗性 - Google Patents

马铃薯的马铃薯y病毒组抗性 Download PDF

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Abstract

本发明涉及来自野生植物(例如野生马铃薯和胡椒植物)的新颖基因，所述基因将马铃薯Y病毒组抗性赋予植物，例如在经转化的栽培植物中。还涵盖利用所述新颖基因转化的栽培植物、从所述经转化的栽培植物制得的食品和制造所述植物和食品的方法。

Description

马铃薯的马铃薯Y病毒组抗性
相关专利申请案的交叉参考
本申请案主张对2010年10月18日提出申请的美国临时申请案第61/394,081号和2011年5月4日提出申请的美国临时申请案第61/482,579号的优先权，全部临时申请案均以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明属于农业基因组学和植物遗传修饰以产生与未经修饰或未经转化的植物相比具有经改变的性状(例如PVY抗性或改进的PVY抗性)的植物的领域。
背景技术
马铃薯植物的马铃薯Y病毒组(potyvirus)感染根据病毒株而导致各种症状。这些症状包括产量损失、叶片卷曲、轻微斑点、感染区域和感染周围区域的快速死亡、扭曲和易碎的叶片、有褶皱且粗糙的叶片和马铃薯块茎坏死环斑病。坏死环斑病使得马铃薯不能上市销售且因此可导致收入明显损失。马铃薯Y病毒组可通过蚜虫载体传播，但也可在种用马铃薯中保持休眠。此意味着使用相同品系的马铃薯产生种用马铃薯用于几次连续世代将导致病毒载量的递增且随后作物损失。
对抗特定马铃薯Y病毒组菌株的隐性抗性可与番茄、胡椒、甜瓜、大麦、生菜和豌豆中eIF4E蛋白质的一个或几个氨基酸取代相关联(图1)。尽管这些取代显示出聚类，但已证明难以设计新的耐eIF4E介导的疾病的型式。
eIF4E基因介导的抗性是隐性的，但已展示胡椒基因pvr1当在番茄中过表达时提供显性马铃薯Y病毒组抗性(康(Kang)等人，植物生物技术杂志(Plant Biotechnol J)5:526-536)。
使用耕作(TILLING)不可能在四倍体马铃薯中发展马铃薯Y病毒组抗性(皮隆(Piron)等人，公共科学图书馆·综合(PLoS ONE)5,2010)。此方法需要使用近交系(其不可能在四倍体马铃薯中产生)以及回交(以将所述性状与全基因组诱发突变处理所诱导的不希望突变隔离)。由于马铃薯是高度杂合子且遭受近交衰退，因此回交导致适应性降低且可触发幼苗死亡。
还不知道关于马铃薯和其性相容“野生马铃薯”亲缘植物中的马铃薯Y病毒组抗性的分子基础的信息。此知识的缺乏使得不可能通过全植物源DNA转化(all-native DNAtransformation，一种被认为更为用户所接受的新的遗传改造途径)将抗性纳入到现有品种中。
马铃薯eIF4E蛋白质具有共有序列DX1X2X3X4K SX5Q X6AW GSS X7RX8X9YTFSX10VEX11FWX12X13YN NIH X14P S KLX15X16GA D(SEQ ID NO:25)的46-氨基酸结构域，由此至少一个中性氨基酸(“X”)由带电荷氨基酸取代或者至少一个带电荷氨基酸由中性氨基酸或具有相反电荷的氨基酸取代。参见美国专利第7,919,677号。还证实(i)中性氨基酸X3由负性氨基酸谷氨酸盐(E)代替，或(ii)中性氨基酸X7由正性氨基酸精氨酸(R)代替可获得马铃薯Y病毒组抗性。参见美国专利第7,772,462B2号。这些研究还指出抗性可通过用精氨酸代替8位的氨基酸来获得。
马铃薯与数百种野生马铃薯物种是性相容的，此意味着其是异常庞大且多样化基因库的一部分。然而，尽管存在此显著的竞争优势，但现有马铃薯品种均未显示对抗农业基因组学上重要的马铃薯Y病毒组病原体马铃薯病毒Y(PVY)的抗性。
发明内容
本发明技术的一个方面是将PVY抗性赋予植物达至少一段时期的方法，其包含：
(A)在植物的细胞中表达以下中的至少一者：(i)包含序列SEQ ID NO:2的全长pwp1基因，或(ii)包含序列SEQ ID NO:4的全长pwp2基因；或者
(B)在植物的细胞中表达以下中的至少一者：(i)包含序列SEQ ID NO:2的全长pwp1基因，或(ii)包含序列SEQ ID NO:4的全长pwp2基因，以及下调植物的内源性eIF4E基因的表达；或者
(C)表达以下中的至少一者：(i)SEQ ID NO:2的N-末端截短片段或(ii)SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或者
(D)使植物的内源性eIF4E基因的序列发生突变以包含至少两个来自以下组成的群组的点突变：SEQ ID NO:6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P，所述点突变赋予对PVY的抗性达至少一段时期；
其中所述植物完全抵抗PVY病毒感染，或在一段时期之后显现PVY疾病的一种或一种以上症状。
在一个实施例中，片段选自由以下组成的群组：(i)SEQ ID NO:20、(ii)SEQ ID NO:21。
在另一实施例中，所述时期选自由以下组成的群组：(i)1到3天；(ii)3到5天；(iii)5到7天；(iv)7到9天；(v)9到11天；(vi)11到13天；(vii)13到15天；(viii)2到3周；(ix)3到4周；(x)4到5周；(xi)5到7周；(xii)7到10周；(xii)2到3个月和(xiii)3到5个月。
在另一实施例中，所述植物选自由以下组成的群组：(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
在另一实施例中，所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状：(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌(Phytophthora)具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
本发明技术的另一方面是转化植物以完全抵抗PVY病毒疾病或以抵抗PVY疾病的一种或一种以上症状的发作达一段时期的方法，所述方法包含利用编码具有选自由以下组成的群组的序列的蛋白质的多核苷酸转化所述植物：(i)SEQ ID NO:26、(ii)SEQ IDNO:28和(iii)选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:32组成的群组的序列的N-末端截短片段。
在一个实施例中，所述时期选自由以下组成的群组：(i)1到3天；(ii)3到5天；(iii)5到7天；(iv)7到9天；(v)9到11天；(vi)11到13天；(vii)13到15天；(viii)2到3周；(ix)3到4周；(x)4到5周；(xi)5到7周；(xii)7到10周；(xii)2到3个月和(xiii)3到5个月。
在另一实施例中，片段选自由以下组成的群组：(i)SEQ ID NO:16和(ii)SEQ ID NO:23。
在另一实施例中，植物选自由以下组成的群组：(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
在另一实施例中，所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状：(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
在另一实施例中，植物的内源性eIF4E基因被下调或抑制。举例来说，天然eIF4E基因的RNA转录物或天然eIF4E基因的蛋白质产物的量可降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
在另一实施例中，经转化植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状：(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
本发明技术的另一方面是分离的多核苷酸，其包含序列，所述序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQ ID NO:6的至少15个连续氨基酸具有至少80%一致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：SEQ ID NO:6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P；或(B)编码包含序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的蛋白质，(C)编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或(D)编码包含序列SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的蛋白质；或(E)编码序列SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32的N-末端截短片段；其中多核苷酸当在植物中表达时赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。
S68N取代是在SEQ ID NO:25的由X1代表的位置处的中性到中性氨基酸变化。本发明技术预期S68可更换为另一种中性氨基酸，例如丙氨酸和半胱氨酸。
S68N取代是在SEQ ID NO:25的由X1代表的位置处的中性到中性氨基酸变化。本发明技术预期S68可更换为另一种中性氨基酸，例如丙氨酸和半胱氨酸。
I70T取代是在SEQ ID NO:25的由X3代表的位置处的中性到中性氨基酸变化。本发明技术预期I70可更换为另一种中性氨基酸，例如缬氨酸和亮氨酸。
K72R取代是在SEQ ID NO:25的由6位代表的位置处的中性到中性氨基酸变化。本发明技术预期K72可更换为另一种正性氨基酸，例如组氨酸和赖氨酸。
A77D取代是在SEQ ID NO:25的由11位代表的位置处的中性到负性氨基酸变化。本发明技术预期A77可更换为另一种负性氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸。
在一个实施例中，多核苷酸编码的蛋白质与SEQ ID NO:2、4或6、或与SEQ ID NO:2、4或6的部分序列片段具有至少约99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%序列一致性。就此来说，SEQ ID NO:2、4或6的部分序列片段是指包含多于2个连续氨基酸且在植物上也起到赋予对PVY病毒的抗性的作用的肽片段。因此，在一个实施例中，SEQ ID NO:2、4或6的部分序列片段赋予植物PVY抗性且包含SEQ ID NO:2、4或6的15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个或231个连续氨基酸。
在另一实施例中，多核苷酸编码本文所揭示的赋予植物PVY抗性的任何序列的N-末端截短片段，其中所述片段包含(i)SEQ ID NO:2、4或6的残基40-231，或(ii)SEQ IDNO:2、4或6的残基50-231，或(iii)SEQ ID NO:2、4或6的残基51-231，或(iv)SEQ IDNO:2、4或6的残基52-231，或(v)SEQ ID NO:2、4或6的残基53-231；或(vi)SEQ IDNO:2、4或6的残基54-231，或(vii)SEQ ID NO:2、4或6的残基55-231，或(viii)SEQID NO:2、4或6的残基60-231。
在另一实施例中，SEQ ID NO:2的片段包含一个或一个以上以下氨基酸的组合：(N68,T70)、(N68,R72)、(N68,I76)、(N68,D77)、(N68,I128)、(N68,S130)、(N68,N172)、(N68,V175)、(T70,N68)、(T70,R72)、(T70,I76)、(T70,D77)、(T70,I128)、(T70,S130)、(T70,N172)、(T70,V175)、(R72,N68)、(R72,T70)、(R72,I76)、(R72,D77)、(R72,I128)、(R72,S130)、(R72,N172)、(R72,V175)、(I76,N68)、(I76,T70)、(I76,R72)、(I76,D77)、(I76,I128)、(I76,S130)、(I76,N172)、(I76,V175)、(D77,N68)、(D77,T70)、(D77,R72)、(D77,I76)、(D77,I128)、(D77,S130)、(D77,N172)、(D77,V175)、(I128,N68)、(I128,T70)、(I128,R72)、(I128,I76)、(I128,D77)、(I128,S130)、(I128,N172)、(I128,V175)、(S130,N68)、(S130,T70)、(S130,R72)、(S130,I76)、(S130,D77)、(S130,I128)、(S130,N172)、(S130,V175)、(N172,N68)、(N172,T70)、(N172,R72)、(N172,I76)、(N172,D77)、(N172,I128)、(N172,S130)、(N172,V175)、(V175,N68)、(V175,T70)、(V175,R72)、(V175,I76)、(V175,D77)、(V175,I128)、(V175,S130)和(V175,N172)。此编号方案反映了所指示残基在SEQ ID NO:2内的位置。因此，“N68”是指天冬酰胺在SEQ ID NO:2的68位处；“T70”表明残基苏氨酸在SEQ ID NO:2的70位处等等。在一个实施例中，SEQ ID NO:2的部分序列片段是含有一个或一个以上SEQ ID NO:2的以下氨基酸的SEQ ID NO:2的片段：(i)N68、(ii)T70、(iii)R72、(iv)I76、(v)D77、(vi)I128、(vii)S130、(viii)N172和(ix)V175。
在另一实施例中，SEQ ID NO:4的片段包含一个或一个以上以下氨基酸的组合：(T10,A23)、(T10,Y57)、(T10,N99Y)、(T10,S140)、(A23,Y57)、(A23,N99Y)、(A23,S140)、(Y57,N99Y)、(Y57,S140)、(N99Y,S140)。此编号方案反映了所指示残基在SEQ ID NO:4内的位置。因此，“T10”是指苏氨酸在SEQ ID NO:4的10位处；“A23”表明残基丙氨酸在SEQ ID NO:4的23位处等等。在一个实施例中，SEQ ID NO:4的部分序列片段是含有一个或一个以上SEQ ID NO:4的以下氨基酸的SEQ ID NO:4的片段：(i)T10、(ii)A23、(iii)Y47、(iv)N99和(v)S140。
在另一实施例中，SEQ ID NO:6的片段包含一个或一个以上SEQ ID NO:6的以下氨基酸取代的组合：(S68N,I70T)、(S68N,K72R)、(S68N,T76I)、(S68N,A77D)、(S68N,V128I)、(S68N,A130S)、(S68N,S172N)、(S68N,S175V)、(I70T,S68N)、(I70T,K72R)、(I70T,T76I)、(I70T,A77D)、(I70T,V128I)、(I70T,A130S)、(I70T,S172N)、(I70T,S175V)、(K72R,S68N)、(K72R,I70T)、(K72R,T76I)、(K72R,A77D)、(K72R,V128I)、(K72R,A130S)、(K72R,S172N)、(K72R,S175V)、(T76I,S68N)、(T76I,I70T)、(T76I,K72R)、(T76I,A77D)、(T76I,V128I)、(T76I,A130S)、(T76I,S172N)、(T76I,S175V)、(A77D,S68N)、(A77D,I70T)、(A77D,K72R)、(A77D,T76I)、(A77D,V128I)、(A77D,A130S)、(A77D,S172N)、(A77D,S175V)、(V128I,S68N)、(V128I,I70T)、(V128I,K72R)、(V128I,T76I)、(V128I,A77D)、(V128I,A130S)、(V128I,S172N)、(V128I,S175V)、(A130S,S68N)、(A130S,I70T)、(A130S,K72R)、(A130S,T76I)、(A130S,A77D)、(A130S,V128I)、(A130S,S172N)、(A130S,S175V)、(S172N,S68N)、(S172N,I70T)、(S172N,K72R)、(S172N,T76I)、(S172N,A77D)、(S172N,V128I)、(S172N,A130S)、(S172N,S175V)、(S175V,S68N)、(S175V,I70T)、(S175V,K72R)、(S175V,T76I)、(S175V,A77D)、(S175V,V128I)、(S175V,A130S)和(S175V,S172N)。
在另一实施例中，SEQ ID NO:6的片段包含一个或一个以上SEQ ID NO:6的以下氨基酸取代的组合：(T10M,A23G)、(T10M,Y57F)、(T10M,N99Y)、(T10M,L140P)、(A23G,Y57F)、(A23G,N99Y)、(A23G,L140P)、(Y57F,N99Y)、(Y57F,L140P)和(N99Y,L140P)。
在一个实施例中，片段选自由以下组成的群组：(i)SEQ ID NO:20、(ii)SEQ ID NO:21、(iii)SEQ ID NO:16和(iv)SEQ ID NO:23。
本发明技术的另一方面是载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含的序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQ ID NO:6的至少15个连续氨基酸具有至少80%一致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：SEQ ID NO:6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P；或(B)编码包含序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的蛋白质，(C)编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或(D)编码包含序列SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的蛋白质；或(E)编码序列SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32的N-末端截短片段；其中多核苷酸当在植物中表达时赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。
在一个实施例中，多核苷酸位于土壤杆菌(Agrobacterium)转移DNA中。
在另一实施例中，土壤杆菌转移DNA包含与任何土壤杆菌T-DNA边界序列均非100%一致的边界样序列。
本发明技术的另一方面是在其基因组中包含多核苷酸或以其它方式表达所述多核苷酸的植物，所述多核苷酸包含的序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQ ID NO:6的至少15个连续氨基酸具有至少80%一致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：SEQ ID NO:6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P；或(B)编码包含序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的蛋白质，(C)编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或(D)编码包含序列SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的蛋白质；或(E)编码序列SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32的N-末端截短片段；其中多核苷酸当在植物中表达是赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。
在一个实施例中，植物选自由以下组成的群组：(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
另一实施例是从植物生长的块茎、叶片或果实。
在另一实施例中，所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状：(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
本发明技术的另一方面制造食品的方法，其包含：(1)利用根据技术方案13所述的多核苷酸转化植物；(2)使所述经转化植物生长并从植物获得块茎、果实或叶片；和(3)(i)将块茎、果实或叶片作为食品直接使用或(ii)将块茎、果实或叶片加工成食品。
在一个实施例中，植物的内源性eIF4E基因的表达被下调或抑制。举例来说，天然eIF4E基因的RNA转录物或天然eIF4E基因的蛋白质产物的量可降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
在另一实施例中，经转化植物的实质上所有的细胞均表达多核苷酸。
在另一实施例中，经转化植物的至少5个叶片表达多核苷酸。
在另一实施例中，经转化植物的至少50%细胞表达多核苷酸。
在另一实施例中，多核苷酸表达持续至少1周。
本发明技术的另一方面是通过制造食品的方法制得的食品，其包含：(1)利用根据权利要求13所述的多核苷酸转化植物；(2)使所述经转化植物生长并从植物获得块茎、果实或叶片；和(3)(i)将块茎、果实或叶片作为食品直接使用或(ii)将块茎、果实或叶片加工成食品。
