WO2017188321A1 - ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法 - Google Patents

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WO2017188321A1
WO2017188321A1 PCT/JP2017/016568 JP2017016568W WO2017188321A1 WO 2017188321 A1 WO2017188321 A1 WO 2017188321A1 JP 2017016568 W JP2017016568 W JP 2017016568W WO 2017188321 A1 WO2017188321 A1 WO 2017188321A1
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eif4e2
virus
tobacco
gene
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PCT/JP2017/016568
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高倉　由光
亮 新城
久史 宇田川
一治 古賀
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日本たばこ産業株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a virus-resistant tobacco and a production method thereof.
  • PVY Potato virus Y
  • tobacco Natural grassa tabacum
  • PVY causes symptoms such as dark flesh of mesophyll, leaf and stem gangrene, leaf yellowing, and growth inhibition, depending on the lineage and the tobacco varieties infected, resulting in the quality of leaf tobacco. As well as causing a decrease in yield, it causes significant damage to tobacco production worldwide.
  • Non-patent Document 1 when leaf veins and stem gangrene occur, the plants themselves often die from the yellowing and browning of the leaves, which greatly affects the quality and yield of leaf tobacco (Non-patent Document 1).
  • leaf tobacco that has been infected with PVY and whose quality is reduced is used as a raw material, the quality of the tobacco product produced is also greatly reduced.
  • VAM Virgin A mutant
  • PVY-Breaking line (sometimes referred to as PVY-Breaking line or PVY-B)
  • Non-Patent Document 2 tobacco that has acquired resistance to the VAM-Breaking line by irradiation
  • Non-patent Document 3 About half of about 200 known plant virus resistance genes have recessive inheritance (Non-patent Document 3). These are considered to be host factors necessary for virus growth and cell-to-cell transfer. Some of these factors have become apparent from the last decade of research. For example, translation initiation factors such as eIF4E and eIF4G, DEAD-box RNA helicase-like protein (Non-patent document 4), cysteine-rich VPg-interacting protein (Non-patent document 5), Translation elongation factor (Non-patent document 6), etc. has been identified as a recessive virus-resistant genetic factor. Of course, these are not all, and it is considered that there are many other candidates (Non-Patent Document 3). For example, as other candidates, various plant factors related to phloem transport of plant viruses (Non-Patent Document 7). Is mentioned.
  • Patent Document 1 describes a method for imparting virus resistance by overexpression of a gene encoding eIF4E (not including eIF (iso) 4E) in which a specific amino acid is mutated.
  • Patent Document 2 describes a mutant having eIF4E or eIF (iso) 4E to which a virus does not act due to a splicing mutation in the eIF4E gene or eIF (iso) 4E gene.
  • Patent Document 3 discloses a method for selecting a resistant plant against pepper pepper leaf spot disease (Pepper vettle mottle virus, PVMV) by a combination of both eIF4E and eIF (iso) 4E mutations, specifically, eIF4E and eIF ( iso) A method for screening plants that do not express 4E at all and express mutant eIF4E is described.
  • PVMV pepper vettle mottle virus
  • Non-patent Document 9 Clover yellow vein virus grows in eIF (iso) 4E-deficient Arabidopsis but does not grow in eIF4E-deficient Arabidopsis and, conversely, TuMV grows in eIF4E-deficient Arabidopsis, but eIF (iso) 4E It has been shown that it does not grow in deficient Arabidopsis thaliana (Non-patent Document 10). Furthermore, in order to acquire resistance to PVMV, both eIF4E and eIF (iso) 4E must simultaneously lose their functions (Non-patent Document 11). Examples of recent reviews of translation initiation factors and plant virus resistance include Non-Patent Document 12 and Non-Patent Document 13.
  • CMV Cucumber mosaic virus
  • RYMV Rice mottle virus
  • RNAi RNA interference
  • eIF4E1 and eIF4E2 RNA interference
  • eIF (iso) 4E RNAi was not resistant to any of these viruses (Non-patent Document 17).
  • eIF (iso) 4E of tomato is not related to virus resistance other than the genus Potyvirus (Non-patent Document 17).
  • EIF (iso) 4E is categorized into the eIF4E family, but generally in plants, the DNA sequence identity between eIF4E and eIF (iso) 4E is less than 60%. Also, eIF (iso) 4E forms a translation complex different from eIF4E. Specifically, eIF (iso) 4E forms a translation complex called eIF (iso) 4F together with eIF (iso) 4G, and eIF4E forms a translation complex called eIF4F together with eIF4G.
  • Non-patent Document 18 In tobacco (Nicotiana tabacum), there is a report that the expression level of eIF4E1 or eIF (iso) 4E is reduced (Non-patent Document 18). In this report, antisense technology is used to repress the transcription of tobacco eIF4E1 or eIF (iso) 4E. And producing tobacco in which the amount of eIF4E1 transcript was suppressed to 30-40% of the control, and tobacco in which the amount of eIF (iso) 4E transcript was suppressed to 60% of the control, and both It is described that the amount of the transcript of eIF4E1 was reduced to 26% of the control and the amount of the transcript of eIF (iso) 4E to 31% of the control.
  • Non-patent Document 21 Non-patent Document 20
  • Tobacco Nicotiana tabacum
  • S Nicotiana ylsylvestris
  • T Nicotiana tomentosiformis
  • Non-Patent Document 21 describes that suppression of S-derived eIF4E function results in PVY resistance.
  • tobacco is double diploid and has more genes than normal diploid plants, and the genes from Nicotiana sylvestris and genes from Nicotiana tomentosiformis are basically always One set exists. That is, at least two sets of homologous genes exist in tobacco. Therefore, the inheritance pattern is more complicated than other diploid plants.
  • Arabidopsis thaliana there are three types of eIF4E and one type of eIF (iso) 4E (Non-patent Document 12). It is considered that all translation initiation factors found in Arabidopsis thaliana are present in pairs.
  • Non-patent Document 20 Including cap-binding protein that is functionally similar to eIF4E, it has been found that there are at least 12 eIF4E families of tobacco (Non-patent Document 20). If eIF4G and eIF (iso) 4G are included, the number is further increased. Therefore, finding a factor involved in resistance of a desired virus by suppressing the function among these requires a great deal of labor.
  • Ruffel et al. (2002) A natural recessive resistance gene against potato virus Y in pepper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E). Plan J. 32, 1067-1075. Sato et al. (2005) Selective involvement of members of theeukaryotic initiation factor 4E family in the infection of Arabidopsis thalianaby potyviruses. FEBS Lett. 579: 1167-1171. Ruffel et al. (2006) Simultaneous mutations in translation initiation factors eIF4E and eIF (iso) 4E are required to prevent pepper veinal mottle virus infection of pepper. J Gen Virol. 87, 2089-2098. Robaglia and Caranta.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and has as its main object to provide a cigarette having resistance to viruses and a method for producing the cigarette.
  • the PVY resistance that has been used for tobacco breeding has been due to the suppression of the function of the S-derived eIF4E2 gene, but as a result of extensive studies, the present inventors have conducted extensive studies on the S-derived eIF4E2 gene and T Although the sequence homology of the eIF4E2 gene derived from T was as high as 93%, surprisingly, a mutant of a tobacco in which the function of the eIF4E2 gene derived from T was suppressed was detected in a conventional virus resistant tobacco (eIF4E2 derived from S It has been found that it exhibits stronger PVY resistance (fewer gangrene symptoms) than functionally suppressed tobacco.
  • T-derived eIF4E2 gene whose function has been suppressed has a mutant mutant of PVY-B that invades S-derived eIF4E2 function-suppressed tobacco. It has also been found that it exhibits stronger resistance (less gangrene symptoms) than conventional resistant tobacco (eIF (iso) 4E function-suppressed tobacco).
  • One aspect of the virus-resistant tobacco according to the present invention has a mutation in the translation initiation factor eIF4E2-T gene, thereby producing a non-functional eIF4E2-T protein against the virus, or eIF4E2 -T gene expression is suppressed.
  • Another aspect of the virus-resistant tobacco according to the present invention is characterized in that the expression level of the translation initiation factor eIF4E2-T gene is small compared to the wild type.
  • a mutation that produces a non-functional translation initiation factor eIF4E2-T protein or suppresses expression of the eIF4E2-T gene is used. It is characterized by producing tobacco having resistance to viruses by introduction into genes.
  • Another aspect of the method for producing a virus-resistant tobacco according to the present invention is to provide resistance to a virus by introducing a factor that reduces the expression level of the translation initiation factor eIF4E2-T gene compared to the wild type. It is characterized by producing cigarettes having.
  • the method for producing a progeny of virus-resistant tobacco according to the present invention is characterized by self-pollination or cross-pollination of the virus-resistant tobacco produced in the virus-resistant tobacco production method or its progeny.
  • One embodiment of the polynucleotide for detection according to the present invention is a polynucleotide for detecting a mutation in the tobacco translation initiation factor eIF4E2-T gene, which mutation is non-functional for viruses. It is characterized by being a mutation that produces a protein or suppresses the expression of the eIF4E2-T gene.
  • One aspect of the method for selecting a virus-resistant tobacco according to the present invention is an inspection step in which the presence or absence of the mutation in genomic DNA is examined in tobacco using the detection polynucleotide, and the mutation is detected in the inspection step. And a selection step of selecting the resulting tobacco as a virus-resistant tobacco.
  • One embodiment of the DNA marker for determining the resistance of tobacco to the virus according to the present invention comprises a polynucleotide comprising a continuous base sequence containing a mutation in the translation initiation factor eIF4E2-T gene or a complementary sequence thereof, and the mutation Is characterized by producing a non-functional eIF4E2-T protein against the virus or a mutation that suppresses the expression of the eIF4E2-T gene.
  • One aspect of the leaf tobacco according to the present invention is the leaf tobacco of the virus-resistant tobacco.
  • One aspect of the tobacco product according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned leaf tobacco as a raw material.
  • the present invention can provide a cigarette having resistance to viruses.
  • T1 is a mutation that occurs in exon 2
  • T2 is a mutation that occurs in exon 1.
  • TT represents a wild type homozygote
  • Tt is heterozygous
  • tt is a mutant homozygote.
  • Virus resistant tobacco and method for producing the same
  • tobacco having resistance to viruses virus-resistant tobacco
  • virus-resistant tobacco in which the amount (eg, the amount of transcript) is reduced.
  • Another embodiment of the present invention relates to a method for producing a tobacco having resistance to a virus (a method for producing a virus-resistant tobacco).
  • the present invention relates to a method for producing virus-resistant tobacco by reducing the expression level of eIF4E2-T gene (eg, the amount of transcript).
  • Nicotiana tabacum is a double diploid and has both a genome derived from Nicotiana sylvestris (S type genome) and a genome derived from Nicotiana tomentosiformis (T type genome). Therefore, N. tabacum has two sets of eIF4E2 genes (alleles) with different base sequences.
  • eIF4E2 encoded by the N. sylvestris-derived genome in a Nicotiana genus plant having a genome derived from N. sylvestris is referred to as "eIF4E2-S”.
  • eIF4E2-T tomentosiformis
  • the present invention focuses on the eIF4E2-T gene.
  • the eIF4E2-T gene of N. tabacum has 5 exons and 4 introns as shown in FIG.
  • the number described in the lower part shows the number of nonsense mutation candidate parts, and the arrow shows the position of the primer in an Example.
  • SEQ ID NO: 1 GenBank accession number: KM202068.
  • SEQ ID NO: 1 the open reading frame is the 61st to 717th base
  • the translation start codon is the 61st to 63rd base
  • the translation stop codon is the 715th to 717th base.
  • SEQ ID NO: 2 An example of the amino acid sequence of wild-type eIF4E2-T protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 3 An example of the base sequence of the genomic DNA of the wild type eIF4E2-T gene is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the 5 ′ transcriptional regulatory region including the promoter is the 1st to 1764th bases.
  • the translation start codon is the 1765th to 1767th base
  • the translation stop codon is the 7112th to 7114th base
  • the first exon is the 1705th to 2012th base
  • the second exon is the 4639th to 4804th base
  • the third exon is the 4915th to 5040th base
  • the fourth exon is the 6927th to 6992th base
  • the fifth exon is the 7064th to 7114th base.
  • the first intron is the base from 2013 to 4638
  • the second intron is the base from 4805 to 4914
  • the third intron is the base from 5041 to 6926
  • the fourth intron is the base from 6993 to 7063 is there.
  • the terminator region on the 3 'side is the 7115 to 8039th base.
  • the base sequence of the protein coding region of a plant gene having the same function may vary from 1% to several percent between cultivars depending on the gene. There may be a difference of several to 10% between wild relatives.
  • the wild-type eIF4E2-T gene before the mutation occurs includes a gene that generates an mRNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an eIF4E2-T that has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a gene encoding a protein is included.
  • the wild-type eIF4E2-T gene before the mutation occurs is 94% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, and further preferably, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the wild-type eIF4E2-T gene includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a sequence of 88% or more, preferably 92% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
  • genes encoding functional eIF4E2-T proteins with identity are also included.
  • the eIF4E2-T gene of GenBank accession number KM2020068 and the eIF4E2-S gene of GenBank accession number KF155696 have a DNA sequence identity of 93.2% (612 bases out of 657 bases match). is there.
  • the amino acid sequence identity is 87.7% (192 of 219 amino acids match), and the similarity is 97%.
  • the wild-type eIF4E2-T gene includes 1 to 50, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a gene encoding a functional eIF4E2-T protein is also included.
  • the wild-type eIF4E2-T gene includes 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 4 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, Also included are genes encoding a functional eIF4E2-T protein having an amino acid sequence with 1-3, 1-2, or 1 amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions.
  • a to B indicating a numerical range is intended to be “A or more and B or less”.
  • the wild-type eIF4E2-T gene before the occurrence of mutation includes a gene whose mRNA sequence is the sequence of GenBank accession number KM202068.
  • This sequence is derived from the eIF4E2-T gene of tobacco line T021658, and includes a DNA sequence corresponding to the protein coding region of KM2020068 and an exon sequence of SEQ ID NO: 3 (genomic DNA sequence of eIF4E2-T of tobacco variety K326).
  • the sequence identity is 99.2% (652 out of 657 bases match).
  • the difference of about 1% (5 bases out of 657 bases) is considered to be due to the difference between tobacco lines and varieties.
  • identity of base sequences refers to the ratio of exactly the same base sequence in a plurality of base sequences.
  • amino acid sequence identity refers to the ratio of the exact same amino acid sequence in a plurality of amino acid sequences.
  • similarity of amino acid sequences refers to the ratio of amino acid sequences having the same amino acid or similar properties in a plurality of amino acid sequences.
  • amino acids of similar nature include, for example, lysine, arginine, and histidine with positively charged residues; aspartic acid and glutamic acid with negatively charged residues; alanine with nonpolar or hydrophobic residues , Valine, leucine, isoleucine, methionine, tryptophan, phenylalanine, and proline; polar but uncharged glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • base sequence identity “amino acid sequence identity”, or “amino acid sequence similarity”
  • BLAST a sequence analysis (homology search) program BLAST (literature: Altschul et al.
  • tobacco includes not only Nicotiana tabacum but also other species of the same Nicotiana genus having the eIF4E2-T gene.
  • Other species of the Nicotiana genus that have the eIF4E2-T gene include, for example, N.Ntomentosa, N. tomentosiformis, and N.Nkawakamii.
  • tobacco also includes tobacco plants, plant tissues (eg, leaves, stems, flowers, roots, reproductive organs, embryos and parts thereof), seedlings and seeds, and dried leaves, stems, flowers. , Roots and seeds, and the like.
  • virus resistant tobacco includes not only the present-day tobacco into which mutations have been introduced, but also its offspring (progeny).
  • the mRNA sequence of the eIF4E2-T gene of these Nicotiana plants is considered to have 95% or more sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 shows 99.2% sequence identity (652 bases out of 657 bases match) with the mRNA sequence of the N. tomentosiformis eIF4E2-T gene (excluding introns).
  • the structure of the eIF4E2-T gene of N. ⁇ tomentosiformis has the same number of exons (5) and the same number of introns (4) as the N. ⁇ ⁇ ⁇ tabacum gene.
  • nucleotide sequence of the wild-type eIF4E2-T gene using the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, the genome of N. tomentosiformis (Whole genome shotgun contigs) registered in GenBank is searched for homology using the BLAST program etc. Can be obtained.
  • the nucleotide sequence of eIF4E2-T of a plant species derived from a Nicotiana genus plant is amplified from the genomic DNA of the plant species by PCR, for example, using the primer sequences shown in SEQ ID NOs: 4-7. It can be obtained by determining the base sequence.
  • a BLAST program may be used, or commercially available nucleic acid / amino acid sequence analysis software may be used.
  • the wild-type tobacco eIF4E2-T gene was detected. It is possible to obtain a base sequence.
  • the eIF4E2-T gene can be easily discriminated by comparing the sequence with the eIF4E2 gene of N. tomentosiformis and the eIF4E2 gene of N. sylvestris.
  • Viruses to which the virus-resistant tobacco is resistant are not particularly limited.
  • viruses belonging to the genus Alfamovirus for example, Alfalfa mosaic virus
  • Curtovirus for example, Beet curly top virus
  • Begomovirus for example, Tobaccocovirus
  • Cucumovirus genus viruses eg Cucumber mosaic virus, and Peanut stunt virus
  • Ilarvirus genus viruses eg Tobacco streak virus
  • Potyvirus genus viruses eg Potato virus Y (PVY), Tobacco etch virus, Tobacco vein mottling virus) , And Tobacco vein banding mosaic) virus
  • Tobamovirus genus virus eg Tobacco mosaic virus
  • Tobravirus genus virus eg Tobacco rattle virus
  • Necrovirus genus virus eg Tobacco necrosis virus
  • Varicosavirus genus virus eg Tobacco stuntvirus
  • Genus virus eg Tobacco ringspot virus
  • Umbravirus genus viruses eg Tobacco mottle virus
  • Polerovirus genus viruses eg Tobacco vein distorting virus
  • Mastrevirus genus viruses eg Tobacco yellow dwarf virus
  • Tospovirus genus viruses eg Tomato spotted wilt virus
  • the virus-resistant tobacco according to the present invention may be resistant to one type of virus or may be resistant to multiple types of viruses.
  • the virus-resistant tobacco according to the present invention may have a remarkable resistance to a virus belonging to the genus Potyvirus.
  • Potato virus Y (PVY) PVY-O strain, PVY-C strain, PVY- It may be resistant to Z strains, PVY-N (including NTN and NW) strains, particularly PVY strains (VAM-Breaking strains) that break the virus resistance of tobacco Virgin A mutant.
  • virus resistance refers to the fact that the symptoms that occur in tobacco are not delayed or caused by viral infection as compared to susceptible tobacco varieties. Symptoms occurring in tobacco include, for example, growth stagnation, leaf vein gangrene, stem gangrene, leaf vein penetration, and mottling in the case of PVY and PVY VAM-Breaking strains. In the present invention, in particular, the occurrence of veins or stem gangrene can be suppressed. Since leaf vein or stem gangrene affects the final tobacco yield, suppression of the occurrence of leaf vein or stem gangrene is a very practical effect. Alternatively, “virus resistance” refers to inhibition of virus growth or inhibition of viral cell-to-cell migration as compared to susceptible tobacco varieties.
  • the expression level (for example, the amount of transcript) of genes other than the eIF4E2-T gene may be decreased or decreased. It does not have to be.
  • One aspect of the virus-resistant tobacco according to the present invention has a mutation in the eIF4E2-T gene, thereby producing a non-functional eIF4E2-T protein against the virus, or the eIF4E2-T gene It is a virus-resistant tobacco in which the expression of is suppressed.
  • mutant refers to point mutations, deletions, insertions, duplications, translocations, and inversions in DNA, and refers to differences from the wild-type base sequence unless otherwise specified.
  • the “eIF4E2-T gene” means not only the coding region encoding the eIF4E2-T protein but also the intron, regulatory region, and other untranslated sequences in the genome. It is a concept including non-coding regions necessary for expression.
