CN110786542A - 一种利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，包括采收成熟度适宜的鲜烟叶；将采收的鲜烟叶在晾房内逐步干燥，干燥过程中分2次用05‑101、J45、J54中至少一种菌种配制的OD₆₀₀值为1的菌液接种；将晾制后的烟叶采用集中堆垛进行发酵，发酵过程中分2次用05‑101、J45、J54中至少一种菌种配制的OD₆₀₀值为1的菌液接种，即可得到低TSNAs的雪茄烟烟叶。本发明通过选用能显著降低雪茄烟特有亚硝胺的三个菌种，将该单一或混合菌种发酵制备菌液并运用于雪茄烟晾制和发酵过程，结合晾制和发酵过程温湿度控制，实现雪茄烟特有亚硝胺的高效定向降解，且抗逆性好、操作简便，具有较高的推广应用价值。

Description

一种利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法

技术领域

本发明属于烟草工业技术领域，具体涉及一种操作简便，能高效定向降解雪茄烟TSNAs含量且抗逆性好的利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法。

背景技术

亚硝胺(TSNAs)是烟草特有的N-亚硝胺基类化合物，是一种存在于烟草中的有害物质，同时也是影响人体健康的主要有害物质之一。在目前已鉴定出的8种TSNAs中，N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基-亚硝氨)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT) 和N-亚硝基假木贼碱 (NAB) 4种含量较高。早在1962年，国际上就首次报道了关于烟草特有亚硝胺(TSNAs)的潜在致癌作用，导致人类肺部、口腔、食道、胃、胰脏、肝脏等部位形成肿瘤。另有研究证明，NNN与NNK均为动物强致癌物，其危害性通过不吸烟而长期闻鼻烟者口腔癌的高发率研究中得到证实。因此，降低烟草亚硝胺(TSNAs)对提高烟草的品质和安全性至关重要，成为近年的研究热点。

研究表明，亚硝胺(TSNAs)在成熟采收的鲜烟叶中含量极低，其主要在烟叶调制过程中产生和积累。前人虽已在多方面探索了降低烟叶中亚硝胺(TSNAs)的方法，其中多涉及烤烟、卷烟等，包括使用装置、烟叶调制、改进工艺等，但整体效果并不十分明显，而且针对雪茄烟亚硝胺(TSNAs)降解的方法鲜有报道，因此，通过接种菌种降低雪茄烟TSNAs是值得研究的一个方向。雪茄烟烟叶亚硝胺(TSNAs)降解的实现，对提高烟草品质，减轻烟草特有亚硝胺(TSNAs)对人体健康及生活环境带来的危害均具有非常重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种操作简便，能高效定向降解雪茄烟TSNAs含量且抗逆性好的利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法。

本发明是这样实现的：包括采收、晾制、发酵步骤，具体步骤如下：

A、采收：采收成熟度适宜的鲜烟叶；

B、晾制：将采收的鲜烟叶在晾房内逐步干燥，干燥过程中分2次用05-101、J45、J54中至少一种菌种配制的OD₆₀₀值为1的菌液接种；

C、发酵：将晾制后的烟叶采用集中堆垛进行发酵，发酵过程中分2次用05-101、J45、J54中至少一种菌种配制的OD₆₀₀值为1的菌液接种，即可得到低TSNAs的雪茄烟烟叶。

本发明的有益效果为：

1、本发明首次将菌种用于雪茄烟晾制和发酵过程以降低TSNAs含量，雪茄烟烟叶的特有亚硝胺(TSNAs)含量降低幅度高达35%。

2、本发明通过特别筛选的05-101（保藏编号为CCTCC NO：M2019665）、J45（保藏编号为CCTCC NO：M2019666）、J54（保藏编号为CCTCC NO：M2019667）菌种，菌种使用成本低，菌液应用于雪茄烟烟叶的操作便捷，在晾制发酵过程中即可以达到降TSNAs的目的。

3、本发明基于05-101、J45、J54菌种的自身繁衍特性，通过在晾制和发酵过程中调控温、湿度计温度和时间，给菌种提供了适于生存的环境，从而提高接种菌种的存活率及活跃度，提高了TSNAs的降解率，从而显著降低了雪茄烟TSNAs对人体健康及生活环境带来的危害。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。

