CN114449889A - 赋予对锈病病害的抗性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及赋予或增强小麦植物对叶锈病病害和条锈病病害的抗性或耐受性的多核苷酸。本发明还涉及使用赋予抗性的多核苷酸产生抗性或耐受性小麦植物的方法，以及如此产生的小麦植物。

Description

赋予对锈病病害的抗性的组合物和方法

发明领域

本发明涉及赋予或增强小麦植物对锈病病害叶锈病和条锈病的抗性或耐受性的多核苷酸，并且涉及对锈病病害是抗性的或耐受的包含该多核苷酸的小麦植物及其产生方法。

发明背景

叶锈病(由真菌小麦叶锈菌(Puccinia triticina tritici)引起的)和条(黄)锈病(由小麦条锈菌(Puccinia striiformis tritici)引起的)是主要的小麦疾病。叶锈病和条锈病每年引起巨大的产量损失。在过去的几年，在澳大利亚、中国、巴基斯坦、中亚和西亚、中东(叙利亚和土耳其)、印度和美国报告了条锈病爆发，指示病原菌的毒力改变(Wellings C R等人,2012.CAB International,第63-83页)。还示出的是，新的条锈病菌株开始适应更高的接种温度，这可以对病原菌的有害传播做出解释(Milus E A等人,2006.Plant Disease,90:847-852)。

沙融山羊草(Sharon goatgrass)(沙融山羊草(Aegilops sharonensis Eig))(AES)是小麦的野生二倍体(基因组S^shS^sh；2n＝14)亲缘植物(relative)。它原产于以色列和南黎巴嫩的海岸平原，在稳定化的沙丘上生长。由Olivera等人(Olivera P.D.等人2007.Plant Disease 91:942-950)，对在以色列收集的沙融山羊草品系的代表性样品完成的工作和来自谷物作物改进研究所(Institute for Cereal Crops Improvement)(ICCI，以色列)(Anikster Y.等人2005.Plant Disease 89:303-308)的数据揭示，许多登记物(accession)对以叶锈病病原菌或条锈病病原菌的接种是高度抗性的。在ICCI，1800个新收集的AES登记物的最近评价确证这些物种中对这些疾病的抗性的高频率。在许多这些品系中的遗传分析(Olivera P.D.等人.2008.Phytopathology98:353-358)说明抗性基因的单基因遗传。

尽管沙融山羊草S^sh基因组与四倍体小麦和六倍体小麦的B基因组紧密相关，然而两个基因组不能被认为是同源的。因此与从具有同源基因组的供体物种转移相比，从沙融山羊草的基因转移可能是更难的。技术问题(例如，开花的时间、花药开裂的时间)以及与小麦的固有的低的杂交性(crossability)导致非常低的杂交结实率(hybrid seed set)。其后，配对和染色体区段交换是稀少的。

已经利用不同的方法将来自野生亲缘植物的基因转移至小麦(例如，FeldmanM.1983.Acta Biol.Yugoslav.Genet.15:145-161；Millet E.2007.Isr.J.Plant Sci.55:277–287；Millet E等人，2007.CAB International第554-563页；Qi L等人，2007.Chrom.Res.15:3-19；Kilian B等人，2011.Aegilops.In Wild Crop Relatives:Genomic and Breeding Resources,Cereals.由C.Kole Springer-Verlag,BerlinHeidelberg编辑,第1-76页)，其中许多包括通过种间杂交的染色体复制和Ph基因的突变体的使用产生双倍体，Ph基因的突变体抑制部分同源配对，并且特别地ph1b等位基因允许这样的配对。

此外，沙融山羊草具有杀配子(Gc)基因(Maan S.1975.Crop Sci.15:287–292；Endo T R.1985.Jpn.J.Genet.60:125–135)。仅几个AES登记物已经在遗传研究中被使用，但其全部示出杀配子效应，如未能获得全纯系列的AES的添加品系所反映的。染色体4S^sh一直被包含在育种后代中的发现(Zhang H.等人2001.Theor.Genet 103:518-525)，支持以下论点：Gc基因引起其宿主染色体(hosting chromosome)的优先传递。其在植物中的存在伴随着不携带Gc基因的配子的染色体断裂，最终导致半不育穗型(semi-sterile spike)。

为了避免此杀配子效应，可以使用“抗杀配子”小麦突变体(Gc2^mut；Friebe B.等人2003.Chromosoma 111:509-517)，其赋予正常染色体分离，而不是携带杀配子基因的染色体的优先的传递。

尽管其对不同小麦疾病是高抗性的，然而沙融山羊草一直难以被开发以改进小麦。Marais等人(Marais G F等人,2003.S Afr J Plant Soil20:193-198)已经鉴定沙融山羊草中可能有用的抗性基因，所述抗性基因被基因渗入(introgress)到小麦常染色体中。在另外的研究中，将叶锈病抗性基因和条锈病抗性基因(称为Lr56/Yr38)从沙融山羊草转移至常见小麦的染色体6A中(Marais G F等人2006.Euphytica 149:373-380)。易位断裂在小麦染色体6A的长臂的区域内发生。发现Lr56/Yr38易位染色体是最有效的沙融山羊草染色体，其长臂的末端区段被小麦6AL染色体的对应区段替换。在降低转移的染色质的量的尝试中，他们在不存在部分同源配对抑制基因Ph1的情况下使用重组并且获得携带Lr56/Yr38连锁基因的插入的亚端粒小基因渗入(sub-telomeric small introgression)(Marais GF等人,2010.Euphytica 171:15-22)。

国际(PCT)专利申请公布第WO 1995/029238号和第WO 1999/045118号公开了赋予或以其他方式有助于植物中的抗病性，例如抵抗锈病和霉病的遗传序列。该申请提供了能够产生抗病性植物，特别是抗病性作物品种的携带主题遗传序列的转基因植物。

国际(PCT)专利申请公布第WO 2013/082335号涉及新的抗病性作物以及产生新的抗病性作物的方法。具体地，该申请公开了包含来自小麦有关的草(中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)和长穗偃麦草(Th.Ponticum))的四个高度有效的抗病性基因Lr19、Sr25、Bdv3以及Qfhs.pur-7EL(全部在小麦染色体7D的长臂上)的小麦遗传品系。预计这些基因在小麦遗传品系中保持互引，导致对黄矮病毒(yellow dwarf virus)、赤霉病(fusarium head blight)、茎锈病、以及叶锈病具有降低的易感性的小麦遗传品系。

国际(PCT)专利申请公布第WO 2014197505号公开了转基因小麦2174栽培品种以及用于制备该转基因栽培品种的方法，该转基因小麦2174栽培品种对由叶病原菌(包括叶锈病、条锈病、茎锈病和白粉病)以及大麦黄矮病毒引起的病害具有增加的抗性。这些方法涉及对2174进行遗传工程(转化)来以正确剪接的形式过量表达编码抗性基因LR34的cDNA。

本发明发明人的国际(PCT)专利申请公布第WO 2015/036995号公开了沙融山羊草登记号TH548的染色体6S^sh的大区段向小麦染色体6B跨越30cM位置至70cM位置的基因渗入，该基因渗入赋予或增强小麦植物对叶锈病病害和/或条锈病病害的抗性。在本发明的优先权日之后发表的本发明的发明人和合作者的论文描述了一个较短的区段，其特征在于赋予或增强对由高度毒性柄锈菌属(Puccinia)小种引起的叶锈菌病害和条锈菌病害二者的抗性的SNP标志物(Khazan S等人2020.BMC Plant Biology 20(153).doi.org/10.1186/s12870-020-2306-9)。

国际(PCT)专利申请公布第WO 2019197408号公开了一种分离的核酸，该分离的核酸编码包含锌指BED结构域的核苷酸结合且富含亮氨酸的重复(nucleotide-binding andleucine-rich repeat，NLR)多肽，其中NLR多肽在植物中的表达赋予或增强植物对真菌(例如小麦黄(条)锈病真菌小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici))的抗性。

公认的是，使用抗性品种是控制叶锈病和条锈病最有效且最经济的方式。然而，病原菌的高速变化会快速侵蚀锈病抗性基因的原始池。严重锈病爆发的发生率在过去几年已经加强，主要是因为出现了克服流行的锈病抗性来源的高度毒性病原菌小种(

M S等人，2016.Plant Pathol65:402–411；Liu T等人，2017.Plant disease 101:1522-1532)。由于进一步消除了小麦育种中使用的剩余锈病抗性来源，连同为病害爆发创造了有利条件的气候变化，这种情况预期会恶化(Lyon和Broders,2017)。因此，需要新的锈病抗性来源来增强小麦的锈病抗性基因池。此外，对于能够被引入小麦基因组而不会对小麦生长特性以及最重要的产量产生负面影响的赋予抗性的遗传元件存在需求。

因此，对于具有赋予或增强商业上农业小麦栽培品种对锈病病害的抗性而不负面影响小麦栽培品种的农业特性的遗传元件存在公认的需求且其将是高度有益的。

发明概述

本发明提供了赋予、增强或以其他方式促进在其基因组中包含多核苷酸序列的小麦植物和栽培品种对叶锈病病害和条锈病病害的抗性的这些序列。本发明还提供了对引起叶锈病病害和条锈病病害的高度毒性形式的柄锈菌属真菌抗性的小麦植物，包括抗性优良的小麦栽培品种。