本发明技术的另一方面是食品，其包含从在其基因组内包含多核苷酸或以其它方式表达所述多核苷酸的植物获得的植物细胞，所述多核苷酸包含的序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQ ID NO:6的至少15个连续氨基酸具有至少80%一致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：SEQ ID NO:6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P；或(B)编码包含序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的蛋白质，(C)编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或(D)编码包含序列SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的蛋白质；或(E)编码序列SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32的N-末端截短片段；其中多核苷酸当在植物中表达时赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。
附图说明
图1：与隐性抗性相关联的eIF4E蛋白质的比对。在每一抗性等位基因中所观察到的突变加下划线。
图2：由来自马铃薯(potato,S.tuberosum)和来自野生马铃薯物种的种质(accession)非结薯马铃薯种(S.etuberosum)、恰柯薯(S.chacoense)和落果薯(S.demissum)的隔离个体的eIF4E编码的蛋白质的比对。pwp1是从非结薯马铃薯种的种质PI245939、恰柯薯种质PI175446和PI175419以及落果薯种质PI175423中分离。pwp2是从匍枝薯(S.stoloniferum)种质PI195195和PI275244分离。两种野生型等位基因之间的多态性加下划线，且野生马铃薯等位基因上的突变也加下划线。
图3：具有与隐性抗性相关联的先前表征的eIF4E蛋白质的pwp1和pwp2的比对。pwp1和pwp2上的突变加下划线。
图4：pwp1、pwp2和SteIF4EA77D蛋白质在酵母双杂交系统中的vpg结合能力。(顶部板)pwp1和pwp2结合能力：(左侧)SD(-Leu、-Trp)板上的酵母转化株。(右侧)SD(-Leu、-Trp、-His)板上的酵母转化株。诱饵质粒(bait plasmid)PBD用于表达来自PVY菌株NTN的vpg。猎物质粒(prey plasmid)PAD用于表达野生型马铃薯EIF4E和野生马铃薯pwp1和pwp2。1-4：单一载体转化株(1，PBD-vpg；2，PAD-wt EIF4E；3，PAD-pwp1；4，PAD-pwp2)。5-6：双重载体共转化株(5，PBD-vpg+PAD-wt EIF4E；6，PBD-vpg+PAD-pwp1；7，PBD-vpg+PAD-pwp2)。在亮氨酸、色氨酸介质上生长的来自每一共转化的菌落表明存在两种构建体。仅PBD-VPg/PAD-WTEIF4E共转化株在亮氨酸、色氨酸、组氨酸板上生长表明仅wtEIF4E与VPg相互作用，而pwp1和pwp2不与VPg相互作用。(底部板)SteIF4EA77D结合能力。将两个独立的酵母转化株在SD(-Leu,-Trp,-His)板上划线。1和4(PAD::SteIF4EA77D和PBD::VPg)，2和5(PAD::SteIF4E和PBD::VPg)，3和6(PAD::SteIF4EA77D)。PBD-VPg/PAD-SteIF4EA77D共转化株在亮氨酸、色氨酸、组氨酸板上生长表明仅A77D突变不能废除SteIF4E蛋白质的VPg结合能力。
图5：pSIM1567植株的RNA凝胶印迹分析。将RNA从野生型布尔班克(Burbank)(wt)、空白载体对照(vc)和转基因pSIM1567(1-25)植株的叶片组织中分离，在凝胶上运行，转移到尼龙(nylon)膜上并根据标准试验方案与经Dig标记的马铃薯EIF4E探针杂交。使用EB染色的核糖体RNA作为负载量对照。
图6：用于PVY控制的全植物源转移DNA。
图7：pSIM1719品系的叶片中的Fpvr的转录水平。RBc是黄褐色布尔班克对照且401c是空白载体对照。
图8：所选pSIM1569植株的RNA凝胶印迹分析。将RNA从野生型布尔班克(wt)、空白载体对照(401)和转基因pSIM1569(9、16、18、23、25)植株的叶片组织中分离，在凝胶上运行，转移到尼龙膜并根据标准试验方案与经Dig标记的马铃薯EIF4E探针杂交。使用EB染色的核糖体RNA作为负载量对照。
图9：所选pSIM1588(经修饰胡椒eIF4E1，mpe1，过表达)植株的RNA凝胶印迹分析。将RNA从野生型布尔班克(wt)、空白载体对照(401)和转基因pSIM1588(2、5、7、9、12、13、18、19、20和23)植株的叶片组织分离，在凝胶上运行，转移到尼龙膜并根据标准试验方案与经Dig标记的胡椒eIF4E探针杂交。使用EB染色的核糖体RNA作为负载量对照。品系7、9、13、19和20在感染后抵抗PVY达2周，且品系9和13在感染后抵抗PVY达4周。品系2、5、12、18、23易受感染。
图10：所选pSIM1723(经修饰胡椒eIF4E2，mpe2，过表达)植株的RNA凝胶印迹分析。将RNA从野生型布尔班克(wt)、空白载体对照(401)和转基因pSIM1723(6、7、9、10、15、19、20和22)植株的叶片组织分离，在凝胶上运行，转移到尼龙膜并根据标准试验方案与经Dig标记的胡椒eIF4E探针杂交。使用EB染色的核糖体RNA作为负载量对照。品系9和20在感染后抵抗PVY达2周，品系20在感染后抵抗PVY达4周，且品系6、7、10、15、19和22易受感染。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与所属领域的技术人员通常所了解意义相同的意义。通常，本文所用的命名法和本文所描述的在细胞培养、分子遗传学和核酸化学和杂交中的试验程序均是此项技术中众所周知且普遍采用的那些。使用标准技术用于重组核酸方法、多核苷酸合成、微生物培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学分析和医药调配和递送。通常，酶反应和纯化和/或分离步骤是根据制造商说明书执行。这些技术和程序通常根据常规方法来执行，例如在“分子克隆试验手册(Molecular cloning a laboratory manual)”，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold SpringHarbor,N.Y.)(1989)和分子生物学实验手册(Current protocols in molecular biology)，约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)，马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Md.)(1989)中所揭示。
“土壤杆菌”是指用于转化植物细胞且一般含有载体的根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌的卸甲(disarmed)及毒性衍生物的任何土壤杆菌属。载体通常含有位于T-DNA的边界之间或根据本发明在“植物-DNA”(“P-DNA”)的边界样序列(参见下文定义)之间的所要多核苷酸，所述边界(样)序列能够将所要多核苷酸转移到植物基因组中。土壤杆菌属的实例包括(但不限于)土壤杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、叶杆菌属(Phyllobacteriumsp.)、大豆根瘤菌属(SinoRhizobium sp.)和中间根瘤菌属(MesoRhizobium sp.)。
“氨基酸序列”包括从植物中分离、源于植物或在植物中天然存在或以合成方式制得但包含内源性对应物的核酸序列的低聚肽、肽、多肽或蛋白质和其片段。
“人工操纵”是指通过人工或通过机械手段或重组手段(例如通过遗传改造技术)移动、布置、操作或控制植物或植物细胞，以便产生与未经操纵的天然存在的对应物相比具有不同的生物学、生物化学、形态学或生理学表型和/或基因型的植物或植物细胞
“无性繁殖”是指通过从叶插、茎插、根插、块茎眼(tuber eye)、匍匐枝、单一植物细胞原生质体、愈伤组织(callus)等生成整个植株来产生后代，而不涉及配子融合。
“骨架”是指除去待整合到植物基因组中的特定盒或表达盒或构建体以外的载体或质粒的核酸序列。举例来说，在土壤杆菌转移质粒的情形中，骨架是除去位于引入和/或整合到植物基因组中的所要核酸内的特定T-DNA或P-DNA序列以外的整个质粒。因此，此质粒的骨架可含有其它表达盒，例如用于表达可选标记但不希望转移到植物基因组中的那些表达盒。这些不打算转移到植物基因组中的盒和构建体因此可视为质粒或载体“骨架”的构成部分。
“细菌介导的植物转化”是指植物改性，其通过利用选自由土壤杆菌属、根瘤菌属、叶杆菌属、大豆根瘤菌属和中间根瘤菌属组成的群组的细菌感染植物或源自所述植物的外植体或细胞，以将在所述细菌中复制的质粒的至少一部分转移到个别植物细胞的细胞核中用于随后稳定整合到所述植物细胞的基因组中。
“双元质粒”或“双元构建体”是指可保持在大肠杆菌(E.coli)和根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)二者中且含有T-DNA右侧和左侧边界的质粒，所述边界侧接至少10个侧接土壤杆菌Ti或Ri质粒中的这些元件的DNA碱基对。“边界和边界样序列”是促使转化载体T-DNA或P-DNA的裂解的土壤杆菌衍生的或植物源序列。通常，左侧边界序列和右侧边界序列侧接T-DNA或P-DNA且它们均起到virD2催化的切割反应的识别位点的作用。此活动释放位于这些边界之间的核酸。参见下表1针对边界序列的实例。
表1.“边界”和“边界样”序列
Figure BDA00003311938500111
Figure BDA00003311938500121
Y=C或T；R=A或G；K=G或T；M=A或C；W=A或T；S=C或G；V=A、C或G；B=C、G或T。
边界样序列的种质编号为：亚洲栽培稻染色体10BAC OSJNBa0096G08基因组序列(AC078894.11)；拟南芥染色体3(NM_114337.1)；拟南芥染色体1(NM_105664.1)；腾冲嗜热厌氧杆菌菌株MB4T全基因组的244个区段中的区段118(AE013091.1)；智人克隆HQ0089(AF090888.1)；根瘤菌克隆：rhiz98e12.q1k。*马铃薯左侧和右侧边界序列是根据先前描述的本发明方法获得并分离。
所释放的与virD2和virE2复合的核酸靶向植物细胞核，在其中核酸通常整合于植物细胞的基因组中。一般来说，使用两个边界序列(即，左侧边界和右侧边界)来将位于其间的核苷酸序列整合到另一核苷酸序列中。也可仅使用一个边界或两个以上边界来以此方式完成所要核酸的整合。
“天然P-DNA边界序列”是与土壤杆菌T-DNA边界序列约99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%或50%相似但并不一致的核苷酸序列。因此，边界样序列可从植物基因组分离并经修饰或突变以改变能够将核苷酸序列整合到另一核苷酸序列中的功效。其它多核苷酸序列可添加或纳入到本发明的边界样序列内。因此，P-DNA左侧边界或P-DNA右侧边界可经修饰以具有5'和3'-多克隆位点或额外的限制酶切位点。P-DNA边界序列可经修饰以增加来自伴随载体的骨架DNA不会被整合到植物基因组中的可能性。
“边界样序列”是从待修饰的所选植物物种或从与待修饰的植物物种性相容的植物分离，且起到像土壤杆菌的边界序列一样的功能。也就是说，本发明的边界样序列促进并促使其所链接多核苷酸的整合。本发明的植物DNA(即，P-DNA)优选含有边界样序列。边界样序列可包含5′-YGRYAGGATATATWSNVBKGTAAWY-3′(SEQ ID NO:34)共有序列，如美国专利第7,619,138号中所描述，其中Y为C或T；R为A或G；K为G或T；M为A或C；W为A或T；S为C或G；V为A、C或G；且B为C、G或T。来自马铃薯的边界样序列(SEQ ID NO:33)描述于(例如)美国专利第7,880,057号中。
P-DNA的边界样序列的长度在5bp到100bp之间，长度在10bp到80bp之间，长度在15bp到75bp之间，长度在15bp到60bp之间，长度在15bp到50bp之间，长度在15bp到40bp之间，长度在15bp到30bp之间，长度在16bp到30bp之间，长度在20bp到30bp之间，长度在21bp到30bp之间，长度在22bp到30bp之间，长度在23bp到30bp之间，长度在24bp到30bp之间，长度在25bp到30bp之间或长度在26bp到30bp之间。
“盒”是可包含各种遗传元件的DNA序列。因此，本文所描述的表达盒中的任一者可插入到由这些P-DNA边界序列限定的转移DNA中，所述P-DNA边界序列能够将所述盒整合到另一核酸中，例如植物基因组或植物染色体。因此，含有本文所描述的表达盒但不包含涉及RNA转录物的3-端形成和多聚腺苷酸化的DNA区的土壤杆菌质粒可经由土壤杆菌介导的转化稳定地整合到植物的基因组中。因此，经转化植物的后代将继续表达与表达盒相关联的转录物。
“愈伤组织形成”：通常，幼小的根、茎、芽和发芽幼苗是可用于诱导愈伤组织形成的几个植物组织来源。愈伤组织形成是由组织培养基中存在的生长调节物质(例如植物生长素和细胞分裂素)控制。诱导愈伤组织形成的特定物质和这些物质的浓度在植物物种之间有所不同。有时，不同来源的外植体需要不同的培养条件，即使是从相同植物或物种获得。因此，可将各种生长物质的混合物添加到组织培养基，以诱导在此培养基中培育的各种植物物种的愈伤组织形成。举例来说，诸如光的量、温度和湿度等其它因素在建立愈伤组织中很重要。一旦建立，便可使用愈伤组织培养物以获得原生质体，或用以研究体细胞胚胎发生、器官发生和次级代谢产物产生。
“裂解位点”是结构上不同于T-DNA边界但功能与其相似的DNA序列。裂解位点包含当暴露于涉及细菌介导的植物转化的酶时被切割的序列。其可代表活有机体的基因组中可能不存在的合成序列，或其可代表来自活的有机体(例如植物、动物、真菌或细菌)的序列。
“赋予”是指使具有一种性质或特性，例如在本发明技术中，将特定性状或特性或性质授予或给予植物或植物细胞。因此，特定抗性基因可赋予暴露于特定病毒的植物抗病毒性。抗性基因也可赋予植物细胞表达RNA转录物或蛋白质的能力，所述RNA转录物或蛋白质自身或与从其它细胞表达的转录物或抗性蛋白质的聚集体一起使得植物、植物的一部分或植物的后代对病毒具有抗性。因此，在遗传改造的植物的情况下，也可说当植物或其一部分暴露于一种或一种以上病毒时，整合到植物基因组中或在植物细胞中表达但未整合的基因或多核苷酸“赋予”其抗性。为赋予抗性，基因可稳定地或瞬时表达。根据本发明，对PVY的抗性可在一段时期内赋予经转化植物。举例来说，本发明的经转化栽培植物可抵抗PVY病毒达1到5天、1周、2到4周、1个月、2到12个月、1年、2到5年、5到10年、10到50年或50到100年或更长。
术语“组成型”当与启动子结合使用时是指启动子指令由所述启动子控制的基因的持续活性表达。术语“近组成型”当与启动子结合使用时是指启动子在不同的组织类型之间具有不同的活性。植物中的近组成型的两个实例是35S启动子和Pat启动子。
“栽培”植物是在人类管理、留意和耕作的控制下生长或通过人类管理、留意和耕作来护理的植物。关于马铃薯植物，马铃薯普通栽培亚种(Solanum tuberosum ssp.tuberosum)是一种最广泛栽培的马铃薯品种的实例，但全世界有数千种马铃薯品种。马铃薯的现代品种受到最广泛栽培。有两种主要的马铃薯亚种：安第斯亚种(andigena,Andean)；和智利亚种(tuberosum,Chilean)。一般来说，已知的栽培品种包括(但不限于)赤褐马铃薯、红马铃薯、白马铃薯、黄马铃薯(也称为Yukons)和紫马铃薯。流行品种(也称为栽培品种)包括：阿迪朗达克蓝(Adirondack Blue)、阿迪朗达克红(Adirondack Red)、阿加塔马铃薯(Agata)、杏仁马铃薯(Almond)、阿芒迪娜马铃薯(Amandine)、安雅马铃薯(Anya)、阿兰威胜马铃薯(Arran Victory)、大西洋马铃薯(Atlantic)、班贝克马铃薯(Bamberg)、拜耳德丰特奈马铃薯(Belle de Fontenay)、BF-15、彼得星马铃薯(Bildtstar)、槟旗马铃薯(Bintje)、蓝色刚果马铃薯(Blue Congo)、博诺特马铃薯(Bonnotte)、卡波斯马铃薯(Cabritas)、卡莫塔马铃薯(Camota)、车利纳马铃薯(Chelina)、奇洛埃马铃薯(Chiloé)、施露马铃薯(Cielo)、科沃拉布兰卡马铃薯(Clavela Blanca)、黛泽蕾马铃薯(Désirée)、雪妃马铃薯(Fianna)、鱼种马铃薯(Fingerling)、黄色马铃薯(Flava)、金色奇迹马铃薯(Golden Wonder)、改革者马铃薯(Innovator)、泽西皇族马铃薯(Jersey Royal)、克尔粉马铃薯(Kerr's Pink)、红隼马铃薯(Kestrel)、国王爱德华马铃薯(King Edward)、柯瑞福马铃薯(Kipfler)、巴尔弗夫人马铃薯(Lady Balfour)、琳达马铃薯(Linda)、马弗娜马铃薯(Marfona)、梅莉斯吹笛手马铃薯(Maris Piper)、马奎斯马铃薯(Marquis)、胜利者马铃薯(Nicola)、帕克卡纳马铃薯
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粉眼马铃薯(Pink Eye)、粉冷杉苹果马铃薯(Pink Fir Apple)、普莉姆拉马铃薯(Primura)、瑞特马铃薯(Ratte)、红诺兰马铃薯(Red Norland)、红庞蒂亚克马铃薯(RedPontiac)、公鸡马铃薯(Rooster)、黄褐色布尔班克、黄褐色诺库塔马铃薯(Russet Norkotah)、莎曼马铃薯(Selma)、夏波蒂马铃薯(Shepody)、西格琳德马铃薯(Sieglinde)、思科马铃薯(Sirco)、斯朋达马铃薯(Spunta)、施托布拉瓦马铃薯(Stobrawa)、维尔瓦第马铃薯(Vivaldi)、紫色马铃薯(Vitelotte)、黄色芬兰马铃薯(Yellow Finn)和育空金马铃薯(Yukon Gold)。这些栽培品种中的任一者均可如本文所揭示进行修饰以表达pwp1基因用于当品种暴露于PVY病毒时赋予抗性。野生马铃薯植物不是栽培马铃薯植物品种。参见本文其它地方定义的更多细节。
在本发明的上下文中，术语“延迟疾病进展”或“延迟疾病症状”或“抵抗PVY疾病的一种或一种以上症状的发作”或“部分抗性”是指在经PVY病毒感染之后，在如本文所揭示经转化以表达PVY抗性多核苷酸的植物中在一段时期内不会出现PVY疾病的一种或一种以上症状。举例来说，经转化植物展现疾病症状可比未经转化植物晚1到3天、3到5天、5到7天、7到9天、9到11天、11到13天、13到15天、2到3周、3到4周、4到5周、5到7周、7到10周、2到3个月和3到5个月。延迟疾病进展之经转化植物通常在感染时携带PVY病毒蛋白。参见实例5。PVY病毒蛋白可经由ELISA分析检测。症状延迟的时间长度有所不同。
PVY疾病“症状”是指植物在PVY病毒感染时可能出现的各种反应。这些“症状”包括(但不限于)感染区域和感染周围区域的快速死亡、扭曲和易碎的叶片、有褶皱且粗糙的叶片、叶片卷曲、轻微斑点、一定程度的减产和马铃薯块茎坏死环斑病。本发明涵盖这些症状中的任一者的出现或发作的延迟，且以上所描述的短语(例如“延迟疾病进展”、“延迟疾病症状”、“抵抗PVY疾病的一种或一种以上症状的发作”和“部分抗性”)意味着PVY症状出现的延迟。
“下调”或“抑制”是指细胞组份(例如RNA或蛋白质)的数量响应外部变量而减少的过程。因此，举例来说，在基因沉默的情况下，可使用有义、反义、共抑制、双链RNA、发夹RNA、siRNA，或依赖于其它基因沉默机制(例如RNAi)来下调、抑制或沉默内源性基因的表达。这可意味着基因沉默的结果是从被靶向基因正常表达的RNA转录物的水平降低，或可意味着与非沉默植物细胞相比，经编码和翻译的蛋白质水平降低。
“基因”是含有合成产物(即多肽链或RNA分子)所需的所有信息且包括编码和非编码序列的DNA分子的片段。举例来说，基因可包含不同的遗传元件(例如谨慎核苷酸序列)，其包括(但不限于)启动子、终止子、内含子、增强子、间隔子、5′-非翻译区、3′-非翻译区或重组酶识别位点。
“遗传修饰”有机体可指将核酸引入到植物或有机体的细胞或基因组中。所引入的核酸可为DNA或RNA。DNA或RNA可为单链或双链。所引入的核酸可稳定地整合到基因组或染色体物质中，或可以染色体外地方式存在于细胞内。
“分离”是指与其正常、天然环境物理隔离的任何核酸或化合物，且因此显著不同于其内源性对应物。分离的物质可维持在含有(例如)溶剂、缓冲剂、离子或其它组份的适当溶液中，且可呈纯化或未纯化形式。
“天然”当用于描述基因或遗传元件时是指基因或遗传元件天然地存在于待转化植物的基因组中，源于待转化植物的基因组或属于待转化植物的基因组。同样，术语“内源性”也可用于识别特定核酸(例如DNA或RNA)或蛋白质对于植物是“天然的”。内源性是指源于生物体内的成份。因此，从待转化的植物或植物物种的基因组分离或从与待转化植物物种性相容或可杂交的植物或物种分离的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子对于植物物种来说是“天然的”，亦即，是原生的(indigenous)。换句话说，天然遗传元件代表植物育种家可获得的通过经典植物育种用于改进植物的所有遗传物质。根据本发明，天然核酸的任何变体也可视为是“天然的”。就此来说，“天然”核酸也可从植物或其性相容物种分离并经修饰或突变，以便所得变体与从植物分离的未经修饰的天然核酸的核苷酸序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%相似性。天然核酸变体的核苷酸序列也可具有小于约60%、小于约55%或小于约50%相似性。