本发明包括采收、晾制、发酵步骤，具体步骤如下：

A、采收：采收成熟度适宜的鲜烟叶；

B、晾制：将采收的鲜烟叶在晾房内逐步干燥，干燥过程中分2次用05-101、J45、J54中至少一种菌种配制的OD₆₀₀值为1的菌液接种；

C、发酵：将晾制后的烟叶采用集中堆垛进行发酵，发酵过程中分2次用05-101、J45、J54中至少一种菌种配制的OD₆₀₀值为1的菌液接种，即可得到低TSNAs的雪茄烟烟叶。

所述05-101菌种的保藏编号为CCTCC NO：M2019665，所述J45菌种的保藏编号为CCTCC NO：M2019666，所述J54菌种的保藏编号为CCTCC NO：M2019667。

所述B步骤和/或C步骤中OD₆₀₀值为1的菌液是将菌种在25～30℃下培养48～72h得发酵菌剂，然后将发酵菌剂与灭菌清水混合得到OD₆₀₀值为1的菌液，所述菌液的每次使用量为烟草重量的3～5%。

所述B步骤中采收的鲜烟叶茄衣采用针穿挂杆晾制且茄心采用烟杆绑烟叶晾制。

所述B步骤中鲜烟叶干燥过程根据烟叶叶色的变化分为凋萎、变黄、变棕、定色、干筋五个阶段，共计需调制时间25～32d，其中：

凋萎期：把采收的烟叶挂在温度为20~30℃，湿度为40~70％的遮荫大棚中,期间白天通风排湿，晚上关闭，鲜烟叶1d后，叶片较嫩部分出现小卷筒，烟叶进入萎蔫阶段，再经2～3d，叶片变软凋萎，叶尖叶缘变黄；

变黄期：经凋萎期后，继续在温度为20～25℃、相对湿度80～85%的条件下维持5～7d，至烟叶颜色由绿变黄，叶片变软，在变黄的最后阶段，氧化反应让烟叶表面呈褐色；

变棕期：经变黄期后，白天通风排湿，晚上关闭，继续在温度25～30℃、相对湿度70～75%的条件下保持5～7d，至叶色转变成红褐色，红褐相间，边变黄边变褐，叶尖叶缘干燥；

定色期：经变棕期后，通风排湿装置白天全开，晚上关闭，继续在温度32～35℃、相对湿度45～55%的条件下保持7~8d，至叶色红褐或红棕色，叶片两则支脉全干，主脉干至7成；

