CN110857437A - 一种马铃薯y病毒弱毒株、载体、制备方法及其应用 - Google Patents

一种马铃薯y病毒弱毒株、载体、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，公开了一种马铃薯Y病毒弱毒株、载体、制备方法及其应用。马铃薯Y病毒弱毒株系中，HC‑Pro基因的氨基酸序列的第182位的赖氨酸突变为精氨酸。HC‑Pro的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，HC‑Pro的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。本发明通过定点突变的方式获得了一种致病力明显降低的马铃薯Y病毒弱毒株突变体，该弱毒株突变体可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受马铃薯Y病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

Description

一种马铃薯Y病毒弱毒株、载体、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体地说，涉及一种马铃薯Y病毒弱毒株、载体、制备方法及其应用。
背景技术
病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物病毒病种类多，传播途径复杂，生产上没有免疫或高抗病毒病的品种，市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。
马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，寄主范围较广，可侵染马铃薯、烟草、番茄和辣椒在内的多种茄科作物，造成巨大的经济损失。
目前关于PVY株系划分的研究较多。根据其在烟草上的症状，PVY分为引起叶脉坏死的坏死株系(PVYN)和引起花叶的普通株系(PVYO)，其中坏死株系可导致烟叶绝产，在生产中的危害更重。因此，PVY尤其是N株系是威胁烟叶安全生产的重要问题。受限于卷烟企业和生产需要，仅有的几个抗病毒烟草品种不能广泛种植，市场上又没有对病毒病特效的药剂，烟草病毒病的防治非常困难。因此，交叉保护是防治烟草病毒病的一种有效方式。交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。而限制交叉保护广泛应用的关键因素是可用的弱毒株系太少。
目前关于PVY弱毒株系的研究很少。有研究证明了HC-Pro蛋白的C末端的氨基酸K400和E419是决定烟草叶脉坏死的关键位点。但也有一些PVY分离物，其HC-Pro蛋白中同时存在K400和E419两个氨基酸残基，但不会诱导烟草出现叶脉坏死症状。这表明，K400和E419两个氨基酸残基不是决定烟草叶脉坏死的唯一决定因素，除了此之外还可能有其它决定因子的存在。因此，急需能够起到有效交叉保护作用的弱毒株系来防治植物的病毒病。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种马铃薯Y病毒弱毒株、载体、制备方法及其应用。本发明通过定点突变的方式获得了一种致病力明显降低的马铃薯Y病毒弱毒株突变体，同时该弱毒株突变体可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受马铃薯Y病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种马铃薯Y病毒弱毒株系，其特征在于，马铃薯Y病毒弱毒株系中，HC-Pro基因的氨基酸序列的第182位的赖氨酸突变为精氨酸。
进一步的方案，突变前，HC-Pro的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，HC-Pro的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。
本发明的第二目的是提供一种含有如上所述的马铃薯Y病毒弱毒株系基因组的载体。
进一步的方案，载体以pCAMBIA0390为基础，插入马铃薯Y病毒弱毒株系基因组，且HC-Pro基因的氨基酸序列的第182位的赖氨酸突变为精氨酸。
本发明的第三目的是提供一种如上所述的一种马铃薯Y病毒弱毒株系，或者如上所述的载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用PCR定点突变将马铃薯Y病毒的辅助成分-蛋白酶HC-Pro的第182位氨基酸赖氨酸突变为精氨酸；
(2)筛选弱毒株系，获得马铃薯Y病毒弱毒株系。
进一步的方案，筛选获得弱毒株系后，通过农杆菌浸润法将获得的马铃薯Y病毒弱毒株系接种到寄主植物普通烟，发现弱毒株系的致病力显著下降。
进一步的方案，在接种马铃薯Y病毒弱毒株系到寄主植物普通烟后第15天接种马铃薯Y病毒强毒株系，测定交叉保护效果，发现弱毒株系可有效抵御强毒株系的侵染。
本发明的第四目的是提供一种含有如权利要求1或2所述的一种马铃薯Y病毒弱毒株系，或者权利要求3或4所述的载体的重组菌。
进一步的方案，所述的重组菌包括重组的农杆菌，农杆菌中转入含有马铃薯Y病毒弱毒株系的载体。
本发明的第五目的是提供一种如上所述的一种马铃薯Y病毒弱毒株系，或者如上所述的载体在防治马铃薯Y病毒强毒株系侵染植物方面的应用；
优选的，所述的植物为双子叶植物；
优选的，所述的植物为烟草。
本发明实施的具体技术方案是：
a.弱毒分离物的获得：通过对采集到的156个马铃薯病毒病样品进行检测，其中在89％的样品中检测到PVY。在对它们进行生物学分析时发现其中有16个分离物侵染普通烟后引起轻微的症状，其中一个分离物通过分子生物学分析被划分到PVYN株系，但是侵染普通烟后不引起坏死症状。我们将此分离物与PVYN株系的HC-Pro氨基酸序列进行比对发现，第182位氨基酸由K变成R。
b.突变体的获得：以自主构建的马铃薯Y病毒侵染性克隆为基础，针对其HC-Pro第182位氨基酸设计突变引物，利用QuickChangeTM定点突变试剂盒在这些位点引入突变。
c.弱毒株系的筛选：通过农杆菌浸润法将b中获得的突变体接种到寄主植物普通烟，观察这个突变体所致症状的变化，发现突变体的致病力明显降低。
d.交叉保护效果测定：在接种弱毒株系后15天接种PVY强毒株系，测定交叉保护效果，发现弱毒株系可有效抵御强毒株系的侵染。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1)本发明通过定点提突变的方式获得了1个致病力明显降低的PVY弱毒株系K182R。
2)本发明的弱毒株系K182R可有效保护植株免受PVY强毒株系的侵染，因此可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受马铃薯Y病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1为PVY强毒株系和弱毒株系K182R接种后第14天的症状，以接种空载体pCam0390的植株为对照；