  • Non-functional eIF4E2-T protein against virus refers to an eIF4E2-T protein that is not available (at least partially inhibited from use) during viral self-propagation or cell-to-cell transfer in tobacco This includes both the case where the normal eIF4E2-T protein function (function as a translation initiation factor) is not performed, and the case where the normal eIF4E2-T protein function is performed in tobacco but no virus is available.
  • “Expression level of eIF4E2-T gene” refers to the amount of transcription of eIF4E2-T into mRNA (transcription level or amount of transcript) and the amount of translation into eIF4E2-T protein (translation level or amount of translation product). Either may be sufficient. Therefore, “expression of eIF4E2-T is suppressed” means that the transcription is suppressed compared to the wild type, the translation is suppressed compared to the wild type, and the wild type. In comparison, both transcription and translation are suppressed. Note that “transfer is suppressed” includes the case where the transcript is decomposed.
  • the mutation in the eIF4E2-T gene may be present in only one of the two chromosomes or in both. When both are present, the mutation in the eIF4E2-T gene may be homozygous or heterozygous, but is preferably homozygous.
  • One eIF4E2-T gene may have a plurality of mutations.
  • the virus-resistant tobacco according to the present invention has a mutation in the coding region, it has a mutation in the amino acid sequence of the eIF4E2-T protein. Mutations include substitutions, deletions and insertions.
  • the mutation is an amino acid substitution
  • the amino acid to be substituted and the amino acid after the substitution are not particularly limited as long as the eIF4E2-T protein is made non-functional with respect to the virus. For example, non-conservative substitution (non -conservative substitutions).
  • Non-conservative substitutions include substitution of an amino acid with another amino acid with a different charge or hydrophobicity (such as substitution of a basic amino acid with an acidic amino acid, or substitution of a polar amino acid with a nonpolar amino acid), and certain amino acids Is substituted with another amino acid having a different side chain.
  • the coding region may be a frameshift mutation or a nonsense mutation (mutation that becomes a stop codon).
  • nonsense-mediated mRNA decay reference: Brogna and Wen 2009, Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113 may occur, and the transcript may be degraded.
  • the position of the nonsense mutation is preferably in the first exon, the second exon, and / or the third exon, and more preferably in the first exon and / or the second exon.
  • the position of the mutation is preferably on the 5 'end side rather than about the 5' end half of the gene.
  • the virus-resistant tobacco according to the present invention has a mutation in the non-coding region, it does not affect the amino acid sequence of the encoded eIF4E2-T protein, but changes the secondary structure of DNA or mRNA.
  • the binding site for the translation machinery can be altered, or the tRNA binding efficiency can be reduced. Thereby, the transcription level can be reduced or the translation level can be reduced.
  • the amount of the transcript of the eIF4E2-T gene is preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and even more preferably 5% or less compared to the wild type. It is.
  • the amount of the translation product of the eIF4E2-T gene is preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and even more preferably 5% compared to the wild type. % Or less.
  • RNA splicing may not function normally due to mutations in the eIF4E2-T gene.
  • 10 bases before and after GT at the 5 ′ end side of the intron preferably 5 bases, more preferably 1 base, or 10 bases before and after the AG at the 3 ′ end side of the intron, preferably 5 bases, more preferably If there is a mutation at one base, intron excision is not successful and abnormal mRNA is generated to produce non-functional eIF4E2-T protein for the virus, or translation of the eIF4E2-T gene Can be suppressed.
  • the method for causing mutation in the eIF4E2-T gene is not particularly limited, and a known method can be used.
  • mutagen for example, chemical agents such as ethyl methanesulfonic acid (EMS), sodium azide, ethidium bromide, and nitrous acid can be used.
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • any chemical agent that causes mutation in tobacco genomic DNA can be used. It is not limited to these.
  • mutagens include ⁇ -rays, heavy ion beams, X-rays, neutron beams, and UV, but are not limited to these as long as they cause radiation in tobacco genomic DNA.
  • EMS is preferred as the mutagen.
  • tissue or organ of tobacco to be treated with mutagen examples include seeds, roots, leaves, flowers and the like, and the type is not particularly limited as long as the plant body can be regenerated, but seeds are preferable.
  • the dose of mutagenic chemicals or radiation is determined empirically for each type of plant tissue so that a mutation frequency is obtained that is below the threshold level leading to lethality or reproductive sterility. Is done.
  • transposons mobile genetic factors
  • the transposon can translocate on the tobacco genome and suppress the function of the eIF4E2-T gene.
  • a preferred example of such a transposon is tobacco retrotransposon tnt1.
  • transposons of other plants can be introduced into tobacco for use. Examples of such transposons include, but are not limited to, corn transposon Ac / Ds, Spm / dSpm, and Mu, rice transposon nDart, and snapdragon transposon tam.
  • a tobacco mutant population (panel) obtained by treating tobacco with a mutagen as described above and causing mutations in the entire tobacco genome is obtained.
  • the gene-specific primer is used to amplify the eIF4E2-T gene from each of the panel genomic DNAs or from a pool of them, determine the base sequence of the product, and select a strain-containing strain.
  • the type of mutation is preferably a mutation involving an amino acid mutation or a nonsense mutation, and more preferably a nonsense mutation.
  • DNA is extracted from a plant grown by seeding the selected line, and an individual having a homozygous mutation in the eIF4E2-T gene is selected.
  • the thus obtained strain having a homozygous mutation in the eIF4E2-T gene is subjected to virus assay to confirm resistance.
  • expression analysis of the eIF4E2-T gene may be performed using quantitative PCR or the like to confirm that the transcription amount has been reduced.
  • a step of creating a tobacco mutant population (panel) in which mutations have occurred in the entire tobacco genome a step of extracting genomic DNA, and a determination of the base sequence of the eIF4E2-T gene
  • a step of selecting a strain containing a homozygous mutation, and a step of confirming resistance by performing a virus assay may be included.
  • the mutation-treated line may be crossed with a line not subjected to mutation treatment at any timing.
  • Extraction of genomic DNA from tobacco mutants may be performed based on a known method, and a commercially available extraction kit may be used.
  • the genomic DNA may be a crude product or a purified product that has undergone several purification steps.
  • the amplification of the polynucleotide can be performed, for example, by PCR, but may be performed by other known gene amplification methods, for example, LCR (ligase chain reaction) method or LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method.
  • LCR ligase chain reaction
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • the primer sequence for amplifying each polynucleotide can be designed from the base sequence of SEQ ID NO: 3, for example. From the homology analysis result between the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the genomic sequence of eIF4E2-S, a T-type specific region is found. By designing a primer in that region, a T-type gene can be specifically amplified from a tobacco genome in which S-type and T-type are mixed.
  • the site to be designed can be selected from a T-type specific region, for example, a region including an exon and an exon / intron boundary region. It can also be an intron, 5 'untranslated region or 3' untranslated region.
  • the length of the primer is preferably 15 to 30 bases, particularly preferably 17 to 27 bases.
  • the primer sequence may be designed based on a region specific to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. Moreover, as long as it can function as a primer for amplifying a sequence having a predetermined number of bases including a mutation site, the sequence may contain one or more substitutions, deletions, and / or additions. In addition, the primer may be labeled with a fluorescent substance or a radioactive substance as necessary.
  • each polynucleotide to be amplified is not particularly limited as long as various detection methods described below can be used.
  • the length is 20 bases to 5000 bases, more preferably 50 bases to 2000 bases, and still more preferably 100 bases.
  • the mutation By confirming the base sequence of the amplified (PCR) product from the tobacco mutant in which the mutation is detected by the above method, using eIF4E2-T gene-specific primer, the mutation can be homozygous or heterozygous. It can be determined whether the mutation occurs.
  • codons that become stop codons when mutated by EMS treatment are CAA (first C is replaced with T), CGA (first C is replaced with T), and TGG (two There are four types: eye G, or third G is replaced with A), and CAG (first C is replaced with T).
  • the mutation is one or more mutations shown in the above (1) to (23) of the eIF4E2-T gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in genomic DNA.
  • a case where mutation occurs in any of (1) to (20) is preferable.
  • the mutation is (a) an exon of a wild-type eIF4E2-T gene encoding a functional eIF4E2-T protein having a sequence identity of 88% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (b) a sequence In the exon of the wild-type eIF4E2-T gene encoding mRNA that has 94% or more sequence identity with the base sequence shown in No.
  • the gene editing technique is a technique for introducing a mutation into an arbitrary region of the genome.
  • examples of such techniques include TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat) / CAS, ODM (Oligonucleotide Directed Mutagenesis), and ZFN (Zinc Finger Nuclease).
  • ODM and ZFN are described in the document: Lusser et al. (2012) Nature Biotechnology 30: 231-239.
  • ZFN application to plants is described in the literature: Duraiuraet al. (2005) Nucleic Acids Res 33: 5978-5990. According to these methods, mutations can be introduced into the eIF4E2-T gene.
  • TALEN is as follows.
  • the DNA-binding protein Transcription activator-like effector (TALE) derived from a plant pathogen has a structural portion in which 34 amino acids are repeated, and each of these repeating structures recognizes one base of DNA.
  • TALE Transcription activator-like effector
  • a product obtained by fusing this TAL effector with an enzyme FokI that exhibits DNA cleavage activity when dimerized is called TAL effector nuclease (TALEN).
  • TALEN When this TALEN is designed to bind in the vicinity of two, FokI forms a dimer and cleaves the DNA between the two TALENs. After the cleavage occurs, the DNA is repaired. At this time, the cleavage site may be slightly scraped or newly added. TALEN has been shown to function in plants (reference: Zhang et al. (2013) Plant Physiology 161: 20-27).
  • nucleotide sequence preferably 15 to 25 bases, more preferably 18 to 22 bases, which is specific to eIF4E2-T in the protein coding region.
  • a nucleotide sequence is similarly designed at a location 9 to 15 bases away from there. The part sandwiched between these two nucleotides will be cleaved later.
  • the designed nucleotide sequence is homologous to a known sequence database such as tobacco (N.Ntabacum) or N. sylvestris or N. tomentosiformis By performing sex search, it may be examined whether there is a region having high homology including the sequence in addition to the sequence itself.
  • sequence database for example, GenBank, EMBL (The European Molecular Biology Loboratory), DDBJ (DNA Data Bank of Japan) or the like can be used.
  • BLAST a sequence analysis algorithm
  • database sequences include, but are not limited to, Nucleotide Collection (nr / nt), Expressed Sequence Tags (EST), Genomic Survey Sequences (GSS), Whole Genome Shotgun Contigs (WGS), and the like.
  • TALE Design TALE gene sequence based on the designed specific nucleotide sequence.
  • GoldenGateTALEN Kit Additional nucleotide sequence
  • an appropriate linker sequence may be arranged.
  • the FokI sequence is listed in a known database.
  • the promoter for expressing the TALE / FokI fusion gene in tobacco is preferably a highly expressed promoter, and a constitutive expression promoter such as a cauliflower mosaic virus 35S35RNA gene promoter, an actin gene promoter, and a ubiquitin gene promoter; Rubisco small subunit Examples include, but are not limited to, promoters of genes, green tissue specific promoters such as the PPDK gene promoter; and other organ or time specific promoters.
  • a desired intron may be placed between the promoter and TALE / FokI.
  • the TALE / FokI codon may be optimized as a plant (tobacco) codon. Plant codons are described in known databases such as Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/).
  • a vector for introducing a TALEN expression cassette into a plant may incorporate an expression cassette of a drug resistance gene (selection marker) for selecting a plant cell into which the expression cassette has been introduced.
  • the drug resistance gene may be any drug resistance gene capable of selecting tobacco cells.
  • a kanamycin resistance gene neomycin phosphotransferase: NPT-II
  • hygromycin resistance gene hygromycin phosphotransferase: HPT
  • a promoter will not be specifically limited if it expresses constitutively.
  • a right border (RB) sequence and a left border (LB) sequence are arranged at both ends of the T-DNA as T-DNA border sequences.
  • Examples of vectors for introducing a TALEN expression cassette into a plant and capable of introducing a gene into tobacco include pBI and pSB (reference: Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 15- 41.), pLC system (literature: U.S. Pat. No. 8,298,819), and pGreen (literature: Hellens et al. 2000. Plant Mol. Biol. 42: 819-832.) And the like.
  • the method for introducing the TALEN expression cassette into the plant is not particularly limited, and is usually used by those skilled in the art, such as the method using Agrobacterium, the particle gun method, the PEG method, the electroporation method, or the Agroinfiltration method. What is necessary is just to use the method to do.
  • the type of tobacco tissue or organ to be introduced is not particularly limited as long as the plant body can be regenerated, and examples thereof include seeds, roots, leaves, and flowers.
  • the drug used for selection include, but are not limited to, kanamycin and hygromycin.
  • the concentration of the drug can be, for example, 20 mg / mL to 200 mg / mL, and preferably 50 mg / mL to 100 mg / mL.
  • a culture medium for growing plant cultures may be a commonly used medium, and examples of inorganic salts include MS and LS.
  • sucrose, agar, or plant hormones are added thereto. These use concentrations may be in accordance with protocols usually used by those skilled in the art.
  • protoplasts can be used as tissues or organs for gene transfer.
  • Protoplasts can be prepared according to conventional methods using cell wall degrading enzymes.
  • a transient method can also be used as a gene introduction method.
  • the transient assay may be performed using a conventional method such as an electroporation method or a PEG method.
  • Other transient assay methods include Agro-infiltration and viral vectors.
  • ALSV Apple Latent Spherical Virus
  • TRV tobacco Rattle Virus
  • the method for analyzing gene expression is not particularly limited, and may be performed by a known method such as Northern hybridization or quantitative PCR.
  • the probe used for the hybridization can be the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof, or a base sequence having one or more base substitutions, deletions or insertions therein. It can be 20 bases to the full length of the sequence.
  • RNA for the above expression analysis may be performed by a known method such as guanidine hydrochloride method or SDS-phenol method, or a commercially available kit may be used. Further, mRNA (polyA + RNA) may be further purified from the total RNA.
  • Synthesis of cDNA for performing quantitative PCR can be performed by a known method using reverse transcriptase and oligo dT primer or gene-specific primer, and a commercially available kit may be used.
  • primers for quantitative PCR can be designed based on SEQ ID NO: 1.
  • the length of the primer is preferably 15 to 30 bases, particularly preferably 17 to 25 bases.
  • the length of the amplification sequence targeted by one set of primer sets is not particularly limited, and can be, for example, 40 bases to the entire sequence length, and preferably 50 bases to 500 bases.
  • a probe sequence is set in the target sequence in addition to the above primers.
  • the length of the target sequence is preferably 40 bases to 200 bases, more preferably 50 bases to 150 bases.
  • Reporter dyes for labeling primers and probes include FAM, HEX, TET, and Cyanine5, and quencher dyes include TAMRA, BHQ1, and the like. be able to.
  • the gene used as an internal standard for quantitative PCR is not particularly limited as long as it is a constitutively expressed gene, and preferred genes include an elongation factor gene and an actin gene.
  • the CRISPR / CAS is as follows.
  • the CRISPR / CAS system is a gene editing technique using a guide RNA that recognizes a DNA sequence and a CAS nuclease, and is known to function in plants (Reference: Belhaj et al. (2013) Plant Methods 9). : 39).
  • This technique is a technique for cleaving DNA having a desired sequence on the genome, and for the deletion, addition and insertion of the target genome sequence, as with TALEN, it relies on mistakes in the host DNA repair system. .
  • a promoter for expressing CAS9 in a plant those that are highly expressed are preferable, and examples thereof include, but are not limited to, the above-described 35S RNA promoter, ubiquitin gene promoter, and PPDK gene promoter.
  • a desired intron may be disposed between the promoter and CAS9.
  • the base sequence of CAS9 is known.
  • the codon of CAS9 may be optimized to the codon of plant (tobacco). Further, a nuclear localization signal NLS (Nuclear localize Signal) may be added to CAS9.
  • RNA Design the desired genomic sequence and complementary guide RNA.
  • SEQ ID NO: 3 preferably a nucleotide sequence of preferably 19 to 22 bases, which is specific to eIF4E2-T, is preferably determined in the protein coding region.
  • PAM protospacer-adjacent motif
  • the designed sequence is searched for homology with, for example, a sequence database of tobacco (Nicotiana tabacum) or Nicotiana tomentosiformis. Whether or not there is a highly homologous region including the sequence can be examined.
  • sequence database and analysis algorithm are the same as described above.
  • the sgRNA scaffold sequence is fused to the 3 ′ end side to form sgRNA (guide (g) RNA + gRNA scaffold), and a construct for expressing this sgRNA is prepared.
  • a promoter such as RNA polymerase III U6 or U3 can be used as the promoter.
  • the completed construct is introduced into tobacco using an appropriate vector, and the recombinant is selected and regenerated.
  • a plurality of guide RNAs can be designed inside eIF4E2-T, and a construct expressing them can be simultaneously introduced into tobacco.
  • a plurality of guide RNA expression cassettes and CAS9 expression cassettes may be simultaneously arranged on one T-DNA.
  • protoplasts can be used as a tissue or organ for gene transfer.
  • Protoplasts can be prepared according to conventional methods using cell wall degrading enzymes.
  • a transient method can be used in addition to the above-described stable transformation method. The transient assay is the same as described in TALEN above.
  • Whether or not a mutation has occurred in the eIF4E2-T gene in an individual regenerated from a cell into which a gene has been introduced, or in a tissue or organ, can be confirmed by the same method as described in TALEN above.
  • virus assay method examples include, but are not limited to, a mechanical inoculation method in which a virus solution and a solid powder such as carborundum are combined, and an insect inoculation method using aphids in which a virus is preserved.
  • virus to be used is not particularly limited, and the viruses listed above can be used as viruses that are resistant to virus-resistant tobacco.
  • Another aspect of the virus-resistant tobacco according to the present invention is a virus-resistant tobacco in which the expression level of the eIF4E2-T gene is low compared to the wild type.
  • the expression level of the eIF4E2-T gene in tobacco whose expression is suppressed is preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and even more preferably 5% or less, when the wild-type expression level is 100%.
  • wild type refers to tobacco in which a factor that suppresses the expression of the eIF4E2-T gene has not been introduced and the eIF4E2-T gene has no mutation.
  • virus-resistant tobacco For producing such virus-resistant tobacco, conventionally known methods can be used, for example, antisense, cosuppression, RNA interference (RNAi), microRNA, VIGS, ribozyme, homologous recombination, and dominant negative gene.
  • RNAi RNA interference
  • microRNA microRNA
  • VIGS VIGS
  • ribozyme homologous recombination
  • dominant negative gene A method using expression of the product and the like can be mentioned.
  • a factor that reduces the expression level of the eIF4E2-T gene as compared to the wild type preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and even more preferably 5% or less is introduced into tobacco. It can be created by doing.
  • the “virus resistant tobacco” includes not only the tobacco of the present generation into which the above-described factors are introduced, but also the descendants (progenies) of the tobacco.
  • RNAi is preferable as a method for suppressing the expression of eIF4E2-T.
  • an RNAi construct using a base sequence of the eIF4E2-T gene for example, SEQ ID NO: 1 or a sequence in which the base U of SEQ ID NO: 1 is T
  • a part thereof as a trigger is prepared in a plant. It is fused to the promoter to be expressed and introduced into tobacco using a vector. Then, an RNAi construct is expressed to obtain a virus resistant tobacco in which expression of the eIF4E2-T gene is suppressed. Accordingly, the virus resistant tobacco in one embodiment can retain an RNAi construct for suppressing expression of the eIF4E2-T gene.
  • the length of the trigger can be, for example, 21 bases to the entire sequence length, but is preferably 50 bases or more, more preferably 100 bases or more.
  • the trigger sequence may have one or more base substitutions, deletions or insertions.
  • RNAi an RNAi construct in which the trigger sequence is inverted is produced by functionally linking one trigger sequence in the sense direction and the other in the antisense direction.
  • a spacer sequence is preferably a sequence not included in the tobacco genome or a region not included in the mature mRNA such as an intron sequence. Examples of such sequences include, but are not limited to, intron sequences such as ⁇ -glucuronidase (GUS) gene and pyruvate dehydrogenase kinase (pdk) and catalase (cat) genes.