从植物分离的“天然”核酸也可编码从核酸转录并翻译的天然存在蛋白质产物的变体。因此，天然核酸可编码氨基酸序列与在从其中分离核酸的植物中表达的未经修饰的天然蛋白质具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%相似性的蛋白质。
“天然存在核酸”是指在所选植物物种的基因组内发现的核酸且可为DNA分子或RNA分子。通常存在于植物物种的基因组中的限制酶切位点的序列可改造到外源性DNA分子(例如载体或低聚核苷酸)中，即使限制酶切位点未自基因组物理分离。因此，本发明允许合成产生核苷酸序列(例如限制性酶识别序列)，只要所述序列天然存在于所选植物物种或与待转化的所选植物物种性相容的植物的基因组中即可。
公众关心的问题已通过研发全天然途径来制造遗传改造植物得到解决，如罗曼(Rommens)等人在新西兰(New Zealand)专利第535,395号、美国专利第7,250,554号、US7,534,934和WO2005/004585(其所有均以引用的方式并入本文中)中所揭示。罗曼等人教示，遗传元件从可用于细菌介导的植物转化的植物的识别和分离。因此，举例来说，罗曼教示植物源转移DNA(“P-DNA”)可从植物基因组分离并代替土壤杆菌T-DNA用于遗传工程植物。
“N-末端”是指由具有游离氨基(-NH2)的氨基酸封端的蛋白质或多肽的开始。每一氨基酸具有羧基和氨基，且氨基酸通过脱水反应通过将一个氨基酸的氨基连接到下一个氨基酸的羧基来彼此链接以形成链。因此，多肽链具有未结合羧基的端(C-末端)和具有氨基的端(N-末端)。书写肽序列的惯例是将N-末端放在左侧且从N-末端到C-末端书写所述序列。当从信使RNA翻译蛋白质时，它是从N-末端到C-末端形成。“N-末端截短”是指自蛋白质的N-末端缺失蛋白质的99%氨基酸。举例来说，对于100个氨基酸长的全长蛋白质来说，此蛋白质的N-末端截短型式可缺失N-末端处的第一个氨基酸、N-末端处的第一个到第五个氨基酸、N-末端处的第一个到第十个氨基酸、N-末端处的第一个到第二十个氨基酸、N-末端处的第一个到第三十个氨基酸、N-末端处的第一个到第四十个氨基酸、N-末端处的第一个到第五十个氨基酸、N-末端处的第一个到第六十个氨基酸、N-末端处的第一个到第七十个氨基酸、N-末端处的第一个到第八十个氨基酸、N-末端处的第一个到第九十个氨基酸或N-末端处的第一个到第九十九个氨基酸。更特定地，N-末端截短pwp1可缺失N-末端处的第一个氨基酸、第一个到第二十个氨基酸、第一个到第四十个氨基酸、第一个到第六十个氨基酸、第一个到第八十个氨基酸、第一个到第一百个氨基酸、第一个到第一百五十个氨基酸、第一个到第二百个氨基酸、第一个到第二百三十个氨基酸。N-末端截短pwp2可缺失N-末端处的第一个氨基酸、第一个到第二十个氨基酸、第一个到第四十个氨基酸、第一个到第六十个氨基酸、第一个到第八十个氨基酸、第一个到第一百个氨基酸、第一个到第一百五十个氨基酸、第一个到第二百个氨基酸、第一个到第二百三十个氨基酸。更特定地，pwp1或pwp2可缺失第一个到第五十二个氨基酸，如实例9中的SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中所展示。
本发明的“植物”包括(但不限于)被子植物和裸子植物，例如马铃薯、番茄、烟草、鳄梨、紫花苜蓿、生菜、胡萝卜、草莓、甜菜、树薯、蕃薯、大豆、豌豆、扁豆、黄瓜、葡萄、芸苔、玉蜀黍、草坪草、小麦、稻谷、大麦、高粱、燕麦、橡树、桉树、胡桃和棕榈树。因此，植物可为单子叶植物或双子叶植物。“植物”和“植物材料”在本文中可互换使用，也涵盖植物细胞、种子、植物后代、繁殖体(无论是以有性方式还是以无性方式产生)和这些中任一者的派生物(例如插条或种子)。“植物材料”可是指植物细胞、细胞悬浮液培养物、愈伤组织、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶片、根、芽、配偶体、孢子体、花粉、种子、发芽幼苗和小孢子。植物可处于成熟期的各个阶段且可在液体或固体培养中或在土壤或适宜介质中在罐、温室或田地中生长。植物中所引入的前导区、尾随区或基因序列的表达可以是瞬时的或永久的。
“调控序列或元件”是指在此项技术中的标准且已知的那些序列，所述序列可包括在表达载体中以增加和/或最大化植物系统中所关注基因的转录或所得RNA的翻译。这些包括(但不限于)启动子、肽输出信号序列、内含子、多聚腺苷酸化和转录终止位点。修饰核酸构建体以增加在植物中的表达水平的方法也通常为此项技术得知(参见例如罗杰斯(Rogers)等人，260生物化学杂志(J.Biol.Chem.)3731-38,1985；科尔内霍(Cornejo)等人，23植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)567:81,1993)。在改造植物系统以影响蛋白质的转录速率中，此项技术中的各种因素(包括调控序列，例如正或负作用序列；增强子和沉默子以及染色质结构)可具有影响。本发明提出，在改造植物中可利用这些因素中的至少一者以表达所关注蛋白质。本发明的调控序列是天然遗传元件，即，是从待修饰的所选植物物种分离。用于引发所要多核苷酸的转录的启动子可为组成型、组织优选型或诱导型启动子或其前突变。举例来说，“强”启动子包括马铃薯泛素-7和泛素-3启动子，和来自玉蜀黍、稻谷和甘蔗的泛素启动子。它们还包括稻谷肌动蛋白启动子、各种核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)小亚基启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶激活酶启动子和稻谷肌动蛋白启动子。主要在马铃薯块茎中表达的良好组织优选型启动子包括颗粒结合淀粉合成酶和ADP葡糖焦磷酸化酶基因的启动子。存在各种诱导型启动子，但通常诱导型启动子可为温度敏感型启动子、化学诱导启动子或瞬时启动子。具体地，诱导型启动子可为Ha hsp17.7G4启动子、小麦wcs120启动子、Rab16A基因启动子、α-淀粉酶基因启动子、pin2基因启动子或羧化酶启动子。
“抗性”在植物病理学的情况下是指植物、外植体或植物细胞承受、耐受有害试剂(例如，病原体、昆虫、植物、细菌或病毒)的有害效应或影响(例如疾病、毒性和感染)或能够存活的力量或能力。抗性是相对术语，其通常通过植物、外植体或植物细胞能够容忍侵入试剂的有害效应的时间长度来测量。举例来说，经本发明技术转化的植物展现疾病症状可比未经转化以表达本文所揭示的pwp1或pwp2多核苷酸中的一者的植物晚1到7天、1到4周、1到12个月、1到5年或长达植物的整个生命时间。
术语“隐性”在本发明的情况下描述使得表型(可见或可检测特性)仅在纯合基因型(具有同一等位基因的两个拷贝的生物体)中可见而在杂合基因型中不可见的等位基因。就此而言，“隐性抗性”是指仅在抗性等位基因的纯合基因型中可见的抗性表型。
“序列一致性”或“一致性”在两个核酸或多肽序列的情况下包括提及当在指定区进行比对以获得最大对应时两个序列中的残基相同。当关于蛋白质使用序列一致性百分数时，应认识到，不一致的残基位置的差别通常是保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代且因此不改变分子的功能性质。在序列在保守取代方面不同的情况下，可向上调整序列一致性%以校正取代的保守性质。因这些保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调整的方法为所属领域的技术人员所熟知。此通常涉及将保守取代作为部分而非完全失配进行评分，由此增加序列一致性%。因此，举例来说，当相同的氨基酸给出分数为1且非保守取代给出分数为0，那么保守取代给出的分数在0和1之间。根据(例如)迈耶尔和米勒算法(algorithm of Meyers and Miller)(生物科学中的计算机应用(Computer Applic.Biol.Sci.),4:11-17(1988))计算保守取代的得分，例如如在程序PC/GENE(英特尔遗传公司(Intelligenetics),美国加利福尼亚州山景城(Mountain View,Calif.,USA))中所执行。
“序列一致性的百分数”是指通过在比较窗口内比较两个最优比对序列所测定的值，其中比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列(其不包含添加或删除)相比可包含添加或删除(即，空位)以对两个序列进行最优比对。百分数是通过以下计算：测定两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基出现位置的数量以得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数，并将所得结果乘以100，得到序列一致性百分数。
用于比较的序列比对方法已为此项技术熟知。用于比较的最佳序列比对可通过以下实施：史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)的局部同源算法，应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2:482(1981)；尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)的同源比对算法,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443(1970)；皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)的关于相似性方法的研究，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85:2444(1988)；这些算法的计算机执行，包括(但不限于)PC/Gene程序中的CLUSTAL(英特尔遗传公司，加利福尼亚州山景城)；威斯康星州遗传软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)(GCG),575麦迪逊博士(Science Dr.)，美国威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.,USA)；CLUSTAL程序由希金斯(Higgins)和夏普(Sharp)充分描述，基因(Gene)73:237-244(1988)；希金斯和夏普，CABIOS5:151-153(1989)；库佩特(Corpet)等人，核酸研究(NucleicAcids Research)16:10881-90(1988)；黄(Huang)等人，生物科学中的计算机应用(Computer Applications in the Biosciences)8:155-65(1992)，和皮尔森等人，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)24:307-331(1994)。
可用于数据库相似性搜索的BLAST程序家族包括：BLASTN，针对核苷酸数据库序列用于核苷酸查询序列；BLASTX，针对蛋白质数据库序列用于核苷酸查询序列；BLASTP，针对蛋白质数据库序列用于蛋白质查询序列；TBLASTN，针对核苷酸数据库序列用于蛋白质查询序列；和TBLASTX，针对核苷酸数据库序列用于核苷酸查询序列。参见分子生物学实验手册，第19章，奥苏贝尔(Ausubel)等人编辑，格林出版社和威利国际科学(Greene Publishing and Wiley-Interscience)，纽约(New York)(1995)；阿尔丘尔(Altschul)等人，分子生物学杂志，215:403-410(1990)；和阿尔丘尔等人，核酸研究(NucleicAcids Res.)，25:3389-3402(1997)。
用于执行BLAST分析的软件可通过(例如)国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开获得。此算法涉及首先通过识别询问序列中的代码长度缩写W来识别高得分序列对(HSP)，当代码与数据库序列中具有相同长度的代码进行比对时，其将与某一正阈值分数T相匹配或满足其条件。T是指相邻代码分数阈值。这些初始相邻重复代码将作为引子来启动发现含有其的更长HSP的搜索。接着使重复代码沿每一序列的两个方向延伸，尽量能够使累积比对分数增加。对于核苷酸序列，累积分数是使用参数M(匹配残基对的奖励分数；始终大于0)和N(不匹配残基的惩罚分数；始终小于0)来计算。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积分数。重复代码在每一方向上的延伸在以下时候将停止：累积比对分数从其最大实现值降低了数量X；由于一个或一个以上负得分残基比对累加而使累积分数变为零或负值；或达到任一序列的端点。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度及速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值有代码长度(W)11、预期值(E)10、截止值100、M=5、N=-4和两条链的比较值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值有代码长度(W)3、预期值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见海尼科夫(Henikoff)和海尼科夫(1989)美国国家科学院院刊89:10915)。
除了计算序列一致性%以外，BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如卡尔林(Karlin)和阿尔丘尔，美国国家科学院院刊90:5873-5877(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。
BLAST搜索假设蛋白质可模型化为随机序列。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列的区，其可为均聚体束、短周期重复单元、或富含一个或一个以上氨基酸的区。可能会在不相关蛋白质之间比对这些低复杂度区，即使蛋白质的其它区完全不相似。可采用许多低复杂度过滤程序来减少低复杂度比对。举例来说，SEG(武藤(Wooten)和芬德赫(Federhen)，计算化学(Comput.Chem.)，17:149-163(1993))和XNU(克拉弗里(Claverie)和史迪斯(States)，计算化学，17:191-201(1993))低复杂度过滤器可单独或组合使用。
可使用CLUSTAL比对方法利用默认参数(GAP PENALTY=10，GAP LENGTHPENALTY=10)执行序列的多重比对(希金斯和夏普(1989)CABIOS.5:151-153)。使用CLUSTAL方法进行逐对比对的默认参数为KTUPLE1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5和DIAGONALS SAVED=5。
“性状”是植物的显著特征或特性，其可根据本发明通过将一个或一个以上“所要多核苷酸”和/或可筛选/可选标记整合到经转化植物的至少一个植物细胞的基因组中而改变。“所要多核苷酸”和/或标记可通过修饰经转化植物细胞或植物作为整体的许多遗传、分子、生物化学、生理学、形态学或农艺学特性或性质中的任一者赋予经转化植物的性状的变化。因此，一种或一种以上稳定整合的所要多核苷酸在植物基因组中的表达可改变选自由以下组成的群组的性状(但不限于此)：增加耐旱性、增强耐寒和霜冻性、提高活力、增强颜色、增强健康和营养特性、改进储存、增强产量、增强耐盐性、增强重金属耐性、增加耐病性、增加抗昆虫性、增加水胁迫耐性、增强甜度、提高活力、改进口味、改进质地、减少磷酸盐含量、增加发芽、增加微量营养素吸收、改进淀粉组成和改进花的寿命。
植物的“转化”是将DNA稳定整合到植物细胞的基因组中的过程。“稳定地”是指多核苷酸永久或非瞬时的保留在细胞基因组中和/或由细胞基因组表达。因此，稳定整合的多核苷酸是一个经转化细胞基因组内的固定物且可通过细胞或所得经转化植物的连续后代复制并传播。转化可在自然或人工条件下使用此项技术中熟知的各种方法来发生。举例来说，植物分子生物学和生物技术中的方法(METHODS IN PLANT MOLECULARBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY)，伯纳德R.格里克(Bernard R.Glick)和约翰E.汤普森(John E.Thompson)(编者),CRC出版社(CRC Press,Inc.)，伦敦(London)(1993)；奇尔顿(Chilton),科学美国人(Scientific American)，248)(6)，第36至45页,1983；贝文(Bevan)，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)，12，第8711至8721页，1984；和范·蒙塔古(Van Montague)等人，英国伦敦皇家学会会刊B卷：生物科学(Proc R Soc Lond B Biol Sci.),210(1180)，第351-65页,1980。植物也可使用“精致转化(Refined Transformation)”和“精确育种(Precise Breeding)”技术来转化。参见(例如)罗曼等人在新西兰专利第535,395号、美国专利第7,250,554号、美国专利第7,534,934号、WO2005/004585、美国专利第7,598,430号、US-2005-0034188、WO2005/002994和新西兰专利第536,037号中，其所有均以引用的方式并入本文中。
将DNA稳定整合到植物细胞的基因组中并不一定意味着经整合的DNA在植物的所有部分中连续表达。举例来说，在本发明技术的一个实施例中，经整合的DNA可在植物的实质上所有的细胞中表达，或在植物的50%到99%细胞中表达。在另一实施例中，经整合的DNA可在以下中的一者或一者以上中表达：植物的叶片、茎、花、生殖器官、根和果实和蔬菜(例如在经转化马铃薯植株的块茎中)。如本文其它地方所揭示，稳定整合的多核苷酸可在一段时期内连续或瞬时表达。举例来说，本发明的经转化栽培植物可对抗PVY病毒达1到5天、1周、2到4周、1个月、2到12个月、1年、2到5年、5到10年、10到50年或50到100年。
“转化载体”是可维持在土壤杆菌中含有至少一个右侧边界或初始裂解位点的质粒。利用携载转化载体的土壤杆菌菌株感染外植体并实施转化程序将产生含有稳定整合到其基因组中的转化载体的至少一部分的经转化愈伤组织、芽和/或植物。载体可包含可选标记以帮助识别已经稳定转化的植物。
本发明的“转基因植物”是包含至少一个外源性核酸已经稳定整合到其中的细胞基因组的植物。根据本发明，转基因植物是仅包含一个遗传修饰细胞和细胞基因组的植物，或包含一些遗传修饰细胞的植物，或其中所有细胞均经遗传修饰的植物。本发明的转基因植物可为包含所要多核苷酸(即，外源性核酸)在植物的仅某些部分中表达的植物。因此，转基因植物可仅在其结构的某些部分中含有遗传修饰细胞。
“块茎”是增厚的通常在地下的食物储存器官，其没有球茎和鳞茎具有的基部底盘和种皮样外壳二者。根和芽从块茎表面上的生长芽(称为“眼”)生长。一些块茎(例如贝母)随着植物生长大小变小并在眼处形成新的块茎。其它的块茎(例如块茎状秋海棠(tuberousbegonias)随着其在生长期期间储存营养而大小增加并同时发育新的生长芽。块茎可能会皱缩且硬或略微有肉质。其可为圆形、扁平、奇怪的形状或粗糙。块茎的实例包括(但不限于)安第斯豆薯(ahipa)、芹菜(apio)、秘鲁胡萝卜(arracacha)、茨菇(arrowhead)、竹芋(arrowroot)、巴朵(baddo)、苦树薯(bitter casava)、巴西竹芋(Brazilian arrowroot)、树薯、中国洋蓟(Chinese artichoke)、荸荠(Chinese water chestnut)、椰子、芋头(cocoyam)、芋(dasheen)、小芋头(eddo)、象耳(elephant's ear)、菊芋(girasole)、茨菇(goo)、日本洋蓟(Japanese artichoke)、日本马铃薯、耶路撒冷洋蓟(Jerusalem artichoke)、豆薯(jicama)、百合根(lily root)、ling gaw、木薯(mandioca,manioc)、墨西哥(Mexican)马铃薯、墨西哥豆薯(yam bean)、芋(old cocoyam)、马铃薯、凉薯(saa got)、(sato-imo)、竹芋(seegoo)、洋姜(sunchoke,sunroot)、甜树薯(sweet casava)、蕃薯、芋类(tanier,tannia,tannier)、木薯根(tapioca root)、洋姜(topinambour)、睡莲根(water lily root)、豆薯(yam bean)、山药(yam)和箭叶黄体芋(yautia)。马铃薯的实例包括(但不限于)黄褐色马铃薯、白皮圆形马铃薯(Round White Potatoes)、白皮长圆形马铃薯(Long White Potatoes)、红皮圆形马铃薯(Round Red Potatoes)、黄肉马铃薯(Yellow Flesh Potatoes)和蓝紫色马铃薯(Blue andPurple Potatoes)。
块茎可分为“微型块茎”、“小型块茎”、“近熟”块茎和“成熟”块茎。微型块茎是在组织培养基上生长且大小较小的块茎。“小”是指约0.1cm到1cm。“小型块茎”是比微型块茎大且在土壤中生长的块茎。“近熟”块茎是源自开始衰老的植物，且如果在温室中生长为约9周。“成熟”块茎是源自已经历衰老的植物的块茎。成熟块茎是(例如)约12或更多周的块茎。
本发明的植物源转移DNA(“P-DNA”)边界序列的核苷酸序列与任何已知细菌源T-DNA边界序列均不同，但其用于本质上相同的目的。也就是说，P-DNA可用于将一个多核苷酸转移并整合到另一个多核苷酸中。P-DNA可代替常规T-DNA插入肿瘤诱导质粒(例如来自土壤杆菌的Ti质粒)中，并如常规转化质粒那样维持在细菌菌株中。P-DNA可经操纵以便含有所要多核苷酸，所述多核苷酸注定经由细菌介导的植物转化用于整合到植物基因组中。参见罗曼等人在新西兰专利第535,395号、US-2003-0221213、美国专利第7,534,934号和WO2005/004585中，其所有均以引用的方式并入本文中.