图2为接种后10天PVY强毒株系和弱毒株系K182R在普通烟中的积累水平；
图3显示保护间隔期为15天时，弱毒株系K182R在挑战接种后15天对烟草植株的保护效果；
图4为弱毒株系K182R在挑战接种后21天对烟草植株的保护效果；
图5为挑战接种后15天不同处理的烟草植株内GFP的检测结果。
pCam0390+PVY-GFP，先接种pCam0390再接种强毒株系PVY-GFP的普通烟植株；K182R+PVY-GFP，先接种弱毒株系K182R再接种强毒株系PVY-GFP的普通烟植株；PVY-GFP，只接种强毒株系PVY-GFP的普通烟植株，为阳性对照；pCam0390(Mock)，只接种pCam0390的普通烟植株，为阴性对照。
本发明中，pCam0390即为pCAMBIA0390载体，弱毒株系K182R即为弱毒株系pCamPVY-K182R。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一马铃薯Y病毒侵染性克隆的构建
以马铃薯Y病毒的RNA为模板，用随机引物进行反转录。根据现有马铃薯Y病毒全基因组的限制性酶切图谱，可分多个部分扩增，酶切后装配为马铃薯Y病毒全长cDNA克隆。
以所得反转录产物为模板和相应的引物进行PCR扩增。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。切胶回收后获得多个片段，将多个片段连接到农杆菌介导的表达载体pCAMBIA0390，发明人将该策略构建的侵染性克隆命名为pCamPVYN。
实施例二：弱毒分离物的获得
从黑龙江采集到156个马铃薯病毒病样品，ELISA检测结果表明，其中在139个样品中检测到PVY。接种普通烟后21天，包括A12在内的16个分离物只引起轻微的花叶症状，但根据氨基酸序列分析结果，分离物A12的HC-Pro属于PVYN株系。通过比对分离物A12与其它PVYN株系的HC-Pro氨基酸序列发现，一般PVYN株系HC-Pro第182位氨基酸为赖氨酸(K)，而分离物A12第182位氨基酸为(R)。
实施例三：定点突变
以马铃薯Y病毒侵染性克隆pCamPVYN为模板，利用PCR进行突变。本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：
表1定点突变引物序列
Figure BDA0001771068390000051
其中引物1和2应用于将HC-Pro第182位的K突变为R。粗体字代表突变的核苷酸位点。突变前的HC-Pro的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，氨基酸序列如Seq ID No.4所示。
以马铃薯Y病毒侵染性克隆pCamPVYN为模板，利用PCR进行突变，所用聚合酶为Phusion高保真聚合酶(Finnzymes)。
PCR反应体系如下：
反应结束，在PCR产物中加入0.5μL DpnI(20U/μL)，37℃处理2h，加入125μL无水乙醇和5μL 3mol/L的醋酸钠(pH＝5.2)混匀，-20℃沉淀过夜。13000r/min离心10min，弃上清，沉淀用1mL 75％乙醇洗涤后置于室温自然干燥，加入10μL ddH2O水回溶，转化大肠杆菌DH5α，突变质粒经测序验证，获得的突变质粒命名为pCamPVY-K182R。
实施例四病毒接种
将空载体pCAMBIA0390、侵染克隆pCamPVYN和突变体pCamPVY-K182R转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/L MgCl2，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD600为0.5左右，室温静置3小时。取5mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，从普通烟(5－6周龄或4－6片真叶)叶片背面浸润。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。
实施例五症状观察及病毒浓度检测
观察接种植物的症状，用ELISA检测病毒积累情况。在接种后第10天，带有野生型病毒的侵染克隆pCamPVYN(WT)在普通烟系统叶上引起明显的叶脉坏死症状，而突变体pCamPVY-K182R在普通烟上不引起可见症状，更无叶脉坏死(图1)。
接种后15天，pCamPVYN在普通烟上引起严重坏死，突变体pCamPVY-K182R仍不表现症状。
另外，ELISA检测表明，在接种10天时，突变体pCamPVY-K182R的积累量明显低于野生型病毒的积累量(图2)。
试验例交叉保护效果测定
将弱毒株系预先接种普通烟15天后，接种PVY强毒株系，观察弱毒株系的交叉保护效果。
具体方法包括：
选取5周龄的普通烟，分为2组，每组12棵。第一组为空白对照组，mock组，预先接种空载体pCAMBIA0390；第二组预先接种弱毒株系pCamPVY-K182R。
接种15天后，第16天，两组的普通烟分别接种带有荧光蛋白的马铃薯Y病毒的强毒株系PVY-GFP。
将以上试验重复三次，分别观察，记录结果。将三次重复实验烟草发病率结果进行汇总，攻毒后15天观察，调查发病情况，结果如下：
1、预先接种空载体pCAMBIA0390再接种强毒株系的普通烟植株出现严重的叶脉坏死症状，发病率为100％；
2、预先接种弱毒株系pCamPVY-K182R，再接种强毒株系的普通烟植株表现正常，发病率为0，保护效果为100％。
在紫外灯下，先接种空载体pCAMBIA0390再接种强毒株系的普通烟植株系统叶片上出现明显的绿色荧光，而先接种弱毒株系pCamPVY-K182R再接种强毒株系的普通烟系统叶片上无绿色荧光(图3)。
在接种后21天，先接种空载体pCAMBIA0390再接种强毒株系的普通烟植株上许多叶片出现坏死，而先接种弱毒株系pCamPVY-K182R再接种强毒株系的普通烟植株无叶片坏死现象(图4)。
Western blot检测结果表明，先接种弱毒株系pCamPVY-K182R再接种强毒株系PVY-GFP的普通烟植株内没有检测到GFP，而先接种空载体pCAMBIA0390再接种强毒株系PVY-GFP的对照普通烟植株能检测到GFP(图5)。
以上结果表明，弱毒株系pCamPVY-K182R对PVY强毒株系的交叉保护效果显著，可有效保护植物免受PVY强毒株系的侵染。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Figure IDA0001771068450000011
Figure IDA0001771068450000021
Figure IDA0001771068450000031
Figure IDA0001771068450000041