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • pdk pyruvate dehydrogenase kinase
  • cat catalase
  • promoters for transcription of RNAi constructs in plants include constitutive expression promoters such as cauliflower mosaic virus 35S RNA gene promoter, actin gene promoter, and ubiquitin gene promoter; Rubisco small subunit gene promoter, And green tissue-specific promoters such as and the PPDK gene promoter; and other organ or time-specific promoters.
  • the promoter is preferably a promoter expressed in a virus-infected tissue.
  • examples of the terminator include a cauliflower mosaic virus 35S RNA or 19S RNA gene terminator, a nopaline synthase gene terminator, and the like, but are not limited to these as long as they function in plants.
  • a vector for introducing an RNAi expression cassette into a plant may incorporate a drug resistance gene expression cassette for selecting plant cells into which the expression cassette has been introduced.
  • the drug resistance gene may be any drug resistance gene capable of selecting tobacco cells.
  • a kanamycin resistance gene neomycin phosphotransferase: NPT-II
  • hygromycin resistance gene hygromycin phosphotransferase: HPT
  • the promoter is not particularly limited as long as it also expresses constitutively.
  • RNAi expression cassette and the selection marker expression cassette must be present in T-DNA.
  • a right border (RB) sequence and a left border (LB) sequence are arranged at both ends of the T-DNA as T-DNA border sequences.
  • an expression cassette for fluorescent protein may be placed in T-DNA.
  • the fluorescent protein include, but are not limited to, green fluorescent protein (GFP) and yellow fluorescent protein (YFP).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • a preferred fluorescent protein is GFP.
  • the fluorescence can be observed with an image analyzer.
  • Examples of vectors for introducing RNAi expression cassettes into plants and capable of introducing genes into tobacco include pBI and pSB systems (reference: Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 15- 41.), pLC system (literature: US Pat. No. 8,298,819), pGreen (literature: Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.), PHellsgate (literature: Wesley et al. 2001 Plant) J 27: 581-590.) And pSP231 (Document: International Publication No. 2011/102394), but not limited thereto.
  • the method for introducing an RNAi expression cassette into a plant is not particularly limited, and is usually used by those skilled in the art, such as the method using Agrobacterium described above, the particle gun method, the PEG method, the electroporation method, or the agroinfiltration method.
  • the method to be used may be used.
  • the type of tobacco tissue or organ to be introduced is not particularly limited as long as the plant body can be regenerated, and examples thereof include seeds, roots, leaves, and flowers.
  • the drug used for selection include, but are not limited to, kanamycin and hygromycin.
  • the concentration of the drug can be, for example, 20 mg / mL to 200 mg / mL, and preferably 50 mg / mL to 100 mg / mL.
  • a culture medium for growing plant cultures may be a commonly used medium, and examples of inorganic salts include MS and LS.
  • sucrose, agar, or plant hormones are added thereto. These use concentrations may be in accordance with protocols usually used by those skilled in the art.
  • the method for analyzing gene expression and the virus assay method are as described above.
  • the present invention also provides a method of conferring virus resistance to tobacco.
  • viral resistance is introduced into tobacco by producing a non-functional eIF4E2-T protein against the virus or introducing a mutation into the eIF4E2-T gene that suppresses expression of the eIF4E2-T gene. Gives sex.
  • a mutation into the eIF4E2-T gene that suppresses expression of the eIF4E2-T gene Gives sex.
  • the expression level of the eIF4E2-T gene is reduced to a factor lower than that of the wild type, preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and even more preferably 5% or less.
  • a factor that imparts viral resistance to tobacco For the method of introducing such factors, see [1. Virus resistant tobacco and its production method] column.
  • the present invention also provides a method for producing progeny of virus resistant tobacco breeding.
  • self-pollination or cross-pollination is performed on the virus-resistant tobacco produced by the above-described virus-resistant tobacco production method or its progeny.
  • pollination may be performed in a natural state or artificially.
  • the progeny is self-pollination or cross-pollination of the current virus-resistant tobacco produced in the above-described method for producing virus-resistant tobacco, or further repeated self-pollination from the progeny thus obtained. Or it can be obtained by cross-pollination.
  • the above-mentioned virus-resistant tobacco or progeny may be multiplied by virus-resistant tobacco having the same mutation in the eIF4E2-T gene, or different mutations in the eIF4E2-T gene. It may be a virus-resistant tobacco that has or may not have a mutation in the eIF4E2-T gene, or it has a mutation in the eIF4E2-T gene. There may be no cigarettes.
  • a hybrid generation F 1 , F 2 ,...), A mutant self-generation (M 1 , M 2 ,%), Backcross (BC 1 , BC 2 ,... ⁇ )
  • Tobacco of breeding generations such as generations can be obtained.
  • These tobaccos may have male sterility (MS) traits.
  • the present invention also provides a virus-resistant tobacco breeding method in which the virus-resistant tobacco produced in the above-described virus-resistant tobacco production method or a progeny thereof is self-pollinated or cross-pollinated.
  • a virus-resistant tobacco individual having a mutation in the eIF4E2-T gene produced in the above-described method for producing a virus-resistant tobacco was obtained. after, it crossed with tobacco variety or tobacco line to produce the F1 hybrid F 1.
  • the breed or line is further backcrossed to produce BC 1 F 1 .
  • selecting an individual having the mutation crossing (backcrossing) with the breed or line is further repeated to produce BC X F 1 (X is 3 to 8, for example).
  • BC X F 1 is self-bred, and in the BC X F 2 generation, individuals having the mutation are selected, and further self-breeding is repeated in order to fix the genetic background (BC X F 3 , BC X F 4, ⁇ ), is breeding a new virus-resistant tobacco.
  • BC X F 4 ⁇
  • a DNA marker can be developed using a mutation generated on the tobacco eIF4E2-T gene, and can be used for marker breeding.
  • a “DNA marker” is a tool for detecting a difference (mutation or polymorphism) in DNA base sequence between varieties or individuals, or a difference between them, and a base serving as a mark for identifying a variety or individual Refers to a sequence difference (mutation or polymorphism) or a tool for detecting the difference.
  • a marker that can be used to identify the causative mutation can be designed on the eIF4E2-T gene. Since the relationship between the mutation and virus resistance is not broken by genetic separation, precise marker breeding is possible. If the presence or absence of this mutation is detected, it is not necessary to confirm the virus resistance once at a time when the mating is repeated.
  • Extraction of genomic DNA from tobacco may be based on a conventional method, and a commercially available extraction kit may be used, but is not particularly limited.
  • the genomic DNA may be a crude product or a purified product that has undergone several purification steps.
  • a technique for detecting the presence or absence of a mutation for example, a technique that applies hybridization of a nucleic acid (also referred to as “polynucleotide”) using RFLP or single-stranded DNA as a probe, and amplification of a polynucleotide such as PCR, etc.
  • PCR amplification of a polynucleotide
  • the polynucleotide can be amplified by, for example, the PCR method, but may be performed by other known gene amplification methods, for example, the LCR method, the SDA (Strand Displacement Amplification) method, the LAMP method, or the like.
  • the length of each polynucleotide to be amplified is not particularly limited as long as various detection methods described below can be used.
  • the length is preferably 40 bases to 5000 bases, and preferably 100 bases to 1000 bases. Is more preferably 100 bases to 700 bases, and even more preferably 100 bases to 500 bases.
  • the primer sequence for amplifying each polynucleotide is preferably designed so as to sandwich or include the mutation site, but the position for designing the primer sequence is not particularly limited.
  • a primer sequence so as to sandwich a mutation site for example, it may be designed to be located within the eIF4E2-T gene.
  • the length of the primer is preferably 15 to 30 bases, particularly preferably 17 to 25 bases.
  • the sequence may contain one or more substitutions, deletions, and / or additions.
  • the primer may be labeled with a fluorescent substance or a radioactive substance as necessary.
  • the detected mutation is a mutation that causes production of non-functional eIF4E2-T protein against the virus or suppresses expression of the eIF4E2-T gene. Specific examples are given in [1. Virus resistant tobacco and its production method] column.
  • a method for determining the presence or absence of cleavage after treatment with a restriction enzyme that specifically recognizes the sequence at the mutation site (sequence before mutation or sequence after mutation) on the amplified polynucleotide. Polymorphic (Sequence) method).
  • a dCAPS (derived CAPS) method in which a restriction enzyme recognition site is prepared by a primer set including an intentionally designed mismatch primer may be used.
  • a person skilled in the art can detect a desired mutation without designing a primer sequence by designing a primer sequence and performing PCR.
  • primer sequences can be designed via the web (reference: Neff et al. (2002) Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. TRENDS in Genetics 18: 613-615).
  • a mismatch primer is used in the dCAPS method, a DNA polymerase having no proofreading activity is preferable.
  • a DNA polymerase includes TaKaRa Taq TM (Takara Bio Inc.).
  • the analysis method is not particularly limited, and for example, PCR using the TaqMan (registered trademark) probe method, MassARRAY (registered trademark) analysis, which is a measurement technique using TOF-MS, or the like can be used.
  • a primer sequence is designed by partially including the sequence of the mutation site (pre-mutation sequence and / or post-mutation sequence), and amplified by the PCR method, etc. Detection method (allyl-specific PCR method).
  • a nucleic acid primer having a base sequence specific to the base sequence before mutation can be used.
  • the position is preferably at the end or between several bases from the end. Even when a target mutation is introduced near the 3 'end of the primer, a wild-type sequence without mutation may be amplified in addition to the mutant-type sequence. In such a case, it is possible to introduce a mismatch other than the target mismatch at the same position of the mutant detection primer and the wild type detection primer, perform PCR, and obtain a mutant type or wild type specific amplification. Good.
  • a primer for the gene that is an internal standard for PCR may be added to the PCR reaction solution.
  • JPO website ⁇ http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0025.html >.
  • gene mutation detection and analysis methods are described in detail in the following document: JPO website ⁇ http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0028 .html>.
  • literature Agarwal et al. (2008) Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep. 27: 617-631., Neff et al. (1998) dCAPS, a simple technique for the gen ofsingle nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14: 387-392.
  • the present invention provides a polynucleotide for detecting a mutation in the eIF4E2-T gene.
  • the mutation is a mutation that produces a non-functional eIF4E2-T protein against the virus or suppresses the expression of the eIF4E2-T gene. Specific examples are given in [1. Virus resistant tobacco and its production method] column.
  • one form of the detection polynucleotide is a nucleic acid primer or a set of nucleic acid primers.
  • the set of nucleic acid primers may be a set of nucleic acid primers sandwiching the mutation, or a set of nucleic acid primers including a polynucleotide comprising a continuous base sequence containing the mutation or a complementary sequence thereof.
  • Another form of the detection polynucleotide is a nucleic acid probe that hybridizes to a continuous base sequence containing the mutation or a complementary sequence thereof.
  • the present invention also provides a method for determining the resistance of tobacco to viruses, characterized in that the occurrence of the mutation in the eIF4E2-T gene in tobacco genomic DNA is used as an indicator of virus resistance. .
  • the present invention also provides a kit for determining the resistance of tobacco to viruses, comprising a set of nucleic acid primers for detecting the mutation in the eIF4E2-T gene.
  • the present invention also provides a kit for determining a resistance to tobacco, which comprises a probe that hybridizes to a continuous base sequence containing the above mutation in the eIF4E2-T gene or a complementary sequence thereof.
  • the present invention also provides a method for breeding virus-resistant tobacco, comprising a selection step of selecting tobacco resistant to viruses using the determination method.
  • the present invention also provides an inspection step for examining the presence or absence of the mutation in genomic DNA using the detection polynucleotide in tobacco, and selecting the tobacco in which the mutation is detected in the inspection step as a virus-resistant tobacco.
  • the present invention also provides a DNA marker for determining the resistance of tobacco to viruses, comprising a polynucleotide comprising a continuous base sequence containing the mutation in the eIF4E2-T gene or a complementary sequence thereof.
  • Leaf tobacco produced by cultivating the virus-resistant tobacco of the present invention does not suffer from diseases caused by the virus (for example, PVY strains that break the virus resistance of Virgin A mutant). Therefore, especially when cultivated in an environment where the disease occurs, quality deterioration is reduced and high quality compared with leaf tobacco produced by cultivating tobacco that is not virus resistant. As a result, higher quality tobacco products can be produced.
  • diseases caused by the virus for example, PVY strains that break the virus resistance of Virgin A mutant. Therefore, especially when cultivated in an environment where the disease occurs, quality deterioration is reduced and high quality compared with leaf tobacco produced by cultivating tobacco that is not virus resistant. As a result, higher quality tobacco products can be produced.
  • Leaf tobacco refers to raw tobacco leaves that have been harvested and dried and used as a raw material for the manufacture of tobacco products.
  • tobacco products refers to cigarettes (with and without filters) (CIGARETTE), cigars (CIGAR), cigarillos (CIGARILLO), snus (SNUS), snuff (SNUFF), chewing tobacco, electronic cigarettes, etc. .
  • the present invention provides leaf tobacco produced from the above virus-resistant tobacco.
  • the present invention also provides a method for producing leaf tobacco comprising a step of drying fresh leaves after harvesting the virus-resistant tobacco.
  • the present invention also provides a tobacco product containing the above leaf tobacco as a raw material.
  • one embodiment of the virus-resistant tobacco according to the present invention has a mutation in the translation initiation factor eIF4E2-T gene, thereby producing a non-functional eIF4E2-T protein against the virus. Or the expression of the eIF4E2-T gene is suppressed.
  • the mutation is preferably a nonsense mutation.
  • the mutation is (a) an exon of a wild-type eIF4E2-T gene encoding an eIF4E2-T protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, (b) a sequence An exon of a wild-type eIF4E2-T gene encoding a functional eIF4E2-T protein having a sequence identity of 88% or more with the amino acid sequence shown in No. 2, and (c) an mRNA comprising the base sequence shown in SEQ ID No. 1.
  • the mutation is one or more mutations shown in the following (1) to (23) of the eIF4E2-T gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in genomic DNA.
  • Another aspect of the virus-resistant tobacco according to the present invention is characterized in that the expression level of the translation initiation factor eIF4E2-T gene is small compared to the wild type.
  • the virus is preferably a virus belonging to the genus Potyvirus.
  • the virus belonging to the genus Potyvirus is Potato virus Y.
  • the virus belonging to the genus Potyvirus is one line of Potato virus Y, which breaks the virus resistance of tobacco Virgin A mutant.
  • a mutation that produces a non-functional translation initiation factor eIF4E2-T protein or suppresses expression of the eIF4E2-T gene is used. It is characterized by producing tobacco having resistance to viruses by introduction into genes.
  • the mutation is preferably a nonsense mutation.
  • the mutation is caused by ethylmethanesulfonic acid.
  • the mutation is (a) an exon of a wild-type eIF4E2-T gene encoding an eIF4E2-T protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, ) An exon of a wild-type eIF4E2-T gene encoding a functional eIF4E2-T protein having a sequence identity of 88% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and (c) consisting of a base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the mutation is one or more of the eIF4E2-T gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in genomic DNA shown in the following (1) to (23): (1) 1913th G is replaced with A, (2) 1914th G is replaced with A, (3) 1922th G is replaced with A, (4) 1923th G G is replaced with A, (5) 1948th C is replaced with T, (6) 1958th G is replaced with A, (7) 1959th G is replaced with A, (8) 2009th G is (9) 2010th G replaced with A, (10) 4722th G replaced with A, (11) 4723rd G replaced with A, (12) 4755th G replaced with A Replacement, (13) 4756th G is replaced with A, (14) 479 G is replaced with A, (15) 4795th G is replaced with A, (16) 4936th C is replaced with T, (17) 4981st C is replaced with T, (18) 5009th G is replaced with A, (19) 5010th
  • Another aspect of the method for producing a virus-resistant tobacco according to the present invention is to provide resistance to a virus by introducing a factor that reduces the expression level of the translation initiation factor eIF4E2-T gene compared to the wild type. It is characterized by producing cigarettes having.
  • the virus is preferably a virus belonging to the genus Potyvirus.
  • the virus belonging to the genus Potyvirus is more preferably Potato virus Y.
  • the virus belonging to the genus Potyvirus is a line of Potato virus Y, which breaks the virus resistance of tobacco Virgin A mutant.
  • the method for producing a progeny of virus-resistant tobacco according to the present invention is characterized by self-pollination or cross-pollination of the virus-resistant tobacco produced in the virus-resistant tobacco production method or its progeny.
  • One embodiment of the polynucleotide for detection according to the present invention is a polynucleotide for detecting a mutation in the tobacco translation initiation factor eIF4E2-T gene, which mutation is non-functional for viruses. It is characterized by being a mutation that produces a protein or suppresses the expression of the eIF4E2-T gene.
  • the mutation is preferably a nonsense mutation.
  • the mutation is (a) an exon of a wild-type eIF4E2-T gene encoding an eIF4E2-T protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and (b) a sequence.
  • the mutation is one or more mutations shown in the following (1) to (23) of the eIF4E2-T gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in genomic DNA.
  • the set of nucleic acid primers sandwiching the mutation or a set of nucleic acid primers including a polynucleotide comprising a continuous base sequence containing the mutation or a complementary sequence thereof. preferable.
  • One aspect of the method for selecting a virus-resistant tobacco according to the present invention is an inspection step in which the presence or absence of the mutation in genomic DNA is examined in tobacco using the detection polynucleotide, and the mutation is detected in the inspection step. And a selection step of selecting the resulting tobacco as a virus-resistant tobacco.
  • One embodiment of the DNA marker for determining the resistance of tobacco to the virus according to the present invention comprises a polynucleotide comprising a continuous base sequence containing a mutation in the translation initiation factor eIF4E2-T gene or a complementary sequence thereof, and the mutation Is characterized by producing a non-functional eIF4E2-T protein against the virus or a mutation that suppresses the expression of the eIF4E2-T gene.
  • One aspect of the leaf tobacco according to the present invention is the leaf tobacco of the virus-resistant tobacco.
  • One aspect of the tobacco product according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned leaf tobacco as a raw material.
  • GenBank database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
  • GenBank accession number KF155696 as a translation initiation factor for tobacco (Nicotiana tabacum)
  • mRNA base sequence of eIF4E whose accession number is KM202068 was obtained.
  • SEQ ID NO: 1 The nucleotide sequence of eIF4E2-T is shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the encoded protein is shown in SEQ ID NO: 2, and the genome sequence of the eIF4E2-T gene is shown in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 3 was obtained by performing a BLAST analysis on WGS of Nicotiana tabacum in the GenBank database using the sequence of KM2020068 as a query. Specifically, it is a part of accession number AWOJ01182781 (contig182781 which is a genomic DNA sequence derived from cultivar K326) (the 30001st to 38039th sequence among the complementary sequences of AWOJ01182781).
  • the identity between the exon sequence of this genomic sequence and the DNA sequence of the protein coding region of KM202068 was 99.2% (652 bases out of 657 bases matched). The difference of about 1% (5 bases out of 657 bases) was considered to be due to the difference between tobacco lines and varieties (KM202068 is line T021658 and AWOJ01182781 is cultivar K326).
  • the sequence identity of the DNA in the protein coding region of the eIF4E2-S gene and the eIF4E2-T gene was 93.2% (612 bases out of 657 bases matched).
  • the amino acid sequence identity was 87.7% (192 of 219 amino acids were identical), and the similarity was 97.3% (213 amino acids of 219 were identical or similar).
  • Nucleic acid / amino acid sequence analysis software GENETYX registered trademark
  • ver. 12 Genetics
  • the open reading frame consists of the 61st to 717th bases
  • the translation start codon is the 61st to 63rd base
  • the translation stop codon is the 715th to 717th base.
  • the translation start codon is the bases 1765 to 1767
  • the translation stop codon is the bases 7112 to 7114
  • the first exon is the bases 1705 to 2012
  • the second exon is the bases 4639 to 4804
  • Exon 3 is the 4915th to 5040th base
  • 4th exon is the 6927th to 6992th base
  • 5th exon is the 7064th to 7114th base.
  • FIG. 1 schematically shows the exon / intron structure of the eIF4E2-T gene.
  • the numbers described at the bottom indicate the number of candidate sites of nonsense mutations that can be caused by a G to A mutation or a C to T mutation caused by EMS treatment.
  • the number of bases that can become a stop codon due to the G to A mutation or the C to T mutation caused by EMS treatment and the number thereof are 9 in the first exon (of SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing).