干筋期：经定色期后，通风排湿装置白天半开或微开，晚上关闭或微开，在温度35～40℃、相对湿度30～40%的条件下保持5～6d，至主脉全干，晾制结束。

所述B步骤中菌液分别在晾制的变黄期开始阶段和定色期开始阶段分别均匀喷洒于烟叶上进行接种。

所述C步骤中烟叶采用集中堆垛进行发酵，发酵过程分为茄芯发酵和茄衣发酵两个阶段，其中：

茄芯发酵：发酵前将烟叶水分调节至22～26%，然后在温度25～28℃、相对湿度73～77%的条件下发酵70～74d；

茄衣发酵：发酵前烟叶水分调节至22～26%，然后在温度25～28℃、相对湿度73～77%的条件下发酵50～54d。

所述茄芯发酵过程中温度达到46℃对烟叶进行翻堆处理，所述茄衣发酵过程中温度达到43℃对烟叶进行翻堆处理。

所述茄芯发酵和茄衣发酵过程中，菌液分别在发酵开始时和发酵20～22d时均匀喷洒于烟叶上进行接种。

所述A步骤中成熟度适宜的鲜烟叶按照部位分为上部叶、中部叶、下部叶，其中：

下部叶：叶色浅绿或绿中微带黄，主脉发白、支脉嫩白色，叶面平滑发亮呈青带微黄，腺毛部分脱落，叶尖微枯黄的烟叶；

中部叶：叶色淡绿或绿中透黄，主脉白亮、支脉浅白色，叶面微皱发亮呈绿黄色，有成熟斑，叶尖叶缘下垂，腺毛基本脱落，茎叶角度增大的烟叶；

上部叶：叶色黄绿或黄中带绿，主脉白亮、支脉白色，叶面较皱发亮呈黄绿色，成熟斑明显，腺毛大部分脱落，茎叶角度较大，叶尖微枯黄的烟叶。

实施例1

S100：采收云南省临沧市耿马县成熟度适宜的烟株上部叶、中部叶、下部叶，其中：

下部叶采集叶色浅绿或绿中微带黄，主脉发白、支脉嫩白色，叶面平滑发亮呈青带微黄，腺毛部分脱落，叶尖微枯黄的烟叶。

中部叶采集叶色淡绿或绿中透黄，主脉白亮、支脉浅白色，叶面微皱发亮呈绿黄色，有成熟斑，叶尖叶缘下垂，腺毛基本脱落，茎叶角度增大的烟叶。

上部叶采集叶色黄绿或黄中带绿，主脉白亮、支脉白色，叶面较皱发亮呈黄绿色，成熟斑明显，腺毛大部分脱落，茎叶角度较大，叶尖微枯黄的烟叶。

S200：将采收的鲜烟叶茄衣采用针穿挂杆及茄心采用烟杆绑烟叶在晾房内逐步干燥，干燥过程根据烟叶叶色的变化分为五个阶段：凋萎、变黄、变棕、定色、干筋，其中：

凋萎期：把采收的烟叶挂在温度为20~30℃，湿度为40~70％的遮荫大棚中,期间白天通风排湿，晚上关闭，鲜烟叶1d后叶片较嫩部分出现小卷筒，烟叶进入萎蔫阶段，再经3d后叶片变软凋萎，叶尖叶缘变黄。

变黄期：经凋萎期后，继续在温度为23℃、相对湿度85%的条件下维持7d，至烟叶颜色由绿变黄，叶片变软；在变黄的最后阶段，氧化反应让烟叶表面呈褐色。

变棕期：经变黄期后，白天通风排湿，晚上关闭，继续在温度28℃、相对湿度75%的条件下保持6d，至叶色转变成红褐色，红褐相间，边变黄边变褐，叶尖叶缘干燥；

定色期：经变棕期后，通风排湿装置白天全开，晚上关闭，继续在温度33℃、相对湿度50%的条件下保持7d，至叶色红褐或红棕色，叶片两则支脉全干，主脉干至7成；

干筋期：经定色期后，通风排湿装置白天半开或微开，晚上关闭或微开，在温度38℃、相对湿度35%的条件下保持6d，至主脉全干，晾制结束。

S300：将晾制后的烟叶采用集中堆垛进行发酵，发酵过程分为茄芯发酵和茄衣发酵两个阶段，其中：

茄芯发酵：发酵前将茄芯水分调节至24%，然后在温度27℃、相对湿度75%的条件下发酵74d，发酵过程中温度达到46℃对烟叶进行翻堆处理。

茄衣发酵：发酵前将茄衣水分调节至24%，然后在温度27℃、相对湿度75%的条件下发酵54d，发酵过程中温度达到43℃对烟叶进行翻堆处理。

实施例2

在实施例1的基础上，在雪茄烟的晾制过程中分别接种05-101、J45、J54以及混合菌种，测定其在雪茄烟亚硝胺（TSNAs）降解中的作用。

实验一过程：

将经过分离、筛选及纯化工序获得的05-101、J45、J54菌种在25～30℃下培养60h得发酵菌剂，然后将发酵菌剂与灭菌清水混合得到OD₆₀₀值为1的菌液。在雪茄烟的晾制过程中，依次将按烟叶重量4%的菌液在晾制变黄期开始时和定色期开始时分别均匀喷洒于烟叶上进行接种。