本发明部分地基于以下意外发现：沙融山羊草染色体6S^sh(跨越6S^sh染色体的约34Mbp位置至约62Mbp位置之间)的短区段，其部分足以增强对叶锈菌病害和条锈菌病害的抗性。这一发现具有重要意义，使得将赋予抗性的区段转化至易感植物的遗传操作更容易。本发明还公开了将该区段或其一部分插入易感小麦栽培品种，特别是插入小麦染色体6B中约33Mbp位置至约50Mbp位置之间，导致赋予小麦对叶锈病病害和条锈病病害二者的显著抗性，而不会负面影响小麦栽培品种表型。

根据一方面，本发明提供了一种小麦植物，所述小麦植物在其基因组中包含赋予或增强所述小麦植物对叶锈病病害和条锈病病害的抗性的异源多核苷酸区段，其中所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源的核酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其部分。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些示例性实施方案，异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:2的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:2的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源的核酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:1中列出的核酸序列或其一部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，异源多核苷酸区段包含具有SEQ IDNO:1中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:3中列出的核酸序列或其一部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，异源多核苷酸区段包含具有SEQ IDNO:3中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:31中列出的核酸序列或其一部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，异源多核苷酸区段包含具有SEQ IDNO:31中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:23中列出的核酸序列或其部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，异源多核苷酸区段包含具有SEQ ID NO:23中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:2中列出的核酸序列或其部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，异源多核苷酸区段包含具有SEQ ID NO:2中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段的长度在约5Kbp至约28Mbp、约20Kbp至约15Mbp或约50Kbp至约1Mbp的范围内。根据一些实施方案，异源多核苷酸区段的长度是约5Kbp至约1Mbp、约5Kbp至约50Kbp或约5Kbp至约20Kbp。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含沙融山羊草登记物TH548的染色体6S^sh的片段，所述沙融山羊草登记物TH548的种子已经以登记号NCIMB 43567保藏于作为国际保藏机构的NCIMB Ltd.。根据某些实施方案，该片段包含存在于沙融山羊草染色体6S^sh从约34Mbp位置至约62Mbp位置中的核酸序列。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段包含指定为2-3HS2的核酸标志物，其中该标志物被一对引物扩增，该对引物包含含有SEQ ID NO:32中列出的核酸序列的正向引物和含有SEQ ID NO:33中列出的核酸序列的反向引物。

根据某些示例性实施方案，该标志物包含与SEQ ID NO:34至少90％同源的核酸序列。根据另外的某些示例性实施方案，标志物包含SEQ ID NO:34中列出的核酸序列。根据另外的或替代的实施方案，沙融山羊草染色体6S^sh的片段包含选自由以下组成的组的至少一个支架或其一部分：位于58Mbp周围的具有SEQ ID NO:1的核酸序列的支架19799；位于57.5Mbp周围的具有SEQ ID NO:3的核酸序列的支架00757；位于57.7Mbp周围的具有SEQ IDNO:31的核酸序列的支架1934717；位于56Mbp周围的具有SEQ ID NO:23的核酸序列的支架1549600；位于44Mbp周围的具有SEQ ID No:2的核酸序列的支架20860；位于32Mbp周围的具有SEQ ID NO:4的核酸序列的支架1540406；位于33Mbp周围的具有SEQ ID NO:5的核酸序列的支架1900261；位于34Mbp周围的具有SEQ ID No:6的核酸序列的支架1933170；位于35Mbp周围的具有SEQ ID No:7的核酸序列的支架1531163；位于35Mbp周围的具有SEQ ID NO:8的核酸序列的支架1927703；位于38Mbp周围的具有SEQ ID NO:9的核酸序列的支架1895355；位于38Mbp周围的具有SEQ ID NO:10的核酸序列的支架1931208；位于39Mbp周围的具有SEQID NO:11的核酸序列的支架1935984；位于42Mbp周围的具有SEQ ID NO:12的核酸序列的支架1913977；位于43Mbp周围的具有SEQ ID NO:13的核酸序列的支架1916860；位于44Mbp周围的具有SEQ ID NO:14的核酸序列的支架1891763；位于44Mbp周围的具有SEQ ID NO:15的核酸序列的支架1937448；位于46Mbp周围的具有SEQ ID NO:16的核酸序列的支架1896571；位于47Mbp周围的具有SEQ ID NO:17的核酸序列的支架1528020；位于47Mbp周围的具有SEQID NO:18的核酸序列的支架1935712；位于48Mbp周围或57Mbp周围的具有SEQ ID NO:19的核酸序列的支架1893110；位于51Mbp周围的具有SEQ ID NO:20的核酸序列的支架1898148；位于51Mbp周围的具有SEQ ID NO:21的核酸序列的支架1934541；位于56Mbp周围的具有SEQID NO:22的核酸序列的支架1538547；位于56Mbp周围的具有SEQ ID NO:24的核酸序列的支架1872406；位于58Mbp周围的具有SEQ ID NO:25的核酸序列的支架1889560；位于58Mbp周围的具有SEQ ID NO:26的核酸序列的支架75951；位于59Mbp周围的具有SEQ ID NO:27的核酸序列的支架1893791；位于61Mbp周围的具有SEQ ID NO:28的核酸序列的支架1892710；位于57.5Mbp周围的具有SEQ ID NO:29的核酸序列的支架1926247；位于57.4Mbp周围的具有SEQ ID NO:30的核酸序列的支架1929618；及其任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些示例性实施方案，沙融山羊草染色体6S^sh的片段包含支架19799、支架00757、支架1934717、支架1549600、支架20860及其片段中的至少一种。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，沙融山羊草染色体6S^sh的片段包含位于沙融山羊草染色体6S^sh的44Mbp位置周围的具有SEQ ID NO:2中列出的核酸序列或其一部分的支架20860。

根据某些实施方案，沙融山羊草染色体6S^sh的片段包含位于沙融山羊草染色体6S^sh的58Mbp位置周围的具有SEQ ID NO:1中列出的核酸序列或其一部分的支架19799。

根据某些实施方案，沙融山羊草染色体6S^sh的片段包含位于沙融山羊草染色体6S^sh的57.5Mbp位置周围的具有SEQ ID NO:3中列出的核酸序列或其一部分的支架00757。

根据某些实施方案，沙融山羊草染色体6S^sh的片段包含位于沙融山羊草染色体6S^sh的57.7Mbp位置周围的具有SEQ ID NO:31的核酸序列或其一部分的支架1934717。

根据某些实施方案，沙融山羊草染色体6S^sh的片段包含位于沙融山羊草染色体6S^sh的56Mbp位置周围的具有SEQ ID NO:23的核酸序列或其一部分的支架1549600。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段缺乏SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或其组合中列出的核酸序列。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段位于小麦植物的染色体6B中。根据某些示例性实施方案，异源多核苷酸区段位于小麦染色体6B中约33Mbp至约50Mbp之间的位置处。

根据某些实施方案，异源多核苷酸片段是还包含至少一种调节元件的核酸构建体。核酸构建体可以是转化载体、表达载体或其组合。

根据某些示例性实施方案，本发明的小麦植物是适于商业上农业生长的栽培品种，但不限于特定的物种、株系或品种。根据某些示例性实施方案，包含异源多核苷酸区段的小麦栽培品种是选自由圆锥小麦(Triticum turgidum)和普通小麦(Triticumaestivum)组成的组的物种。根据某些实施方案，小麦植物是优良农业栽培品种。

根据某些实施方案，小麦植物是对包含异源多核苷酸区段的染色体6B纯合的。根据其他实施方案，小麦植物是杂合的，包含天然小麦染色体6B和包含异源多核苷酸区段的染色体6B。

根据某些实施方案，包含异源多核苷酸区段的小麦植物与在其基因组中不包含该异源多核苷酸区段的对应的植物相比显示出增强的对叶锈病病害和条锈病病害的抗性或耐受性的表型。

根据一些实施方案，小麦植物包含功能性部分同源配对抑制基因Ph1。应明确地理解的是，小麦缺乏ph1突变等位基因。

根据另外的实施方案，小麦植物缺乏沙融山羊草杀配子Gc2基因和/或其突变体。

应明确地理解的是，本发明的小麦植物和小麦栽培品种是可育的。种子和可以用于繁殖的任何其他植物部分(包括分离的细胞和组织培养物)也涵盖在本发明的范围内。应当理解的是，由所述种子或其他繁殖材料产生的植物包含如本文描述的赋予或增强对叶锈病病害和条锈病病害的抗性的异源多核苷酸区段。

根据某些实施方案，叶锈病病害由真菌叶锈菌引起。根据某些示例性实施方案，叶锈病由小麦叶锈菌引起。根据某些实施方案，条锈病病害由真菌条锈菌引起。根据某些示例性实施方案，条锈病病害由小麦条锈菌引起。

根据另外的方面，本发明提供了一种小麦植物，所述小麦植物在其基因组中包含异源多核苷酸区段，所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列，其中所述多核苷酸赋予或增强所述小麦植物对由真菌柄锈菌属引起的病害的抗性。

异源多核苷酸区段如以上描述。根据某些实施方案，所述柄锈菌属是叶锈菌，并且病害是叶锈病。根据某些实施方案，所述柄锈菌属是条锈菌，并且病害是条锈病。

根据又另外的方面，本发明提供了一种用于产生对叶锈病病害和条锈病病害具有增强的抗性的小麦植物的方法，所述方法包括将异源多核苷酸区段引入对锈病病害易感的小麦植物的至少一个细胞中，从而产生与对应的对照植物相比对所述锈病病害具有增强的抗性的小麦植物，所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQID NO:1-31中任一项列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列。