  • Genomic DNA was extracted from individuals having mutations caused by EMS treatment, and the eIF4E2-T gene region was amplified by PCR using the above primers. By confirming the base sequence of the amplified product, an eIF4E2-T tobacco mutant in which a stop codon was generated in the first exon, the second exon or the third exon was selected.
  • a tobacco mutant panel produced by Nagima et al. (Reference: 2011 Annual Meeting of the Japanese Society for Plant Pathology, P226, Production of Tobacco Mutant Panel) was selected.
  • This panel shows that the seeds of the tobacco variety Tsukuba No. 1 (thousands) were subjected to EMS treatment as a mutagen treatment, and progeny progeny seeds (M2 bulk seeds) obtained for each individual grown (M1 generation) And a set of bulk DNA extracted from seedlings of 8 individuals of each line grown by sowing and growing these M2 seeds.
  • EMS treatment as a mutagen treatment
  • M2 bulk seeds progeny progeny seeds obtained for each individual grown
  • M1 generation a set of bulk DNA extracted from seedlings of 8 individuals of each line grown by sowing and growing these M2 seeds.
  • PCR was performed using the primers shown in Table 1.
  • DNA extraction was performed as follows. A tobacco leaf sample (1 cm ⁇ 1 cm) is placed in a 2 mL tube, and 400 ⁇ L of an extract (composition is 200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) and 200 ⁇ L Protein Precipitation Solution. (QIAGEN) was added, and then metal corn was added for crushing, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes. 300 ⁇ L of the supernatant was transferred to a new 1.5 mL tube, and 800 ⁇ L of 100% ethanol was added and mixed by inversion. After centrifugation at 15000 rpm for 10 minutes, the supernatant was completely removed.
  • composition is 200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) and 200 ⁇ L Protein Precipitation Solution. (QIAGEN) was added, and then metal corn was added for
  • TE Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA
  • PCR was performed in a 20 ⁇ L reaction system using 5 ng of tobacco genomic DNA as a template.
  • the enzyme used was Tks Gflex TM DNA Polymerase (Takara Bio Inc.). The reaction was carried out 35 times after 1 minute at 94 ° C. with a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds and 68 ° C. for 70 seconds.
  • 5 individuals with eIF4E2-T1 and 6 individuals with eIF4E2-T2 were obtained that were homozygous for the target mutation.
  • a dCAPS marker was developed as a DNA marker for detecting the polymorphism of the eIF4E2-T gene.
  • the polymorphism can be discriminated by detecting the difference in fragment length after the restriction enzyme treatment. This can be determined by the CAPS marker, PCR-RFLP marker. Call it.
  • a dCAPS marker was prepared by introducing a double-base mutation so that it was cut with the restriction enzyme in the wild type but not with the mutant type. In this case, the difference in fragment length is detected as a difference corresponding to the length of the primer.
  • the prepared primers are shown in Table 2.
  • next base of ggC at the 3 ′ end is C in the wild-type template DNA and Hae III site (GGCC), but is T in the template DNA of eIF4E2-T1, and is a restriction site. It will not be.
  • the next base of ggC at the 3 ′ end is C in the wild type template DNA and HaeHIII site (GGCC), but is T in the template DNA of eIF4E2-T2, which is a restriction. It doesn't become a site.
  • telomere mismatch When a mismatch is introduced near the 3 ′ end of the primer, if PCR is performed using a DNA polymerase having a proofreading activity, the primer mismatch may be corrected and may not be cleaved by a restriction enzyme. On the other hand, when PCR was carried out using genomic DNA as a template using TaKaRa Taq TM (Takara Bio) having no proofreading activity, sufficient amplification could not be obtained.
  • primer concentrations were prepared so that 0.5 [mu] M, the buffer used was attached to the enzyme.
  • PCR was performed at 94 ° C. for 2 minutes once, 94 ° C. for 30 seconds, 52 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds for 40 cycles and 72 ° C. for 90 seconds once.
  • eIF4E2-T1, eIF4E2-T2 together were treated 2 nd PCR product with Hae III (Takara Bio Inc.).
  • the genotype of the sample in which no cleavage is observed can be determined to be t 1 t 1 (having a mutation generated in exon 2 homozygously), and eIF (iso)
  • the genotype of the sample in which no cleavage was observed could be determined to be t 2 t 2 (having a mutation that occurred in exon 1).
  • the genotype of a sample that does not cleave with the eIF4E2-T1 primer or eIF4E2-T2 primer is tt
  • the genotype of the sample that cleaves with the eIF4E2-T1 primer and the eIF4E2-T2 primer is TT
  • eIF4E2- It was possible to easily determine that the genotype of the sample in which the cleavage occurred or not occurred with the T1 primer or eIF4E2-T2 primer was Tt. Therefore, it was shown that the present dCAPS marker can be used to identify the genotype of an individual having a mutation in the tobacco eIF4E2-T gene.
  • amplification reaction was performed using TaqMan Fast Advanced Master mix (Life technologies). The reaction conditions were 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C.
  • StepOne Software v2.2 (Life technologies) was used.
  • the elongation factor1-alpha (EF1- ⁇ ) gene was used as an internal standard for PCR, and the relative gene expression level of the target gene was calculated by comparison with the expression level of this gene.
  • Tsukuba No. 1 was used as a control.
  • FIG. 3 shows the relative expression level when the expression level of the eIF4E2-T gene is 1 when the average value of the transcripts of Tsukuba No. 1 (WT) is 1.
  • the horizontal axis shows each mutant.
  • shaft shows the relative value of the transcript amount in each variant.
  • the amount of eIF4E2-T1 and eIF4E2-T2 mutant tobacco transcripts of the eIF4E2-T gene is much lower than the expression level of the control, which is 1 to 3% and 1 to 7% of the control Tsukuba No. 1, respectively. It was the expression level. From this, it was revealed that the expression of the eIF4E2-T gene was remarkably suppressed in the eIF4E2-T mutant.
  • the eIF4E2-T1 and eIF4E2-T2 mutant tobacco transcripts of the eIF4E2-S gene did not significantly change compared to the control expression level.
  • NMD Nonsense-mediated mRNAdecay
  • Virus inoculation test 1 of eIF4E2-T tobacco mutant The tobacco lines tested for virus inoculation studies are the eIF4E2-T1 tobacco mutant and, as controls, the Tsukuba 1, TN90, and eIF (iso) 4E-S & T mutant lines (sstt).
  • Tsukuba No. 1 is a cultivar, both the eIF4E2 gene and the eIF (iso) 4E gene have a wild type genotype (SSTT) and are susceptible to both PVY and PVY-B.
  • TN90 is a cultivar, of which there is a deletion in the S type of the two eIF4E2 genes, and the function of the eIF4E2-S gene is lost (genotype is ssTT for eIF4E2), which is resistant to PVY.
  • PVY-B is a susceptible variety.
  • the eIF (iso) 4E-S & T mutant strain is a PVY-B resistant tobacco mutant created by the inventors (Patent Document 4). Both the S-type and T-type of the eIF (iso) 4E gene are nonsense. Has mutations and loss of function of both genes (genotype is sst for eIF (iso) 4E).
  • PVY-B is a virus strain isolated by the Japan Tobacco Inc. Leaf Tobacco Research Institute, and is a VAM breaking strain that causes gangrene symptoms in the existing tobacco variety Virgin A mutant (VAM) that is PVY resistant.
  • VAM Virgin A mutant
  • As the inoculum diseased leaves of VAM infected and infected with the virus were used. The collected diseased leaves were ground with 0.01 N phosphate buffer in a mortar. The ground solution was smeared and inoculated with a carborundum on the half leaf of the largest leaf (fourth or fifth from the bottom) of the tobacco seedling 37 days after sowing. The plants were then cultivated in a greenhouse, and timely symptoms (vein veins or stem gangrene symptoms) were observed.
  • Virus inoculation test 2 of eIF4E2-T tobacco mutant The tobacco line, the inoculation method, and the investigation method used in the virus inoculation test were carried out in the same manner as in the virus inoculation experiment 1.
  • PVY-B used in virus inoculation experiment 1 PVY isolated by the Tobacco Research Institute, Japan Tobacco Inc. was used.
  • the present invention can be used for tobacco breeding.

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Abstract

ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを提供するため、本発明に係るタバコは、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現が抑制されている、あるいは、本発明に係るタバコは、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量が野生型と比較して少ない。

Description

ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法
　本発明は、ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法に関するものである。
　Potyvirus属は植物ウイルスの中で最大のグループであり、様々な植物を宿主とする。Potato virus Y（以下、ＰＶＹ）は、Potyvirus属のウイルスであり、アブラムシを通じて非永続的に伝搬し、ナス科植物の多様な種に感染する。タバコ（Nicotiana tabacum）においては、ＰＶＹは、その系統および感染するタバコ品種によって、葉肉の濃緑淡、葉脈および茎の壊疽、葉の黄化、ならびに生育抑制等の症状を引き起こし、その結果葉たばこの品質ならびに収量の低下をもたらし、世界中の葉たばこ生産に大きな被害を及ぼす。特に葉脈および茎の壊疽症状が生じると、その後葉の黄化および褐変から、植物体自体が枯死に到る場合が多く、葉たばこの品質および収量に与える影響が大きい（非特許文献１）。またＰＶＹに感染し品質が低下した葉たばこを原料に使用した場合、生産されるたばこ製品の品質も大きく低下する。
　タバコでは、ＰＶＹに対する抵抗性を示す既存遺伝資源Virgin A mutant（以下、ＶＡＭ）が知られており、積極的にタバコ育種プログラムに活用されてきた。しかし最近、ＶＡＭの抵抗性を打破するＰＶＹの新系統であるVAM-Breaking系統（PVY-Breaking系統、またはＰＶＹ－Ｂと表記することもある）が世界中で報告された。現在、このVAM-Breaking系統に対する抵抗性タバコが強く求められている。最近、放射線照射によって、VAM-Breaking系統への抵抗性を獲得したタバコが報告されたが（非特許文献２）、原因遺伝子の同定には至っていない。また、例えばNicotiana africana等のタバコ野生種の中にPVY-Breaking系統に抵抗性を示すものがあることは知られているが、実用化されていない。
　およそ２００種類ある既知の植物ウイルス抵抗性遺伝子の約半分は劣性遺伝をする（非特許文献３）。これらはウイルス増殖および細胞間移行等に必要な宿主因子であると考えられる。ここ１０年の研究から、これらの因子の一部が明らかとなってきた。例えばｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４Ｇ等の翻訳開始因子、DEAD-box RNA helicase-like protein（非特許文献４）、システインリッチなVPg-interacting protein（非特許文献５）、およびTranslation elongation factor（非特許文献６）等が、劣性のウイルス抵抗性遺伝因子として同定された。勿論これらが全てではなく、他にも多数の候補があると考えられ（非特許文献３）、例えばその他の候補として、植物ウイルスの師管輸送に関連する様々な植物因子（非特許文献７）が挙げられる。
　ウイルスは自分自身のゲノムからタンパク質を合成する際、宿主の翻訳開始機構を利用する。２００２年に、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）におけるTurnip mosaic virus（ＴｕＭＶ）に対する劣性の抵抗性遺伝因子が、翻訳開始因子であるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異であることが示された（非特許文献８）。それ以来、既知のPotyvirus属のウイルスに対する劣性抵抗性へのｅＩＦ４Ｅ遺伝子ファミリーの関与が幾つかの植物で検討されてきた。そして、実際にｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異によって、劣性のウイルス抵抗性が獲得されたことが示されている。
　例えば、特許文献１では、特定のアミノ酸に変異を生じたｅＩＦ４Ｅ（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは含まれない）をコードする遺伝子の過剰発現によるウイルス抵抗性付与の方法が述べられている。また特許文献２では、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のスプライシング変異により、ウイルスが作用しないｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを持つ変異体が述べられている。変異はｅＩＦ４ＥもしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの非コード領域、またはスプライシングエレメント（エクソン／イントロン境界部位の±１０塩基の領域）の少なくとも１塩基に挿入、欠失、または置換を生じるものであり、望ましくはイントロン、より望ましくは第１イントロンが対象である。さらに特許文献３には、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両変異の組合せによるトウガラシ葉脈斑紋病（Pepper veinal mottle virus、ＰＶＭＶ）に対する抵抗性植物の選抜に関する方法、具体的には、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが全く発現せず、かつ変異ｅＩＦ４Ｅが発現する植物を選別する方法が述べられている。
　さらに例えば、コショウのＰＶＹに対する劣性抵抗性の原因遺伝子はｅＩＦ４Ｅであることが示されている（非特許文献９）。また、Clover yellow vein virusはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖するが、ｅＩＦ４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖しないこと、そして、これとは逆に、ＴｕＭＶはｅＩＦ４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖するが、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖しないことが示されている（非特許文献１０）。さらにＰＶＭＶに対する抵抗性を獲得するには、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両方が同時に機能喪失していなければならない（非特許文献１１）。近年の翻訳開始因子および植物ウイルス抵抗性を総説したものとして、例えば、非特許文献１２および非特許文献１３等がある。
　Potyvirus属以外のウイルスと翻訳開始因子との関連性も限定的ではあるが指摘されている。例えば、Cucumber mosaic virus（ＣＭＶ）は、Cucumovirus属ウイルスであり、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ４Ｇが破壊されたシロイヌナズナでは、ＣＭＶの細胞間移行に関与する３ａ　ｐｒｏｔｅｉｎの生産が阻害される。また、Rice yellow mottle virus（ＲＹＭＶ）はSobemovirus属ウイルスであり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇが突然変異したイネはこのウイルスに抵抗性となる（非特許文献１４および非特許文献１５）。
　タバコと同じナス科植物のトマトにおいては、トマト変異体パネルの網羅的解析に基づいて、Potyvirus抵抗性と翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅとの関係が研究されている。その中で、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子ファミリーの一つであるｅＩＦ４Ｅ１の機能抑制が、ＰＶＹおよびPepper mottle virus（ＰｅｐＭｏＶ）に対する抵抗性を付与する一方、Tobacco etch virus（ＴＥＶ）に対しては抵抗性を付与しないことが示された（非特許文献１６）。また、ｅＩＦ４Ｅ２、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇの機能抑制はこれらのPotyvirus属のウイルスに抵抗性を付与しないことも同時に示された。また、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を用いてｅＩＦ４Ｅ１とｅＩＦ４Ｅ２とを同時に機能抑制すると、ＰＶＹ、ＰｅｐＭｏＶおよびＴＥＶを含む７種類のPotyvirus属のウイルスに抵抗性になることが示された。しかしながら一方で、興味深いことに、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＲＮＡｉではこれらのどのウイルスに対しても抵抗性にはならないことが示された（非特許文献１７）。また、トマトのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはPotyvirus属以外のウイルス抵抗性との関連性もないことも併せて示された（非特許文献１７）。
　ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ４Ｅファミリーにカテゴライズされるが、植物では一般に、ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥとのＤＮＡ配列同一性は６０％に満たない。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ４Ｅとは異なる翻訳複合体を形成する。具体的には、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＧとともにｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｆという翻訳複合体を形成し、ｅＩＦ４ＥはｅＩＦ４ＧとともにｅＩＦ４Ｆという翻訳複合体を形成する。
　タバコ（Nicotiana tabacum）においては、ｅＩＦ４Ｅ１またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現量を低下させた報告がある（非特許文献１８）。この報告ではアンチセンス技術を用いてタバコのｅＩＦ４Ｅ１またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写を抑制している。そして、ｅＩＦ４Ｅ１の転写物の量が対照の３０～４０％まで抑制されたタバコ、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写物の量が対照の６０％にまで抑制されたタバコを作出したこと、ならびに両者を交配した後代ではｅＩＦ４Ｅ１の転写物の量が対照の２６％、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写物の量が対照の３１％にまで低減していたことが記載されているものの、ウイルス抵抗性との関連性は全く述べられていない。また、ＰＶＹのＨＣ－Ｐｒｏタンパク質がタバコのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅと相互作用する可能性が、Nicotiana benthamianaを使ったアッセイ系から示唆されているものの（非特許文献１９）、抵抗性との関連性は指摘されていなかった。
　最近、タバコにおいて、ＰＶＹ抵抗性のＶＡＭタバコおよびＰＶＹ感受性のタバコの転写物の網羅的解析から、ＶＡＭタバコにおいて特異的に転写量の低い遺伝子の中にｅＩＦ４Ｅがあることが見出され、この遺伝子に変異が生じたタバコはＰＶＹ抵抗性になることが示された（非特許文献２０、非特許文献２１）。タバコ（Nicotiana tabacum）は、Nicotiana sylvestris（S）由来のゲノムとNicotiana tomentosiformis（T）由来のゲノムとを有する複二倍体であり、それゆえNicotiana sylvestris（S）由来の遺伝子とNicotianatomentosiformis（T）由来の遺伝子が基本的には１組ずつ存在するが、非特許文献２１ではＳ由来のｅＩＦ４Ｅの機能抑制が、PVY抵抗性をもたらすことが記載されている。
　さらに最近、タバコにおいて、翻訳開始因子の１つであるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能抑制によって、ＰＶＹ－ＢおよびTobacco Bushy Top Virus（ＴＢＴＶ）に抵抗性になることが示された（特許文献４）。より具体的には、Ｔ由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能抑制によってＰＶＹ－Ｂ抵抗性になり、Ｓ由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能抑制によってＴＢＴＶに抵抗性になることが示された（特許文献４）。
　上述のようにタバコ（Nicotiana tabacum）は複二倍体であり、通常の二倍体植物に比べて遺伝子の数が多く、Nicotiana sylvestris由来の遺伝子とNicotiana tomentosiformis由来の遺伝子が、基本的には常に１組ずつ存在する。すなわち、タバコにおいては相同遺伝子が少なくとも２組存在する。そのため、他の二倍体の植物と比べて遺伝様式が複雑である。シロイヌナズナにおいてはｅＩＦ４Ｅが３種類、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが１種類存在するとされており（非特許文献１２）、タバコではシロイヌナズナで見られる翻訳開始因子はすべて組になって存在すると考えられる。ｅＩＦ４Ｅと機能的に類似するcap-binding proteinまで含めると、タバコのｅＩＦ４Ｅファミリーは、少なくとも１２個存在することが分っている（非特許文献２０）。さらにｅＩＦ４ＧおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇまで含めると、その数はさらに多くなる。したがって、これらの中から機能抑制によって所望のウイルスの抵抗性に関与する因子を見出すことは、多大な労力を必要とする。