此实验设置4个处理（TI、T2、T3、T4、CK），其中：以实施例1未接种菌种作为对照（CK）；T1菌液采用05-101菌种配制；T2菌液采用J45菌种配制；T3菌液采用J54菌种配制；T4菌液采用05-101、J45、J54三种菌种按1：1：1的重量比混合配制。实验结束，测定调制完成雪茄烟亚硝胺（TSNAs）的含量如表1。

表1 晾制过程接种菌种后雪茄烟TSNAs含量

实施例3

在实施例1的基础上，在雪茄烟的发酵过程中分别接种05-101、J45、J54以及混合菌种，测定其在雪茄烟亚硝胺（TSNAs）降解中的作用。

实验二过程：

将经过分离、筛选及纯化工序获得的05-101、J45、J54菌种在25～30℃下培养60h得发酵菌剂，然后将发酵菌剂与灭菌清水混合得到OD₆₀₀值为1的菌液。在雪茄烟的发酵过程中，依次将按烟叶重量4%的菌液在发酵开始时和发酵21d时分别均匀喷洒于烟叶上进行接种。

此实验设置4个处理（TI、T2、T3、T4、CK），其中：以实施例1未接种菌种作为对照（CK）；T1菌液采用05-101菌种配制；T2菌液采用J45菌种配制；T3菌液采用J54菌种配制；T4菌液采用05-101、J45、J54三种菌种按1：1：1的重量比混合配制。实验结束，测定调制完成雪茄烟亚硝胺（TSNAs）的含量如表2。

表2 发酵过程接种菌种后雪茄烟TSNAs含量

实施例4

在实施例1的基础上，在雪茄烟的晾晒和发酵过程中分别接种05-101、J45、J54以及混合菌种，测定其在雪茄烟亚硝胺（TSNAs）降解中的作用。

实验三过程：

将经过分离、筛选及纯化工序获得的05-101、J45、J54菌种在25～30℃下培养60h得发酵菌剂，然后将发酵菌剂与灭菌清水混合得到OD₆₀₀值为1的菌液。在雪茄烟的晾制过程中，依次将按烟叶重量4%的菌液在晾制变黄期开始时和定色期开始时分别均匀喷洒于烟叶上进行接种。然后在雪茄烟的发酵过程中，依次将按烟叶重量4%的菌液在发酵开始时和发酵21d时分别均匀喷洒于烟叶上进行接种。

此实验设置4个处理（TI、T2、T3、T4、CK），其中：以实施例1未接种菌种作为对照（CK）；T1菌液采用05-101菌种配制；T2菌液采用J45菌种配制；T3菌液采用J54菌种配制；T4菌液采用05-101、J45、J54三种菌种按1：1：1的重量比混合配制。实验结束，测定调制完成雪茄烟亚硝胺（TSNAs）的含量如表3。

表3 晾晒和发酵过程接种菌种后雪茄烟TSNAs含量

实验结果：

由表1可知，仅在雪茄烟晾制过程中接种菌种，其亚硝胺（TSNAs）含量平均降低了23.55%，三种菌种单独使用和混合使用效果相当；由表2可知，仅在雪茄烟发酵过程中接种菌种，其亚硝胺（TSNAs）含量平均降低了22.60%，三种菌种单独使用和混合使用效果相当；由表3可知，在雪茄烟晾制过程和发酵过程中分别接种菌种，其亚硝胺（TSNAs）含量平均降低了35.38%，三种菌种单独使用和混合使用效果相当。因此，05-101、J45、J54三种菌种可明显降低雪茄烟亚硝胺（TSNAs）含量，其在晾制过程和发酵过程都接种菌种的使用效果更好。

Claims (10)

1.一种利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于包括采收、晾制、发酵步骤，具体步骤如下：

A、采收：采收成熟度适宜的鲜烟叶；

B、晾制：将采收的鲜烟叶在晾房内逐步干燥，干燥过程中分2次用05-101、J45、J54中至少一种菌种配制的OD₆₀₀值为1的菌液接种；

C、发酵：将晾制后的烟叶采用集中堆垛进行发酵，发酵过程中分2次用05-101、J45、J54中至少一种菌种配制的OD₆₀₀值为1的菌液接种，即可得到低TSNAs的雪茄烟烟叶。