根据某些实施方案，将异源多核苷酸区段引入易感小麦植物的至少一个细胞的染色体6B中。根据某些示例性实施方案，将异源多核苷酸区段引入小麦染色体6B中约33Mbp至约50Mbp之间的位置。

根据某些实施方案，小麦植物是如上文描述的小麦栽培品种。

根据某些实施方案，对照植物是对叶锈病病害和条锈病病害易感的小麦植物或小麦栽培品种。根据一些实施方案，对照植物缺乏该异源多核苷酸区段。根据某些实施方案，对照小麦植物具有相同的遗传背景。

如本领域技术人员已知的任何方法都可以用于将本发明的异源多核苷酸区段引入易感小麦植物中。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段是分离的多核苷酸或包含其的构建体。根据这些实施方案，异源多核苷酸区段通过将所述分离的多核苷酸或包含所述多核苷酸的构建体转化到易感小麦植物的至少一个细胞中来引入。根据某些实施方案，分离的多核苷酸通过使用人工工程化核酸酶使易感小麦植物的至少一个细胞经历基因组编辑来引入。

根据某些实施方案，异源多核苷酸区段形成沙融山羊草染色体6S^sh的一部分。根据某些示例性实施方案，沙融山羊草是上文描述的沙融山羊草登记物TH548。根据这些实施方案，异源多核苷酸区段在无需预先分离的情况下通过跨越约34位置至约64位置或其一部分的沙融山羊草染色体6S^sh片段向易感小麦植物的基因渗入被引入易感小麦植物。

根据另外的方面，本发明提供了一种用于选择对叶锈病病害和条锈病病害具有增强的抗性的小麦植物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供多于一个植物，每一个植物包含含有赋予或增强小麦栽培品种对叶锈病病害和条锈病病害的抗性的异源多核苷酸区段的至少一个细胞，其中所述异源多核苷酸区段与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源；并且

b.选择与对照小麦植物或预定抗性评分值相比对所述锈病病害显示出增强的抗性的植物；

从而选择对所述锈病病害具有增强的抗性的植物。

根据某些实施方案，对照植物是对锈病病害易感的小麦植物。根据一些实施方案，易感对照小麦植物具有相同的遗传背景。

根据某些实施方案，选择对锈病病害抗性的植物通过用各自的真菌接种该植物并且在表型上选择抗性的植物来进行。根据某些示例性实施方案，接种和选择在植物的幼苗期进行。

各自的真菌如上文描述。

根据另外的或替代的实施方案，选择对锈病病害抗性的植物通过检测小麦植物基因组中异源多核苷酸区段的存在来进行。如本领域已知的任何方法可以被用来检测异源多核苷酸区段。根据某些示例性实施方案，检测通过鉴定位于上文描述的异源多核苷酸区段中的至少一个支架的序列来进行。根据某些实施方案，检测通过鉴定至少一种序列特异性探针来进行，所述至少一种序列特异性探针在严格条件下与与SEQ ID NO:1-31的任一项或其一部分至少70％同源的核酸序列特异性杂交。

根据某些另外的示例性实施方案，检测通过鉴定标志物2-3HS2的存在来进行，所述标志物2-3HS2包含与SEQ ID NO:34中列出的核酸序列至少90％同源的核酸序列。根据一些实施方案，标志物2-3HS2的存在使用一对引物来鉴定，所述一对引物具有SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中列出的核酸序列。

根据某些实施方案，植物进一步地被选择以缺乏ph1突变基因。

根据又另外的方面，本发明提供了一种用于鉴定和选择对叶锈病病害和条锈病病害具有增强的抗性或耐受性的小麦植物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供多于一个小麦植物；

b.检查从所述多于一个小麦植物中的每一个获得的核酸样品中异源多核苷酸区段的存在，所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源；任选地

c.检查从所述多于一个小麦植物中的每一个获得的核酸样品中2-3HS2标志物的存在，所述2-3HS2标志物具有与SEQ ID NO:34中列出的核酸序列至少90％同源的核酸序列；并且

d.选择包含异源多核苷酸区段和/或2-3HS2标志物的小麦植物。

鉴定异源多核苷酸区段和/或2-3HS2标志物如本领域已知和如上文描述来进行。

根据某些实施方案，该方法还包括用各自的真菌接种包含异源多核苷酸区段的小麦植物，并且在表型上选择抗性的植物。根据某些示例性实施方案，接种和选择在植物的幼苗期进行。各自的真菌如上文描述。

根据又另外的方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列，其中所述分离的多核苷酸在引入小麦植物时，赋予或增强所述小麦植物对叶锈病病害和条锈病病害的抗性。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源的核酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架具有SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其部分。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些示例性实施方案，分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:2的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:2的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源的核酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1或其部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，分离的多核苷酸包含具有SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其一部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，分离的多核苷酸包含具有SEQ ID NO:2中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:3或其一部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，分离的多核苷酸包含具有SEQ ID NO:3中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:31中列出的核酸序列或其一部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，分离的多核苷酸包含具有SEQ ID NO:31中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:23中列出的核酸序列或其一部分至少95％同源的支架。根据一些实施方案，分离的多核苷酸包含具有SEQ ID NO:23中列出的核酸序列的支架。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含沙融山羊草登记物TH548的染色体6S^sh的片段，所述沙融山羊草登记物TH548的种子已经以登记号NCIMB 43567保藏于作为国际保藏机构的NCIMB Ltd.。根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含存在于沙融山羊草染色体6S^sh从约34Mbp位置至约62Mbp位置中的核酸序列。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含指定为2-3HS2的标志物，其中该标志物被一对引物扩增，该对引物包含含有SEQ ID NO:32中列出的核酸序列的正向引物和含有SEQ ID NO:33中列出的核酸序列的反向引物。

根据某些示例性实施方案，该标志物包含与SEQ ID NO:34至少90％同源的核酸序列。根据另外的某些示例性实施方案，标志物包含SEQ ID NO:34中列出的核酸序列。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸缺乏SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或其组合中列出的核酸序列。

根据另外的方面，本发明提供了包含根据本发明一些实施方案的分离的多核苷酸的核酸构建体，该核酸构建体还包含用于指导多核苷酸在植物细胞中表达的至少一种调节元件。根据某些实施方案，调节元件选自由启动子、增强子和翻译终止子序列组成的组。调节元件，特别是启动子，对于包含核酸构建体的植物可以是内源的或异源的。根据某些示例性实施方案，植物是小麦植物。

根据某些示例性实施方案，叶锈病由真菌叶锈菌引起。根据某些典型的实施方案，叶锈病由小麦叶锈菌引起。根据其他实施方案，条锈病由条锈菌引起。根据某些典型的实施方案，条锈病由小麦条锈菌引起。

根据又另外的方面，本发明提供了用于鉴定小麦植物对叶锈病病害和条锈病病害的抗性或耐受性的一对引物，该对引物包含具有SEQ ID NO:32中列出的核酸序列的一个引物和具有SEQ ID NO:33中列出的核酸序列的另一个引物。

根据某些实施方案，该对引物扩增叶锈病和条锈病抗性的标志物，该标志物具有与SEQ ID NO:34至少90％同源的核酸序列。根据某些示例性实施方案，该对引物扩增叶锈病和条锈病抗性的标志物，该标志物具有SEQ ID NO:34中列出的核酸序列。应当理解的是，本文公开的方面和实施方案的每一个的任何组合都明确涵盖在本发明的公开内容中。

本发明的其他目的、特征和优点从以下描述和附图将变得清楚。

附图简述

图1是用于衍生二级重组体和三级重组体的程序的示意图。R和r分别表示一个或更多个外源(alien)抗性基因的存在或不存在。Ph和ph分别表示Ph1和ph1b等位基因。HP-部分同源配对。百分比值是计算出的Galil染色质比率。

图2示出了对沙融山羊草与面包小麦之间染色体6B中的SNP进行的Fisher精确检验的(–)log P值(基于与中国春(CS)基因组的比对)。X轴表示CS基因组上每个SNP(用圆圈表示)的位置。Y轴是Fisher精确检验的(–)log P值。图2A：SNP的总数目。图2B：放大潜在的SNP的区域。具有(–)log p>16的SNP被加框。

图3示出了表示用于评价区段边界的所有PCR标志物的凝胶电泳。Galil是易感的优良栽培品种(缺乏条带表示不存在沙融山羊草区段)。品系42是用作阳性对照的初级重组体之一。R-6是具有朝向长臂端粒缩短的区段的二级重组体的实例，R-10是朝向短臂端粒重组的二级重组体的实例。

图4示出了根据用PCR标志物1-9进行的分析的染色体6B构成(表3)。呈现的小麦品系包括12个二级重组体品系(指定为R-[编号])，一个三级重组体品系(P-37)(具有比初级重组体品系42中更短的外源区段)，衍生自R-10和R-18杂交的R-1018-8品系，以及衍生自R-10和R-16杂交的R-1016-10品系。Galil是没有沙融山羊草区段的易感优良栽培品种。跨越重组体染色体6B的0-140Mb的区段被分成4个以标志物为边界的区域。符号+和-分别指示存在和不存在标志物；深灰色和浅灰色分别表示存在或不存在沙融山羊草区段。加框(中间)区域是所有抗性的重组体中存在的外源区域。区域I和区域II是左延伸(朝向短臂端粒)；区域III和区域IV是右延伸(朝向长臂端粒)。