因此，P-DNA边界序列存在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个与来自土壤杆菌属(例如根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌)的已知T-DNA边界序列不同的核苷酸。
P-DNA边界序列的核苷酸序列与土壤杆菌T-DNA边界序列具有不大于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%或50%相似性。
已研发方法来从植物、特别地马铃薯和小麦识别并分离转移DNA，并使用美国专利第7,534,934号(其以引用的方式并入本文中)中所描述的边界基序共有区。
就此来说，如果本发明的植物源DNA(例如本文所揭示的序列、裂解位点、区或元件中的任一者)以以下转化频率促进多核苷酸到其链接的另一核酸分子(例如到植物染色体中)中的转移和整合：约99%、约98%、约97%、约96%、约95%、约94%、约93%、约92%、约91%、约90%、约89%、约88%、约87%、约86%、约85%、约84%、约83%、约82%、约81%、约80%、约79%、约78%、约77%、约76%、约75%、约74%、约73%、约72%、约71%、约70%、约69%、约68%、约67%、约66%、约65%、约64%、约63%、约62%、约61%、约60%、约59%、约58%、约57%、约56%、约55%、约54%、约53%、约52%、约51%、约50%、约49%、约48%、约47%、约46%、约45%、约44%、约43%、约42%、约41%、约40%、约39%、约38%、约37%、约36%、约35%、约34%、约33%、约32%、约31%、约30%、约29%、约28%、约27%、约26%、约25%、约24%、约23%、约22%、约21%、约20%、约15%、或约5%或至少约1%，那么本发明的植物源DNA是起作用的。
这些转化相关序列和元件中的任一者均可经修饰或突变以改变转化功效。其它多核苷酸序列可添加到本发明的转化序列中。举例来说，其可经修饰以具有5′-和3′-多克隆位点或额外的限制酶切位点。举例来说，本文所揭示的裂解位点的序列可经修饰以增加来自伴随载体的骨架DNA不会整合到植物基因组中的可能性。
任何所要多核苷酸可插在本文所描述的裂解或边界序列之间。举例来说，所要多核苷酸可为源自植物物种的野生型或经修饰基因，或其可为来自非植物基因组的基因。举例来说，当转化马铃薯植物时，可制作包含操作地链接到所要马铃薯基因或其片段的马铃薯特异性启动子和马铃薯特异性终止子的表达盒。表达盒可含有额外的马铃薯遗传元件，例如在框架内融合到基因的5′-端的信号肽序列和马铃薯转录增强子。本发明并不限于此布置，且转化盒可经构建以便所要多核苷酸在操作地链接到启动子的同时不会操作地链接到终止子序列。
除了植物源元件以外，还在(例如)真菌和哺乳动物中识别这些元件。这些物种中的几种已经展示能够进行土壤杆菌介导的转化。参见库尼科(Kunik)等人，美国国家科学院院刊98:1871-1876,2001，和卡萨斯-弗洛雷斯(Casas-Flores)等人，分子生物学方法(Methods Mol Biol)267:315-325,2004，其以引用的方式并入本文中。
当从植物识别并分离转化相关序列或元件(例如本文所描述的那些)时，且如果所述序列或元件随后用于转化同一物种的植物，那么所述序列或元件可描述为对所述植物基因组来说是“天然的”。
“变体”应理解为是指从特定基因或蛋白质的标准或给定核苷酸或氨基酸序列衍生的核苷酸或氨基酸序列。术语“亚型”、“同种型”和“类似物”还指核苷酸或氨基酸序列的“变体”形式。通过添加、移除或取代一个或一个以上氨基酸改变的氨基酸序列或核苷酸序列中有变化可视为“变体”序列。变体可具有“保守”变化，其中经取代氨基酸具有相似结构或化学性质，例如用异亮氨酸代替亮氨酸。变体可具有“非保守”变化，例如用色氨酸代替甘氨酸。类似微小变化也可包括氨基酸删除或插入或二者。测定哪些氨基酸残基可经取代、插入或删除的指导可使用此项技术中熟知的计算机程序(例如Vector NTISuite(信息最大化(InforMax),马里兰州(MD))软件发现。
“载体”也可视为“质粒”或“构建体”，是用于将遗传物质转移到目标细胞的媒介。载体通常可含有所要多核苷酸，其与操作地链接到启动子和终止子或链接到两个收敛定向的启动子或在缺少终止子的表达盒中的目标基因的至少一部分共有序列一致性。如所充分了解，启动子引发转录，而终止子在特定位点终止转录且随后介导多聚腺苷酸化。此转录物加工对于转录物的稳定性和其从细胞核到细胞质中的运输来说很重要。另一方面，本发明技术的另一方面是在缺少任何操作链接终止子的情况下通过两个收敛定向的启动子表达所要多核苷酸的沉默构建体。这些构建体产生在使内源性目标基因沉默方面特别有效的非指定RNA转录物。参见例如美国专利第7,713,735号，其以引用方式并入本文中。
本发明的载体可通过触发所要多核苷酸的收敛转录用于有效地减少或阻止目标核酸的转录或翻译。因此，本发明的一个目标是提供产生核酸分子的构建体，所述核酸分子阻止或降低基因或基因产物的表达(例如RNA转录物或蛋白质)。
野生马铃薯与栽培马铃薯有关但并非栽培马铃薯，且属于茄科(Solanaceae)家族。有约199种野生马铃薯物种，且其中的约90%生长在玻利维亚(Bolivia)、秘鲁(Peru)、阿根廷(Argentina)和墨西哥。如本文所用，野生马铃薯也可认为是未经栽培或非栽培马铃薯。因此，野生、未经栽培和非栽培在整个申请案中互换使用，以指不属于栽培类马铃薯(例如那些用于商业食品者，如本文其它地方所揭示)的马铃薯类型。因此，野生马铃薯不能仅仅因为其已在除天然发现它的地方以外的某个地方生长而将其归类为“栽培”马铃薯。也就是说，已经转移到温室或栽培田且之后在人类的引导和关注下生长的野生马铃薯物种出于本发明的目的不能重新归类为在新环境中的“栽培”马铃薯。野生马铃薯物种的实例包括(但不限于)茄属植物(Solanum L.)物种，例如茄科马铃薯组(Solanaceae sect.PetotaDumort)和茄属非结薯组(Solanum sect.Etuberosum)。参见希曼斯(Hijmans)和斯普纳(Spooner),美国植物学杂志(American Journal of Botany),88(11):2101-2112(2001)，其以引用的方式并入本文中。野生马铃薯物种的特定实例包括非结薯马铃薯(种质PI245939)、恰柯薯(种质PI175446和PI175419)和落果薯种质PI175423。因此，本发明涵盖从一个或一个以上野生马铃薯基因组识别并分离抗病毒基因，和利用这些野生抗病毒基因或其片段中的一者或一者以上转化栽培马铃薯植物。
因此，本发明的一个方面是将一个或一个以上eIF4E基因的野生同系物引入到植物、外植体或细胞中，以赋予所述植物、外植体或细胞抗病毒性。举例来说，植物的一个实例是栽培马铃薯植物。eIF4E基因的野生同系物的一个实例是pwp1。pwp1可引入植物的基因组中以赋予抗性，或天然eIF4E可经突变以含有一个或一个以上pwp1-特异性氨基酸以赋予抗性。本发明此方面的植物的一个实例是展现对PVY病毒的抗性的栽培马铃薯植物。
1.马铃薯病毒Y
马铃薯病毒Y(PVY，也称为马铃薯Y病毒(Solanum virus2))是家族马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的植物病原性病毒，且是一种影响马铃薯生产的最重要的植物病毒。PVY可严重地降低栽培马铃薯的产量且通过蚜虫以非持久方式并通过人类活性传播。此意味着使用相同品系的马铃薯产生种用马铃薯用于几次连续世代可导致病毒载量的递增且随后作物损失。
马铃薯植物的PVY感染视病毒株而定导致各种症状。这些症状中最轻者是产量损失，但最有害的是“马铃薯块茎坏死环斑病”(PTNRD)。坏死环斑病使得马铃薯不能上市销售且因此可导致收入明显损失。最近几年感染率的增加可归因于几个因素。这些包括用于载体控制的化学品的有效性和投与的明显下降、栽培种使用了感染的种用马铃薯、错误的灌溉和耕作方法以及缺乏敏感、快速且可靠的检测方法。
全世界约5千个栽培马铃薯品种，其属于8或9个物种，且约200个野生物种和亚种。然而，许多商业上重要的栽培马铃薯品种均为展现对抗农艺学上毁灭性的PVY病毒的抗性。而且，除了感染马铃薯，PVY还影响其它茄属作物(西红柿、胡椒)和野草(龙葵(nightshade)、地樱桃(groundcherry))。因此，本发明可施加于各种植物，不仅是马铃薯，例如施加于(但不限于)番茄、胡椒、龙葵和地樱桃。
2.eIF4E
eIF4E(真核细胞翻译起始因子4E)是涉及引导核糖体到mRNA的帽结构以引发翻译的真核细胞翻译起始因子。在执行其功能时，eIF4E结合到mRNA帽结构(即，mRNA分子的5′端上的第一个核苷酸)和7甲基鸟苷(m7G)以有效地将m7G夹于2个色氨酸残基之间。存在至少两个内源性eIF4E等位基因(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:35)，如序列表和图2中所展示。
eIF4E蛋白质可以游离形式或作为称为EIF4E的多蛋白前起始复合体的一部分存在。EIF4E的其它亚基是EIF4F、EIF4A和EIF4G。几乎所有细胞蛋白质均需要eIF4E来翻译成蛋白质。
一些病毒切割eIF4G以便移除eIF4E结合位点。如此，病毒可在没有eIF4E的情况下翻译其自身蛋白质。一些细胞蛋白质(例如热休克蛋白)也不需要eIF4E来进行翻译。
如下文所解释，本发明发明者从野生马铃薯基因组识别出两个新的eIF4E样基因，且惊讶地发现所述基因赋予对PVY病毒的抗性。
3.PVY病毒抗性的测试
对PVY病毒的抗性可以以下方式测试：首先，通过用PVY感染宿主的叶片提取物摩擦植物的叶片表面来感染植物。然后，评价其出现典型症状(例如叶片卷曲和轻微斑点)的时间。较长的时间表示对PVY病毒的抗性。更精确的，可通过使用阿格迪(Agdia)(印第安纳州埃尔克哈特(Elkhart,IN))研发的PVY-特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)实施PVY抗性的分子水平测试以检测PVY蛋白质的存在。举例来说，参见R.G.波兹德(R.G.Bouzid)等人，表达抗-NIa蛋白质scFv抗体的PVY-抗性经转化马铃薯植物(PVY-resistant transformed potato plants expressing an anti-NIa protein scFv antibody)，分子生物学技术(Molecular Biotechnology)，第33卷，第2期，133-140，(2006)。ELISA分析可根据实例12中所详细描述的步骤实施。在植物中检测出PVY蛋白质所花费的时间越长，植物对PVY病毒的抗性越大。因此，测试PVY蛋白质的出现是一种测定本文所揭示经转化植物中的任一者的抗性状态的方法。
4.从野生马铃薯分离的新pwp1和pwp2PVY抗性基因
如本文所描述，已识别并分离出野生马铃薯中的两种新的且独特eIF4E基因(SEQ IDNO.:1,SEQ ID NO:3)。如下文所解释，这些新的序列在本文中命名为“pwp1”和“pwp2”。pwp1基因的重要性通过在所分析的五种物种中的三者中表达的事实来例证：非结薯马铃薯种质PI245939、恰柯薯种质PI175446和PI175419以及落果薯种质PI175423。基因未在匍枝薯种质PI195195和PI275244以及富利亚薯(S.phureja)中表达。pwp2基因的重要性通过其在匍枝薯物种的两个种质(PI195195和PI275244)中表达的事实来例证。
野生马铃薯型式的pwp1和pwp2基因所编码的蛋白质(SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO:4)令人惊讶地不同于栽培马铃薯的eIF4E(SEQ ID NO.:5针对基因，SEQ ID NO.:6针对蛋白质)(图2)。其具有不同于先前技术所分析基因的任一者的多个独特氨基酸(图3)。野生马铃薯pwp1蛋白质含有10个不同于栽培马铃薯的eIF4E的氨基酸：(i)T54、(ii)S68、(iii)I70、(iv)K72、(v)T76、(vi)A77、(vii)V128、(viii)A130、(ix)S172和(x)S175。野生马铃薯pwp2蛋白质含有5个不同于栽培马铃薯的eIF4E的氨基酸：(i)T10、(ii)A23、(iii)Y57、(iv)N99和(v)S140。
重要的是，表达新eIF4E基因pwp1的所有三个物种(非结薯马铃薯种质PI245939、恰柯薯种质PI175446和PI175419，以及落果薯种质PI175423)均展现对抗马铃薯Y病毒组PVY菌株PVY0和PVYWI的抗性。而且，表达新eIF4E基因pwp2的匍枝薯物种的两个种质(PI195195和PI275244)展现对抗马铃薯Y病毒组PVY菌株PVY0和PVYWI的抗性。因此，分离的基因指定为与“野生马铃薯中的PVY抗性”(pwp1和pwp2)相关联。
这些马铃薯pwp1和pwp2序列可容易地用于识别用于赋予其它植物物种PVY抗性的其它植物序列和基因。这些物种包括(但不限于)单子叶植物，选自由以下组成的群组：小麦、草坪的草、草坪草、谷物、玉蜀黍、稻谷、燕麦、小麦、大麦、高粱、兰花、鸢尾花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高粱和棕榈树；和双子叶植物，选自由以下组成的群组：鳄梨、马铃薯、烟草、番茄、甜菜、绿花椰菜、树薯、蕃薯、胡椒、棉花、猩猩木、豆科植物、紫花苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、生菜、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊和仙人掌。
在这些品系中，本文已展示这些序列用于识别来自胡椒的PVY抗性：经修饰胡椒的eIF4E,mpe1(即，pwp1的胡椒等效物)可赋予马铃薯物种强的PVY抗性(图9和10)。图9和10中结果说明，所属领域的技术人员可容易地使用来自一种物种的经修饰eIF4E赋予另一物种PVY抗性。
本发明包含赋予PVY抗性的蛋白质，但所述蛋白质未必包含适合共有序列SEQ IDNO:25:DXXXXKSBQXAWGSSXRXXYTFSXVEXFWXXYNNIHBPSKLXXGAD的序列，其中X为中性氨基酸且B为碱性氨基酸。参见罗巴利亚(Robaglia)和卡兰达(Caranta)，植物科学发展趋势(Trends in Plant Science),11(1)，第40到45页,2006；和美国专利第7,772,462号。在另一实施例中，本发明包含在对PVY病毒无抗性的栽培植物中表达可含有或不含有SEQ ID NO:25共有序列的野生PVY抗性基因。
就此而言，中性氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。碱性氨基酸包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
此外，氨基酸可为极性或非极性的。非极性氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和缬氨酸。极性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸。
氨基酸也可分类为带电荷或不带电荷。带电荷氨基酸包括精氨酸、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、组氨酸和赖氨酸。
氨基酸的再一种分类方式是疏水性对亲水性。就此而言，疏水性氨基酸包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸盐、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸盐、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
氨基酸可进一步分类为脂肪族或芳香族氨基酸。脂肪族氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。芳香族氨基酸包括组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
氨基酸可也经修饰。大量经修饰氨基酸由化学试剂供应商(例如西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))出售。
通常，由于在蛋白质上利用相同类型的氨基酸进行保守取代(例如，中性对中性)不会导致蛋白质的显著结构变化，因此预期具有经取代氨基酸的蛋白质的功能不会改变。举例来说，预期eIF4E蛋白质上中性对中性取代不会显著改变其结构。就此而言，本发明发明者意外地发现pwp1/pwp2蛋白质的功能显著不同于天然eIF4E蛋白质，尽管事实上pwp1/pwp2蛋白质与eIF4E蛋白质之间的差异均为保守取代。换句话说，pwp1/pwp2蛋白质与eIF4E蛋白质在某些位置处具有不同的氨基酸。但这些氨基酸为相同类型，例如二者均为中性。由于这些氨基酸均为相同类型，因此所属领域的技术人员将不会预料到pwp1/pwp2的功能显著不同于eIF4E。
因此，所属领域的技术人员通常不会预料到保守取代显著改变eIF4E蛋白质结合vpg病毒蛋白质的能力。因此，不会预料到eIF4E蛋白质中的保守取代会改变植物对PVY病毒的敏感性。
除了在SEQ ID NO:25中由X代表的位置以外，技术人员可对非X残基作出改变(即，取代)。改变可为保守或非保守的。就此而言，保守改变意味着一个氨基酸被具有相似性质的另一氨基酸取代。举例来说，极性氨基酸被另一极性氨基酸取代，疏水性氨基酸被另一疏水性氨基酸取代，或中性氨基酸被另一中性氨基酸取代。非保守改变意味着一个氨基酸被具有不同性质的另一氨基酸取代。举例来说，中性氨基酸被碱性氨基酸或酸性氨基酸取代，极性氨基酸被非极性氨基酸取代，或疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。
可改变SEQ ID NO:25的1-5、5-10、10-15、15-20个氨基酸。在对SEQ ID NO:25进行这些改变时，技术人员然后可利用经改变的SEQ ID NO:25序列转化植物并测试经转化植物的PVY病毒抗性。用于PVY病毒抗性的测试程序在以上部分3中列举。
5.利用pwp1和pwp2转化的栽培马铃薯植物中的延迟疾病进展
本发明的一个方面涵盖将野生马铃薯1和2(pwp1和pwp2)基因引入到植物中以赋予病毒抗性。利用pwp1或pwp2进行转化通常导致延迟疾病进展，此意味着当PVY病毒感染时，经转化马铃薯展示疾病症状比未转化马铃薯晚。举例来说，在实例5中，强烈表达pwp1的经转化马铃薯比其它品系晚1周展示典型疾病症状(叶片卷曲和轻微斑点)。
pwp1或pwp2经转化植物可为(但不限于)栽培马铃薯。而且，病毒抗性可为(但不限于)对抗PVY。本发明涵盖经转化植物能抵抗其它PVY相关病毒，例如马铃薯病毒X(PVX)和马铃薯病毒A(PVA)。pwp1和pwp2可经由此项技术中熟知的各种手段引入到植物中。举例来说，转化可依赖用于将核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法，其包括土壤杆菌介导的转化方案、病毒感染、晶须、电穿孔、热休克、脂质转染、聚乙二醇处理、微注射和粒子轰击。因此，这些手段可为(但不限于)土壤杆菌介导的转化(详细解释于实例2中)或P-DNA介导的转化(详细解释于实例5中)。
6.利用pwp1和pwp2进行转化同时使内源性eIF4E基因沉默
本发明进一步涵盖在将pwp1或pwp2基因引入到植物基因组中时，下调或抑制天然同源性pwp1(eIF4E基因)的表达。本发明发明者观察到，除表达全长pwp1和pwp2基因以外，再加上下调或抑制eIF4E基因的表达将导致完全病毒抗性。已使内源性eIF4E沉默的经全长pwp1或pwp2转化的植物不是延迟疾病症状的进展，而是完全抵抗PVY病毒。举例来说，实例6含有关于已使内源性eIF4E沉默的经pwp1转化马铃薯的详细数据。在一些经转化马铃薯品种，甚至在经PVY病毒感染4周之后还未出现疾病症状。ELISA分析并未在这些经转化马铃薯中检测出PVY病毒蛋白。本发明并不限于实例6中经由使盒沉默来下调或抑制eIF4E，因为所属领域的技术人员已知各种下调或抑制基因表达的途径。就此而言，内源性eIF4E可通过(但不限于)收敛转录、有义抑制、反义抑制和RNAi来下调或抑制。
内源性eIF4E基因的表达可通过收敛转录技术下调，如美国专利第7,713,735号中所描述，其整体内容以引用的方式并入本申请案中。就此而言，eIF4E的多核苷酸(例如eIF4E基因的所要20-50个核苷酸片段)和其反向重复序列定位于两个具有相反方向转录的功能启动子之间且操作地链接到所述功能启动子，而eIF4E多核苷酸和其反向重复序列均未操作地链接到终止子。此构建体可位于适于细菌介导的植物转化的质粒的转移DNA边界序列之间。此构建体还可含有位于eIF4E多核苷酸和其反向重复序列之间的最多500个核苷酸长的间隔子。构建体中的启动子可选自各种不同的启动子，包括组成型启动子、近组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。
内源性eIF4E基因的表达可通过RNA干扰(RNAi)下调或抑制，如在以下中所描述：夏H(Xia H)等人，活体外和活体内的siRNA介导的基因沉默(siRNA-mediated genesilencing in vitro and in vivo)，自然-生物技术(Nature Biotechnology)(2002),第20卷,1006-1010，韦斯利SV(Wesley SV)等人，在植物中高效、有效且高通量基因沉默的构建体设计(Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing inplants)，植物学杂志(The Plant Journal)(2001)27(6),581-590，迈斯特G(Meister G)等人，通过双链RNA的基因沉默机制(Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA)，自然(Nature)(2004)，第431卷,343-349和哈蒙德S(Hammond S)等人，通过双链RNA的翻译后基因沉默(Post-Translational Gene Silencing by Double-Stranded RNA)，自然(2001)，第2卷,110-119，所有这些的整体内容以引用的方式并入本申请案中。就此而言，自互补‘发夹’RNA或更通常微小RNA或小干扰RNA(siRNA)可利用所属领域的技术人员熟知的技术设计，以结合到eIF4E基因的信使RNA(mRNA)，以(例如)通过防止mRNA产生蛋白质来降低mRNA的活性。
内源性eIF4E基因的表达可通过有义抑制下调或抑制，如在以下中所描述：木村T(Kimura T.)等人，在蕃薯[紫肉甘薯]中在引入颗粒结合淀粉合成酶I cDNA之后淀粉酶的缺乏(Absence of amylose in sweet potato[Ipomoea batatas(L.)Lam.]following theintroduction of granule-bound starch synthase I cDNA)，植物细胞报告(Plant Cell Reports)(2001)，第20(7)卷,663-666和查森R(Chasen,R)，获得病毒RNA介导的抗性的有义(抑制)(Making Sense(Suppression)of Viral RNA-Mediated Resistance)，植物细胞报告(ThePlant Cell)，第6卷,1329-1331，所有这些的整体内容以引用的方式并入本申请案中。就此而言，有义抑制意味着当基因的功能活性片段或变体在有义方向上引入到植物中时，其使得相对于未经转化的对照植物相应基因在经转化植物中的表达可识别的降低。有义方向是指核酸与已翻译或可翻译成蛋白质的信使RNA拷贝在同一方向上或具有相同的极性。因此，在eIF4E基因的情形下，内源性eIF4E的有义方向链可转移到植物中以降低内源性eIF4E基因的表达。有义抑制工作的机制包括转录失活或转录后RNA降解。参见林德赛AR(Lindsey AR)，转基因植物研究(Transgenic Plant Research)，第116页,CRC出版社(1998)，其整体内容以引用的方式并入本申请案中。