Claims (10)

1.一种马铃薯Y病毒弱毒株系，其特征在于，马铃薯Y病毒弱毒株系中，HC-Pro基因的氨基酸序列的第182位的赖氨酸突变为精氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯Y病毒弱毒株系，其特征在于，突变前，HC-Pro的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，HC-Pro的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。
3.一种含有如权利要求1或2所述的马铃薯Y病毒弱毒株系基因组的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，载体以pCAMBIA0390为基础，插入马铃薯Y病毒弱毒株系基因组，且HC-Pro基因的氨基酸序列的第182位的赖氨酸突变为精氨酸。
5.一种如权利要求1或2所述的一种马铃薯Y病毒弱毒株系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用PCR定点突变将马铃薯Y病毒的辅助成分-蛋白酶HC-Pro的第182位氨基酸赖氨酸突变为精氨酸；
(2)筛选弱毒株系，获得马铃薯Y病毒弱毒株系。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，筛选获得弱毒株系后，通过农杆菌浸润法将获得的马铃薯Y病毒弱毒株系接种到寄主植物普通烟，发现弱毒株系的致病力显著下降。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在接种马铃薯Y病毒弱毒株系到寄主植物普通烟后第15天接种马铃薯Y病毒强毒株系，测定交叉保护效果，发现弱毒株系可有效抵御强毒株系的侵染。
8.一种含有如权利要求1或2所述的一种马铃薯Y病毒弱毒株系，或者权利要求3或4所述的载体的重组菌。
9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌包括重组的农杆菌，农杆菌中转入含有马铃薯Y病毒弱毒株系的载体。
10.一种如权利要求1或2所述的一种马铃薯Y病毒弱毒株系，或者权利要求3或4所述的载体在防治马铃薯Y病毒强毒株系侵染植物方面的应用；
优选的，所述的植物为双子叶植物；
优选的，所述的植物为烟草。
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