图5示出了用于评价区段的PCR标志物的出现频率。从用所有标志物筛选的20个候选物中计算频率。

图6示出了对通过喷洒条锈病分离株#5006进行的田间接种的反应量度。^*VR＝非常抗性的；R＝抗性的；MS＝中度易感；S＝易感；VS＝非常易感。

图7示出了重组体染色体6B的结构。

发明详述

本发明公开了赋予或增强小麦植物对锈病病害(特别是由物种柄锈菌属的真菌引起的叶锈病病害和条锈病病害(后者也被称为黄锈病病害))的抗性的新颖核酸序列。本发明还提供了在基因组中包含异源多核苷酸区段的小麦植物及其产生方法，所述异源多核苷酸区段包含对真菌显示出增强的抗性或耐受性的赋予抗性的核酸序列。本发明还提供了用于鉴定对叶锈病病害和条锈病病害的抗性的标志物。

定义

术语“包含/包括(comprise)”、“包含/包括(comprising)”、“包括/包含(includes)”、“包括/包含(including)”、“具有(having)”和其同源词意指“包括但不限于”。

术语“由...组成(consisting of)”意指“包括并限于”。

术语“基本上由...组成(consisting essentially of)”意指，组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅当该另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变请求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征的情况下。

除非上下文另外清楚指明，如本文使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。例如，提及多核苷酸的术语“一部分”可以包括多于一个多核苷酸部分，包括其混合物。

如本文使用的术语“约”是指数值±10％。

无论何时本文指示数值范围，其意在包括所指示的范围内的任何引用的数值(分数或整数)。措辞“从”第一指示数字且“至”第二指示数字意指包括第一指示数字和第二指示数字以及其之间的所有分数和整数。

本文以它的最广泛的含义使用术语“植物”。其还指大部分分化成在植物的发育的任何阶段存在的结构的多个植物细胞。这样的结构包括但不限于根、茎、芽、叶、花、花瓣、果实等。根据某些示例性实施方案，术语“小麦植物”是指禾本科(Poaceae)(禾本科(Gramineae)小麦族(tribe Triticeae)的圆锥小麦硬质小麦亚种(Triticum turgidumsubsp.durum)(圆锥小麦＝通心粉小麦)和普通小麦普通小麦亚种(T.aestivumsubsp.aestivum)(六倍体小麦＝面包小麦＝普通小麦)。

本文使用术语“栽培品种”(缩写cv.)表示具有生物学状态而不是“野生”状态的植物，“野生”状态指示植物或登记物的原始的非栽培状态或天然状态。术语“栽培品种”(对于栽培的植物)包括但不限于半天然的、半野生的、似杂草的、传统的栽培品种、地方品种(landrace)、育种材料、研究材料、繁殖的品系、合成的种群、杂交种、建立者原种/基本种群、自交品系(杂交栽培品种的亲本)、分离种群、突变体/遗传原种、以及高级的/改进的栽培品种。如本文所使用的术语包括注册的以及非注册的品系。栽培品种的实例包括属于物种圆锥小麦和普通小麦(Triticum aestivum)的这样的栽培的变种，包括但不限于“中国春”(CS)和“Galil”。

术语“沙融山羊草(Aegilops sharonensis)”或“沙融山羊草(Ae.haronensis)”或“AES”在本文可交换地被使用并且涉及对由物种柄锈菌属的真菌，特别地由叶锈菌和/或条锈菌引起的疾病抗性的野生型植物。根据有些示例性实施方案，该术语是指对叶锈菌和条锈菌两者是抗性的并且因此对叶锈病和条锈病是抗性的沙融山羊草登记物TH548。沙融山羊草TH548的种子已由Ramot at Tel Aviv University Ltd.Israel(是本发明申请人(技术创新动力基金(以色列)有限合伙公司(Technology Innovation Momentum Fund(Israel)Limited Partnership))的共同管理人)根据并满足关于为专利程序目的对微生物保藏进行国际承认的布达佩斯条约的要求于2020年1月31日以登记号NCIMB 43567保藏于国家工业、食品和海洋微生物保藏中心(the National Collection of Industrial,Food and Marine Bacteria，NCIMB)(NCIMB Ltd,Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA Scotland)。这样的登记物也以编号AE-548-4从Tel Aviv University谷物作物改良研究所的Harold and Adele Lieberman种质库(https://www.genesys-pgr.org/wiews/ISR003)可得。

如本文使用的术语“抗性的(resistant)”和“抗性(resistance)”是指当与在相似环境条件和害虫或病原菌压力下的易感植物品种相比时，植物品种限制特定害虫或病原菌的生长和发育和/或它们引起的损害的能力。这些术语涵盖对感染的部分抗性和完全抗性二者。锈病抗性植物可以对由真菌柄锈菌属，特定地由叶锈菌和/或条锈菌，更特定地由小麦叶锈菌和/或小麦条锈菌的感染是完全抗性的或具有低水平的易感性。

术语“耐受(tolerant)完和“耐受性(tolerance)全在本文中用于指示植物的以下表型，其中当所述植物暴露于感染剂量的病原菌特别是真菌，以由此至少在一些培养条件下可以建立病原菌的存在时，至少一些病害症状保持不存在。因此，耐受植物对症状表现是抗性的，但对病原菌，特别是真菌是无症状携带者。

如本文使用的术语“易感的(susceptible)”和“易感性(susceptibility)”是指植物不能限制特定害虫或病原菌的生长和发育；易感植物显示出与病原菌感染，特别是真菌感染相关的有害症状。锈病易感性小麦植物可以对这些真菌是非抗性的或具有低水平的抗性。条锈病(也称为黄锈病，由真菌条锈菌引起)和叶锈病(由叶锈菌引起)是引起巨大的每年产量损失的两种毁灭性的小麦疾病。真菌病原菌频繁地改变，产生新的毒性类型并且因此克服当前部署的抗性基因。因此，主要的小麦基因库越来越是耗尽的并且需要新的抗性基因。小麦的野生亲缘植物仍是未开发的抗性基因库。

因此，“赋予对一种或更多种锈病病害的抗性”或“增强对一种或更多种锈病病害的抗性”是指这样的表型，其中植物，根据本发明的小麦植物，与对病原菌没有增强的抗性的小麦植物相比，具有更好的健康、生长、繁殖、育性、活力、强度(例如茎强度和抗性)、产量或与引起锈病病害的病原真菌感染相关的严重度降低的症状。在测试植物抗性的情况下，对照植物被用来评价植物抗性的程度。根据本发明的某些实施方案，对照植物是未被操作以在其基因组中包含本发明的赋予抗性或增强抗性的多核苷酸区段的植物。对照植物通常，但不一定，具有与被检查的植物相同的遗传背景。与对照植物相比，增强可以表现为在健康、生长、繁殖、育性、活力、强度或产量方面增加0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.75％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。与对照植物相比，增强可以是与真菌感染相关症状的0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.75％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的减少。根据某些示例性实施方案，检查的植物和对照植物在相同的条件下生长。

如本文使用的术语“基因座(locus)”(复数“基因座(loci)”)是指已被遗传定义的任何位点。基因座可以是单个位置(核苷酸)或染色体区域。一个基因座可以是一个基因、一个遗传决定簇或一个基因的一部分或一个DNA序列，并且可以被不同的序列占据。一个基因座也可以由一个SNP(单核苷酸多态性)、几个SNP或两个侧翼SNP来定义。根据某些实施方案，基因座在本文中被定义为给定基因或遗传决定簇在给定物种的染色体上占据的位置。

如本文使用的，术语“多核苷酸”是指以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、DNA序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)的形式分离和提供的单链或双链核酸序列。

如本文使用的，措辞“互补多核苷酸序列”是指使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶从信使RNA的逆转录产生的序列。这样的序列随后可以使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外扩增。

如本文使用的，措辞“复合多核苷酸序列”是指至少部分地互补和至少部分地基因组的序列。复合序列可以包括编码本发明多肽所需的一些外显子序列，以及插入其间的一些内含子序列。内含子序列可以来自任何来源，包括其他基因，并且通常将包括保守的剪接信号序列。这样的内含子序列还可以包括顺式作用表达调节元件。

术语“分离的”是指至少部分地与自然环境分离，例如与植物细胞分离。

当提及特定序列表时，这样的提及应理解为也涵盖大体上与其互补序列对应的序列，如包括由例如测序错误、克隆错误引起的微小的序列变异或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其他改变，条件是这样的变异的频率是50个核苷酸中少于1个，可选地100个核苷酸中少于1个，可选地200个核苷酸中少于1个，可选地500个核苷酸中少于1个，可选地1000个核苷酸中少于1个，可选地少于5000个核苷酸中少于1个，可选地10,000个核苷酸中少于1个。

提及多核苷酸如本文使用的术语“异源的”是指不是天然存在于植物特别是小麦植物中并且已经被人工引入该植物中的序列。

如本文使用的术语“杂合的”意指当不同等位基因(给定基因、遗传决定簇或序列的形式)存在于同源染色体上的对应的基因座时存在的遗传状态。

如本文使用的术语“纯合的”意指当相同的等位基因(给定基因、遗传决定簇或序列的形式)存在于同源染色体上的对应的基因座时存在的遗传状态。

术语“基因渗入(introgression)”、“基因渗入的(introgressed)”以及“基因渗入(introgressing)”是指将来自一个物种、品种或栽培品种的遗传背景的一个或更多个期望的等位基因(给定基因、遗传决定簇或序列的形式)易位到另一个物种、品种或栽培品种的基因组中。在一种方法中，一个或更多个期望的等位基因可以通过两个亲本之间的有性杂交被基因渗入，其中亲本中的一个在其基因组中具有期望的等位基因。期望的等位基因可以包括期望的一种或多于一种基因、标志物基因座、QTL或类似物。