米国特許第７７７２４６２号明細書 米国特許出願公開第２０１３／１１７８７９号明細書 国際公開第２００５／１１８８５０号 国際公開第２０１５／１９９２４２号
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　PVY-Breaking系統に対して抵抗性を有するタバコは知られているが、上述のように、わずか数例に過ぎず、それらの抵抗性の持続性も未だ不明である。したがって、潜在的な遺伝的脆弱性を回避するためにも、PVY-Breaking系統を含むウイルスに対する別の新しい抵抗性タバコを開発することが急務である。また、ＰＶＹに関しても、遺伝的脆弱性を回避するために、新しい抵抗性タバコを開発することが必要である。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコおよびその作出方法を提供することを主たる目的とする。
　従来、タバコの育種に利用されてきたＰＶＹ抵抗性は、Ｓ由来のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の機能抑制によるものであったが、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、Ｓ由来のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子とＴ由来のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の配列相同性が９３％と高いにも関わらず、驚くべきことに、Ｔ由来のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子が機能抑制されたタバコの変異体が、従来のウイルス抵抗性タバコ（Ｓ由来のｅＩＦ４Ｅ２機能抑制タバコ）よりも強いＰＶＹ抵抗性を示す（より壊疽症状が少ない）ことを見出した。さらに本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、Ｔ由来のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子が機能抑制されたタバコの変異体が、Ｓ由来のｅＩＦ４Ｅ２機能抑制タバコを侵すＰＶＹ－Ｂに対しても、従来の抵抗性タバコ（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコ）よりも強い抵抗性を示す（より壊疽症状が少ない）ことを見出した。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量が野生型と比較して少ないことを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法は、上記ウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させることを特徴とする。
　本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様は、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ選抜方法の一態様は、タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、上記検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする。
　本発明に係るウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーの一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする。
　本発明に係る葉たばこの一態様は、上記ウイルス抵抗性タバコの葉たばこであることを特徴とする。
　本発明に係るたばこ製品の一態様は、上記葉たばこを原料として含むことを特徴とする。
　本発明は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを提供することができる。
タバコ（N. tabacum）のＴ型（N. tomentosiformis由来）のｅＩＦ４Ｅ２の遺伝子構造を示す模式図である。白いＢｏｘはエクソン（Ex）を表し、エクソンの下にある数字はナンセンス変異候補の数を表している。白いＢｏｘに挟まれた領域がイントロンである。矢印は使用したプライマーの位置を示す。 本発明の実施例おける、ｄＣＡＰＳマーカーによる変異体検出の結果を示す図である。Ｔ１はエクソン２に生じた変異、Ｔ２はエクソン１に生じた変異である。ＴＴは変異について野生型ホモ、Ｔｔはヘテロ、ｔｔは変異型ホモをそれぞれ示す。 本発明の実施例おける、定量ＰＣＲによるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔの遺伝子発現解析の結果（つくば１号の転写物の量の平均値を１とした場合の相対転写量）を示す図である。＃１は変異体系統ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１、＃２は変異体系統ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２をそれぞれ示し、枝番は各系統の個体番号を示す。
　〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕
　本発明の一態様は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコ（ウイルス抵抗性タバコ）に関し、より具体的には、細胞内における、ウイルスに対して機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量（例えば、転写物の量）が減少した、ウイルス抵抗性タバコに関する。また、本発明の別の一態様は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出する方法（ウイルス抵抗性タバコ作出方法）に関し、より具体的には、細胞内における、ウイルスに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量（例えば、転写物の量）を減少させることによって、ウイルス抵抗性タバコを作出する方法に関する。
　Nicotiana tabacumは複二倍体であり、祖先種であるNicotiana sylvestris由来のゲノム（Ｓ型ゲノム）およびNicotiana tomentosiformis由来のゲノム（Ｔ型ゲノム）の両方を有する。そのため、N. tabacumは、塩基配列が異なる２組のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子（対立遺伝子）を有する。本明細書では、N. tabacumに含まれるものに限らず、N. sylvestris由来のゲノムを有するNicotiana属植物における当該N. sylvestris由来のゲノムにコードされているｅＩＦ４Ｅ２を「ｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ」と称し、N. tomentosiformis由来のゲノムを有するNicotiana属植物における当該N. tomentosiformis由来のゲノムにコードされているｅＩＦ４Ｅ２を「ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ」と称する。本発明は、そのうちでｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に着目したものである。N. tabacumのｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子は、図１に示されるとおり、５つのエクソンと４つのイントロンを有している。なお、図１において、下部に記載の数字はナンセンス変異の候補箇所の数を示し、矢印は実施例におけるプライマーの位置を示す。
　野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列の一例を配列番号１（GenBankアクセッション番号：KM202068）に示す。配列番号１において、オープンリーディングフレームは、６１～７１７番目の塩基であり、翻訳開始コドンが６１～６３番目の塩基であり、翻訳終止コドンが７１５～７１７番目の塩基である。また、野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質のアミノ酸配列の一例を配列番号２に示す。また、野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号３に示す。配列番号３において、プロモーターを含む５’側の転写調節領域は、１～１７６４番目の塩基である。翻訳開始コドンは１７６５～１７６７番目の塩基であり、翻訳終止コドンは７１１２～７１１４番目の塩基であり、第１エクソンは１７０５～２０１２番目の塩基であり、第２エクソンは４６３９～４８０４番目の塩基であり、第３エクソンは４９１５～５０４０番目の塩基であり、第４エクソンは６９２７～６９９２番目の塩基であり、第５エクソンは７０６４～７１１４番目の塩基である。第１イントロンは２０１３～４６３８番目の塩基であり、第２イントロンは４８０５～４９１４番目の塩基であり、第３イントロンは５０４１～６９２６番目の塩基であり、第４イントロンは６９９３～７０６３番目の塩基である。３’側のターミネーター領域は、７１１５～８０３９番目の塩基である。
　同一機能を有する植物の遺伝子のタンパク質コード領域（オープンリーディングフレームのうち終止コドンを除いた配列）の塩基配列は、遺伝子によっては栽培品種間において１％から数％程度の差異があり得、栽培品種と近縁野生種間においては数％から１０％程度の差異があり得る。本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子には、配列番号１に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される遺伝子、および、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする遺伝子が包含される。さらに、本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子には、配列番号１に示す塩基配列と、９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子には、配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする遺伝子も包含される。
　なお、GenBankアクセッション番号ＫＭ２０２０６８のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子とGenBankアクセッション番号ＫＦ１５５６９６のｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ遺伝子とは、タンパク質コード領域のＤＮＡの配列同一性が９３．２％（６５７塩基中６１２塩基が一致）である。またアミノ酸配列の同一性は８７．７％（２１９アミノ酸中１９２アミノ酸が一致）、類似性は９７％である。
　さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子には、配列番号１に示す塩基配列において１～５０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個、１～２個、または１個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子には、配列番号２に示すアミノ酸配列において１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする遺伝子も包含される。なお、本明細書において、特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
　例えば本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子には、ｍＲＮＡ配列がGenBankアクセッション番号ＫＭ２０２０６８の配列となる遺伝子も包含される。この配列はタバコ系統Ｔ０２１６５８のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に由来する配列であり、ＫＭ２０２０６８のタンパク質コード領域に対応するＤＮＡ配列と配列番号３（タバコ品種Ｋ３２６のｅＩＦ４Ｅ２－ＴのゲノムＤＮＡ配列）のエクソン配列との配列同一性は９９．２％（６５７塩基中６５２塩基が一致）である。約１％の違い（６５７塩基中５塩基の違い）はタバコ系統・品種間の差異によるものと考えられる。
　なお、本明細書において、「塩基配列の同一性」とは、複数の塩基配列において、全く同じ塩基の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。「アミノ酸配列の同一性」とは、複数のアミノ酸配列において、全く同じアミノ酸の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。「アミノ酸配列の類似性」とは、複数のアミノ酸配列において、全く同じアミノ酸、または性質の似たアミノ酸の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。性質の似たアミノ酸の例として例えば、正電荷をもつ残基を有するリシン、アルギニン、およびヒスチジン；負電荷をもつ残基を有するアスパラギン酸、およびグルタミン酸；非極性すなわち疎水性の残基を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびプロリン；極性だが電荷のないグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン；が挙げられる。「塩基配列の同一性」、「アミノ酸配列の同一性」、または「アミノ酸配列の類似性」に関しては、当業者が通常用いる配列解析（相同性検索）プログラムBLAST（文献：Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215:403-410.）等、または市販の核酸・アミノ酸解析ソフトを用いて、計算することができる。BLAST検索は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）またはDNA Data Bank of Japan（http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）等のウェブサイトにおいて実施可能である。その際、各種の検索パラメーターの変更が可能であるが、通常はデフォルト値を用いる。
　本明細書において、「タバコ」とは、Nicotiana tabacumだけでなく、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子を有する同じNicotiana属の他の種も包含する。ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子を有するNicotiana属の他の種としては、例えば、N. tomentosa、N. tomentosiformis、およびN. kawakamiiが挙げられる。また、「タバコ」には、タバコの植物全体、植物組織（例えば、葉、茎、花、根、生殖器官、胚およびそれらの一部など）、苗および種子、ならびに乾燥した葉、茎、花、根および種子等が含まれ得る。
　また、本実施形態において、「ウイルス抵抗性タバコ」には、変異を導入した当代のタバコだけでなく、その子孫（後代）のタバコも包含される。
　これらNicotiana属植物のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のｍＲＮＡ配列は、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有すると考えられる。実際、配列番号１に示す塩基配列はN. tomentosiformisのｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のｍＲＮＡ配列と９９．２％の配列同一性（６５７塩基中６５２塩基が一致）を示す（イントロンは除く）。また、N. tomentosiformisのｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の構造は、N. tabacumの遺伝子と同じ数のエクソン（５つ）、同じ数のイントロン（４つ）を有している。
　上記野生種のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列を用いて、GenBankに登録されているN. tomentosiformisのゲノム（Whole genome shotgun contigs）をBLASTプログラム等によって相同性検索することによって得られる。あるいは、Nicotiana属植物に由来する植物種のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔの塩基配列は、例えば配列番号４～７に示すプライマー配列を用いて、当該植物種のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法によってｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子を増幅し、塩基配列を決定することによって得ることができる。相同性検索としてはBLASTプログラムを用いてもよいし、市販の核酸・アミノ酸配列解析ソフトを用いてもよい。
　また、配列番号１に示す塩基配列をプローブとして用いて、タバコ野生種のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション実験を行うことによって、タバコ野生種のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の塩基配列を取得することが可能である。
　N. tabacumにおいては、N. tomentosiformisのｅＩＦ４Ｅ２遺伝子およびN. sylvestrisのｅＩＦ４Ｅ２遺伝子と配列を比較することで、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子を容易に判別することができる。
　ウイルス抵抗性タバコが抵抗性を示すウイルスは、特に限定されないが、例えば、タバコに感染するAlfamovirus属ウイルス（例えばAlfalfa mosaic virus）、Curtovirus属ウイルス（例えばBeet curly top virus）、Begomovirus属ウイルス（例えばTobacco leaf curl virus）、Cucumovirus属ウイルス（例えばCucumber mosaic virus、およびPeanut stunt virus）、Ilarvirus属ウイルス（例えばTobacco streak virus）、Potyvirus属ウイルス（例えばPotato virus Y（PVY）、Tobacco etch virus、Tobacco vein mottling virus、およびTobacco vein banding mosaic virus）、Tobamovirus属ウイルス（例えばTobacco mosaic virus）、Tobravirus属ウイルス（例えばTobacco rattle virus）、Necrovirus属ウイルス（例えばTobacco necrosis virus）、Varicosavirus属ウイルス（例えばTobacco stunt virus）、Nepovirus属ウイルス（例えばTobacco ringspot virus）、Umbravirus属ウイルス（例えばTobacco mottle virus）、Polerovirus属ウイルス（例えばTobacco vein distorting virus）、Mastrevirus属ウイルス（例えばTobacco yellow dwarf virus）、およびTospovirus属ウイルス（例えばTomato spotted wilt virus）等のウイルスが挙げられる。本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、１種類のウイルスに対して抵抗性を有していてもよいし、複数種のウイルスに対して抵抗性を有していてもよい。本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、Potyvirus属のウイルスに対して顕著な抵抗性を有していてもよく、なかでもPotato virus Y（PVY）のPVY-O系統、PVY-C系統、PVY-Z系統、PVY-N（NTNおよびNWを含む）系統、特にタバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破するPVY系統（ＶＡＭ－Ｂｒｅａｋｉｎｇ系統）に対して抵抗性を有し得る。
　本明細書において、「ウイルス抵抗性」とは、罹病性タバコ品種と比較して、ウイルス感染により、タバコに発生する症状が遅延または発生しないことを指す。タバコに発生する症状としては、例えばＰＶＹおよびＰＶＹのＶＡＭ－Ｂｒｅａｋｉｎｇ系統の場合は、生育停滞、葉脈壊疽、茎壊疽、葉脈透過、およびモットリング等が挙げられる。本発明では特に、葉脈もしくは茎の壊疽の発生が抑えられ得る。葉脈もしくは茎の壊疽は最終的なタバコの収量に影響を与えるため、葉脈もしくは茎の壊疽の発生の抑制は非常に実用的な効果である。あるいは、「ウイルス抵抗性」とは、罹病性タバコ品種と比較して、ウイルスの増殖が抑制される、またはウイルスの細胞間移行が抑制されることを指す。
　なお、本発明に係るウイルス抵抗性タバコにおいて、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子以外の遺伝子（例えば、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ遺伝子）の発現量（例えば、転写物の量）は減少していてもよいし、減少していなくてもよい。
　（ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法の態様１）
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現が抑制されているウイルス抵抗性タバコである。
　本明細書において、「変異」とは、ＤＮＡにおける点変異、欠失、挿入、重複、転座および逆位を指し、特に記載がない場合は、野生型の塩基配列に対する差異を指す。
　また、本明細書において、「ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子」とは、ゲノムにおいて、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードするコード領域だけでなく、イントロン、調節領域、および他の非翻訳配列等、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質の発現に必要な非コード領域も含む概念である。
　「ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質」とは、ウイルスが自己増殖または細胞間移行の際に利用できない（少なくとも部分的に利用が阻害される）ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を指し、タバコにおいて正常なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質の機能（翻訳開始因子としての機能）を果たしていない場合、および、タバコにおいては正常なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質の機能を果たしているが、ウイルスが利用できない場合の両方を包含する。
　「ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量」は、ｅＩＦ４Ｅ２－ＴのｍＲＮＡへの転写の量（転写レベルあるいは転写物の量）およびｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質への翻訳の量（翻訳レベルあるいは翻訳産物の量）の何れであってもよいし、両方であってもよい。そのため、「ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔの発現が抑制されている」とは、野生型と比較して転写が抑制されている場合も、野生型と比較して翻訳が抑制されている場合も、野生型と比較して転写および翻訳の両方が抑制されている場合も包含する。なお、「転写が抑制されている」には、転写物が分解される場合も包含される。
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異は、２本の染色体のうちの片方のみに有していてもよいし、両方に有していてもよい。また、両方に有していている場合、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異は、ホモであってもよいし、ヘテロであってもよいが、ホモであることが好ましい。また、１つのｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子が複数の変異を有していてもよい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコがコード領域に変異を有している場合、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質のアミノ酸配列に変異を有している。変異としては、置換、欠失および挿入等が挙げられる。変異がアミノ酸の置換である場合、置換されるアミノ酸および置換後のアミノ酸は、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をウイルスに対して非機能的なものにする限り特に限定されないが、例えば、非保存的置換（non-conservative substitutions）であることが好ましい。非保存的置換としては、アミノ酸を電荷または疎水性が異なる別のアミノ酸に置換すること（塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への置換、または極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換等）、および、あるアミノ酸を側鎖のかさが異なる別のアミノ酸に置換することが挙げられる。また、コード領域に変異を有している場合、フレームシフト変異またはナンセンス変異（ストップコドンになる変異）であってもよい。ナンセンス変異の場合、nonsense-mediated mRNA decay（文献：Brogna and Wen 2009, Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113）が生じ、転写物が分解されることがある。この場合、ナンセンス変異の位置は、第１エクソン、第２エクソン、および／または第３エクソンにあることが好ましく、第１エクソンおよび／または第２キソンにあることがより好ましい。フレームシフト変異またはナンセンス変異の場合、当該変異の位置は遺伝子の５’末端側半分程度より５’末端側であることが好ましい。具体的には第１エクソン、第２エクソン、および／または第３エクソンに変異があることが好ましい。５’末端に近いほど、タンパク質における正常な部分が短くなるため、ウイルスに対して非機能的になる可能性が高くなる。タバコが有している全てのｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のコード領域に変異を有している場合、ウイルスに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質は全く生産されない。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコが非コード領域に変異を有している場合、コードされるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさないが、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡの二次構造を変更させる、転写もしくは翻訳機構のための結合部位を変更させる、またはｔＲＮＡ結合効率を減少させ得る。それによって、転写レベルを減少させたり、翻訳レベルを減少させたりし得る。
　あるいは、翻訳開始コドンＡＴＧのＧがＡに変異した場合、正しい翻訳開始が行われず、正しいｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質が翻訳されない。さらに、５’末端側の非コード領域に変異を有している場合において、その変異によって正しいフレームとは異なるフレームにＡＴＧ（開始コドン）が生じる場合、その誤ったフレームから翻訳が開始される可能性がある。このような場合においても正常なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質は生産されない。例えば変異原が後述のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の場合において、ＧＴＧのＧがＡに変異した場合またはＡＣＧのＣがＴに変異した場合、新たなＡＴＧが生じる。この場合においてフレームがずれた場合、正しいｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質が翻訳されない。
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のイントロンの５’末端のＧＴのＧ、あるいは３’末端のＡＧのＧが、Ａに変異した場合、正しい位置でイントロンが除去されず、正しいｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質が翻訳されない。
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の転写が抑制されている場合、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の転写物の量は、野生型と比較して、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である。また、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の翻訳が抑制されている場合、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の翻訳産物の量は、野生型と比較して、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である。
　また、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の変異によって、ＲＮＡのスプライシングが正常に機能しない場合もあり得る。例えば、イントロンの５’末端側のＧＴを含む前後１０塩基、好ましくは５塩基、より好ましくは１塩基、またはイントロンの３’末端側のＡＧを含む前後１０塩基、好ましくは５塩基、より好ましくは１塩基に、変異が生じている場合、イントロンの切り出しがうまくいかず、異常なｍＲＮＡが生じて、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の翻訳が抑制され得る。
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を生じさせる方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
　変異原としては、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、アジ化ナトリウム、エチジウムブロマイド、および亜硝酸等の化学薬剤を用いることができるが、タバコのゲノムＤＮＡに変異を生じさせる化学薬剤であればこれらに限定されない。また、変異原として、例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、またはＵＶ等が挙げられるが、タバコのゲノムＤＮＡに変異を生じさせる放射線等であればこれらに限定されない。変異原として好ましくはＥＭＳである。
　変異原処理されるタバコの組織または器官としては、種子、根、葉、および花等が挙げられ、植物体を再生できれば特にその種類は限定されないが、好ましくは種子である。変異誘発集団に関して、変異誘発性の化学薬剤または放射線の用量は、致死性または生殖不稔性に至る閾値レベルよりも低い変異頻度が得られるように、それぞれのタイプの植物組織に関して経験的に決定される。