内源性eIF4E基因的表达可通过反义抑制下调或抑制，如在罗默S(Romer S)等人，富玉米黄素的马铃薯通过反义失活和类胡萝卜素环氧化作用的共抑制的遗传改造(Genetic Engineering of a Zeaxanthin-rich Potato by Antisense Inactivation andCo-suppression of Carotenoid Epoxidation.)，代谢工程(Metabolic Engineering)(2002)，第4(4)卷,263-272，其整体内容以引用的方式并入本申请案中。就此而言，反义抑制意味着当将基因的反义方向链在有义方向上引入到植物中时，其使得相对于未经转化的对照植物相应基因在经转化植物中的表达可识别的降低。反义方向是指核酸与已翻译或可翻译成蛋白质的信使RNA拷贝在相反方向上或具有相反的极性。因此，在eIF4E基因的情形下，内源性eIF4E的反义方向链可转移到植物中以降低内源性eIF4E基因的表达。反义抑制的机制包括目标基因的反义链结合到目标基因的mRNA并由此阻断mRNA的正常翻译。参见林德赛AR，转基因植物研究，第116页，CRC出版社(1998)。
7.pwp1或pwp2的片段的表达赋予非马铃薯Y病毒组的抗性
本发明进一步涵盖将pwp1或pwp2基因或来自胡椒的pvr1-2基因的片段引入到植物中以赋予病毒抗性。已观察到，当经全长pwp1或pwp2转化的植物对PVY病毒感染展现延迟疾病进展时，经pwp1或pwp2的片段转化的植物对PVY病毒感染产生完全抗性。举例来说，实例9描述在经N-末端处缺少大约五十个氨基酸的马铃薯pwp1或pwp2基因转化时具有完全PVY抗性的植物。此外，经N-末端截短的pvr1-2基因转化的植物也对PVY病毒感染产生完全抗性。实例9含有这些经转化植物的详细数据。
8.修饰栽培植物中的天然eIF4E基因
除将野生马铃薯1(pwp1)和野生马铃薯2(pwp2)基因引入到植物中以赋予病毒抗性以外，本发明还涵盖对eIF4E基因进行取代以使得eIF4E基因看起来像pwp1或pwp2。举例来说，可使得天然eIF4E包含至少两个选自由以下组成的群组氨基酸取代：SEQ IDNO:6的(i)T54A(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P。可通过此项技术中熟知的定点诱发突变实现特定氨基酸取代。举例来说，参见葛比逊L(Gilbertson L)，Cre-lox重组：用于植物技术的Cre-ative工具(Cre-lox Recombination:Cre-ative Tools for Plant Biotechnology),生物技术趋势(Trendsin Biotechnology)，第21(21)卷,550-555(2003)(“葛比逊2003”)，其以引用的方式并入本文中。
关于修饰植物中的天然eIF4E基因，本发明还涵盖敲除植物的天然eIF4E基因或抑制其表达，并将包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代的天然eIF4E基因的至少一个拷贝引入到植物中：SEQ ID NO:6的(i)T54A(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P(在下文中“具有两个取代的eIF4E基因”)。
就此而言，植物的天然eIF4E基因的表达可通过包括(但不限于)收敛转录技术、RNA干扰(RNAi)、有义抑制和反义抑制的方法(这些已在以上部分6中详细描述)来敲除或抑制。
具有两个取代的eIF4E基因可通过此行技术中熟知的方法引入到植物中。这些方法包括(但不限于)：
(1)无标记转化方法，如美国专利第7,619,138号中所描述，其整体内容以引用的方式并入，
(2)基因枪(biolistic)(或粒子枪)方法，如莱特M.(Wright,M.)，使用磷酸甘露糖异构酶基因pmi作为可选标记进行玉蜀黍(maize,Zea mays L.)和小麦(wheat,Triticumaestivum L.)的有效的基因枪转化(Efficient biolistic transformation of maize(Zea mays L.)and wheat(Triticum aestivum L.)using the phosphomannose isomerase gene,pmi,as theselectable marker)，植物细胞报告，第20(5)卷,429-436(2001)中所描述，其整体内容以引用的方式并入，
(3)土壤杆菌转化方法，如布劳可M.(Block M.)，使用根瘤土壤杆菌进行马铃薯的基因独立型叶盘转化(Genotype-independent leaf disc transformation of potato(Solanumtuberosum)using Agrobacterium tumefaciens),理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)，第76卷,767-774(1988)中所描述，其整体内容以引用的方式并入，
(4)基因枪方法和土壤杆菌转化方法的组合，如汉森G.(Hansen G.)等人，植物细胞的“农杆枪法”转化：植物中生成的T-链的整合(“Agrolistic”transformation of plant cells:Integration of T-strands generated in planta),美国国家科学院院刊，第93(25)卷,14978-14983(1996)中所描述，其整体内容以引用的方式并入，
(5)cre-lox方法，如葛比逊2003中所描述。
9.叠加性状
除病毒抗性以外，还可修饰植物的额外性状。此项性状可包括(但不限于)抗晚疫病、低还原糖、低游离天冬酰胺、低损伤性、降低的低温诱导甜化、低丙烯酰胺、降低的淀粉磷酸酯水平和增加的抗氧化剂。此项技术中已知许多方法来修饰植物以具有额外的性状。举例来说，赋予抗晚疫病的方法描述于宋J(Song J)等人，从球栗薯(Solanumbulbocastanum)克隆的基因RB赋予对马铃薯晚疫病的光谱抗性(Gene RB cloned fromSolanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potato late blight).美国国家科学院院刊(PNAS)(2003)，第100卷(16):9128-9133，其整体内容以引用的方式并入本申请案中。赋予低还原糖的性状的方法描述于美国专利第7,250,554号中。赋予低游离天冬酰胺的性状的方法描述于欧洲专利第1974039号中。赋予低损伤性、降低的低温诱导甜化或降低的淀粉磷酸酯水平的性状的方法描述于美国专利第7,250,554号中。赋予低丙烯酰胺的性状的方法描述于美国公开的专利申请案第2007/0074304号和美国专利第7,250,554号中。赋予增加的抗氧化剂的性状的方法描述于美国专利第7,855,319号中。美国专利第7,250,554号、欧洲专利第1974039号、美国专利第7,855,319号和本文所引用的其它专利或公开申请案整体内容以引用的方式并入本申请案中。
本发明的植物可经修饰以具有这些性状的任何组合。举例来说，植物可经修饰以具有各种组合性状，例如(但不限于)以下的各种组合和排列：性状(1)PVY抗性(完全或延迟)；性状(2)抗晚疫病，性状(3)低还原糖、性状(4)低游离天冬酰胺、性状(5)低损伤性、性状(6)降低的低温诱导甜化、性状(7)低丙烯酰胺、性状(8)降低的淀粉磷酸酯水平、性状(9)增加的抗氧化剂；和性状(10)增加的维生素含量，例如增加的维生素C。举例来说，性状(1)(即，PVY抗性)可与性状(2)-(10)中的一者或一者以上组合。因此，本发明技术涵盖性状(1)和(2)；(1)和(3)；(1)和(4)；(1)和(5)；(1)和(6)；(1)和(7)；(1)和(8)；(1)和(9)；(1)和(10)逐对组合；以及这些性状的每一者所有其它组合排列。除性状(1)与性状(2)-(10)中的一者或一者以上组合，本发明还涵盖所属领域的技术人员可与性状(1)叠加或组合的其他性状。
*  *  *
以下实例用于说明本发明的各个实施例且无论如何不应解释为限制本发明的范围。
本文所引用的所有参考资料(包括专利、专利申请案和公开案)均以其整体引用的方式并入，无论先前是否特定并入。
现在已全面地描述本发明，所属领域的技术人员应了解，可在等效参数、浓度和条件的宽范围内执行本发明而无需过度试验。本申请案打算涵盖本发明的各种变化形式、使用或修改，所述变化形式、使用或修改通常遵循本发明的原理且包括与本揭示内容背离但属于在本发明所属技术内的已知或习惯做法内且可应用上文中所阐释的基本特征的所述变化形式、使用或修改。
实例
实例1
野生马铃薯EIF4E等位基因的颗粒和表征
本文揭示野生马铃薯中的两种新的且独特的eIF4E基因。第一新基因的核酸序列描绘于SEQ ID NO.:1中。已发现，此新的基因表达于所分析五种物种中的三者的特定种质的个别隔离植物(并非所有植物)中：
非结薯马铃薯种质PI245939的个别植株；
恰柯薯种质PI175446和PI175419的个别植株；和
落果薯种质PI175423的个别植株。
此基因并未在三种植物匍枝薯记号PI195195和PI275244以及富利亚薯中表达。然而，所提及种质的更广泛分析可能将识别表达SEQ ID NO.:1中所示基因的个别隔离植物。
第二基因的核酸序列描绘于SEQ ID NO.:3中。发现此新的基因表达于匍枝薯的两个种质的个别隔离植株(并非所有植株)中。
匍枝薯种质PI195195和PI27524。
此基因并未在三种植物非结薯马铃薯种质PI245939、恰柯薯种质PI175446和PI175419、落果薯种质PI175423和富利亚薯中表达。然而，所提及种质的更广泛分析可能将识别表达SEQ ID NO.:3中所示基因的个别隔离植物。
重要的是，所有表达eIF4E pwp1和pwp2基因的植物均对马铃薯Y病毒组PVY菌株PVY0和PVYWI具有抗性。
由于分离的野生马铃薯eIF4E基因与野生马铃薯(wild potato)1和2中的PVY抗性相关联，因此在本文中将其指定为pwp1和pwp2。
野生马铃薯eIF4E基因(即“pwp1”)编码具有描绘于SEQ ID NO.:2中的氨基酸序列的蛋白质，其令人惊讶地不同于栽培马铃薯eIF4E基因。栽培马铃薯eIF4E基因的DNA序列描绘于SEQ ID NO.:5中且编码氨基酸蛋白质序列描绘于SEQ ID NO.:6中。参见图2关于野生对栽培比对。
野生马铃薯eIF4E基因(即“pwp2”)编码具有描绘于SEQ ID NO.:4中的氨基酸序列的蛋白质，其令人惊讶地不同于栽培马铃薯eIF4E基因。栽培马铃薯eIF4E基因的DNA序列描绘于SEQ ID NO.:5中且编码氨基酸蛋白质序列描绘于SEQ ID NO.:6中。参见图2关于野生对栽培比对。
pwp1和pwp2蛋白质具有不同于先前技术所分析基因的任一者的多个独特氨基酸取代。参见图3。举例来说，野生马铃薯pwp1蛋白质含有在位置72和76处的第一对取代(K72R和T76I)、在位置128和130处的第二对取代(V128I和A130S)和在位置172和175处的第三对取代(S172N和S175V)。野生马铃薯pwp2蛋白质在整个蛋白质中含有5个取代(T10M、A23G、Y57F、N99Y和L140P)。
实例2
pwp1和pwp2蛋白质的结合性质
通过使用酵母双杂交系统测试pwp1和pwp2基因的产物结合病毒vpg蛋白质的能力。出于此目的，将pwp1或pwp2cDNA克隆于载体pAD(斯川特珍(Stratagene))(其还含有亮氨酸(Leu)生物合成标记)中以产生“猎物”蛋白质。“诱饵”蛋白质是通过将Vpg基因表达于pBD(斯川特珍)(也携带色氨酸(Trp)生物合成标记的载体)中来产生。
如图4中所示，酵母菌株YRG-2与经修饰pAD和pBD载体的共转化(根据制造商建议)在缺少Leu和Trp的培养基上产生菌落，但在还缺少组氨酸(His)的培养基上不产生菌落。
与此相比，表达马铃薯eIF4E基因的对照猎物载体与含vpg的pBD载体的共表达导致在缺少此三种氨基酸的培养基上形成菌落，此表明只有马铃薯eIF4E蛋白质与vpg相互作用，由此激活下游His生物合成。无法与vpg结合表明pwp1和pwp2表达与野生马铃薯中的PVY抗性相关联。
pwp1的许多变化位于涉及mRNA帽结合和VPg相互作用的结构域内。实际上，五个取代(S68N、I70T、K72R、T76I和A77D)在预测为马铃薯Y病毒组抗性相关突变的热点的简并46-氨基酸结构域内。参见图2，和罗巴利亚和卡兰达，植物科学发展趋势,11(1)，第40到45页，2006。与从中性到带电荷或带电荷到中性或带相反电荷的氨基酸的预期变化相反，本文中发现四个取代S68N、I70T、T76I和K72R涉及内源性天然碱性氨基酸用其它碱性氨基酸取代，或内源性天然中性氨基酸用其它中性氨基酸取代(S、N、I和T均为中性，且K和R为碱性)。先前所预计与抗性相关联的唯一失配A77D并不干扰酵母双杂交系统中的VPg的结合，且因此不认为是介导抗性的关键(图4)。此发现暗示pwp1属于eIF4E变体的新群组。
实例3
识别其它PWP同系物和序列的方法
野生马铃薯物种的种质(其中的一些维持在美国马铃薯基因库(United States PotatoGenebank)和其它地方)可在温室中生长并评价以测定在其基因组中pwp1基因或同系物的存在。特定来说，利用植物RNA-简易试剂盒(英杰公司(Invitrogen))分离的来自个别植物的叶片的RNA可利用引物对5’-GGA TCC ATG GCA GCA GCT GAA ATG和5’-ACTAGT CTA TAC TGT GTA ACG ATT CTT GGC A用于一步逆转录酶PCR反应(凯杰(Qiagen))，以产生pwp1cDNA。接着将扩增产物凝胶纯化，并克隆到pGEM-Teasy(普洛麦格(Promega))中并进行测序。
实例4
pwp1和pwp2从野生马铃薯转移到栽培马铃薯
pwp1cDNA操作地链接到花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)(SEQ ID NO.:7)的近组成型35S启动子和马铃薯ubi3基因(SEQ ID NO.:8)的终止子。所得表达盒位于双元载体的T-DNA区内以产生pSIM1567。pwp2cDNA操作地链接到马铃薯(SEQ ID NO.:9)的近组成型PAT启动子和马铃薯ubi3基因(SEQ ID NO.:8)的终止子。所得表达盒位于双元载体的T-DNA区内以产生pSIM1569。这些转化载体用于如下转化马铃薯品种黄褐色漫游者(Ranger Russet)。
将感受态LB4404细胞(50μL)在37℃下在1μg载体DNA存在下培养5分钟，在液氮中冷冻(约-196℃)约15秒，并再次在37℃下培养5分钟。添加1ml液体肉汤(LB)之后，使经处理细胞在28℃下生长3小时并置于含有链霉素(100mg/L)和卡那霉素(kanamycin)(100mg/L)的LB/琼脂上。接着将载体DNA与个别LBA4404菌落的过夜培养物分离并通过限制性分析来检查以证实完整质粒DNA的存在。
使过夜生长的土壤杆菌培养物的四倍稀释液生长5-6小时，以2,800RPM沉淀15分钟，用补充有蔗糖的MS液体培养基(植物技术(Phytotechnology))(3%,pH5.7)洗涤，并重新悬浮于相同培养基中达0.2OD/600nm。将重新悬浮的细胞混合并用于感染马铃薯的0.4-0.6mm结间段。将经感染的茎在含有6g/L琼脂的共培培养基(1/10MS盐，3%蔗糖，pH5.7)上在22℃下在珀西瓦尔(Percival)生长室(16小时光)中培育两天，并随后转移到含有特美汀(timentin)(150mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的愈伤组织诱导培养基(CIM，补充有3%蔗糖3、2.5mg/L玉米素核苷、0.1mg/L萘乙酸和6g/L琼脂的MS培养基)。
在CIM上培养一个月之后，将外植体转移到含有特美汀和卡那霉素(分别为150mg/L和100mg/L)的芽诱导培养基(SIM，补充有3%蔗糖、2.5mg/L玉米素核苷、0.3mg/L赤霉酸GA3和6g/L琼脂的MS培养基)，直到出现芽为止。将从外植体显露出的芽转移到具有3%蔗糖、6g/L琼脂和特美汀(150mg/L)的MS培养基。接着将来自独立转化株的个别叶片通过PCR证实含有T-DNA，且接着转移到土壤中并置于生长室中(11小时光，25℃)。
通过利用仅在T-DNA边界之间含有nptII基因表达盒的双元载体pSIM401转化黄褐色漫游者产生转基因对照植物。
实例5
PWP1转基因马铃薯中的延迟疾病进展
将转基因pSIM1567植物和其pSIM401对照物在活体外繁殖以产生品系，且将每一品系的三个拷贝转移到土壤中。叶片组织用于提取RNA并使用eIF4E衍生的探针执行北方印迹分析。此探针使得马铃薯eIF4E基因和来自野生马铃薯的pwp1基因的转录物的总量可视化。假设eIF4E基因的表达水平恒定，假定转录水平的任何增加与pwp1基因的表达相关联。因此，如图5中所示，发现大多数pSIM1567植物表达pwp1基因。在品系pwp1-1、8、12、15和25中观察到最高表达水平。
2周之后，将转基因植物通过PVY感染宿主植物的叶片提取物在其叶片表面上摩擦来用PVY进行感染。在两周和三周之后针对典型疾病症状(叶片卷曲和轻微斑点)评估植物。经感染植物的叶片还利用阿格迪(印第安纳州埃尔克哈特)研发的PVY-特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)来分析PVY蛋白质的存在。
感兴趣的是，疾病进展在2个强烈表达pwp1基因的品系(1567-15和1567-25)中被延迟。这些品系比其它品系晚1周显现疾病症状(表2)。
实例6
当马铃薯EIF4E基因沉默时PWP1基因表达的增强效应
5’-非翻译前导区和3’-非翻译尾随区的序列分析允许产生携载这些eIF4E-特异性序列(SEQ ID NO.:10)的DNA片段。将此片段的两个拷贝作为反向重复序列定位于马铃薯泛素-3基因的强Pat启动子(SEQ ID NO.:9)与终止子之间，以产生打算使eIF4E基因沉默但同源pwp1基因不沉默的表达盒。插入沉默盒靠近双元载体的T-DNA边界内的Bar基因的表达盒以产生pSIM1895，且此载体用于重新转化黄褐色漫游者品系1567-25。
将9个卡那霉素和Bar抗性双重转化株在活体外繁殖，并将每一品系的三个植株种植于土壤中，在生长室中放置2周，且接着用PVY进行感染。在感染后2周，九个品系中的六者展示完全PVY抗性，如通过ELISA分析所测定(表3)。1周之后，此抗性在三个品系中仍显著。甚至在感染后4周，在两个1567-25/1895品系中仍未检测到PVY蛋白质。因此，pwp1基因的过表达连同eIF4E基因沉默触发对抗PVY的有效疾病抗性。
在一个对照试验中，马铃薯植物用eIF4E沉默构建体转化。13Bar抗性品系(三种植物/品系)的感染未导致PVY的任何控制。
实例7
在转基因马铃薯中PWP2在马铃薯延迟疾病进展中的过表达
将25种转基因pSIM1569植物和其pSIM401对照物在活体外繁殖以产生品系，并将每一品系的三个拷贝转移到土壤中，放置于生长室中2周，且接着用PVY进行感染。在感染后2周，25个品系中的4个(编号9、16、23和25)展示完全PVY抗性，如通过ELISA分析所测定。在感染后3周，在两个1569品系中(16号和23号)未检测到PVY蛋白质。然而，在感染后4周，所有品系均展示PVY感染症状且通过ELISA检测为PVY阳性(表4)。因此，pwp2基因的过表达也延迟疾病进展。选择展示抗性2周的四个品系和一个敏感品系(18号)用于表达研究。使用叶片组织用于提取RNA并使用eIF4E衍生的探针执行北方印迹分析。此探针使得马铃薯eIF4E基因和来自野生马铃薯的pwp2基因的转录物的总量可视化。假设eIF4E基因的表达水平恒定，假定转录水平的任何增加与pwp2基因的表达相关联。如图8中所示，发现所检查的所有5个pSIM1569植株均表达pwp2基因。在品系pwp2-23中观察到最高表达水平。
实例8
基因内PVY抗性马铃薯植物的研发
设计仅由源自马铃薯或性相容野生马铃薯的DNA元件组成的转移DNA(图6)。此转移DNA包含融合到近组成型Pat启动子和ubi3终止子的pwp1基因的第一表达盒。第二盒含有由马铃薯间隔子间隔开且位于相同调控元件之间的马铃薯eIF4E基因的两个非翻译5’和3’序列。这两个盒位于马铃薯衍生的转移DNA内。完整序列参见SEQ ID NO.:11。
马铃薯利用全植物源转移DNA的无标记转化(如罗曼等人，2004和芮驰尔(Richael)等人，2008中所描述)产生基因内植物，其中的一些展示PVY抗性。
实例9
特异性EIF4E基因的片段的表达赋予对马铃薯Y病毒组的抗性
来自胡椒的pvr1-2等位基因的克隆和缺失诱发突变
使用植物RNA-简易试剂盒(凯杰)从含有抵抗马铃薯Y病毒组的pvr1-2基因的胡椒品种的叶片中分离RNA。所述RNA利用引物对5’-GGG GAT CCA TGG CAA CAG CTGAA AT(SEQ ID NO:12)和5’-CCA CTA GTC TAT ACG GTG TAA CGA T(SEQ ID NO:13)(分别携载限制酶切位点BamHI和SpeI)用于一步逆转录酶PCR反应(凯杰)，以扩增代表pvr1-2基因的cDNA的DNA片段。将扩增产物凝胶纯化，并克隆到pGEM-Teasy(普洛麦格)中；由cDNA编码的氨基酸序列展示于SEQ ID NO:12中。通过使用引物del25-73有义5′-GAT TGG GGA TCC ATG GCA AAG CAT CCA TTA GAG CAT-3'和del25-73反义5′-ATG CTC TAA TGG ATG CTT TGC CAT GGA TCC CCA ATC-3'在18-环扩增反应中利用Pfu Ultra II Fusion HS DNA聚合酶(安捷伦(Agilent))移除此cDNA的5’-部分获得cDNA的片段。添加总共2μl DpnI酶并将反应培育2小时以解离模板分子。接着将5μl此反应物转化到DH5α感受态细胞(英杰公司)中。对个别删除克隆进行测序以识别无错误克隆，将其进一步亚克隆成双元载体。
pSIM1719构建体和至马铃薯中的转化
完整pvr1-2的序列展示于SEQ ID NO.:14中。将pvr1-2衍生的片段(在本文中指定为Fpvr)(参见针对DNA序列的SEQ ID NO.:15，针对氨基酸序列的SEQ ID NO:16)操作地链接到马铃薯(SEQ ID NO.:9)的近组成型PAT启动子和马铃薯ubi3基因(SEQ IDNO.:8)的终止子。将所得表达盒定位于双元载体的T-DNA边界之间以产生pSIM1719。使用携载此转化载体的土壤杆菌LBA4404菌株来转化马铃薯品种黄褐色布尔班克，如实例4中所描述。
含有pSIM1719的转基因品系的表达分析和疾病分析
将转基因pSIM1719植物和其pSIM401对照物在活体外繁殖以产生品系，且将每一品系的三个拷贝转移到土壤中。叶片组织用于提取RNA并使用eIF4E衍生的探针执行北方印迹分析。使用20μg叶片RNA用于北方分析。此探针使得胡椒eIF4E基因的转录物的总量可视化。在品系1719-11、17、20、23(图7)中观察到高表达水平。
如实例5中所描述检查疾病进展。在感染后2周，三个品系pSIM1719-11、17和20未展示感染症状且在ELISA中呈阴性。品系pSIM1719-11、17甚至在感染后4周仍保持ELISA阴性。因此，Fpvr的表达足以赋予马铃薯PVY抗性。
胡椒与马铃薯eIF4E蛋白质之间的大部分差异是在蛋白质的N-末端区且Fpvr可能在提供抗性方面更稳定。Fpvr片段和SEQ ID NO.:17中所示的相似马铃薯片段仅展示11个氨基酸差异(SEQ ID NO.:16和SEQ ID NO.:17)，且其相应核苷酸序列之间(SEQ IDNO.:15和SEQ ID NO.:18)存在46处差异。
抗性也可通过使得转基因植物具有与pwp1(SEQ ID NO.:19和SEQ ID NO.:20)、pwp2(SEQ ID NO.:21和SEQ ID NO.:22)和mpe突变(SEQ ID NO.:23和SEQ ID NO.:24)相似的近组成型表达的片段区来获得，如以下实例10中所讨论。
实例10
由涉及马铃薯Y病毒组抗性的先前识别的eIF4E基因编码的蛋白质包含具有以下共有序列的氨基酸结构域：
DXXXXKSBQXAWGSSXRXXYTFSXVEXFWXXYNNIHBPSKLXXGAD(SEQ IDNO:25)
其中X是中性氨基酸且B是碱性氨基酸。参见罗巴利亚和卡兰达，植物科学发展趋势，11(1)，第40到45页,2006；和美国专利第7,772,462号。
除来自野生马铃薯物种的pwp1基因编码在通常保守的位置处具有10个差异(包括两个与抗性相关eIF4E突变的共有序列不一致的氨基酸(K69R和A74D，位置基于胡椒eIF4E蛋白质))的蛋白质以外，且来自野生马铃薯的pwp2基因编码在通常保守的位置处具有5个失配的蛋白质，所述失配包括一个与抗性相关eIF4E突变的共有序列不一致的氨基酸(N96Y，位置基于胡椒eIF4E蛋白质)。