术语“遗传工程”、“转化”和“遗传修饰”在本文都用于将分离的和克隆的基因、遗传决定簇或多核苷酸转移到另一个植物的DNA(通常染色体DNA或基因组)中，或将植物基因组中的基因修饰。

如本文使用的，术语“植物部分”通常是指小麦植物的一部分，包括单个细胞和细胞组织，例如在植物中完整的植物细胞、小麦植物可以从其再生的细胞团和组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自花粉、胚珠、叶、胚胎、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽以及种子的单个细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚胎、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、接穗、砧木、种子、原生质体、愈伤组织、以及类似物。

如本文使用的，术语“种群”是指共享常见遗传衍生(common geneticderivation)的植物的遗传上混杂的集合。

如本文使用的术语“连锁群”是指位于相同染色体上的所有基因或遗传性状。在连锁群中，足够邻近的那些基因座将一起在遗传杂交中呈现连锁。因为杂交概率随着在染色体上的基因之间的物理距离增大而增加，所以在连锁群中其位置彼此远离的基因可以在直接的遗传测试中不呈现任何可检测的连锁。

如本文使用的术语“标志物”是指其存在指示一种性状，特别是对条锈病病害和叶锈病病害中至少一种的抗性的核酸序列。

如本文使用的，术语“重叠群”是指一起表示DNA的共有区域的一组重叠的DNA区段。

如本文使用的，术语“支架”是指通常可以位于靶草图基因组或染色体上的连接在一起的相邻重叠群的顺序和取向。

本发明公开了迄今未鉴定的序列，当其存在于小麦植物的基因组中时，赋予或增强小麦植物对柄锈菌属真菌(特别是分别引起叶锈病病害和条锈病病害的叶锈菌和条锈菌)的感染的耐受性和/或抗性的序列。

根据某些方面，本发明提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含能够赋予或增强植物特别是小麦植物对由物种柄锈菌属的至少一种真菌引起的病害(特别是对叶锈病病害和条锈病病害)的抗性的核酸序列。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

该至少一个支架或支架的组合可以包含单个赋予抗性/耐受性的基因或多于一个赋予抗性/耐受性的基因，通常是两个或三个基因。根据一些实施方案，至少一个支架包含单个赋予抗性/耐受性的基因。根据一些实施方案，至少一种支架包含两个赋予抗性/耐受性的基因。根据一些实施方案，至少一个支架包含三个赋予抗性/耐受性的基因。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含至少一个支架，该至少一个支架具有与具有选自由SEQ ID NO:1-31组成的组的核酸序列及其一个或更多个部分的多核苷酸至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多同源或相同的核酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些示例性实施方案，分离的多核苷酸包含支架，该支架具有与SEQ ID NO:1中列出的核酸序列至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多同源或相同的核酸序列。

根据某些另外的或替代的示例性实施方案，分离的多核苷酸包含支架，该支架具有与SEQ ID NO:2中列出的核酸序列至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多同源或相同的核酸序列。

根据某些进一步另外的或替代的示例性实施方案，分离的多核苷酸包含支架，该支架具有与SEQ ID NO:3中列出的核酸序列至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多同源或相同的核酸序列。

根据某些进一步另外的或替代的示例性实施方案，分离的多核苷酸包含支架，该支架具有与SEQ ID NO:23中列出的核酸序列至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多同源或相同的核酸序列。

根据某些进一步另外的或替代的示例性实施方案，分离的多核苷酸包含支架，该支架具有与SEQ ID NO:31中列出的核酸序列至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多同源或相同的核酸序列。

如本文使用的，术语“同源性(homology)”或“同源的(homologous)”在关于核酸序列使用时是指至少两个核苷酸序列之间的相似性或同一性程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即同一性)。“序列同一性”是指两个或更多个核苷酸序列之间相关性的度量，以相对于总比较长度的百分比表示。同一性计算考虑了那些在其各自序列中相同且处于相同相对位置的核苷酸残基。空位，即对齐时一个序列中存在一个残基而另一个序列中不存在残基的位置，被认为是具有不相同残基的位置。同一性(例如，同源性百分比)可以使用任何同源性比较软件，包括，例如，美国国家生物技术信息中心(the National Center ofBiotechnology Information，NCBI)的BlastN软件，诸如通过使用默认参数来确定。用于进行序列比对的广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson，等人Nucl.AcidsRes.,22:4673-4680,1994)。

根据本发明的一些实施方案，同源性或同一性是全局同源性或同一性，即针对本发明的整个核酸序列，而不是针对其部分的同源性或同一性。

根据本发明的一些实施方案，同源性或同一性是部分同源性或同一性，即针对本发明核酸序列的一个或更多个片段，而不是针对整个核酸序列的同源性或同一性。

根据某些示例性实施方案，分离的多核苷酸包含与表1中描述的SEQ ID NO:1-31的任一项的至少一个片段至少80％同源的核酸序列。

根据一些实施方案，分离的多核苷酸包含与表1中描述的SEQ ID NO:1-31的任一项的至少一个片段至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多同源或相同的核酸序列。

表1：支架片段

根据某些实施方案，分离的多核苷酸的长度在以下范围内：约5Kbp至约28Mbp、约5Kbp至约15Mbp、约5Kbp至约13.6Mbp、约5Kbp至约1Mbp、约20Kbp至约28Mbp、约20Kbp至约15Mbp、约20Kbp至约13.6Mbp、约20Kbp至约1Mbp、约50Kbp至约28Mbp、约50Kbp至约15Mbp、约50Kbp至约13.6Mbp、约50Kbp至约1Mbp。根据一些实施方案，分离的多核苷酸的长度是约5Kbp至约1Mbp、约5Kbp至约50Kbp或约5Kbp至约20Kbp。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含上文描述的沙融山羊草登记物TH548的染色体6S^sh片段的核酸序列。根据某些实施方案，分离的多核苷酸包含存在于沙融山羊草染色体6S^sh从34Mbp位置至62Mbp位置中的核酸序列。应当明确理解的是，本发明的分离的多核苷酸可以包括沙融山羊草染色体6S^sh跨越34Mbp位置至62Mbp位置的整个片段或其片段。

根据某些示例性实施方案，分离的多核苷酸包含指定为2-3HS2的标志物，其中该标志物被一对引物扩增，该对引物包含含有SEQ ID NO:32中列出的核酸序列的正向引物和含有SEQ ID NO:33中列出的核酸序列的反向引物。

根据某些示例性实施方案，该标志物包含与SEQ ID NO:34至少90％同源的核酸序列。根据另外的某些示例性实施方案，该标志物包含与SEQ ID NO:34中列出的核酸序列至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多同源或相同的核酸序列。

根据另外的方面，本发明提供了包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，该核酸构建体还包含用于指导核酸序列在宿主植物细胞中转录的至少一个调节元件。

根据某些实施方案，调节元件选自由增强子、启动子、翻译终止序列等组成的组。根据本发明的一些实施方案，调节序列与分离的多核苷酸可操作地连接。

如果调节序列能够对与其连接的编码序列施加调节作用，则核酸序列(特别是编码核酸序列)与调节序列(例如，启动子)“可操作地连接”。

根据某些实施方案，核酸构建体是包含与本发明的多核苷酸可操作地连接的启动子的表达载体。

如本文使用的，术语“启动子”是指置于基因转录起始位点上游、与RNA聚合酶结合以启动RNA的转录的DNA区域。启动子控制基因在何处(例如，植物的哪一部分)和/或何时(例如，在生物体或其细胞生命的哪个阶段或条件)表达。

根据本发明的一些实施方案，启动子对于分离的多核苷酸和/或宿主细胞是异源的。

如本文使用的，措辞“异源启动子”是指来自不同物种或来自相同物种但来自与分离的多核苷酸序列不同的基因基因座的启动子。

本发明的核酸构建体可以使用任何适合的启动子序列。优选地，启动子选自由组成型启动子、组织特异性或生物胁迫特异性启动子组成的组，特别是真菌感染诱导型启动子。根据本发明的一些实施方案，启动子是适于在小麦植物细胞中表达本发明的分离的多核苷酸的植物启动子。

适于在小麦中使用的启动子包括但不限于小麦Lr67基因的启动子(Moore,J.等人2015.Nat Genet 47,1494–1498.Doi:10.1038/ng.3439)；小麦Lr21基因的启动子(Huang l等人，2003.Genetics 164(2):655-664)；野生小麦Yr36基因的启动子(Fu D.等人，2009.Science 323(5919):1357-1360.Doi:10.1126/science.1166289)和组成型花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell JT等人，Nature 313:810-812,1985)。

本发明的核酸构建体还可以包含至少一个标志物(报告物)基因，其与调节元件(例如启动子)可操作地连接，所述调节元件允许通过负选择(通过抑制不包含选择标志物基因的细胞的生长)，或通过正选择(通过筛选由标志物基因编码的产物)回收包含标志物的转化的细胞。用于植物转化的许多常用的可检测的标志物基因是本领域已知的，并且包括例如编码代谢地解毒选择性化学剂(可以是抗生素或除草剂)的酶的基因，或编码对抑制剂不敏感的改变的靶的基因。若干正选择法在是本领域已知的，例如甘露糖选择法。可选地，无标志物转化(marker-less transformation)可以被使用以获得无提及的标记基因的植物，该技术是本领域已知的。