　また、変異原としてトランスポゾン（可動性遺伝因子）を用いることもできる。トランスポゾンがタバコゲノム上で転移し、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の機能を抑制することができる。このようなトランスポゾンの好ましい例として、タバコのレトロトランスポゾンtnt1が挙げられる。あるいは、他の植物のトランスポゾンをタバコに導入して使用することもできる。そのようなトランスポゾンとして、例えば、トウモロコシのトランスポゾンAc/Ds、Spm/dSpm、およびMu、イネのトランスポゾンnDart、ならびにキンギョソウのトランスポゾンtam等が挙げられるが、これらに限定されない。
　さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドの中にあるＴ－ＤＮＡをタバコにat randomに挿入して、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の機能を抑制することも可能である。したがって、Ｔ－ＤＮＡを挿入したタバコ変異体集団（パネル）を作製し、その中からｅＩＦ４Ｅ２－Ｔの塩基配列を指標に、その機能が抑制された個体を選抜することが可能である。
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子にホモに変異を有するウイルス抵抗性タバコの作出方法の一例では、上述のようにタバコを変異原で処理し、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。遺伝子特異的プライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡそれぞれから、またはそれらをプールしたものから、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子を増幅し、その産物の塩基配列を決定し、変異の入った系統を選抜する。変異の種類は、好ましくはアミノ酸変異を伴う変異またはナンセンス変異であり、より好ましくはナンセンス変異である。選抜された系統の種子をまいて育成した植物からＤＮＡを抽出し、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子についてホモ接合変異の入った個体を選抜する。このようにして得られた、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子にホモ接合変異が生じている系統について、ウイルスアッセイを行って抵抗性を確認する。この際、定量ＰＣＲ等を用いてｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現解析を行い、転写量が低減したことを確認してもよい。
　したがって、ウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様において、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製する工程、ゲノムＤＮＡを抽出する工程、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の塩基配列を決定する工程、ホモ接合変異の入った系統を選抜する工程、およびウイルスアッセイを行って抵抗性を確認する工程のうちの少なくとも１つの工程を含んでいてもよい。
　さらに、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子以外のＤＮＡの箇所に入った変異を取り除く目的で、変異処理をした系統を、変異処理をしていない系統と任意のタイミングで掛け合わせてもよい。
　タバコ変異体からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知の方法に基づいて行えばよく、市販の抽出キットを用いてもよい。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。
　ポリヌクレオチドの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法またはＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等によって行ってもよい。
　各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、例えば、配列番号３の塩基配列から設計することが可能である。配列番号３の塩基配列とｅＩＦ４Ｅ２－Ｓのゲノム配列との相同性解析結果から、Ｔ型特異的な領域を見つける。その領域にプライマーを設計することで、Ｓ型とＴ型との混在するタバコゲノムから、Ｔ型の遺伝子を特異的に増幅することができる。設計する部位としては、Ｔ型特異的な領域から選択することができ、例えば、エクソンとエクソン／イントロン境界部位とを含む領域とすることができる。また、イントロン、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域とすることもできる。プライマーの長さは、好ましくは１５塩基～３０塩基、特に好ましくは１７塩基～２７塩基である。プライマー配列は、配列番号３の塩基配列に特異的な領域に基づき設計してもよい。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１またはそれ以上の置換、欠失、および／または付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質または放射性物質等で標識されていてもよい。
　増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、２０塩基～５０００塩基、より好ましくは５０塩基～２０００塩基、さらに好ましくは１００塩基～７００塩基、よりさらに好ましくは１００塩基～５００塩基である。
　以下、変異を検出する方法として代表的なものを挙げるが、これらに限定されない。
（１）市販のシーケンサー等を利用し、各ポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism：一本鎖高次構造多型）法を用いて変異の有無を検出する方法。
　上記方法によって変異の検出されたタバコ変異体から、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子特異的プライマーを利用して、増幅された（ＰＣＲ）産物の塩基配列を確認することで、変異が、ホモ接合変異かヘテロ接合変異かが判明し得る。
　ＥＭＳ処理の場合、多くのＤＮＡの変異はＣ→ＴおよびＧ→Ａである。そのため、ＥＭＳ処理によって変異するとストップコドンになる（すなわち、ナンセンス変異の候補になる）コドンは、ＣＡＡ（最初のＣがＴに置換）、ＣＧＡ（最初のＣがＴに置換）、ＴＧＧ（２つ目のＧ、または３つ目のＧがＡに置換）、およびＣＡＧ（最初のＣがＴに置換）の４種類である。
　例えば、配列番号３の場合、（１）１９１３番目のＧがＡに置換、（２）１９１４番目のＧがＡに置換、（３）１９２２番目のＧがＡに置換、（４）１９２３番目のＧがＡに置換、（５）１９４８番目のＣがＴに置換、（６）１９５８番目のＧがＡに置換、（７）１９５９番目のＧがＡに置換、（８）２００９番目のＧがＡに置換、（９）２０１０番目のＧがＡに置換、（１０）４７２２番目のＧがＡに置換、（１１）４７２３番目のＧがＡに置換、（１２）４７５５番目のＧがＡに置換、（１３）４７５６番目のＧがＡに置換、（１４）４７９４番目のＧがＡに置換、（１５）４７９５番目のＧがＡに置換、（１６）４９３６番目のＣがＴに置換、（１７）４９８１番目のＣがＴに置換、（１８）５００９番目のＧがＡに置換、（１９）５０１０番目のＧがＡに置換、（２０）５０３８番目のＣがＴに置換、（２１）６９４２番目のＣがＴに置換、（２２）６９４６番目のＧがＡに置換、（２３）６９４７番目のＧがＡに置換されれば、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）となる。そのため、ウイルス抵抗性タバコの好ましい一例では、変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号３に示す塩基配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の上記（１）～（２３）に示す１つ以上の変異である。これらのうち好ましくは、（１）～（２０）の何れかに変異が起きる場合である。
　あるいは、変異は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、または（ｂ）配列番号１に示す塩基配列と９４％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソンにおける、下記（１）～（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を生じさせる別の手段として、遺伝子編集技術を用いることもできる。遺伝子編集技術とは、ゲノムの任意の領域に変異を導入する技術である。このような技術としては、例えば、ＴＡＬＥＮ（Transcription activator-like effector nuclease）、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat）／ＣＡＳ、ＯＤＭ（Oligonucleotide Directed Mutagenesis）、およびＺＦＮ（Zinc Finger Nuclease）等が挙げられる。
　ＯＤＭおよびＺＦＮの定義は、文献：Lusser et al. (2012) Nature Biotechnology 30: 231-239に記載されている。また、ＯＤＭについては、例えば、文献：Zhu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8768-8773、および文献：Oh and May (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:169-172.に植物への適用が記載されている。ＺＦＮについては、文献：Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res 33: 5978-5990に植物への適用が記載されている。これらに記載された方法に従えば、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を導入することが可能である。
　ＴＡＬＥＮについては次のとおりである。植物病原菌由来のＤＮＡ結合タンパクTranscription activator-like effector (TALE)は、３４アミノ酸が繰り返された構造部分を有し、この繰り返し構造の１つ１つがそれぞれＤＮＡの１つの塩基を認識する。ＤＮＡには４種の塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）があるが、TAL effectorの繰り返し構造の１３番目および１４番目の２つのアミノ酸によって、ＤＮＡ配列の結合特異性が決定される。すなわち、各繰り返し構造の１３～１４番目のアミノ酸を選択することによって、人工的にTAL effectorを所望のＤＮＡ領域に結合させることができる。このTAL effectorに、二量体のときＤＮＡ切断活性を示す酵素ＦｏｋＩと融合させたものをTAL effector nuclease（ＴＡＬＥＮ）という。このＴＡＬＥＮを２つ近傍に結合させるように設計すると、ＦｏｋＩが二量体を形成し、２つのＴＡＬＥＮの間のＤＮＡを切断する。切断が起こった後、ＤＮＡの修復が行われるが、その際、切断部位が多少削れたり、新たに付加が入ったりすることがある。ＴＡＬＥＮは植物でも機能することが分っている（文献：Zhang et al. (2013) Plant Physiology 161: 20-27）。
　例えば配列番号３のうち、好ましくはタンパク質コード領域において、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ特異的な、好ましくは１５塩基～２５塩基、より好ましくは１８塩基～２２塩基のヌクレオチド配列を設計する。さらにそこから好ましくは９塩基～１５塩基離れた場所に同様にヌクレオチド配列を設計する。これら２つのヌクレオチドに挟まれた部分が後に切断されることになる。
　設計したヌクレオチド配列がｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子特異的か否かを判断するために、設計したヌクレオチド配列を、例えばタバコ（N. tabacum）またはN. sylvestrisもしくはN. tomentosiformisの公知の配列データベースに対して相同性検索することによって、配列そのものの他に、その配列を含め相同性の高い領域があるか否かを調べてもよい。配列データベースとしては、例えば、GenBank、EMBL（The European Molecular Biology Loboratory）、またはDDBJ（DNA Data Bank of Japan）等を利用することができる。配列分析アルゴリズムとしては、例えば、BLAST等を利用することができる。また、データベースの配列の種類としては、Nucleotide Collection(nr/nt)、Expressed Sequence Tags(EST)、Genomic survey sequences(GSS)、およびWhole genome shotgun contigs(WGS)等があるが、これらに限定されない。
　設計した特異的ヌクレオチド配列を基に、ＴＡＬＥの遺伝子配列を設計する。複数の繰り返し構造の結合には、例えば、GoldenGateTALEN Kit（Addgene社）を用いることができるが、これに限定されない。ＴＡＬＥとＦｏｋＩとを融合させる際には、例えば、適当なリンカー配列を配置してもよい。なお、ＦｏｋＩ配列は公知データベースに収載されている。ＴＡＬＥ／ＦｏｋＩ融合遺伝子をタバコで発現させるためのプロモーターは高発現するものが好ましく、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、およびユビキチン遺伝子のプロモーター等の構成的発現プロモーター；Rubisco small subunit遺伝子のプロモーター、ＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等の緑色組織特異的プロモーター；ならびにその他の器官または時期特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。発現量を上げるために所望のイントロンをプロモーターとＴＡＬＥ／ＦｏｋＩとの間に配置してもよい。さらに発現量を上げるために、ＴＡＬＥ／ＦｏｋＩのコドンを植物（タバコ）のコドンに最適化してもよい。植物コドンは、例えばCodon Usage Database（http://www.kazusa.or.jp/codon/）等の公知のデータベースに記載されている。
　ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入するためのベクターには、上記の他に、その発現カセットが導入された植物細胞を選抜するための薬剤耐性遺伝子（選抜マーカー）の発現カセットが組み込まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、タバコ細胞を選抜可能な薬剤の耐性遺伝子であればよく、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＮＰＴ－ＩＩ）、およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＨＰＴ）等が挙げられるが、これらに限定されない。またプロモーターは構成的発現をするものであれば特に限定されない。
　さらに、ＴＡＬＥＮ発現カセットを安定的に植物に導入する際にアグロバクテリウムを利用する場合は、ＴＡＬＥＮ発現カセットおよび選抜マーカー発現カセットがＴ－ＤＮＡに存在することが必要である。この場合、Ｔ－ＤＮＡの境界配列としてライトボーダー（ＲＢ）配列およびレフトボーダー（ＬＢ）配列がＴ－ＤＮＡの両端に配置される。
　ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入するためのベクターであって、タバコに遺伝子を導入できるものとしては、例えば、pBI系、pSB系（文献：Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 15-41.）、pLC系（文献：米国特許第８２９８８１９号明細書）、およびpGreen（文献：Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.）等が挙げられるがこれらに限定されない。
　ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入する方法は特に限定されず、上述のアグロバクテリウムを使用する方法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、またはアグロインフィルトレーション法等、当業者が通常使用する方法を用いればよい。また、導入されるタバコの組織または器官としては、植物体を再生できれば特にその種類は限定されず、例えば、種子、根、葉、および花等が挙げられる。
　形質転換植物の選抜および育成は、当業者であれば容易に実施することが可能である。選抜に用いる薬剤としては、これらに限定されるわけではないが、カナマイシン、およびハイグロマイシン等が挙げられる。薬剤の濃度は、例えば２０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬとすることができ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬである。植物培養物の育成用の培地は通常用いられるものでよく、無機塩の種類としてＭＳおよびＬＳ等が挙げられ、これに例えば、ショ糖、寒天、または植物ホルモン等を添加する。これらの使用濃度は、当業者が通常用いるプロトコールに従えばよい。
　遺伝子導入を行う組織または器官として、上述に加えて、プロトプラストを使用ことができる。プロトプラストは細胞壁分解酵素を用いて常法に従い調製することができる。また、遺伝子導入法として、上述の安定形質転換法に加えて、トランジェント法を用いることも可能である。トランジェントアッセイは、エレクトロポレーション法、またはＰＥＧ法等の常法を用いて実施すればよい。また別のトランジェントアッセイ法として、Agro-infiltration、およびウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、ＡＬＳＶ（Apple latent spherical virus）またはＴＲＶ（Tobacco rattle virus）等を用いることができるが、これらに限定されない。
　遺伝子を導入した細胞から再生した個体、または組織もしくは器官において、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異が生じたか否かは、標的とした領域を挟む形で、プライマーを設計し、所望の植物組織からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ等によって当該領域を増幅し、その産物の塩基配列を調べることによって確認することができる。
　遺伝子発現を解析する方法は、特に限定されず、ノーザンハイブリダイゼーション法または定量ＰＣＲ法等の公知の方法で行えばよい。ハイブリダイゼーションに使用するプローブは、配列番号１の塩基配列もしくはその一部、またはこれらに１もしくは複数の塩基の置換、欠失もしくは挿入がある塩基配列とすることができ、プローブの長さは例えば２０塩基～配列全長とすることができる。
　上記発現解析を行うためのＲＮＡの抽出は、グアニジン塩酸法またはＳＤＳ－フェノール法等、公知の方法で行えばよく、市販のキットを用いてもよい。また、総ＲＮＡからさらにｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ）を精製してもよい。
　定量ＰＣＲを実施するためのｃＤＮＡの合成は、逆転写酵素とオリゴｄＴプライマーまたは遺伝子特異的プライマーとを用いた公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いてもよい。
　また、定量ＰＣＲのためのプライマーは、配列番号１に基づき設計することができる。プライマーの長さとしては好ましくは１５塩基～３０塩基、特に好ましくは１７塩基～２５塩基である。一組のプライマーセットが標的とする増幅配列の長さは、特に限定されず、例えば４０塩基～配列全長とすることができ、好ましくは５０塩基～５００塩基である。
　蛍光ＰＣＲ装置を用いた定量ＰＣＲを実施する際には、上記プライマーに加え、標的配列の中にプローブ配列を設定する。標的配列の長さは、好ましくは４０塩基～２００塩基、さらに好ましくは５０塩基～１５０塩基である。プライマーおよびプローブを標識するレポーター色素としてＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、およびＣｙａｎｉｎｅ５が挙げられ、クエンチャー色素としてＴＡＭＲＡ、およびＢＨＱ１等が挙げられるが、これらに限定されず、当業者が適宜選択して組合せることができる。定量ＰＣＲの内部標準として用いる遺伝子は、構成的発現遺伝子であれば特に限定されないが、好ましい遺伝子として、elongation factor遺伝子およびアクチン遺伝子等が挙げられる。
　ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳについては次のとおりである。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、ＤＮＡ配列を認識するガイドＲＮＡと、ＣＡＳヌクレアーゼを使用する遺伝子編集技術であり、植物においても機能することが知られている（文献：Belhaj et al. (2013) Plant Methods 9:39）。この技術は、ゲノム上の所望の配列を有するＤＮＡを切断する技術であり、標的ゲノム配列の欠失、付加および挿入に関しては、ＴＡＬＥＮと同様に、宿主のＤＮＡ修復系のミスに頼るものである。
　ＣＡＳ９を植物で発現させるためのプロモーターとしては、高発現するものが好ましく、例えば、上述の３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、ユビキチン遺伝子のプロモーター、およびＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。発現量を上げるために所望のイントロンをプロモーターとＣＡＳ９との間に配置してもよい。なお、ＣＡＳ９の塩基配列は公知である。さらに発現量を上げるために、ＣＡＳ９のコドンを植物（タバコ）のコドンに最適化してもよい。また、ＣＡＳ９に核局在シグナルＮＬＳ（Nuclear localize Signal）を付加してもよい。
　所望のゲノム配列および相補的なガイドＲＮＡを設計する。例えば配列番号３のうち、好ましくはタンパク質コード領域において、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ特異的な、好ましくは１９塩基～２２塩基のヌクレオチド配列を決定する。この際、その配列の３’末端側にはprotospacer-adjacent motif（ＰＡＭ）と呼ばれるＮＧＧ配列が存在する必要がある。また、後述のプロモーターの種類がＵ６の場合、転写開始点（ガイドＲＮＡの５’末端）はＧ、Ｕ３プロモーターの場合はＡであることが必要である。
　ガイドＲＮＡの配列がｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子特異的か否かを判断するために、設計した配列を、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）またはNicotiana tomentosiformisの配列データベースに対して相同性検索し、配列そのものの他に、その配列を含め相同性の高い領域があるか否かを調べることができる。配列データベースおよび分析アルゴリズムについては、上述と同様である。
　ガイドＲＮＡを設計後、その３’末端側にｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を融合、ｓｇＲＮＡ（ガイド(g)RNA＋gRNA scaffold）とし、このｓｇＲＮＡを発現するためのコンストラクトを作製する。その際、プロモーターとして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６またはＵ３等のプロモーターが使用できる。適当なベクターを用いて完成したコンストラクトをタバコに導入し、組換え体を選抜、再生する。なお、より確実に変異を生じさせるために、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ内部に複数のガイドＲＮＡを設計し、それらを発現するコンストラクトを同時にタバコに導入することもできる。この場合は、１つのＴ－ＤＮＡ上に複数のガイドＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＳ９発現カセットを同時に配置させてもよい。
　なお、ガイドＲＮＡおよびＣＡＳ９を発現させるカセットを植物に導入するためのベクター、ならびにタバコ形質転換の方法は、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様である。
　遺伝子導入を行う組織または器官として、上述に加えて、プロトプラストを使用することができる。プロトプラストは細胞壁分解酵素を用いて常法に従い調製することができる。また、遺伝子導入法として、上述の安定形質転換法に加えトランジェント法を用いることも可能である。トランジェントアッセイについては、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様である。
　遺伝子を導入した細胞から再生した個体、または組織もしくは器官において、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異が生じたか否かは、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様の方法で確認することできる。
　ウイルスアッセイ方法としては、ウイルス溶液とカーボランダム等の固形粉体とを組み合わせた機械接種法、および、ウイルスを保毒させたアブラムシを用いる虫媒接種法等が挙げられるが、これらに限定されない。また、用いるウイルスは、特に限定されず、ウイルス抵抗性タバコが抵抗性を示すウイルスとして上記に列挙したウイルスを用いることができる。
　（ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法の態様２）
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様は、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量が野生型と比較して少ないウイルス抵抗性タバコである。発現が抑制されたタバコのｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量は、野生型の発現量を１００％とした場合、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である。ここで、「野生型」とは、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制させる因子が導入されておらず、かつ、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を有していないタバコを指す。
　このようなウイルス抵抗性タバコの作出には、従来公知の方法が利用可能であり、例えば、アンチセンス、コサプレッション、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＶＩＧＳ、リボザイム、相同組換え、およびドミナントネガティブ遺伝子産物の発現等を利用した方法が挙げられる。具体的には、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下に抑制させる因子をタバコに導入することによって作出することができる。なお、本実施形態において、「ウイルス抵抗性タバコ」には、上記の因子等を導入した当代のタバコだけでなく、その子孫（後代）のタバコも包含される。
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔの発現を抑制する方法として好ましくは、ＲＮＡｉである。具体的には、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１、あるいは配列番号１の塩基のＵがＴになった配列）またはその一部をトリガーとして用いたＲＮＡｉコンストラクトを作製し、植物で発現するプロモーターと融合し、ベクターを用いてこれをタバコに導入する。そして、ＲＮＡｉコンストラクトを発現させて、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制させたウイルス抵抗性タバコを得る。したがって、一態様におけるウイルス抵抗性タバコは、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉコンストラクトを保持し得る。
　トリガーの長さは、例えば２１塩基～配列全長とすることができるが、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上である。トリガー配列には、１または複数の塩基の置換、欠失または挿入があってもよい。
　ＲＮＡｉでは、トリガー配列を１つがセンス方向、もう１つがアンチセンス方向となるように機能的に連結させて、トリガー配列が逆位反復となる様なＲＮＡｉコンストラクトを作製する。その際、両トリガーの間にスペーサー配列を入れることが好ましい。そのようなスペーサー配列としては、タバコのゲノムに含まれない配列、またはイントロン配列等の成熟ｍＲＮＡに含まれない領域が好ましい。このような配列としては、例えば、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子ならびにpyruvate dehydrogenase kinase（ｐｄｋ）およびカタラーゼ（ｃａｔ）遺伝子等のイントロン配列が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＲＮＡｉコンストラクトを植物の中で転写させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、およびユビキチン遺伝子のプロモーター等の構成的発現プロモーター；Rubisco small subunit遺伝子のプロモーター、およびＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等の緑色組織特異的プロモーター；ならびにその他の器官または時期特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。上記プロモーターとして好ましくは、ウイルスの感染する組織で発現するプロモーターである。
　また、ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡまたは１９Ｓ ＲＮＡ遺伝子のターミネーター、およびノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター等が挙げられるが、植物で機能するものであれば、これらに限定されない。
　ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入するためのベクターには、上記の他に、その発現カセットが導入された植物細胞を選抜するための薬剤耐性遺伝子の発現カセットが組み込まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、タバコ細胞を選抜可能な薬剤の耐性遺伝子であればよく、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＮＰＴ－ＩＩ）、およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＨＰＴ）等が挙げられるが、これらに限定されない。またプロモーターも構成的発現をするものであれば特に限定されない。
　さらに、ＲＮＡｉ発現カセットを安定的に植物に導入する際にアグロバクテリウムを利用する場合は、ＲＮＡｉ発現カセットおよび選抜マーカー発現カセットが、Ｔ－ＤＮＡに存在することが必要である。この場合、Ｔ－ＤＮＡの境界配列として、ライトボーダー（ＲＢ）配列およびレフトボーダー（ＬＢ）配列がＴ－ＤＮＡの両端にそれぞれ配置される。
　また、遺伝子発現を視覚的に予測するために、蛍光タンパク質の発現カセットをＴ－ＤＮＡの中に配置してもよい。蛍光タンパク質としては、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質として好ましくは、ＧＦＰである。蛍光はイメージアナライザーで観察することができる。
　ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入するためのベクターであって、タバコに遺伝子を導入できるものとしては、例えば、pBI系、pSB系（文献：Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 15-41.）、pLC系（文献：米国特許第８２９８８１９号明細書）、pGreen（文献：Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.）、pHellsgate（文献：Wesley et al. 2001 Plant J 27: 581-590.）、およびpSP231（文献：国際公開第２０１１／１０２３９４号公報）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入する方法は特に限定されず、上述のアグロバクテリウムを使用する方法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、またはアグロインフィルトレーション法等、当業者が通常使用する方法を用いればよい。また、導入されるタバコの組織または器官としては、植物体を再生できれば特にその種類は限定されず、例えば、種子、根、葉、および花等が挙げられる。
　形質転換植物の選抜および育成は、当業者であれば容易に実施することが可能である。選抜に用いる薬剤としては、これらに限定されるわけではないが、カナマイシン、およびハイグロマイシン等が挙げられる。薬剤の濃度は、例えば２０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬとすることができ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬである。植物培養物の育成用の培地は通常用いられるものでよく、無機塩の種類としてＭＳおよびＬＳ等が挙げられ、これに例えば、ショ糖、寒天、または植物ホルモン等を添加する。これらの使用濃度は、当業者が通常用いるプロトコールに従えばよい。
　遺伝子発現を解析する方法およびウイルスアッセイ方法については、上述のとおりである。
　〔２．タバコにウイルス抵抗性を付与する方法〕
　本発明はまた、タバコにウイルス抵抗性を付与する方法を提供する。
　当該方法の一態様では、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に導入することによって、タバコにウイルス抵抗性を付与する。そのような変異を導入する方法については、〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕欄に記載のとおりである。
　また、当該方法の別の一態様では、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下に抑制させる因子を導入することによって、タバコにウイルス抵抗性を付与する。そのような因子を導入する方法については、〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕欄に記載のとおりである。
　〔３．ウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法〕
　本発明はまた、ウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法を提供する。
　当該方法の一態様では、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を、自家受粉または他家受粉させる。ここで受粉は自然状態で行われてもよいし、人為的に行われてもよい。一実施形態において、当該後代は、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出された当代のウイルス抵抗性タバコを自家受粉または他家受粉させる、あるいはそのようにして得られた後代からさらに繰り返し自家受粉または他家受粉させて得ることができる。
　他家受粉において上述のウイルス抵抗性タバコまたはその後代と掛け合わせるのは、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に同じ変異を有しているウイルス抵抗性タバコであってもよいし、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に異なる変異を有しているウイルス抵抗性タバコであってもよいし、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を有していないタバコであってもよいし、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を有しているがウイルス抵抗性ではないタバコであってもよい。
　当該方法の一態様では、雑種世代（Ｆ１、Ｆ２、・・・）、変異体の自殖世代（Ｍ１、Ｍ２、・・・）、戻し交配（ＢＣ１、ＢＣ２、・・・）世代等の育種後代のタバコが得られうる。なお、これらのタバコは雄性不稔（ＭＳ）形質を有していてもよい。
　本発明はまた、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させる、ウイルス抵抗性タバコ育種方法を提供する。当該方法の一態様として、例えば、これに限定されるわけではないが、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出された、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子上に変異が生じたウイルス抵抗性タバコ個体を得た後、タバコ品種あるいはタバコ系統と交配し、雑種第一代Ｆ１を作出する。ここに当該品種あるいは系統をさらに戻し交配し、ＢＣ１Ｆ１を作出する。当該変異を有する個体を選抜しながら、当該品種あるいは系統との交配（戻し交配）をさらに繰り返し、ＢＣＸＦ１（Ｘは例えば３～８）を作出する。その後、当該ＢＣＸＦ１を自殖し、ＢＣＸＦ２世代において、当該変異をホモで有する個体を選抜し、遺伝的背景を固定するためにさらに自殖を繰り返し（ＢＣＸＦ３、ＢＣＸＦ４、・・・）、新しいウイルス抵抗性タバコを育種する。なお、各世代における個体の選抜は後述のＤＮＡマーカーを利用してもよい。
　〔４．ＤＮＡマーカーおよびその利用〕
　本発明では、タバコｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子上に生じた変異を利用してＤＮＡマーカーを開発することができ、それをマーカー育種に活用することができる。「ＤＮＡマーカー」とは、品種間または個体間におけるＤＮＡの塩基配列の違い（変異または多型）、またはその違いを検出するためのツールであり、品種または個体を識別するための目印となる塩基配列の違い（変異または多型）、またはその違いを検出するためのツールのことを指す。ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異が確定し、その変異によってウイルスに抵抗性となることが確認された場合、その変異が生じたタバコ変異体を、当該ウイルス抵抗性の育種母本として利用することができる。その際、既に抵抗性に係る原因変異が分っているため、原因変異の識別に利用可能なマーカーをｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子上に設計することができる。当該変異とウイルス抵抗性との関係が遺伝的分離によって切れることがないため、精密なマーカー育種が可能となる。この変異の有無を検出すれば、交配等を繰り返した際に、一回一回ウイルス抵抗性を確認する必要がない。
　タバコからのゲノムＤＮＡの抽出は、常法に基づけばよく、市販の抽出キットを用いてもよいが、特に限定されない。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。変異の有無を検出する技術としては、例えばＲＦＬＰまたは一本鎖ＤＮＡをプローブに用いた核酸（「ポリヌクレオチド」ともいう）のハイブリダイゼーションを応用した技術、およびＰＣＲ等のようにポリヌクレオチドの増幅を伴う技術等があるが、変異を検出できるものであれば、特に限定されない。
　ポリヌクレオチドを増幅する場合、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、またはＬＡＭＰ法等によって行ってもよい。増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、４０塩基～５０００塩基であることが好ましく、１００塩基～１０００塩基であることがより好ましく、１００塩基～７００塩基であることがさらに好ましく、１００塩基～５００塩基であることがよりさらに好ましい。
　各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、変異箇所を挟むか、もしくは含むように設計することが好ましいが、プライマー配列を設計する位置は特に限定されない。変異箇所を挟むようにプライマー配列を設計する場合、例えば、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子内に位置するように設計してもよい。プライマーの長さは、好ましくは１５塩基～３０塩基、特に好ましくは１７塩基～２５塩基である。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１またはそれ以上の置換、欠失、および／または付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質または放射性物質等で標識されていてもよい。
　検出される変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産させるか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異である。その具体例は、〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕欄に記載のとおりである。
　以下、変異を検出する方法として代表的なものを挙げるが、こられに限定されない。
　（１）市販のシーケンサー等を利用し、増幅したポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
　（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法を用いて、増幅したポリヌクレオチド上の変異の有無を検出する方法。
　（３）増幅したポリヌクレオチドに対して、変異箇所の配列（変異前の配列または変異後の配列）を特異的に認識する制限酵素による処理後に、切断の有無により判定する方法（ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法）。その他、意図的に設計したミスマッチプライマーを含むプライマーセットによって制限酵素認識部位を作製するｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法を用いてもよい。当業者であれば多大な労力を要することなく、プライマー配列を設計し、ＰＣＲを行い、所望の変異を検出することが可能である。例えば、プライマー配列の設計はウェブを介して行うことができる（文献：Neff et al. (2002) Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. TRENDS in Genetics 18: 613-615）。
　なお、プライマーの３’末端付近にミスマッチを入れた場合、proofreading活性を持つＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行うと、ミスマッチが修正され、制限酵素で切断されなくなる可能性がある。したがって、ｄＣＡＰＳ法において、ミスマッチプライマーを用いる場合、proofreading活性を持たないＤＮＡポリメラーゼが好ましい。限定されるわけではないが、そのようなＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRa TaqTM（タカラバイオ社）が挙げられる。またプライマーの３’末端付近に制限酵素切断部位を入れた場合、切断の有無は、プライマーの長さ分の違いとして検出される。
　（４）変異部分に特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、ハイブリダイズさせることで変異の有無を確認する方法。
　解析手法は、特に限定はされないが、例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法を用いたＰＣＲ、またはＴＯＦ－ＭＳを利用した測定技術であるMassARRAY（登録商標）解析等を用いることができる。
　（５）変異箇所の配列（変異前の配列および／または変異後の配列）を一部に含ませてプライマー配列を設計し、ＰＣＲ法等によって増幅させることにより、増幅の有無によって変異の有無を検出する方法（アリル特異的ＰＣＲ法）。コントロールとして、例えば変異前の塩基配列に特異的な塩基配列からなる核酸プライマーを用いることができる。
　なお、プライマーの３’末端付近に目的変異の塩基を入れる場合、その位置は、末端、もしくは末端から数塩基の間が好ましい。また、プライマーの３’末端付近に目的の変異を入れた場合においても、変異型の配列に加え、変異のない野生型の配列も併せて増幅することがある。このような場合、目的のミスマッチ以外のミスマッチを、変異型検出用プライマーと野生型検出用プライマーとで同じ位置に導入して、ＰＣＲを行い、変異型または野生型特異的な増幅を得てもよい。
　また、必要に応じて、目的とする遺伝子用のプライマーの他に、ＰＣＲの内部標準となる遺伝子用のプライマーを、ＰＣＲ反応液に加えてもよい。
　なお、上記に例示した変異以外の変異を検出する場合においても、当業者であれば多大な労力を要することなく、プライマー配列を設計し、ＰＣＲを行い、所望の変異を検出することが可能である。
　なお、遺伝子変異の検出技術は、以下の文献に詳細に記載されている：日本特許庁のウェブサイト<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0025.html>。また、遺伝子変異の検出および解析手法は、以下の文献に詳細に記載されている：日本特許庁のウェブサイト<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0028.html>。あるいは、文献：Agarwal et al. (2008) Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep. 27:617-631.、Neff et al. (1998) dCAPS, a simple technique for the genetic analysis ofsingle nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14: 387-392.を参照してもよい。
　したがって、本発明は、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異を検出するためポリヌクレオチドを提供する。当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産させるか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異である。その具体例は、〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕欄に記載のとおりである。
　また、上記検出用ポリヌクレオチドの一形態は、核酸プライマーまたは核酸プライマーのセットである。核酸プライマーのセットは、上記変異を挟む核酸プライマーのセットであってもよいし、上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸プライマーのセットであってもよい。上記検出用ポリヌクレオチドの別の一形態は、上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列にハイブリダイズする核酸プローブである。
　本発明はまた、タバコのゲノムＤＮＡにおいて、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に上記変異が生じていることを、ウイルス抵抗性の指標とすることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定方法を提供する。
　本発明はまた、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における上記変異を検出するための核酸プライマーのセットを備えていることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定キットを提供する。
　本発明はまた、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列にハイブリダイズするプローブを備えていることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定キットを提供する。
　本発明はまた、上記判定方法を用いて、ウイルスに対して抵抗性のタバコを選抜する選抜工程を包含することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコの育種方法を提供する。
　本発明はまた、タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、上記検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、当該検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ選抜方法を提供する。検出用ポリヌクレオチドを利用した検査方法の詳細は、上述のとおりである。
　本発明はまた、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーを提供する。
　〔５．葉たばこおよびたばこ製品〕
　本発明のウイルス抵抗性タバコを栽培して生産される葉たばこは、当該ウイルス（例えば、Virgin A mutantのウイルス抵抗性を打破するPVY系統）が引き起こす病気に罹患しない。そのため、特に当該病気が発生する環境下で栽培された場合において、ウイルス抵抗性でないタバコを栽培して生産される葉たばこと比較して、品質低下が軽減され高品質である。その結果、より高品質のたばこ製品を生産することができる。
　「葉たばこ」とは、タバコ植物の生葉を収穫後乾燥させたもので、たばこ製品の製造のための原料となるものを指す。「たばこ製品」とは、紙巻たばこ（フィルタ付、フィルタなし）（CIGARETTE）、シガー（CIGAR）、シガリロ（CIGARILLO）、スヌース（SNUS）、嗅ぎタバコ（SNUFF）、チューイングたばこ、および電子タバコ等を指す。
　したがって、本発明は、上記ウイルス抵抗性タバコから生産される葉たばこを提供する。また、本発明は、上記ウイルス抵抗性タバコの収穫後の生葉を乾燥させる工程を含む葉たばこの生産方法を提供する。
　本発明はまた、上記葉たばこを原料として含むたばこ製品を提供する。
　〔６．まとめ〕
　以上のように、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異はナンセンス変異であることが好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、または（ｄ）配列番号１に示す塩基配列と９４％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソンにおける、下記（１）～（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号３に示す塩基配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の下記（１）～（２３）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）１９１３番目のＧがＡに置換、（２）１９１４番目のＧがＡに置換、（３）１９２２番目のＧがＡに置換、（４）１９２３番目のＧがＡに置換、（５）１９４８番目のＣがＴに置換、（６）１９５８番目のＧがＡに置換、（７）１９５９番目のＧがＡに置換、（８）２００９番目のＧがＡに置換、（９）２０１０番目のＧがＡに置換、（１０）４７２２番目のＧがＡに置換、（１１）４７２３番目のＧがＡに置換、（１２）４７５５番目のＧがＡに置換、（１３）４７５６番目のＧがＡに置換、（１４）４７９４番目のＧがＡに置換、（１５）４７９５番目のＧがＡに置換、（１６）４９３６番目のＣがＴに置換、（１７）４９８１番目のＣがＴに置換、（１８）５００９番目のＧがＡに置換、（１９）５０１０番目のＧがＡに置換、（２０）５０３８番目のＣがＴに置換、（２１）６９４２番目のＣがＴに置換、（２２）６９４６番目のＧがＡに置換、（２３）６９４７番目のＧがＡに置換。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量が野生型と比較して少ないことを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコでは、上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることが好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコでは、上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yであることがより好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコでは、上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることがより好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記変異はナンセンス変異であることが好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、エチルメタンスルホン酸によって上記変異を生じさせることが好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記変異は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、または（ｄ）配列番号１に示す塩基配列と９４％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソンにおける、下記（１）～（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号３に示す塩基配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の下記（１）～（２３）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）１９１３番目のＧがＡに置換、（２）１９１４番目のＧがＡに置換、（３）１９２２番目のＧがＡに置換、（４）１９２３番目のＧがＡに置換、（５）１９４８番目のＣがＴに置換、（６）１９５８番目のＧがＡに置換、（７）１９５９番目のＧがＡに置換、（８）２００９番目のＧがＡに置換、（９）２０１０番目のＧがＡに置換、（１０）４７２２番目のＧがＡに置換、（１１）４７２３番目のＧがＡに置換、（１２）４７５５番目のＧがＡに置換、（１３）４７５６番目のＧがＡに置換、（１４）４７９４番目のＧがＡに置換、（１５）４７９５番目のＧがＡに置換、（１６）４９３６番目のＣがＴに置換、（１７）４９８１番目のＣがＴに置換、（１８）５００９番目のＧがＡに置換、（１９）５０１０番目のＧがＡに置換、（２０）５０３８番目のＣがＴに置換、（２１）６９４２番目のＣがＴに置換、（２２）６９４６番目のＧがＡに置換、（２３）６９４７番目のＧがＡに置換。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法では、上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることが好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法では、上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yであることがより好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法では、上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることがより好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法は、上記ウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させることを特徴とする。
　本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様は、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする。
　本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様では、上記変異はナンセンス変異であることが好ましい。
　本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様では、上記変異は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、または（ｄ）配列番号１に示す塩基配列と９４％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソンにおける、下記（１）～（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
　本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号３に示す塩基配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の下記（１）～（２３）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）１９１３番目のＧがＡに置換、（２）１９１４番目のＧがＡに置換、（３）１９２２番目のＧがＡに置換、（４）１９２３番目のＧがＡに置換、（５）１９４８番目のＣがＴに置換、（６）１９５８番目のＧがＡに置換、（７）１９５９番目のＧがＡに置換、（８）２００９番目のＧがＡに置換、（９）２０１０番目のＧがＡに置換、（１０）４７２２番目のＧがＡに置換、（１１）４７２３番目のＧがＡに置換、（１２）４７５５番目のＧがＡに置換、（１３）４７５６番目のＧがＡに置換、（１４）４７９４番目のＧがＡに置換、（１５）４７９５番目のＧがＡに置換、（１６）４９３６番目のＣがＴに置換、（１７）４９８１番目のＣがＴに置換、（１８）５００９番目のＧがＡに置換、（１９）５０１０番目のＧがＡに置換、（２０）５０３８番目のＣがＴに置換、（２１）６９４２番目のＣがＴに置換、（２２）６９４６番目のＧがＡに置換、（２３）６９４７番目のＧがＡに置換。
　本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様では、上記変異を挟む核酸プライマーのセット、または、上記変異を含む連続した塩基配列もしくはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸プライマーのセットであることが好ましい。
　本発明に係るウイルス抵抗性タバコ選抜方法の一態様は、タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、上記検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする。
　本発明に係るウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーの一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする。
　本発明に係る葉たばこの一態様は、上記ウイルス抵抗性タバコの葉たばこであることを特徴とする。
　本発明に係るたばこ製品の一態様は、上記葉たばこを原料として含むことを特徴とする。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　（遺伝子配列の取得）
　ＧｅｎＢａｎｋデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）の検索を行い、タバコ（Nicotiana tabacum）の翻訳開始因子として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号がＫＦ１５５６９６であるｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡ塩基配列、およびアクセッション番号がＫＭ２０２０６８であるｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡ塩基配列を取得した。ＧｅｎＢａｎｋデータベースのNicotiana tomentosiformisおよびNicotiana sylvestrisのＷＧＳ（Whole-genome shotgun contigs）を用いたＢＬＡＳＴ解析から、アクセッション番号がＫＦ１５５６９６のｅＩＦ４ＥはNicotiana sylvestris由来、ＫＭ２０２０６８のｅＩＦ４ＥはNicotiana tomentosiformis由来であることを確認した。これらの配列をそれぞれ、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＦ１５５６９６）およびｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＭ２０２０６８）と命名した。前者の遺伝子の機能を破壊したタバコは、ＰＶＹに抵抗性になることが示されている（非特許文献２１）。本発明者らは後者の遺伝子に着目し、以下の実験を行った。
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔの塩基配列を配列番号１に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示し、さらにｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のゲノム配列を配列番号３に示す。配列番号３は、ＫＭ２０２０６８の配列をクエリに、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのNicotiana tabacumのＷＧＳに対してＢＬＡＳＴ解析を行うことによって取得した。具体的には、アクセッション番号ＡＷＯＪ０１１８２７８１（品種Ｋ３２６由来のゲノムＤＮＡ配列であるcontig182781）の一部（ＡＷＯＪ０１１８２７８１の相補配列のうち３０００１番目から３８０３９番目の配列）である。このゲノム配列のエクソン配列とＫＭ２０２０６８のタンパク質コード領域のＤＮＡ配列との同一性は９９．２％（６５７塩基中６５２塩基が一致）であった。約１％の違い（６５７塩基中５塩基の違い）はタバコ系統・品種間の差異によるものと考えられた（ＫＭ２０２０６８は系統Ｔ０２１６５８、ＡＷＯＪ０１１８２７８１は品種Ｋ３２６である）。ｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ遺伝子とｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のタンパク質コード領域のＤＮＡの配列同一性は９３．２％（６５７塩基中６１２塩基が一致）であった。またアミノ酸配列の同一性は８７．７％（２１９アミノ酸中１９２アミノ酸が一致）、類似性は９７．３％（２１９アミノ酸中２１３アミノ酸が一致または類似）であった。配列同一性等の解析には、核酸・アミノ酸配列解析ソフトGENETYX（登録商標）(ver.12)（ゼネティックス社）を用いた。