两个突变体eIF4E基因是从胡椒(mpe，经修饰CaeIF4E基因)产生，所述基因编码赋予马铃薯对马铃薯Y病毒组的抗性而不含有与共有序列一致的氨基酸序列的蛋白质。经修饰胡椒eIF4E基因1的DNA和氨基酸序列展示于SEQ ID NO:26和SEQ ID NO.:27中。经修饰胡椒eIF4E基因2的DNA和氨基酸序列分别展示于SEQ ID NO.:28和SEQ IDNO:29中。本文还产生来自马铃薯的突变体eIF4E基因，其编码潜在地赋予马铃薯对马铃薯Y病毒组的抗性而不含有与共有序列一致的氨基酸序列的蛋白质。此经修饰马铃薯eIF4E基因的DNA和氨基酸序列分别展示于SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中。
利用包含操作地链接到PAT启动子的经修饰CaeIF4E基因中任一者(pSIM1588和pSIM1723，图9和10)的表达盒转化马铃薯产生抗PVY的完全抗性，如通过在感染后4周实施的ELISA分析所测定。图9和10还展示与野生型和空白载体对照植物相比，经转化的mpe基因在所选品系中几乎均过表达。
实例11
如先前所提及，当在近组成型启动子(例如35S或PAT(分别为SEQ ID NO:7和SEQID NO:9))和ubi3终止子(SEQ ID NO:8)的控制下表达时，实例1-9中所描述的序列同样可用于改造生菜和番茄中的马铃薯Y病毒组抗性。所得表达盒可位于双元载体的T-DNA区内。接着将所得含有此实例中所描述的感兴趣基因的双元载体转化到土壤杆菌菌株LBA4404中，且可随后根据下文所描述的转化方案转化到生菜或番茄中。转基因对照植物可通过利用在T-DNA边界内仅含有可选标记(例如nptII表达盒)的对照双元载体转化生菜或番茄植物来产生。
生菜转化
为进行杀菌，将生菜种子在70%乙醇浸泡30秒到1分钟且在具有微量吐温20(Tween20)的10%漂白剂中浸泡15分钟，随后用无菌水冲洗3次。将种子(每个莫泽塔盒(Magenta box)30-40粒)均匀地撒布于培养基上，所述培养基由含维生素(M404,植物技术)以及10g蔗糖/升的半浓度MS培养基组成且利用2%结冷胶(Gelrite)凝固，pH5.7。使种子在24℃下以16/8L/D发芽。
使具有所关注基因(例如pSIM1723(经修饰胡椒eIF4E2，mpe2))且使用PAT启动子(SEQ ID NO:9)和ubi3终止子(SEQ ID NO:8)组成型表达的土壤杆菌自冷冻甘油母液(-80℃)在具有卡那霉素和链霉素选择剂的小体积鲁利亚肉汤(Luria Broth)中生长过夜。将两毫升对数期(log-phase)过夜培养物添加到18ml新的LB中，同时在振荡的同时进行选择并生长直到对数期为止。使土壤杆菌(Agro)旋转沉淀并悬浮于液体MS培养基中以实现OD600为0.2。
播种后7天，自幼苗切除子叶并用解剖刀进行切割以获得与中脉成直角的小切口。将所有外植体浸泡在上述土壤杆菌悬浮液中。10分钟之后，吸去土壤杆菌悬浮液并将外植体在无菌滤纸上吸干。将外植体近轴侧向上放置于共培培养基上，上述培养基由具有维生素(M404,植物技术)、30g蔗糖/升、0.1mg/l BAP、0.1mg/l NAA的MS培养基组成且利用6g/l琼脂凝固，pH5.7。2天共培养之后，将外植体移到再生培养基，所述培养基由具有维生素(M404)、30g蔗糖/升、0.1mg/l BAP、0.1mg/l NAA并用6g/l琼脂凝固的MS培养基(pH5.7)以及150mg/l特美汀和100mg/l卡那霉素组成。每2周将外植体移到新的再生培养基中。2-3周后，收获嫩芽并转移到培养基，所述培养基由具有维生素(M404)、30g蔗糖/升、0.1mg/l BAP、0.1mg/l NAA并用6g/l琼脂凝固的MS培养基(pH5.7)以及150mg/l特美汀和100mg/l卡那霉素组成。2到4周后，将伸长的芽转移到生根培养基(没有激素且具有150mg/l特美汀和100mg/l卡那霉素的MS培养基)。
番茄转化
基本上如芮驰尔等人，2008所描述实施番茄转化。将番茄(低温敏感性栽培番茄(cv.Money Maker))的种子在具有2滴吐温-20的20%市售漂白剂中表面杀菌20分钟并用无菌水冲洗3次，每次10分钟。使种子在含有1.5%蔗糖和6g/l琼脂的M404培养基(萌芽培养基)上萌芽。将12到14天幼苗的下胚轴切成5mm到8mm的段并用土壤杆菌感染。对于基于ipt的转化，将经感染外植体转移到含有200lM乙酰丁香酮的共培培养基中。2天后，将栽培外植体转移到无激素培养基中。每2周将外植体转移到新鲜培养基中。对于常规番茄转化(常规-Tm)，将共栽培外植体转移到含有2.5mg/l ZR、0.1mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、75mg/l卡那霉素和150mg/l特美汀的M404培养基(选择性培养基)中。每2周将外植体转移到新鲜选择性培养基。栽培1个月之后，将0.3mg/l GA3添加到选择性培养基中用于芽伸长。
使由此产生的转基因植物在活体外繁殖，并将每一品系的三个植株种植于土壤中，在生长室中放置2周，且可接着用PVY进行感染。可在2周和4周之后如针对马铃薯所描述通过ELISA分析检查敏感和抗性品种的繁殖。仍对PVY有抗性且在ELISA中呈阳性的转基因植物可如针对马铃薯所描述通过北方分析进一步证实转基因表达。
参考文献：
罗曼CM、哈林MA(Haring MA)、索兹K(Swords,K)、戴维斯HV(Davies HV)和贝尔纳普WR(Belknap,WR)(2007)基因内途径作为传统植物育种的新延伸(Theintragenic approach as a new extension to traditional plant breeding)。植物科学发展趋势(Trends in Plant Sci)12(9):397-403。
芮驰尔CM、凯勒凯乐威M(Kalyaeva,M)、克雷蒂安RC(Chretien,RC)、炎H(Yan,H)、安迪穆勒S(Adimulam,S)、史迪威森A(Stivison,A)、威克斯JT(Weeks,JT)和罗曼CM.(2008)细胞分裂素载体介导无标记且无骨架的植物转化(Cytokinin vectors mediatemarker-free and backbone-free plant transformation)。转基因研究(Transgenic Res.)17:905-917。
实例12ELISA分析
酶联免疫吸附分析(ELISA)是依赖于酶转化反应的分析且用于检测样品中抗体或抗原的存在。ELISA已在医药和植物病理学中用作诊断工具以及在各行业中用于质量控制检查。简单地说，在ELISA中，将未知量的抗原固定于表面，且接着将特定抗体施加在所述表面上面，以便其可结合到所述抗原。将此抗体链接到酶，且在最后步骤中，添加含有所述酶的底物的物质。随后的反应产生可检测信号，最常见是底物的颜色变化。在本发明中，ELISA用于检测PVY病毒蛋白质的存在。ELISA分析通常包含以下步骤。
1.分配样品：
根据负载图(loading diagram)，将100μl所准备的样品分配到样品孔中。将100μl阳性对照分配到阳性对照孔中，并将100μl一般提取缓冲液分配到缓冲液孔中。如果使用阴性对照，将100μl分配到阴性孔中。
2.培育板：
将板设置在潮湿箱内部并在室温下培育2小时或在冰箱(4℃)中培育过夜。
3.准备酶偶联物：
碱性磷酸酶酶偶联物的检测抗体两个瓶子(瓶子A和B)作为浓缩物供应且在使用之前必须用ECI缓冲液稀释。在每一标签上给出建议的偶联物对缓冲液比率。将适当体积的所准备ECI缓冲液分配到专用容器中。每一测试孔需要100μl缓冲液。整个板将需要约10ml。接着，根据标签上所给的稀释度添加碱性磷酸酶酶偶联物。举例来说，如果瓶子A和B上所给的浓缩检测抗体与碱性磷酸酶酶偶联物的稀释度为1:100，且测试者准备了10ml酶偶联物溶液，那么测试者应首先分配10ml ECI缓冲液。然后，添加来自瓶子A的100μl且来自瓶子B的100μl到ECI缓冲液。添加来自瓶子A和B的试剂之后，重要的是将酶偶联物溶液孔混合。
4.洗涤板：
当样品培育完成后，洗涤所述板。使用快速翻滚运动将孔倾倒到槽或废物容器中而不混合内容物。用1X PBST完全填充所有孔，且接着将其再次快速倒空。重复7次。洗涤之后，保持框架上下颠倒并稳固地在折叠纸巾上轻叩以移除所有洗涤缓冲液液滴。检查测试孔。所有孔均应无植物组织。如果存在组织，重复洗涤步骤并在纸巾上稳固地轻叩。
5.添加酶偶联物：
每孔分配100μl所准备的酶偶联物。
6.培育板：
将板在潮湿箱中在室温下培育2小时。
7.准备PNP溶液：
每一PNP片剂(ACC00404)将制成1mg/ml浓度的5ml PNP溶液，大约够用于5个8孔条带。在以上培育步骤结束之前约15分钟，对于测试者将使用的每一片剂，量出5ml室温1X PNP缓冲液。接着，不接触片剂，将PNP片剂添加到缓冲液中。
8.洗涤板：
如之前所述，用1X PBST洗涤所述板8次。检视孔查看是否存在气泡。在纸巾上稳固地轻叩以移除残留洗涤缓冲液和任何气泡。如果仍存在气泡，可用干净的移液管尖端使其破裂。
9.添加PNP底物：
将100μl PNP底物分配到每一测试孔中。
10.培育板：
将板在潮湿箱中培育60分钟。板应免于直接或强烈的光。
11.评价结果：
用肉眼检查孔，或在板读数器上在405nm处进行测量。如果在读数时在光程中存在气泡，可改变结果。建议在读数之前消除气泡。显色的孔指示阳性结果。未显著显色的孔指示阴性结果。只有阳性对照孔给出阳性结果且缓冲液孔保持无色，测试结果才有效。只要阴性孔保持实质上澄清，在培育超过60分钟之后即可解读结果。
表2.pSIM1567植物中当用PVYNTN+感染时疾病症状和病毒存在的评估。
Figure BDA00003311938500451
Figure BDA00003311938500461
表3.在用pSIM1895转化的1567-25植物中当用PVYNTN+感染时疾病症状和病毒存在的评估。
表4.在pSIM1569植物中当用PVYNTN+感染时疾病症状和病毒存在的评估。
Figure BDA00003311938500463
Figure BDA00003311938500471
SEQ ID NO的列表：
SEQ ID NO:1(pwp1全长多核苷酸序列)
SEQ ID NO:2(pwp1全长氨基酸序列)
SEQ ID NO:3(pwp2全长多核苷酸序列)
SEQ ID NO:4(pwp2全长氨基酸序列)
SEQ ID NO:5(马铃薯的eIF4E基因多核苷酸序列)
SEQ ID NO:6(马铃薯eIF4E基因，等位基因1，氨基酸序列)
SEQ ID NO:7(35S启动子)
SEQ ID NO:8(ubi3终止子)
SEQ ID NO:9(Pat启动子)
SEQ ID NO:10(EIF4E前导区和尾随区)
SEQ ID NO:11(用于PVY抗性的全植物源转移DNA)
SEQ ID NO:12(用于扩增pvr1-2的引物)
SEQ ID NO:13(用于扩增pvr1-2的引物)
SEQ ID NO:14(pvr1-2cDNA序列，全长)
SEQ ID NO:15(pvr1-2衍生的片段，多核苷酸序列)
SEQ ID NO:16(pvr1-2衍生的片段，氨基酸序列)
SEQ ID NO:17(具有pvr1-2突变的经删除马铃薯片段的氨基酸序列)
SEQ ID NO:18(具有pvr1-2突变的经删除马铃薯片段的DNA序列)
SEQ ID NO:19(具有pwp1突变的经删除马铃薯片段的DNA序列)
SEQ ID NO:20(具有pwp1突变的经删除马铃薯片段的氨基酸序列)
SEQ ID NO:21(具有pwp2突变的经删除马铃薯片段的氨基酸序列)
SEQ ID NO:22(具有pwp2突变的经删除马铃薯片段的DNA序列)
SEQ ID NO:23(具有mpe突变的经删除马铃薯片段的氨基酸序列)
SEQ ID NO:24(具有mpe突变的经删除马铃薯片段的DNA序列)
SEQ ID NO:25(共有序列)
SEQ ID NO:26(经修饰CaeIF4E，mpe，DNA序列1)
SEQ ID NO:27(经修饰CaeIF4E，mpe，氨基酸序列1)
SEQ ID NO:28(经修饰CaeIF4E，mpe，DNA序列2)
SEQ ID NO:29(经修饰CaeIF4E，氨基酸序列2)
SEQ ID NO:30(经修饰StEIF4E，DNA序列)
SEQ ID NO:31(经修饰StEIF4E，氨基酸序列)
SEQ ID NO:32(pvr1-2氨基酸序列)
SEQ ID NO:33(马铃薯边界样序列)
SEQ ID NO:34(边界样序列的共有序列)
SEQ ID NO:35(马铃薯eIF4E基因，等位基因2，氨基酸序列)
SEQ ID NO：1 (pwp1)
ATGGCAGCAGCTGAAATGGAGAGAACGACGTCGTTTGATGCAGCTGAGAAGTTGAAGGCCGCCGATGCAGGAGGA
GGAGAGGTAGACGATGAACTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAATCAAATGATGCGGCGTCGTATTTGGGGAAA
GAAATCACAGTGAAGCATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAACCCTACTGCTAGATCTCGACAA
ATTGATTGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAAT
ATCCATCACCCAAGCAAGTTGGTTATGGGAGCAGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAA
GATCCTATATGTTCCAATGGAGGGACGTGGAAAATGAGTTTTTCGAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATAT
ACGCTGCTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCATGGAGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTTAATGTCCGGGTT
AAGGGAGAAAAAATAGCTTTGTGGACCAAGAATGCTGCAAATGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGG
AAGCAGTTTCTAGATTACAGCGATTCGGTTGGCTTCATATTTCATGACGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAATGCC
AAGAATCGTTACACAGTATAG
SEQ ID NO：2 (pwp1蛋白质)
MAAAEMERTTSFDAAEKLKAADAGGGEVDDELEEGEIVEESNDAASYLGKEITVKHPLEHSWTFWFDNPTARSRQ
IDWGSSLRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVMGADFHCFKHKIEPKWEDPICSNGGTWKMSFSKGKSDTSWLY
TLLAMIGHQFDHGDEICGAVVNVRVKGEKIALWTKNAANETAQVSIGKQWKQFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNA
KNRYTV
SEQ ID No 3 (pwp2 DNA序列)
ATGGCAGCAGCTGAAATGGAGAGAACGATGTCGTTTGATGCAGCTGAGAAGCTGAAGGCCGCCGATGGAGGAGGA
GGGGAGGTAGACGATGAACTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAATCAAATGATACGGCGTCGTTTTTAGGGAAA
GAAATCACAGTGAAGCATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAGCCCTATTGCTAAATCTCGACAA
ACTGCTTGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACTATAAT
ATCCATCACCCAAGCAAGTTGGTTATGGGAGCAGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAA
GATCCTGTATGTGCCAATGGAGGGACGTGGAAAATGAGTTTTCCGAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATAT
ACGCTGCTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCATGGAGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTTAGTGTCCGGGCT
AAGGGAGAAAAAATAGCTTTGTGGACCAAGAATGCTGCAAACGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGCAAACAATGG
AAGCAGTTTCTAGATTACAGCGATTCGGTTGGCTTCATATTTCACGATGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAATGCC
AAGAATCGTTACACAGTTAG
SEQ ID No 4(pwp2氨基酸序列)
Maaaemertmsfdaaeklkaadggggevddeleegeiveesndtasflgkeitvkhplehswtfwfdspiaksrc
tawgsslrnvytfstvedfwgayynihhpsklvmgadfhcfkhkiepkwedpvcanggtwkmsfpkgksdtswly
tllamighqfdhgdeicgavvsvrakgekialwtknaanetaqvsigkqwkqfldysdsvgfifhddakrldrna
knrytv
SEQ ID NO：5(来自马铃薯的eIF4E基因)
ATGGCAGCAGCTGAAATGGAGAGAACGACGTCGTTTGATGCAGCTGAGAAGTTGAAGGCCGCCGATGCAGGAGGA
GGAGAGGTAGACGATGAACTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAATCAAATGATACGGCGTCGTATTTAGGGAAA
GAAATCACAGTGAAACATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAGCCCTATTGCTAAATCTCGACAA
ACTGCTTGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAAT
ATCCATCACCCAAGCAAGTTGGTTATGGGAGCAGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAA
GATCCTGTATGTGCCAATGGAGGGACGTGGAAAATGAATTTTTTGAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATAT
ACGCTGCTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCACGGAGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTTAGTGTCCGGTCT
AAGGGAGAAAAAATAGCTTTGTGGACCAAGAATGCTGCAAATGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGG
AAGCAGTTTCTAGATTACAGCGATTCGGTTGGCTTCATATTTCACGATGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAGTGCC
AAGAATCGTTACACAGTATAG
SEQ ID NO：6(来自马铃薯的eIF4E基因，等位基因1)
MAAAEMERTTSFDAAEKLKAADAGGGEVDDELEEGEIVEESNDTASYLGKEITVKHPLEHSWTFWFDSPIAKSRQ
TAWGSSLRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVMGADFHCFKHKIEPKWEDPVCANGGTWKMNFLKGKSDTSWLY
TLLAMIGHQFDHGDEICGAVVSVRSKGEKIALWTKNAANETAQVSIGKQWKQFLDHSDSVGFIFHDDAKRLDRSA
KNRYTV
SEQ ID No：7(35S启动子)
atggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgag
acttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaagg
acagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctct
gccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtct
tcaaagcaagtggattgatgtgaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagt
ctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgccc
agctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaagg
aaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtgga
aaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgc
acaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaa
tcaccagtctctctctacaaatctatctct
SEQ ID NO：8(ubi3终止子)
gccaaagcacatacttatcgatttaaatttcatcgaagagattaatatcgaataatcatatacatactttaaata
cataacaaattttaaatacatatatctggtatataattaattttttaaagtcatgaagtatgtatcaaatacaca
tatggaaaaaattaactattcataatttaaaaaatagaaaagatacatctagtgaaattaggtgcatgtatcaaa
tacattaggaaaagggcatatatcttgatctagataattaacgattttgatttatgtataatttccaaatgaagg
tttatatctacttcagaaataacaatatacttttatcagaacattcaacaaagtaacaaccaactagagtgaaaa
atacacattgttctctaaacatacaaaattgagaaaagaatctcaaaatttagagaaacaaatctgaatttctag
aagaaaaaaataattatgcactttgctattgctcgaaaaataaatgaaagaaattagacttttttaaaagatgtt
agactagatatactcaaaagctatcaaaggagtaatattcttcttacattaagtattttagttacagtcctgtaa
ttaaagacacattttagattgtatctaaacttaaatgtatctagaatacatatatttgaatgcatcatatacatg
tatccgacacaccaattctcataaaaagcgtaatatcctaaactaatttatccttcaagtcaacttaagcccaat
atacattttcatctctaaaggcccaagtggcacaaaatgtcaggcccaattacgaagaaaagggcttgtaaaacc
ctaataaagtggcactggcagagcttacactctcattccatcaacaaagaaaccctaaaagccgcagcgccactg
atttctctcctccaggcgaagatgcagatcttcgtgaagaccctaacggggaagacgatcaccctagaggttgag