是转化载体、表达载体或其组合的根据本发明的构建体可以是，例如，质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。

本发明的多核苷酸和包含其的构建体可以通过本领域已知的任何方法化学合成。

包含如本文公开的赋予或增强对锈病病害的抗性的多核苷酸的核酸构建体可以用于产生对叶锈病病害和条锈病病害具有增强的抗性或耐受性的小麦植物。根据某些实施方案，将赋予抗性的多核苷酸或包含其的构建体引入易感的小麦植物，通常是用于农业的小麦栽培品种中。

赋予抗性的核酸序列可以通过如本领域技术人员已知的任何方法引入受体小麦植物中。根据某些实施方案，根据本发明的教导，分离的多核苷酸或包含其的构建体可以通过转化引入。转化任选地随后是选择包含赋予抗性序列以及呈现对真菌病害条锈病和叶锈病的抗性的后代植物。

根据某些实施方案，本发明提供了一种用于产生对叶锈病病害和条锈病病害具有增强的抗性的小麦植物的方法，所述方法包括将异源多核苷酸区段引入对锈病病害易感的小麦植物的至少一个细胞中，所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31中任一项列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列，从而产生与对应的对照植物相比对所述锈病病害具有增强的抗性的小麦植物。

异源多核苷酸区段或包含其的构建体如上文描述。

用于以根据本发明的核酸序列转化植物细胞的方法是本领域已知的。如本文所使用的，术语“转化(transformation)”或“转化(transforming)”描述外来核酸序列，例如载体藉以进入受体细胞并且使受体细胞改变成转化的、遗传上修改的或转基因的细胞的过程。转化可以是稳定的，其中核酸序列被整合到植物基因组并且因此代表稳定的和遗传的性状，或瞬时的，其中核酸序列通过转化的细胞被表达，但不被整合到基因组中，并且因此代表瞬时的性状。根据典型的实施方案，本发明的核酸序列被稳定地转化到植物细胞中。

存在多种方法将外来核酸序列引入单子叶植物和双子叶植物两者中(例如，Potrykus I.1991.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42:205-225；Shimamoto K.等人，1989.Nature 338:274-276)。

将外源性DNA稳定地整合到植物基因组DNA中的主要方法包括两种主要方法：

土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的基因转移法：土壤杆菌属介导的系统包括使用包含界定的DNA区段的质粒载体，所述DNA区段被整合到植物基因组DNA。植物组织的接种的方法取决于植物物种和土壤杆菌属递送系统而不同。广泛使用的方法是叶盘法(leaf-disc procedure)，其可以用提供开始全植物分化的良好来源的任何组织外植体来进行(Horsch等人,1988.Plant Molecular Biology Manual A5,1-9,Kluwer AcademicPublishers,Dordrecht)。补充方法采用土壤杆菌属递送系统与真空渗透组合。用于小麦的土壤杆菌属介导的转化方案是本领域技术人员已知的。由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的小麦高效转化由以下描述：Ishida等人(Ishida Y.，等人In:OgiharaY.,Takumi S.,Handa H.(编著)Advances in Wheat Genetics:From Genome toField.Springer,Tokyo.DOI10.1007/978-4-431-55675-6_18)。直接核酸转移法：存在多种方法将核酸直接转移到植物细胞中。在电穿孔法中，将原生质体短暂地暴露至强电场，打开小孔以允许DNA进入。在微注射法中，使用微量移液管将核酸机械地直接注射进入细胞中。在微粒轰击法中，将核酸吸附在微粒，例如硫酸镁晶体或钨颗粒上，并且将微粒物理地加速进入细胞或植物组织中。用于将核酸引入植物中的另一种方法是通过靶细胞的超声处理。可选地，脂质体或原生质球融合已经被用于将表达载体引入植物中。

在小麦靶组织转化之后，使用本领域现在熟知的再生和选择法，上文描述的可选择的标记基因的表达允许转化的细胞、组织和/或植物的优先选择。

根据其他实施方案，本发明的赋予抗性的多核苷酸可以使用基因组编辑技术引入到易感小麦栽培品种的基因组中。这些技术对于将赋予抗性的多核苷酸引入到易感小麦的染色体6B中的预定位置特别有用。

基因组编辑是反向遗传学方法，它使用人工工程化核酸酶在基因组中所期望的一个或更多个位置处切割并产生特定的双链断裂，然后通过细胞内源过程诸如同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)进行修复。NHEJ在双链断裂处直接连接DNA末端，而HDR利用同源序列作为模板，用于在断裂点处再生缺失的DNA序列。为了将特定的核苷酸修饰引入至基因组DNA，在HDR期间必须存在包含所期望序列的DNA修复模板。基因组编辑不能使用传统的限制性内切核酸酶来进行，因为大多数限制性酶识别DNA上的几个碱基对作为它们的靶，并且识别的碱基对组合在跨越基因组的许多位置中将被发现的概率非常高，导致不限于期望的位置的多个切割。为了克服这一挑战并创造位点特异性单链或双链断裂，迄今已经发现并生物工程化了几种不同类别的核酸酶。这些包括兆核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。

如上文描述的，根据本发明的教导，赋予或增强对锈病病害的抗性的核酸序列已经被本发明的发明人在沙融山羊草登记物TH548的染色体6S^sh的跨越从34Mbp位置至62Mbp位置的片段上发现。

因此，根据替代的实施方案，赋予抗性的多核苷酸可以在无需预先从抗性沙融山羊草植物分离的情况下通过沙融山羊草染色体片段基因渗入小麦植物，优选地基因渗入用于农业商业上生长的小麦栽培品种而被易位。

沙融山羊草染色体片段如上文描述。

对叶锈病病害和条锈病病害抗性的植物可以通过检查如以上本文描述的至少一个支架和/或标志物的核酸序列的存在来选择。

根据某些方面，本发明提供了一种小麦植物，所述小麦植物在其基因组中包含赋予或增强所述小麦植物对叶锈病病害和条锈病病害的抗性的异源多核苷酸区段，其中所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

异源多核苷酸区段及其来源如上文描述。

根据又另外的方面，本发明提供了一种用于鉴定和选择具有增强的对叶锈病抗性和条锈病的抗性的小麦植物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供多于一个小麦植物；

b.检查从所述多于一个小麦植物中的每一个获得的核酸样品中异源多核苷酸区段的存在，所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源；任选地

c.检查从所述多于一个小麦植物中的每一个获得的核酸样品中具有SEQ ID NO:34中列出的核酸序列的标志物的存在；并且

d.选择包含所述异源多核苷酸区段的小麦植物。

这种方法可以被定义为“标志物辅助选择”，因为所期望的抗性表型的选择使用对赋予抗性的核酸序列特异性的核酸标志物进行。这样的标志物辅助选择特别有利，能够在商业上育种中选择小植株。

根据某些示例性实施方案，检查从多于一个小麦植物的每一个获得的核酸样品中赋予抗性或增强抗性的多核苷酸的存在的步骤包括使用一组双向引物。双向意指引物的取向是这样的，在核酸扩增反应中，一个作为正向引物起作用，并且一个作为反向引物起作用。双向引物通常用于基因组DNA的扩增反应，该扩增反应扩增赋予抗性或增强抗性的多核苷酸或其标志物的独特核酸序列，但不扩增野生型序列。根据某些实施方案，该对引物被设计为扩增包含SEQ ID NO:34中列出的核酸序列的标志物2-3HS2。根据某些示例性实施方案，标志物2-3HS2通过包含SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中列出的核酸序列的一对引物扩增。

另外地，或者可选地，标志物是序列特异性探针，该序列特异性探针在严格条件下与SEQ ID NO:1-31的任一项或其一部分至少70％同源的核酸序列杂交，但不与从易感叶锈病病害和/或条锈病病害的小麦植物中分离的核酸杂交，并且该序列特异性探针此后可以通过本领域技术人员熟知的多种方法进行检测。

然而，应当明确理解的是，本发明的方法方面不限于使用本文鉴定的标志物，并且本发明的方法也可以利用本文没有明确公开或者甚至还没有鉴定的标志物，因为鉴定和使用这样的标志物完全在具有本领域知识的人员的技能范围内。

在另外的或替代的方法中，如下文例示的，在表型上检查多于一个小麦植物的每一个对引起叶锈病病害或条锈病病害的柄锈菌属真菌感染的耐受性或抗性。

提供以下实施例以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽泛的范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化形式和修改，而不背离本发明的范围。

实施例

材料和方法

植物材料

锈病抗性的初级重组体如下产生：使用ph1b诱导小麦栽培品种(cv.)中国春与沙融山羊草(沙融山羊草(Sharon goatgrass))染色体之间的部分同源配对，随后是与轮回(recurrent)小麦亲本栽培品种Galil回交(Millet等人2014.Genome 57:309–316.dx.doi.org/10.1139/gen-2014-0004)。使用沙融山羊草登记物TH548，该沙融山羊草登记物TH548的种子已经以登记号NCIMB 43567保藏于作为国际保藏机构的NCIMB Ltd.。本发明中使用的重组体来源系及其染色体6B构成呈现于表2中。