　配列番号１では、オープンリーディングフレームが６１～７１７番目の塩基からなり、翻訳開始コドンが６１～６３番目の塩基、翻訳終止コドンが７１５～７１７番目の塩基である。配列番号３では、翻訳開始コドンが１７６５～１７６７番目の塩基、翻訳終止コドンが７１１２～７１１４番目の塩基、第１エクソンが１７０５～２０１２番目の塩基、第２エクソンが４６３９～４８０４番目の塩基、第３エクソンが４９１５～５０４０番目の塩基、第４エクソンが６９２７～６９９２番目の塩基、第５エクソンが７０６４～７１１４番目の塩基である。図１にｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン／イントロンの構造を模式的に示す。図１において、下部に記載の数字はＥＭＳ処理によって生じるＧからＡへの変異またはＣからＴへの変異によって生じ得るナンセンス変異の候補箇所の数を示す。ＥＭＳ処理によって生じるＧからＡへの変異またはＣからＴへの変異によってストップコドンになり得る塩基とその数は、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔの場合、第１エクソンには９個（配列表の配列番号３の１９１３番目のＧ、１９１４番目のＧ、１９２２番目のＧ、１９２３番目のＧ、１９４８番目のＣ、１９５８番目のＧ、１９５９番目のＧ、２００９番目のＧ、および２０１０番目のＧ）、第２エクソンには６個（４７２２番目のＧ、４７２３番目のＧ、４７５５番目のＧ、４７５６番目のＧ、４７９４番目のＧ、および４７９５番目のＧ）、第３エクソンには５個（４９３６番目のＣ、４９８１番目のＣ、５００９番目のＧ、５０１０番目のＧ、および５０３８番目のＣ）、第４エクソンには３個（６９４２番目のＣ、６９４６番目のＧ、および６９４７番目のＧ）、第５エクソンには０個であった。
　（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタバコ変異体の選抜）
　第１エクソン、ならびに第２エクソンおよび第３エクソンについて、エクソンとエクソン／イントロン境界部位とを含む領域を増幅するプライマーを設計した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＥＭＳ処理による変異を有する個体からゲノムＤＮＡを抽出し、上記プライマーを用いたＰＣＲによって、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子領域を増幅した。増幅産物の塩基配列を確認することによって、第１エクソン、第２エクソンまたは第３エクソン内でストップコドンが生じているｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタバコ変異体を選抜した。
　具体的には、田島ら（文献：平成23年度日本植物病理学会大会、P226、タバコ変異体パネルの作出）によって作製されたタバコ変異体パネルを選抜した。このパネルは、タバコ品種つくば１号の種子（数千個）に対して、変異原処理としてＥＭＳ処理を行い、育成した個体（Ｍ１世代）ごとに得られた自殖後代種子（Ｍ２バルク種子）のセットと、これらＭ２種子を播種し、育成した各系統８個体の幼苗から抽出したバルクＤＮＡのセットからなる。このＤＮＡサンプル（１９７４系統分のＤＮＡサンプル）を鋳型に、表１のプライマーを使ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定したところ、エクソン１では３２サンプル（２５か所）、エクソン２と３では計２９サンプル（２６か所）で変異が検出された。変異はいずれもヘテロ接合であった。ナンセンス変異が検出されたサンプルは、エクソン１で１サンプル（配列番号３の第２０１０番目のＧがＡに変異）、エクソン２と３で１サンプル（配列番号３の第４７２２番目のＧがＡに変異）であった。これらのうち、第４７２２番目のＧがＡに変異した系統（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１、Ｍ２世代）、および第２０１０番目のＧがＡに変異した系統（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２、Ｍ２世代）を播種し、４８個体からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲで増幅した産物の塩基配列を決定した。
　なおＤＮＡ抽出は以下のように行った。タバコ葉サンプル（１ｃｍ×１ｃｍ）を２ｍＬチューブに入れ、４００μＬの抽出液（組成は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２５０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＳＤＳ）および２００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を加えた後、メタルコーンを加えて破砕し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清３００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、８００μＬの１００％エタノールを加えて転倒混和した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を完全に取り除いた。ペレットが乾燥したことを確認した後、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ）を５０μＬ加えた。ＰＣＲは、タバコゲノムＤＮＡを鋳型として５ｎｇ使用し、２０μＬの反応系で行った。酵素はＴｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いた。反応は、９８℃を１０秒、６０℃を１５秒および６８℃を７０秒のサイクルを、９４℃で１分の後に３５回行った。その結果、目的の変異をホモ接合で有する個体（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ型変異ホモ個体）が、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１で５個体、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２で６個体得られた。
　（変異体の遺伝子型を識別するｄＣＡＰＳマーカーの開発）
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の多型を検出するためのＤＮＡマーカーとして、ｄＣＡＰＳマーカーを開発した。塩基配列において制限酵素認識配列に多型が存在する場合には、制限酵素処理後の断片長の違いを検出することによって多型を判別することができるが、これをＣＡＰＳマーカー、ＰＣＲ－ＲＦＬＰマーカーと呼ぶ。ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に生じた今回の変異（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１では配列番号３の４７２２番目のＧがＡに変異、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２では配列番号３の２０１０番目のＧがＡに変異）の場合、変異周辺の配列が主要な制限酵素の認識配列を含まなかった。そのため、ＰＣＲで用いるプライマーを設計する際に、変異近傍に人工的に制限酵素サイトを導入した。今回利用した変異においては、変異型遺伝子の変異近傍が制限酵素サイト（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２ともHae III：GGCC）となるには三塩基の変異が必要であった一方で、野生型遺伝子では制限サイトとなるには二塩基の変異で足りた。したがって、本実施例では、二塩基変異導入することで、野生型では制限酵素で切れて、変異型では切れないような、ｄＣＡＰＳマーカーを作製した。この場合、断片長の差はプライマーの長さ分の差として検出される。作製したプライマーは表２のとおりである。
　例えば配列番号９の場合、３’末端側のｇｇＣの次の塩基は、野生型の鋳型ＤＮＡではＣとなり、Hae III部位（ＧＧＣＣ）となるが、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１の鋳型ＤＮＡではＴとなり、制限サイトにはならない。また、配列番号１１の場合、３’末端側のｇｇＣの次の塩基は、野生型の鋳型ＤＮＡではＣとなり、Hae III部位（ＧＧＣＣ）となるが、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２の鋳型ＤＮＡではＴとなり、制限サイトにはならない。
　プライマーの３’末端付近にミスマッチを入れた場合、proofreading活性を持つＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行うと、プライマーのミスマッチが修正され、制限酵素で切断されなくなる可能性がある。一方、proofreading活性を持たないTaKaRa TaqTM（タカラバイオ社）を用いてゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った場合には、十分な増幅が得られなかった。そこで、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、Tks GflexTM DNA Polymerase（Proof Reading機能を有する）を用いた１ｓｔ ＰＣＲでＳＮＰ領域を含む周辺領域を増幅した後、TaKaRa TaqTM（Proof Reading機能を有さない）を用いた２ｎｄＰＣＲで制限酵素の認識部位を作出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２ともに、野生型のＳＮＰを含む場合にのみ制限酵素Hae IIIで切断されるように２ｎｄ ＰＣＲのプライマーにミスマッチを設計した。
　まず、Tks GflexTMDNA Polymeraseを用いて１ｓｔ ＰＣＲを行った。ゲノムＤＮＡ約５ｎｇを鋳型とし、プライマー濃度は０．５μＭとなるように調製し、バッファーは酵素に添付されたものを用いた。ＰＣＲは、９４℃ １分を１回、９８℃ １０秒、６０℃ １５秒、および６８℃ ９０秒のサイクルを３０回、６８℃ １５０秒を１回行った。その後、１ｓｔ ＰＣＲの産物を１００倍に希釈し、１μＬを鋳型としてTaKaRa TaqTMで２ｎｄ ＰＣＲを行った。１ｓｔＰＣＲと同様に、プライマー濃度は０．５μＭとなるように調製し、バッファーは酵素に添付されたものを用いた。ＰＣＲは、９４℃ ２分を１回、９４℃ ３０秒、５２℃ ３０秒、および７２℃ ３０秒のサイクルを４０回、７２℃ ９０秒を１回行った。ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２ともに、２ｎｄＰＣＲ産物をHae III（タカラバイオ社）で処理した。
　結果を図２に示した。ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１プライマーで増幅した産物を制限酵素処理した場合に、切断が見られないサンプルの遺伝子型はｔ1ｔ1（エクソン２に生じた変異をホモに持つ）と判断でき、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ－Ｔ２プライマーで増幅した産物を制限酵素処理した場合に、切断が見られないサンプルの遺伝子型はｔ２ｔ２（エクソン１に生じた変異をホモに持つ）と判断できた。例えば、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１プライマーあるいはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２プライマーで切断が生じないサンプルの遺伝子型はｔｔであり、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１プライマーおよびｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２プライマーで切断が生じたサンプルの遺伝子型はＴＴであり、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１プライマーあるいはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２プライマーで切断が生じたものと生じないものとが現れるサンプルの遺伝子型はＴｔであると容易に判断が可能であった。したがって、本ｄＣＡＰＳマーカーは、タバコｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異が生じた個体の遺伝子型の識別に活用できることが示された。
　（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタバコ変異体における翻訳開始因子の転写解析）
　変異体タバコについて、ｅＩＦ４Ｅ２－ＴならびにｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ遺伝子の発現を調査するため、各遺伝子の塩基配列に基づき、リアルタイムＰＣＲ用のプライマー／プローブを設計した（表３）。また、変異体タバコの葉からＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（QIAGEN社）を用いて総ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。リアルタイムＰＣＲではＴａｑＭａｎ　Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（Life technologies社）を用いて増幅反応を行った。反応条件は５０℃ ２分間、９５℃ ２０秒間の後、９５℃ １秒、６０℃２０秒のサイクルを４０回とした。発現解析はＳｔｅｐＯｎｅ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖ２．２（Life technologies社）を用いた。ＰＣＲの内部標準としてelongation factor1-alpha（ＥＦ１－α）遺伝子を使用し、この遺伝子の発現量との比較で、標的遺伝子の相対的な遺伝子発現量を算出した。対照としてつくば１号を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　測定結果を図３に示した。図３では、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量を、つくば１号（ＷＴ）の転写物の量の平均値を１とした場合の相対発現量を示している。横軸は各変異体を示す。縦軸は各変異体における転写物量の相対値を示す。ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１およびｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２変異体タバコのｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の転写物の量は、対照の発現量に比べてはるかに低く、それぞれ対照のつくば１号の１～３％、１～７％の発現量であった。このことから、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ変異体ではｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現が顕著に抑制されていることが明らかとなった。一方、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１およびｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ２変異体タバコのｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ遺伝子の転写物の量は、対照の発現量に比べて大きな変化は認められなかった。
　なお、ナンセンス変異によって転写が抑制された原因として、Nonsense-mediated mRNAdecay (NMD)（文献：Baker and Parker 2004、Current Opinion in Cell Biology 16: 293-299）が考えられた。
　（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタバコ変異体のウイルス接種試験１）
　ウイルス接種試験に供試したタバコ系統は、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１タバコ変異体、ならびに、対照として、つくば１号、ＴＮ９０、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ－Ｓ＆Ｔ変異体系統（ｓｓｔｔ）である。つくば１号は、栽培品種であり、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子共に野生型の遺伝子型（ＳＳＴＴ）を有し、ＰＶＹおよびＰＶＹ－Ｂの両方に対して罹病性である。ＴＮ９０は、栽培品種であり、２つあるｅＩＦ４Ｅ２遺伝子のうちＳ型の方に欠失が生じ、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ遺伝子の機能が失われており（遺伝子型はｅＩＦ４Ｅ２についてｓｓＴＴ）、ＰＶＹに抵抗性であるが、ＰＶＹ－Ｂには罹病性の品種である。一方、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ－Ｓ＆Ｔ変異体系統は、発明者らが作出したＰＶＹ－Ｂ抵抗性タバコ変異体（特許文献４）であり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のＳ型およびＴ型共にナンセンス変異を有し、両遺伝子の機能が失われている（遺伝子型はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについてｓｓｔｔである）。
　ＰＶＹ－Ｂは、日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所で分離されたウイルス系統であり、ＰＶＹ抵抗性であるタバコ既存品種Ｖｉｒｇｉｎ　Ａ　ｍｕｔａｎｔ（ＶＡＭ）に壊疽症状を発生させるVAM breaking系統である。接種源には、ウイルスが感染し発病したＶＡＭの罹病葉を使用した。採取した罹病葉を乳鉢中で０．０１Ｎリン酸緩衝液とともに磨砕した。その磨砕液を、播種から３７日後のタバコ苗の最大葉（下から４枚目または５枚目）の半葉にカーボランダムを用いて塗抹接種した。その後温室内で栽培し、適時病徴（葉脈もしくは茎の壊疽症状）を観察した。
　ウイルス接種８日、１７日および２８日後の結果を表４に示した。２つの栽培品種では、接種８日目で既に半数以上の個体で、壊疽症状が観察され、接種１７日目までに、全個体に壊疽症状が観察された。これに対し、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ＆Ｔ変異体（ｓｓｔｔ）では、接種８日目では壊疽症状が観察されず、接種１７日目で１２個体中１個体、接種２８日目で１２個体中５個体において壊疽症状が観察された。これらに対して、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１変異体においては、接種２８日目まで観察しても壊疽症状が全く観察されなかった。
　以上のことから、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の機能を破壊することによって、非常に強いＰＶＹ－Ｂ抵抗性が得られることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタバコ変異体のウイルス接種試験２）
　ウイルス接種試験に供試したタバコ系統、接種方法および調査方法は、ウイルス接種実験１と同様の方法で実施した。本接種実験には、ウイルス接種実験１で使用したＰＶＹ－Ｂに加えて、日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所で分離されたＰＶＹを供試した。
　ＰＶＹ接種１０日、１８日および３０日後の結果を表５に示した。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ－Ｓ＆Ｔ変異体（ｓｓｔｔ）および野生型の遺伝子型を持つ栽培品種つくば１号では、接種１０日目で既に９０％以上の個体で、葉脈および茎の壊疽症状が観察され、接種３０日目には、全個体に壊疽症状が観察された。これに対し、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ遺伝子の機能が破壊されたＰＶＹ抵抗性の栽培品種ＴＮ９０では、接種１０日目では壊疽症状が観察されず、接種１８日目で１５個体中４個体、接種３０日目で１５個体中６個体において壊疽症状が観察された。これらに対して、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１変異体においては、接種３０日目まで観察しても、壊疽症状が全く観察されなかった。
　ＰＶＹ－Ｂ接種１０日、１８日および３０日後の結果を表６に示した。ｅＩＦ４Ｅ２－Ｓ遺伝子の機能が破壊されているＴＮ９０および野生型のつくば１号では、接種１０日目で既に８０％以上の個体で、壊疽症状が観察され、接種１８日目には、全個体に壊疽症状が観察された。これに対し、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ_－Ｓ＆Ｔ変異体（ｓｓｔｔ）では、接種１０日目では壊疽症状が観察されず、接種１８日目で１４個体中２個体、接種３０日目で１４個体中８個体において壊疽症状が観察された。これらに対して、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ１変異体においては、接種３０日目まで観察しても、壊疽症状が全く観察されなかった。
　以上のことから、ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の機能を破壊することによって、非常に強いＰＶＹ抵抗性およびＰＶＹ－Ｂ抵抗性が得られることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明は、タバコの育種に利用することができる。

Claims (27)

  1. 　翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とするウイルス抵抗性タバコ。
  2. 　上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  3. 　上記変異は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、または（ｄ）配列番号１に示す塩基配列と９４％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソンにおける、下記（１）～（４）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１または２に記載のウイルス抵抗性タバコ；
    （１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
  4. 　上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号３に示す塩基配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の下記（１）～（２３）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１～３の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ；
    （１）１９１３番目のＧがＡに置換、（２）１９１４番目のＧがＡに置換、（３）１９２２番目のＧがＡに置換、（４）１９２３番目のＧがＡに置換、（５）１９４８番目のＣがＴに置換、（６）１９５８番目のＧがＡに置換、（７）１９５９番目のＧがＡに置換、（８）２００９番目のＧがＡに置換、（９）２０１０番目のＧがＡに置換、（１０）４７２２番目のＧがＡに置換、（１１）４７２３番目のＧがＡに置換、（１２）４７５５番目のＧがＡに置換、（１３）４７５６番目のＧがＡに置換、（１４）４７９４番目のＧがＡに置換、（１５）４７９５番目のＧがＡに置換、（１６）４９３６番目のＣがＴに置換、（１７）４９８１番目のＣがＴに置換、（１８）５００９番目のＧがＡに置換、（１９）５０１０番目のＧがＡに置換、（２０）５０３８番目のＣがＴに置換、（２１）６９４２番目のＣがＴに置換、（２２）６９４６番目のＧがＡに置換、（２３）６９４７番目のＧがＡに置換。
  5. 　翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量が野生型と比較して少ないことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ。
  6. 　上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項１～５の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  7. 　上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yであることを特徴とする、請求項６に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  8. 　上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることを特徴とする、請求項７に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  9. 　ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  10. 　上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項９に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  11. 　エチルメタンスルホン酸によって上記変異を生じさせることを特徴とする、請求項９または１０に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  12. 　上記変異は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、または（ｄ）配列番号１に示す塩基配列と９４％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソンにおける、下記（１）～（４）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項９～１１の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法；
    （１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
  13. 　上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号３に示す塩基配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の下記（１）～（２３）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項９～１２の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法；
    （１）１９１３番目のＧがＡに置換、（２）１９１４番目のＧがＡに置換、（３）１９２２番目のＧがＡに置換、（４）１９２３番目のＧがＡに置換、（５）１９４８番目のＣがＴに置換、（６）１９５８番目のＧがＡに置換、（７）１９５９番目のＧがＡに置換、（８）２００９番目のＧがＡに置換、（９）２０１０番目のＧがＡに置換、（１０）４７２２番目のＧがＡに置換、（１１）４７２３番目のＧがＡに置換、（１２）４７５５番目のＧがＡに置換、（１３）４７５６番目のＧがＡに置換、（１４）４７９４番目のＧがＡに置換、（１５）４７９５番目のＧがＡに置換、（１６）４９３６番目のＣがＴに置換、（１７）４９８１番目のＣがＴに置換、（１８）５００９番目のＧがＡに置換、（１９）５０１０番目のＧがＡに置換、（２０）５０３８番目のＣがＴに置換、（２１）６９４２番目のＣがＴに置換、（２２）６９４６番目のＧがＡに置換、（２３）６９４７番目のＧがＡに置換。
  14. 　翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  15. 　上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項９～１４の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  16. 　上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yであることを特徴とする、請求項１５に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  17. 　上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることを特徴とする、請求項１６に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  18. 　請求項９～１７の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法。
  19. 　タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする、検出用ポリヌクレオチド。
  20. 　上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項１９に記載の検出用ポリヌクレオチド。
  21. 　上記変異は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソン、または（ｄ）配列番号１に示す塩基配列と９４％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子のエクソンにおける、下記（１）～（４）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の検出用ポリヌクレオチド；
    （１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
  22. 　上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号３に示す塩基配列からなるｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の下記（１）～（２３）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１９～２１の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチド；
    （１）１９１３番目のＧがＡに置換、（２）１９１４番目のＧがＡに置換、（３）１９２２番目のＧがＡに置換、（４）１９２３番目のＧがＡに置換、（５）１９４８番目のＣがＴに置換、（６）１９５８番目のＧがＡに置換、（７）１９５９番目のＧがＡに置換、（８）２００９番目のＧがＡに置換、（９）２０１０番目のＧがＡに置換、（１０）４７２２番目のＧがＡに置換、（１１）４７２３番目のＧがＡに置換、（１２）４７５５番目のＧがＡに置換、（１３）４７５６番目のＧがＡに置換、（１４）４７９４番目のＧがＡに置換、（１５）４７９５番目のＧがＡに置換、（１６）４９３６番目のＣがＴに置換、（１７）４９８１番目のＣがＴに置換、（１８）５００９番目のＧがＡに置換、（１９）５０１０番目のＧがＡに置換、（２０）５０３８番目のＣがＴに置換、（２１）６９４２番目のＣがＴに置換、（２２）６９４６番目のＧがＡに置換、（２３）６９４７番目のＧがＡに置換。
  23. 　上記変異を挟む核酸プライマーのセット、または、上記変異を含む連続した塩基配列もしくはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸プライマーのセットであることを特徴とする、請求項１９～２２の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチド。
  24. 　タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、請求項１９～２３の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、
    　上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ選抜方法。
  25. 　翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２－Ｔタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２－Ｔ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカー。
  26. 　請求項１～８の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコの葉たばこ。
  27. 　請求項２６に記載の葉たばこを原料として含むことを特徴とする、たばこ製品。
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