tcttccgacaccatcgacaatgtcaaagccaagatccaggacaaggaagggattcccccagaccagcagcgtttg
attttcgccggaaagcagcttgaggatggtcgtactcttgccgactacaacatccagaaggagtcaactctccat
ctcgtgctccgtctccgtggtggtg
SEQ ID No：9 (Pat启动子)
cacattgattgagttttatatgcaatatagtaataataataatatttcttataaagcaagaggtcaatttttttt
tattataccaacgtcactaaattatatttgataatgtaaaacaattcaattttacttaaatatcatgaaataaac
tatttttataaccaaattactaaatttttccaataaaaaaaagtcattaagaagacataaaataaatttgagtaa
aaagagtgaagtcgactgacttttttttttttatcataagaaaataaattattaactttaacctaataaaacact
aatataatttcatggaatctaatacttacctcttagaaataagaaaaagtgtttctaatagaccctcaatttaca
ttaaatattttcaatcaaatttaaataacaaatatcaatatgaggtcaataacaatatcaaaataatatgaaaaa
agagcaatacataatataagaaagaagatttaagtgcgattatcaaggtagtattatatcctaatttgctaatat
ttaaactcttatatttaaggtcatgttcatgataaacttgaaatgcgctatattagagcatatattaaaataaaa
aaatacctaaaataaaattaagttatttttagtatatatttttttacatgacctacatttttctgggtttttcta
aaggagcgtgtaagtgtcgacctcattctcctaattttccccaccacataaaaattaaaaaggaaaggtagcttt
tgcgtgttgttttggtacactacacctcattattacacgtgtcctcatataattggttaaccctatgaggcggtt
tcgtctagagtcggccatgccatctataaaatgaagctttctgcacctcatttttttcatcttctatctgatttc
tattataatttctctcaattgccttcaaatttctctttaaggttagaaatcttctctatttttggtttttgtctg
tttagattctcgaattagctaatcaggtgctgttatagcccttaattttgagttttttttcggttgttttgatgg
aaaaggcctaaaatttgagtttttttacgttggtttgatggaaaaggcctacaattggagttttccccgttgttt
tgatgaaaaagcccctagtttgagattttttttctgtcgattcgattctaaaggtttaaaattagagtttttaca
tttgtttgatgaaaaaggccttaaatttgagtttttccggttgatttgatgaaaaagccctagaatttgtgtttt
ttcgtcggtttgattctgaaggcctaaaatttgagtttctccggctgttttgatgaaaaagccctaaatttgagt
ttctccggctgttttgatgaaaaagccctaaatttgagttttttccccgtgttttagattgtttggttttaattc
tcgaatcagctaatcagggagtgtgaaaagccctaaaatttgagtttttttcgttgttctgattgttgtttttat
gaatttgcagatgcagatctttgtgaaaactctcaccggaaagactatcaccctagaggtggaaagttctgatac
aatcgacaacgttaaggctaagatccaggataaggaaggaattcccccggatcagcaaaggcttatcttcgccgg
aaagcagttggaggacggacgtactctagctgattacaacatccagaaggagtctaccctccatttggtgctccg
tctacgtggaggt
SEQ ID No：10 (EIF4E前导区和尾随区)
CACCTCCATCAACAATATTCAAAGAGAATTGTACTACAGAGGAATAATAGGGAGCCTGGGGAAGTAATGCAGAAC
ACGCGAATTGTAGAGGCATGGATTCAAACCAAACAATTTTCCGCGATTAGAAAGTGCAAACACCAATACACGAGT
TACTCAAACCAGAAGCTTATCAAATGAGAAACAAAACCAGTGCCTACCAACTTTCCAGTACGAATTGTGTTTCTT
GCATTCCCACATTGCATCAAGAACTAATTTGCTGCTCTGTGGACTGTGGAGCACTTTTTTT
SEQ ID No：11(用于PVY抗性的全植物源转移DNA)
tcgagcacattgattgagttttatatgcaatatagtaataataataatatttcttataaagcaagaggtcaattt
ttttttaattataccaacgtcactaaattatatttgataatgtaaaacaattcaattttacttaaatatcatgaa
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ttgatggaaaaggcctaaaatttgagtttttttacgttggtttgatggaaaaggcctacaattggagttttcccc
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tttgagtttctccggctgttttgatgaaaaagccctaaatttgagttttttccccgtgttttagattgtttggtt
ttaattctcgaatcagctaatcagggagtgtgaaaagccctaaatttgagtttttttcgttgttctgattgttgt
ttttatgaatttgcagatgcagatctttgtgaaaactctcaccggaaagactatcaccctagaggtggaaagttc
tgatacaatcgacaacgttaaggctaagatccaggataaggaaggaattcccccggatcagcaaaggcttatctt
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gctccgtctacgtggaggtggatccatggcagcagctgaaatggagagaacgacgtcgtttgatgcagctgagaa
gttgaaggccgccgatgcaggaggaggagaggtagacgatgaacttgaagaaggtgaaattgttgaagaatcaaa
tgatgcggcgtcgtatttggggaaagaaatcacagtgaagcatccattggagcattcatggactttttggtttga
taaccctactgctagatctcgacaaattgattggggaagctcacttcgaaatgtctacactttctccactgttga
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tggagcagtcgttaatgtccgggttaagggagaaaaaatagctttgtggaccaagaatgctgcaaatgaaacagc
tcaggttagcattggtaagcaatggaagcagtttctagattacagcgattcggttggcttcatatttcatgacga
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ataaccaaattactaaatttttccaataaaaaaaagtcattaagaagacataaaataaatttgagtaaaaagagt
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tttcatggaatctaatacttacctcttagaaataagaaaaagtgtttctaatagaccctcaatttacattaaata
ttttcaatcaaatttaaataacaaatatcaatatgaggtcaataacaatatcaaaataatatgaaaaaagagcaa
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cttatatttaaggtcatgttcatgataaacttgaaatgcgctatattagagcatatattaaaataaaaaaatacc
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gtgtaagtgtcgacctcattctcctaattttccccaccacataaaaattaaaaaggaaaggtagcttttgcgtgt
tgttttggtacactacacctcattattacacgtgtcctcatataattggttaaccctatgaggcggtttcgtcta
gagtcggccatgccatctataaaatgaagctttctgcacctcatttttttcatcttctatctgatttctattata
atttctctcaattgccttcaaatttctctttaaggttagaaatcttctctatttttggtttttgtctgtttagat
tctcgaattagctaatcaggtgctgttatagcccttaattttgagttttttttcggttgttttgatggaaaaggc
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gctgttttgatgaaaaagccctaaatttgagttttttccccgtgttttagattgtttggttttaattctcgaatc
agctaatcagggagtgtgaaaagccctaaaatttgagtttttttcgttgttctgattgttgtttttatgaatttg
cagatgcagatctttgtgaaaactctcaccggaaagactatcaccctagaggtggaaagttctgatacaatcgac
aacgttaaggctaagatccaggataaggaaggaattcccccggatcagcaaaggcttatcttcgccggaaagcag
ttggaggacggacgtactctagctgattacaacatccagaaggagtctaccctccatttggtgctccgtctacgt
ggaggtggatcccacctccatcaacaatattcaaagagaattgtactacagaggaataatagggagcctggggaa
gtaatgcagaacacgcgaattgtagaggcatggattcaaaccaaacaattttccgcgattagaaagtgcaaacac
caatacacgagttactcaaaccagaagcttatcaaatgagaaacaaaaccagtgcctaccaactttccagtacga
attgtgtttcttgcattcccacattgcatcaagaactaatttgctgctctgtggactgtggagcactttttttga
attcgtaacttttactcatctcctccaattatttctgatttcatgcatgtttccctacattctattatgaatcgt
gttatggtgtataaacgttgtttcatatctcatctcatctattctgattttgattctcttgcctactgaatttga
ccctactgtaatcggtgataaatgtgaatgcttcctcttcttcttcttcttctcagaaatcaatttctgttttgt
ttttgttcatctgtagccgcggaaaaaaagtgctccacagtccacagagcagcaaaatagttcttgatgcaatgt
gggaatgcaagaaacacaattcgtactggaaagttggtaggcactggttttgtttctcatttgataagcttctgg
tttgagtaactcgtgtattggtgtttgcactttctaatcgcggaaaattgtttggtttgaatccatgcctctaca
attcgcgtgttctgcattacttccccaggctccctattattcctctgtagtacaattctctttgaatattgttga
tggaggtgactagtcaccaccacggagacggagcacgagatggagagttgactccttctggatgttgtagtcggc
aagagtacgaccatcctcaagctgctttccggcgaaaatcaaacgctgctggtctgggggaatcccttccttgtc
ctggatcttggctttgacattgtcgatggtgtcggaagactcaacctctagggtgatcgtcttccccgttagggt
cttcacgaagatctgcatcttcgcctggaggagagaaatcagtggcgctgcggcttttagggtttctttgttgat
ggaatgagagtgtaagctctgccagtgccactttattagggttttacaagcccttttcttcgtaattgggcctga
cattttgtgccacttgggcctttagagatgaaaatgtatattgggcttaagttgacttgaaggataaattagttt
aggatattacgctttttatgagaattggtgtgtcggatacatgtatatgatgcattcaaatatatgtattctaga
tacatttaagtttagatacaatctaaaatgtgtctttaattacaggactgtaactaaaatacttaatgtaagaag
aatattactcctttgatagcttttgagtatatctagtctaacatcttttaaaaaagtctaatttctttcatttat
ttttcgagcaatagcaaagtgcataattatttttttcttctagaaattcagatttgtttctctaaattttgagat
tcttttctcaattttgtatgtttagagaacaatgtgtatttttcactctagttggttgttactttgttgaatgtt
ctgataaaagtatattgttatttctgaagtagatataaaccttcatttggaaattatacataaatcaaaatcgtt
aattatctagatcaagatatatgcccttttcctaatgtatttgatacatgcacctaatttcactagatgtatctt
ttctattttttaaattatgaatagttaattttttccatatgtgtatttgatacatacttcatgactttaaaaaat
taattatataccagatatatgtatttaaaatttgttatgtatttaaagtatgtatatgattattcgatattaatc
tcttcgatgaaatttaaatcgataagtatgtgctttggc
SEQ ID No 12
GATTGGGGATCCATGGCAAAGCATCCATTAGAGCAT
SEQ ID No 13
ATGCTCTAATGGATGCTTTGCCATGGATCCCCAATC
SEQ ID No 14(pvr1-2 cDNA)
ATGGCAACAGCTGAAATGGAGAAAACGACGACGTTTGATGAAGCTGAGAAGGTGAAATTGAATGCTAATGAGGCA
GATGATGAAGTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAAACTGATGATACGACGTCGTATTTGAGCAAAGAAATAGCA
ACAAAGCATCCATTAGAGCATTCATGGACTTTCTGGTTTGATAATCCAGAGGCGAAATCGAAACAAGCTGCTTGG
GGTAGCTCGCGTCGCAACGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAATATCCACCAC
CCAAGCAAGTTAGTTGTGGGAGCAGACTTACATTGTTTCAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCTGTA
TGTGCCAATGGAGGGACATGGAAAATGAGTTTTTCAAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTGCTT
GCAATGATTGGACATCAATTCGATCATGAAGATGAAATTTGTGGAGCAGTAGTTAGTGTCAGAGGTAAGGGAGAA
AAAATATCTTTGTGGACCAAGAATGCTGCAAATGAAACGGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGCAGTTT
CTGGATTACAGCGACAGTGTTGGCTTCATATTTCACGACGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAATGCAAAGAATCGT
TACACAGTATAA
SEQ ID No 15(pvr1-2衍生的片段)
ATGGCAAAGCATCCATTAGAGCATTCATGGACTTTCTGGTTTGATAATCCAGAGGCGAAATCGAAACAAGCTGCT
TGGGGTAGCTCGCGTCGCAACGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAATATCCAC
CACCCAAGCAAGTTAGTTGTGGGAGCAAACTTACATTGTTTCAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCT
GTATGTGCCAATGGAGGGACATGGAAAATGAGTTTTTCAAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTG
CTTGCAATGATTGGACATCAATTCGATCATGAAGATGAAATTTGTGGAGCAGTAGTTAGTGTCAGAGGTAAGGGA
GAAAAAATATCTTTGTGGACCAAGAATGCTGCAAATGAAACGGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGCAG
TTTCTGGATTACAGCGACAGTGTTGGCTTCATATTTCACGACGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAATGCAAAGAAT
CGTTACACCGTATAG
SEQ ID No 16(pvr1-2衍生片段的氨基酸序列)
MATKHPLEHSWTFWFDNPEAKSKQAAWGSSRRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVVGANLHCFKHKIEPKWED
PVCANGGTWKMSFSKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHEDEICGAVVSVRGKGEKISLWTKNAANETAQVSIGKQWK
QFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNAKNRYTV
Seq ID NO 17(具有pvr1-2突变的经删除马铃薯片段的氨基酸序列)
MAKHPLEHSWTFWFDSPEAKSRQTAWGSSRRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVMGANFHCFKHKIEPKWEDP
VCANGGTWKMNFLKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHGDEICGAVVSVRSKGEKIALWTKNAANETAQVSIGKQWKQ
FLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRSAKNRYTV*
Seq ID NO 18(具有pvr1-2突变的经删除马铃薯片段的DNA序列)
ATGGCAAAACATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAGCCCTGAAGCTAAATCTCGACAAACTGCT
TGGGGAAGCTCAAGACGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAATATCCAT
CACCCAAGCAAGTTGGTTATGGGAGCAAACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCT
GTATGTGCCAATGGAGGGACGTGGAAAATGAATTTTTTGAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTG
CTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCACGGAGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTTAGTGTCCGGTCTAAGGGA
GAAAAAATAGCTTTGTGGACCAAGAATGCTGCAAATGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGCAG
TTTCTAGATTACAGCGATTCGGTTGGCTTCATATTTCACGATGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAGTGCCAAGAAT
CGTTACACAGTATAG
SEQ ID NO：19(具有pwp1突变的经删除马铃薯片段的DNA序列)
ATGGCAAAGCATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAACCCTACTGCTAGATCTCGACAAATTGAT
TGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAATATCCAT
CACCCAAGCAAGTTGGTTATGGGAGCAGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCT
ATATGTTCCAATGGAGGGACGTGGAAAATGAGTTTTTCGAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTG
CTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCATGGAGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTTAATGTCCGGGTTAAGGGA
GAAAAAATAGCTTTGTGGACCAAGAATGCTGCAAATGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGCAG
TTTCTAGATTACAGCGATTCGGTTGGCTTCATATTTCATGACGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAATGCCAAGAAT
CGTTACACAGTATAG
SEQ ID NO：20(具有pwp1突变的经删除马铃薯片段的氨基酸序列)
MAKHPLEHSWTFWFDNPTARSRQIDWGSSLRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVMGADFHCFKHKIEPKWEDP
ICSNGGTWKMSFSKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHGDEICGAVVNVRVKGEKIALWTKNAANETAQVSIGKQWKQ
FLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNAKNRYTV
Seq ID No 21(具有pwp2突变的经删除马铃薯片段的氨基酸序列)
MAKHPLEHSWTFWFDSPIAKSRQTAWGSSLRNVYTFSTVEDFWGAYYNIHHPSKLVMGADFHCFKHKIEPKWEDP
VCANGGTWKMSFPKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHGDEICGAVVSVRAKGEKIALWTKNAANETAQVSIGKQWKQ
FLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNAKNRYTV
Seq ID No 22(具有pwp2突变的经删除马铃薯片段的DNA序列)
ATGGCAAAGCATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAGCCCTATTGCTAAATCTCGACAAACTGCT
TGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACTATAATATCCAT
CACCCAAGCAAGTTGGTTATGGGAGCAGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCT
GTATGTGCCAATGGAGGGACGTGGAAAATGAGTTTTCCGAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTG
CTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCATGGAGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTTAGTGTCCGGGCTAAGGGA
GAAAAAATAGCTTTGTGGACCAAGAATGCTGCAAACGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGCAAACAATGGAAGCAG
TTTCTAGATTACAGCGATTCGGTTGGCTTCATATTTCACGATGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAATGCCAAGAAT
CGTTACACAGTTAG
Seq ID No 23(具有mpe突变的经删除马铃薯片段的氨基酸序列)
MAKHPLEHSWTFWFDSPIPKSRQTAWGSSLRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVHDFHCFKHKIEPKWEDPVC
ANGGTWKMNFLKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHGDEICGAVVSVRSKGEKIALWTKNSANETAQVSIGKQWKQFL
DYSDSVGFIFHDDAKRLDRSAKNRYTV*
Seq ID No 24 (具有mpe突变的经删除马铃薯片段的DNA序列)
ATGGCAAAACATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAGCCCTATTCCTAAATCTCGACAAACTGCT
TGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAATATCCAT
CACCCAAGCAAGTTGGTTCACGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCTGTATGT
GCCAATGGAGGGACGTGGAAAATGAATTTTTTGAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTGCTGGCA
ATGATTGGACATCAATTCGATCACGGAGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTTAGTGTCCGGTCTAAGGGAGAAAAA
ATAGCTTTGTGGACCAAGAATAGTGCAAATGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGCAGTTTCTA
GATTACAGCGATTCGGTTGGCTTCATATTTCACGATGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAGTGCCAAGAATCGTTAC
ACAGTATAG
SEQ ID No 25
DXXXXKSBQXAWGSSXRXXYTFSXVEXFWXXYNNIHBPSKLXXGAD
SEQ ID No 26(经修饰CaeIF4E，DNA序列1)
ATGGCAACAGCTGAAATGGAGAAAACGACGACGTTTGATGAAGCTGAGAAGGTGAAATTGAATGCTAATGAGGCA
GATGATGAAGTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAAACTGATGATACGACGTCGTATTTGAGCAAAGAAATAGCA
ACAAAGCATCCATTAGAGCATTCATGGACTTTCTGGTTTGATAATCCAGTGCCGAAATCGAAACAAGCTGCTTGG
GGTAGCTCGCTTCGCAACGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAATATCCACCAC
CCAAGCAAGTTAGTTCACGACTTACATTGTTTCAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCTGTATGTGCC
AATGGAGGGACATGGAAAATGAGTTTTTCAAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTGCTTGCAATG
ATTGGACATCAATTCGATCATGAAGATGAAATTTGTGGGGCAGTAGTTAGTGTCAGAGGTAAGGGAGAAAAAATA
TCTTTGTGGACCAAGAATTCTGCAAATGAAACGGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGCAGTTTCTGGAT
TACAGCGACAGTGTTGGCTTCATATTTCACGACGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAATGCAAAGAATCGTTACACC
GTATAG
SEQ ID No 27(经修饰CaeIF4E，氨基酸序列1)
MATAEMEKTTTFDEAEKVKLNANEADDEVEEGEIVEETDDTTSYLSKEIATKHPLEHSWTFWFDNPVPKSKQAAW
GSSLRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVHDLHCFKHKIEPKWEDPVCANGGTWKMSFSKGKSDTSWLYTLLAM
IGHQFDHEDEICGAVVSVRGKGEKISLWTKNSANETAQVSIGKQWKQFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNAKNRYT
V
SEQ ID No 28(经修饰CaeIF4E，DNA序列2)
ATGGCAACAGCTGAAATGGAGAAAACGACGACGTTTGATGAAGCTGAGAAGGTGAAATTGAATGCTAATGAGGCA
GATGATGAAGTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAAACTGATGATACGACGTCGTATTTGAGCAAAGAAATAGCA
ACAAAGCATCCATTAGAGCATTCATGGACTTTCTGGTTTGATAATCCAGTGCCGAAATCGAAACAAGCTGCTTGG
GGTAGCTCGCTTCGCAACGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGATTTTTGGGGTGCTTACAATAATATCCACCAC
CCAAGCAAGTTAGTTCACGACTTACATTGTTTCAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCTGTATGTGCC
AATGGAGGGACATGGAAAATGAGTTTTTCAAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTGCTTGCAATG
ATTGGACATCAATTCGATCATGAAGATGAAATTTGTGGGGCAGTAGTTAGTGTCAGAGGTAAGGGAGAAAAAATA
TCTTTGTGGACCAAGAATTCTGCAAATGAAACGGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGCAGTTTCTGGAT
TACAGCGACAGTGTTGGCTTCATATTTCACGACGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAATGCAAAGAATCGTTACACC
GTATAG
SEQ ID No 29(经修饰CaeIF4E，氨基酸序列2)
MATAEMEKTTTFDEAEKVKLNANEADDEVEEGEIVEETDDTTSYLSKEIATKHPLEHSWT
FWFDNPVPKSKQAAWGSSLRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVHDLHCFKHKIEPKWE
DPVCANGGTWKMSFSKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHEDEICGAVVSVRGKGEKISLWTK
NSANETAQVSIGKQWKQFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNAKNRYTV
SEQ ID No 30(经修饰StEIF4E，DNA序列)
ATGGCAGCAGCTGAAATGGAGAGAACGACGTCGTTTGATGCAGCTGAGAAGTTGAAGGCCGCCGATGCAGGAGGA
GGAGAGGTAGACGATGAACTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAATCAAATGATACGGCGTCGTATTTAGGGAAA
GAAATCACAGTGAAACATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAGCCCTATTCCTAAATCTCGACAA
ACTGCTTGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAGAGTTTTGGGGTGCTTACAATAAT
ATCCATCACCCAAGCAAGTTGGTTCACGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCT
GTATGTGCCAATGGAGGGACGTGGAAAATGAATTTTTTGAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATATACGCTG
CTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCACGGAGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTTAGTGTCCGGTCTAAGGGA
GAAAAAATAGCTTTGTGGACCAAGAATACTGCAAATGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGCAG
TTTCTAGATTACAGCGATTCGGTTGGCTTCATATTTCACGATGATGCAAAGAGGCTCGACAGAAGTGCCAAGAAT
CGTTATTCCGTGTAG
SEQ ID No 31(经修饰StEIF4E，氨基酸序列)
MAAAEMERTTSFDAAEKLKAADAGGGEVDDELEEGEIVEESNDTASYLGKEITVKHPLEH
SWTFWFDSPIPKSRQTAWGSSLRNVYTFSTVEEFWGAYNNIHHPSKLVHDFHCFKHKIEP
KWEDPVCANGGTWKMNFLKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHGDEICGAVVSVRSKGEKIAL
WTKNTANETAQVSIGKQWKQFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRSAKNRYSV
SEQ ID NO：32(pvr1-2氨基酸序列)
MATAEMEKTTTFDEAEKVKLNANEADDEVEEGEIVEETDDTTSYLSKEIATKHPLEHSWT
FWFDNPEAKSKQAAWGSSRRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVVGADLHCFKHKIEPK
WEDPVCANGGTWKMSFSKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHEDEICGAVVSVRGKGEKISLW
TKNAANETAQVSIGKQWKQFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNAKNRYTV*
SEQ ID NO：33(马铃薯边界样序列)
GTTTACAGTACCATATATCCTGTCAGAGGTATAGAGGCATGACTGGCATGATCACTAAATTGATGCCCACAGAGG
AGACTTATAACCTACAGGGGCACGTAGTTCTAGGACTTGAAAGTGACTGACCGTAGTCCAACTCGGTATAAAGCC
TACTCCCAACTAAATATATGAAATTTATAGCATAACTGCAGATGAGCTCGATTCTAGAGTAGGTACCGAGCTCGA
ATTCCTTACTCCTCCACAAAGCCGTAACTGAAGCGACTTCTATTTTTCTCAACCTTCGGACCTGACGATCAAGAA
TCTCAATAGGTAGTTCTTCATAAGTGAGACTATCCTTCATAGCTACACTTTCTAAAGGTACGATAGATTTTGGAT
CAACCACACACACTTCGTTTACACCGGTATATATCCTGCCA
SEQ ID NO：34(边界样序列的共有序列)
YGRYAGGATATATWSNVBKGTAAWY
SEQ ID NO：35(马铃薯eIF4E基因，等位基因2，氨基酸序列)
MAAAEMERTTSFDAADKLKAADAGGGEVDDELEEGEIVEESNDTASYLGKEITVKHPLEHSWTFWFDSPIAKSRQ
TAWGSSLRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLVMGADFHCFKHKIEPKWEDPVCANGGTWKMSFSKGKSDTSWLY
TPLAMIGHQFDHGDEICGAVVSVRAKGEKIALWTKNAANETAQVSIGKQWKQFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNA
KNRYTV

Claims (29)

1.一种将PVY抗性赋予植物达至少一段时期的方法，其包含：
(A)在植物的细胞中表达以下中的至少一者：(i)包含序列SEQ ID NO:2的全长pwp1基因，或(ii)包含序列SEQ ID NO:4的全长pwp2基因；或者
(B)在植物的细胞中表达以下中的至少一者：(i)包含序列SEQ ID NO:2的全长pwp1基因，或(ii)包含序列SEQ ID NO:4的全长pwp2基因，以及下调所述植物的内源性eIF4E基因的表达；或者
(C)表达以下中的至少一者：(i)SEQ ID NO:2的N-末端截短片段或(ii)SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或者
(D)使所述植物的内源性eIF4E基因的序列突变以包含至少两个来自由以下组成的群组的点突变：SEQ ID NO:6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P，所述点突变赋予对PVY的抗性达至少一段时期；
其中所述植物完全抵抗PVY病毒感染，或在一段时期之后才显现PVY疾病的一种或一种以上症状。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述片段选自由以下组成的群组：(i)SEQ IDNO:20、(ii)SEQ ID NO:21。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述时期选自由以下组成的群组：(i)1到3天；(ii)3到5天；(iii)5到7天；(iv)7到9天；(v)9到11天；(vi)11到13天；(vii)13到15天；(viii)2到3周；(ix)3到4周；(x)4到5周；(xi)5到7周；(xii)7到10周；(xii)2到3个月和(xiii)3到5个月。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的群组：(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状：(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌(Phytophthora)具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
6.一种转化植物以完全抵抗PVY病毒疾病或抵抗PVY疾病的一种或一种以上症状的发作达一段时期的方法，所述方法包含利用多核苷酸转化所述植物，所述多核苷酸编码具有选自由以下组成的群组的序列的蛋白质：(i)SEQ ID NO:26、(ii)SEQ ID NO:28和(iii)选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:32组成的群组的序列的N-末端截短片段。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述时期选自由以下组成的群组：(i)1到3天；(ii)3到5天；(iii)5到7天；(iv)7到9天；(v)9到11天；(vi)11到13天；(vii)13到15天；(viii)2到3周；(ix)3到4周；(x)4到5周；(xi)5到7周；(xii)7到10周；(xii)2到3个月和(xiii)3到5个月。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述片段选自由以下组成的群组：(i)SEQ IDNO:16和(ii)SEQ ID NO:23。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的群组：(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状：(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
11.根据权利要求6所述的方法，其进一步包含下调或抑制所述植物的内源性eIF4E基因的表达。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述经转化植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状：(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
13.一种分离的多核苷酸，其包含序列，所述序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQID NO:6的至少15个连续氨基酸具有至少80%一致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：SEQ ID NO:6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T76I、(vi)A77D、(vii)V128I、(viii)A130S、(ix)S172N和(x)S175V，或SEQ ID NO:6的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P；或(B)编码包含序列SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的蛋白质；(C)编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或(D)编码包含序列SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的蛋白质；或(E)编码序列SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32的N-末端截短片段；其中所述多核苷酸当其在植物中表达时赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述N-末端截短片段选自由以下组成的群组：(i)SEQ ID NO:20、(ii)SEQ ID NO:21、(iii)SEQ ID NO:16和(iv)SEQ ID NO:23。
15.一种载体，其包含根据权利要求13所述的多核苷酸。
16.根据权利要求15所述的载体，其中所述多核苷酸位于土壤杆菌(Agrobacterium)转移DNA中。
17.根据权利要求15所述的载体，其中所述土壤杆菌转移DNA包含与任何土壤杆菌T-DNA边界序列均非100%一致的边界样序列。
18.一种植物，其在其基因组内包含根据权利要求13所述的多核苷酸或者以其它方式表达根据权利要求13所述的多核苷酸。
19.根据权利要求18所述的植物，其中所述植物选自由以下组成的群组：(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
20.一种从根据权利要求18所述的植物生长的块茎、叶片或果实。
21.根据权利要求18所述的植物，其中所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状：(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
22.一种制造食品的方法，其包含：(1)利用根据权利要求13所述的多核苷酸转化植物；(2)使所述经转化植物生长并从所述植物获得块茎、果实或叶片；和(3)(i)将所述块茎、果实或叶片作为食品直接使用或(ii)将所述块茎、果实或叶片加工成食品。
23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包含下调或抑制所述植物的内源性eIF4E基因的表达。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述经转化植物的实质上所有细胞均表达所述多核苷酸。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述经转化植物的至少5个叶片表达所述多核苷酸。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述经转化植物的至少50%细胞表达所述多核苷酸。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸表达持续至少1周。
28.一种食品，其是根据权利要求22所述的方法制得。
29.一种食品，其包含从根据权利要求18所述的植物获得的植物细胞。
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