在栽培品种中国春(CS)的遗传背景中的部分同源配对ph1b突变体(HP)最初从late E.R.Sears获得。

小麦栽培品种Galil是由Hazera Seed of Growth(Israel)培育的以色列优良春小麦栽培品种。该栽培品种具有叶锈抗性Lr26基因和条锈病抗性Yr19基因，但对本研究中使用的叶锈菌和条锈病分离株易感。

表2:用于产生二级重组体植物的来源品系

*数字基于沙融山羊草DArT标志物的存在或小麦标志物的不存在。括号中的数字基于重组体品系和CS中Galil标志物的不存在(Millet等人2014，同上)。RY和RL分别表示对条锈病或叶锈病的抗性，藉以最初选择这些品系。

**IT值被转换为1(抗性的)至9(易感)的量度，如下所示：IT＝1(0/0；/0；-1-/1--1/1-1+)，IT＝3(1+/1-2/2)，IT＝5(2-2+)，IT＝7(2-3-/2,3-/2,3)，IT＝9(3-/3/3+)。括号中的数字指示根据真菌覆盖率和孢子形成的视觉评价确定的评分。

***反映明显杂合的二级重组体6B染色体。

病原菌

使用来自谷物作物改良研究所原种(stocks)的叶锈病分离株#526-24和条锈病分离株#5006。对于分离株#526-24和#5006，这些分离株的毒力/无毒力(V/Av)式分别为Lr1,3,24,26,10,18,21,23,15/Lr2a,2c,9,16,3ka,11,17,30和Yr6,7,8,9,11,12,17,19,sk,18,A/Yr1,5,10,15,24,26,sp。这两个分离株都用于在幼苗期选择抗性的后代和评价成年植株抗性。这两个分离株对Galil都有毒性，并且表示高度毒性病原菌小种。

接种和病害评价

幼苗期

测试和选择每一代幼苗对叶锈菌和/或条锈菌的易感性。将植物在小花盆中在温控温室中在22℃±2℃生长。将7日龄至10日龄幼苗通过用悬浮于800μl轻质矿物油

170异链烷烃(ChevronPhillips)中的约1mg夏孢子喷洒至溢出接种。油蒸发后，将接种叶锈菌的植物在露室中在18℃维持24h，并且然后移至温室。将接种条锈病的植物在具有9℃温度的露室中在黑暗中维持16小时，随后在15℃在光中维持，并且然后移至具有15℃温度和12h光照/12h黑暗制度的生长室中。在接种后10-12天，以标准0-4量度对感染类型(IT)的症状进行评分。0–2的IT被认为指示抗性响应并且3–4作为易感响应。

成年植物

叶锈病(生长在温室中的植物)

将单个纯合BC₄F₄初级-和BC₂F₄二级-重组体植物在置于冷却温室中的5L小花盆中生长，并且在第七片叶期(茎延伸，第3期-Zadoks量表,Zadoks J C等人1974.WeedResearch 14:415-421)用夏孢子(urodiniospores)喷洒。类似于幼苗接种，接种四组植物，对于每个基因型，每组包含两个小花盆。接种后约3周，在穗出现后评价病害水平。

条锈病(生长在田间的植物)

在田间条件下，将用于幼苗测定的相同初级和二级重组体的种子种植在苗圃地块(nursery plots)。每个地块(单一基因型)由传播者(spreader)栽培品种Falchetto的四个相距20cm的1m行和一个相距40cm的单边缘行组成。在1月14日(此时Falchetto植物处于第七片叶期)至2月5日之间，通过用一束高度感染的叶对上部叶进行涂刷或者通过使用手动气泵用夏孢子和滑石的混合物给植物撒粉将Falchetto植物接种六次夏孢子。在此时间段期间，实验区以高湿度和凉爽的夜晚为主。

病害水平如下测量：通过锈菌覆盖率的％和一般反应(易感的-中间-抗性的)，将每个苗圃地块作为一个整体进行评价。反应的一个实例示于图6中。

缩短外源区段

具有缩短的外源区段的二级重组体(SR)如下获得：如图1和图7描绘的，通过在初级重组体与小麦栽培品种Galil之间的杂交体中诱导部分同源重组，随后是表型分型和分子选择。简言之，选择的在染色体6B上具有不同尺寸的外源基因渗入的初级重组体(表2)由HP突变体授粉，并且F₁后代与HP突变体回交。选择对ph1b纯合的锈病抗性植物，并且由Galil授粉。筛选所得的杂交体对两种病原菌的反应，并且使用分子标志物(使用下文表3和实施例1中描述的PCR标志物)确定抗性植物的6B染色体构成。选择与亲本初级重组体中的片段尺寸相比外源区段尺寸降低的植物，并且允许其自体授粉。选择的锈病抗性F₂植株表征其Ph1基因型。Ph1/-被认为是二级重组体，而纯合的ph1b被允许用于另一个重组事件。两组植物均由Galil授粉，以产生BC₁后代。后一组的BC₁植物的染色体6B用PCR标志物进行分子分析，并且获得一个三级重组体。所有的锈病抗性BC₁重组体再次与Galil回交。对叶锈菌和条锈菌分离株是抗性的BC₂植物自体授粉。如下文描述的，选择每个重组体的对SR 6B染色体也是纯合的抗性BC₂F₂后代。这些植物的BC₂F₃种子被汇集并且用于温室中的种子繁殖。

区段的进一步缩短

重组体品系R-10(其中外源染色质朝向长染色体臂的端粒延伸(右延伸；图7，类型a))和品系R-18(其中外源染色质朝向短染色体臂的端粒延伸(左延伸；图7，类型b))杂交，目的是减少朝向端粒的延伸，同时维持抗性周围的外源区域(图7，三级重组体)。杂交体由Galil授粉，并且其期望的后代使用PCR标志物(表3)来选择。

外源区段的分子表征

DNA提取

收集叶并且储存于-80℃。将冷冻叶样品(50mg)使用冻干机(Blue Wave,BW-10-ORD)冷冻干燥16h，并且在组织裂解器(GenoGrinder)中使用两个1/8”和一个3/16”不锈钢珠，以1,500rpm研磨1min。根据制造商说明，使用E-Z 96植物DNA试剂盒(Omega)(用于PCR分析)或使用DNeasy植物微型试剂盒(Qiagen)(用于GBS)提取DNA。

ph1b突变体的选择

Ph1等位基因的存在如下检测：通过根据Qu等人(Qu L I等人1998.Theor ApplGenet 96:371-375)的具有SEQ ID NO:19的正向引物和具有SEQ ID NO:20的反向引物(表3)扩增标志物PSR2120。缺乏对应的条带的植物被认为是ph1b/ph1b突变体。

通过测序进行基因分型(GBS)

对100个包括栽培品种Galil、HP突变体以及74个抗性的和24个易感的二级重组体F₁植物(图1)的样品进行GBS，其中大多数衍生自初级重组体品系RY 32-3-14(表2)。如以上描述的，从幼小植物(一个月龄)的叶中分离DNA。在AgriLife Genomics(Texas)根据改良的限制性位点相关DNA测序(RAD-Seq)方法进行测序(Elshire RJ等人2011.PLoS One 6,e19379)。简言之，将基因组DNA用限制性酶PstI消化，并且从片段的两侧测序大约110bp。对于测序，在Illumuna Hiseq 2500上使用单端V4化学与125bp试剂盒，导致Galil和HP突变体的每个样品40M读段，并且其余重组体的每个样品8M-10M读段。原始数据由NRGene(nrgene.com/,Israel)使用新组装的野生二粒小麦'Zavitan'基因组(Avni R等人2017.Science 357:93-97)作为参考进行分析。

外源区段分子标志物的开发

根据重组事件的频率，沿着基因渗入区域映射沙融山羊草与小麦序列之间的单核苷酸多态性(SNP)。基于SNP，按照Ayyadevara等人(Ayyadevara S等人2000.Anal Biochem284:11-18)提到的说明设计9个PCR引物。用于标志物扩增的引物描述于下文表3中。使用在线可得数据库来检查标志物中的重复元件(wheat.pw.usda.gov/ITMI/Repeats/blastrepeats3.html)。

从野生二粒小麦图谱序列至CS图谱序列和SNP检测的转换如下完成：使用GBSX对原始读段去多重化(Herten K等人2015.BMC bioinformatics16:73)。使用Burrows-Wheeler比对器(BWA)(Li H和Durbin R.2009.Bioinformatics 25:1754-1760)将每种基因型的读段与CS参考基因组的染色体6B进行比对。使用序列比对/图谱(SAM)工具(LiH.2011.Bioinformatics27:2987-2993)将单独比对文件堆积(pileup)为一个堆积文件，该文件被BCFtools CALL(samtools.github.io/bcftools/)用于调用SNP。使用VariantAnnotation R包(Obenchain V等人2014.Bioinformatics 30:2076-2078)将SNP数据读入R环境。对于每个SNP，使用针对SNP等位基因的来源的抗性和易感基因型的2X2列联表(CS作为“参考”SNP或外源“替代物”)进行Fisher精确检验。将Fisher检验的-log P值相对于对应的SNP的位置绘制。较高的-log P值(即较低的P值)指示SNP抗性相关的概率是非随机的。具有-log P>16的SNP被认为与抗性基因座相关。

下文表3呈现用于映射沙融山羊草外源区段的PCR标志物。在所有基于SNP的标志物中，多态性核苷酸以粗体和下划线标记。标志物1-7用于表征区段的长度。标志物8-9用于检测抗性的临界区域。标志物10用于选择ph1b/ph1b品系。标志物11-12同时用于选择对区段纯合的植物(选择标志物11存在而标志物12不存在的植物)。温度循环由以下组成：95℃持续5min，随后是95℃持续30sec的32个循环；在取决于所使用Taq酶的温度退火30秒；72℃持续30秒；和在72℃持续5min的最终延伸步骤。