2.根据权利要求1所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述05-101菌种的保藏编号为CCTCC NO：M2019665，所述J45菌种的保藏编号为CCTCC NO：M2019666，所述J54菌种的保藏编号为CCTCC NO：M2019667。

3.根据权利要求2所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述B步骤和/或C步骤中OD₆₀₀值为1的菌液是将菌种在25～30℃下培养48～72h得发酵菌剂，然后将发酵菌剂与灭菌清水混合得到OD₆₀₀值为1的菌液，所述菌液的每次使用量为烟草重量的3～5%。

4.根据权利要求3所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述B步骤中采收的鲜烟叶茄衣采用针穿挂杆晾制且茄心采用烟杆绑烟叶晾制。

5.根据权利要求4所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述B步骤中鲜烟叶干燥过程根据烟叶叶色的变化分为凋萎、变黄、变棕、定色、干筋五个阶段，共计需调制时间25～32d，其中：

凋萎期：把采收的烟叶挂在温度为20～30℃，湿度为40～70％的遮荫大棚中,期间白天通风排湿，晚上关闭，鲜烟叶1d后，叶片较嫩部分出现小卷筒，烟叶进入萎蔫阶段，再经2～3d，叶片变软凋萎，叶尖叶缘变黄；

变黄期：经凋萎期后，继续在温度为20～25℃、相对湿度80～85%的条件下维持5～7d，至烟叶颜色由绿变黄，叶片变软，在变黄的最后阶段，氧化反应让烟叶表面呈褐色；

变棕期：经变黄期后，白天通风排湿，晚上关闭，继续在温度25～30℃、相对湿度70～75%的条件下保持5～7d，至叶色转变成红褐色，红褐相间，边变黄边变褐，叶尖叶缘干燥；

定色期：经变棕期后，通风排湿装置白天全开，晚上关闭，继续在温度32～35℃、相对湿度45～55%的条件下保持7~8d，至叶色红褐或红棕色，叶片两则支脉全干，主脉干至7成；

干筋期：经定色期后，通风排湿装置白天半开或微开，晚上关闭或微开，在温度35～40℃、相对湿度30～40%的条件下保持5～6d，至主脉全干，晾制结束。

6.根据权利要求5所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述B步骤中菌液分别在晾制的变黄期开始阶段和定色期开始阶段分别均匀喷洒于烟叶上进行接种。

7.根据权利要求3、4、5或6所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述C步骤中烟叶采用集中堆垛进行发酵，发酵过程分为茄芯发酵和茄衣发酵两个阶段，其中：

茄芯发酵：发酵前将烟叶水分调节至22～26%，然后在温度25～28℃、相对湿度73～77%的条件下发酵70～74d；

茄衣发酵：发酵前烟叶水分调节至22～26%，然后在温度25～28℃、相对湿度73～77%的条件下发酵50～54d。

8.根据权利要求7所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述茄芯发酵过程中温度达到46℃对烟叶进行翻堆处理，所述茄衣发酵过程中温度达到43℃对烟叶进行翻堆处理。

9.根据权利要求7所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述茄芯发酵和茄衣发酵过程中，菌液分别在发酵开始时和发酵20～22d时均匀喷洒于烟叶上进行接种。

10.根据权利要求2所述利用菌种降低雪茄烟烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述A步骤中成熟度适宜的鲜烟叶按照部位分为上部叶、中部叶、下部叶，其中：

下部叶：叶色浅绿或绿中微带黄，主脉发白、支脉嫩白色，叶面平滑发亮呈青带微黄，腺毛部分脱落，叶尖微枯黄的烟叶；

中部叶：叶色淡绿或绿中透黄，主脉白亮、支脉浅白色，叶面微皱发亮呈绿黄色，有成熟斑，叶尖叶缘下垂，腺毛基本脱落，茎叶角度增大的烟叶；

上部叶：叶色黄绿或黄中带绿，主脉白亮、支脉白色，叶面较皱发亮呈黄绿色，成熟斑明显，腺毛大部分脱落，茎叶角度较大，叶尖微枯黄的烟叶。