实施例1：具有较短外源区段的二级重组体的产生

将初级重组体品系与Sears高配对突变体(ph1b，HP突变体)杂交和回交。选择对小麦及其部分同源外源区段杂合的纯合的ph1b后代，并且与优良春小麦栽培品种Galil杂交。将该后代的1240株植物种群接种上文描述的叶锈菌和条锈菌分离株。发现总计594株植物对这两个分离株都是抗性的，发现45株对分离株之一是抗性的(28株对叶锈病是抗性的，并且17株对条锈病是抗性的)，并且另外601株植物对这两个分离株都是易感的。

如上文描述的，对来自100个抗性和易感的后代(包括栽培品种Galil、HP突变体以及74株抗性的和24株易感的二级重组体F₁植物)的DNA进行测序和分析。基于重组事件的频率并且使用野生二粒小麦小麦的基因组序列作为参考，生成了染色体6B的遗传图谱。GBS分析揭示沿着染色体6B上部分同源重组区域分散的SNP。为了更精确地定义外源区段在特定基因渗入品系中的位置，将重组体的序列与面包小麦栽培品种中国春(CS)的序列重新对齐(IWGSC RefSeq v1.0,wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies)。进行Fisher精确检验以发现与抗性相关的非随机SNP。总计发现1,362个SNP，其中大多数位于约0-160Mbp的范围内(图2A)。这些SNP中的26个具有-logP>16的P值(图2B)，并且最有可能区分沙融山羊草与栽培品种Galil的染色质。根据如由SNP反映的重组频率，将重组区域进一步分为四个区域。

这些SNP中跨越整个区段的7个用于开发9个PCR探针，这沿着该区域区分沙融山羊草与小麦(表2)。使用PCR探针筛选520个对条锈菌和叶锈菌分离株二者抗性的二级重组体。

首先，将所有植物用指定为1C和4C的两种远端标志物进行筛选(表2)。两种标志物的存在指示在外源区段中缺乏重组，其中一种标志物的缺乏表明在外源片段的左侧(缺乏标志物1C)或右侧(缺乏标志物4C)重组。鉴定了38株缺乏标志物之一的植物，并且这些植物使用剩余的5种PCR标志物进行进一步评价。基于PCR分析，选择一组20株二级重组体(SR)植物。重新评价这些植物的抗性，并且用PCR标志物再次筛选(图3)。从这些植物中，基于外源片段的长度、基因渗入模式(图4)和植物与栽培品种Galil的表型相似性，选择最终的一组13个SR品系。所有这些品系都包含在标志物2S2与3S1之间检测到的17.4Mb的共同区域，无论重组的断点发生在右端还是左端。为了验证该区域，开发了两种另外的标志物2-3HS2和2-3HS3(表2)，并且用于分析所选择的重组体以及随机选择的作为阴性对照的易感品系。两种标志物都存在于所有的抗性重组体中(图4)，且不存在于易感品系中。计算每种标志物的出现频率，以指示沿着染色体区段的重组率(图5)。标志物2-3HS2和2-3HS3都存在于所有抗性植物中，3S1和3S3各自存在于16株植物中，2S2和3S4各自存在于15株植物中，4C存在于13株植物中，2S1存在于12株植物中，并且1C存在于7株植物中。总计，2.5％(13/520)和1.34％(7/520)的抗性植物分别在基因渗入区段的左端(由缺乏标志物1C指示)或右端(由缺乏标志物4C指示)具有二级重组。

允许13个选择的SR品系自体授粉，并且评价每个SR品系的20-30个F2后代对叶锈菌和条锈菌分离株的反应。用Ph1特异性引物对抗性F2植株的PCR分析揭示，12株植物包含Ph1等位基因，并且1株植物缺乏该等位基因。这12株Ph1阳性植物具有不同的外源染色质构成：在7株植物中，外源区段朝向短臂端粒延伸，而在剩余5株植物中，外源区段朝向长臂端粒延伸(图4)。将所有这些SR 6B植物都与栽培品种Galil回交，并且选择锈病抗性(R/r)的后代。在这个杂交中，发现对ph1b纯合的单一基因型经历了另一个部分同源配对事件，并且在品系P-37中产生三级6B重组体(TR)染色体(图4)。将所有12个SR品系和单个TR品系与栽培品种Galil进一步回交(BC2)(图1)，以便恢复栽培品种Galil遗传背景。

实施例2：鉴定较短的赋予抗性区段

为了进一步降低外源区段的尺寸，在两株SR BC₂植物之间进行杂交，一株具有右臂尾，而另一株具有左臂尾(图7)。将该杂交的后代使用诊断引物通过PCR进行分析(表2)，并且选择两个杂交体。一个杂交体(R-1018)包含衍生自SR品系R-18和R-10中的染色体6B的一个外源区段，并且包含2-3HS2和2-3HS3标志物(图4)。该品系中的外源区段以标志物2-3HS2和3S4为边界，表明甚至比TR品系P-37中的区段更短(图4)。另一个杂交体(R-1610)包含衍生自SR品系R-16和R-10中的染色体6B的一个外源区段，并且包含2-3HS2和2-3HS3标志物，但也以这些标志物为边界。这个杂交体拥有所有基因渗入品系中最短的区段。出乎意料的是，杂合的杂交体(包含一条重组染色体和一条天然染色体)的自体授粉产生完全杂合的后代。

实施例3：纯合的植物的选择

纯合的抗性植物通过其外源区段状态从自体授粉的SR BC2后代中选择，如下所示：用PCR标志物Zyg_1Sh_1和Zyg_2G_2从每个SR品系中筛选出至少100株BC2F2植物(表2)。标志物Zyg_1Sh_1(1Sh_1)检测沙融山羊草的SNP。该标志物扩增来自相同中间区域的与2-3HS2相同的序列；然而，1Sh_1总是与Zyg_2G_2(2G_2)配对使用，后者检测Galil的SNP，使得对于沙融山羊草在纯合的植物中使用1Sh_1将产生扩增的条带，而使用2G_2则不会。在杂合的植物中，两个引物都会给出条带。选择具有栽培品种Galil形态，即具有所期望的外源染色质但缺乏栽培品种Galil PCR标志物的自育品系。每个SR品系的所选择的纯合子的BC2F3种子被汇集并且用于产生BC2F4种子，用于进一步的实验，包括对田间条锈病的抗性。

实施例4：抗性验证

叶锈病

如上文描述的，对代表性SR品系植物(图4中呈现的SR品系)的成年植物的抗性进行检查。重组体品系的反应呈现于表4中，以夏孢子堆覆盖率的百分比和感染类型(IT)值表示。后者被转换为如表4图例中规定的1至9评分量度。9评分被认为是高度易感的，而1至7评分反映了抗性值下降。除了被分离为高度抗性或易感的个体的品系R-4之外，所有重组体品系都是高度抗性的。小麦栽培品种Galil具有多于80％的覆盖率，并且评分是9IT值，因此被认为是易感基因型。

表4:在温室中接种叶锈病分离株#526-24的成年SR品系的反应

表4：值是10株植物的平均值。括号中的IT值表示同一叶上的罕见评分。IT值被转换为1至9的量度，如下所示：IT＝1(0/0；/0；-1-/1--1/1-1+)，IT＝3(1+/1-2/2)，IT＝5(2-2+)，IT＝7(2-3-/2,3-/2,3)，IT＝9(3-/3/3+)。品系R-4被分离为一半R植物和一半S植物。R-抗性的；MR-中度抗性的；S-易感的

条锈病

如上文描述的，使用条锈病分离株#5006检查对条锈病的抗性。除了被分离为0(非常抗性，VR)和50％-60％覆盖率指定为易感(S)的R-4之外，所有重组体品系也是高度抗性的(非常抗性的，VR)，具有0覆盖率(R-1-2-103和R-1-2-104获得0-迹线)(图6)。Galil品种评分30％-40％为中度易感(MS)至易感(S)，并且在每个地块种植的另外的品种Falchetto评分60％-70％或70％-80％为非常易感(VS)的。

实施例5：赋予抗性区段的分析

MutChromSeq是用于在具有复杂和多倍体基因组的植物中分离基因和控制基因表达的DNA序列的方法。它是基于突变体分离的染色体流式分选和DNA测序的无损复杂度降低。将来自野生型亲本染色体的序列与来自多个独立衍生突变体的染色体的比较鉴定单个候选基因或非编码序列中的致病突变(Steuernagel B.等人"Rapid Gene IsolationUsing MutChromSeq."Wheat Rust Diseases.Humana Press,New York,NY,2017.第231-243页)。

数据集。

根据Sánchez-Martín等人，2016(Genome Biology 17(1):221)，对抗性初级基因渗入植物(品系42和34)进行EMS诱变。简言之，将抗性重组体品系的种子用EMS处理(M1种群)，并且生长以获得M2代。对1,396个家系进行对叶锈病分离株#526-24和条锈病分离株#5006的抗性丧失的筛选，并且鉴定16个易感突变体(表5)。

表5:突变为易感的抗性品系

所有的突变体在M4代中进一步验证，并且与易感的Galil和抗性植物杂交，以确认突变在候选基因中以及候选基因的单基因性质。选择9个易感突变体用于6B染色体分选，并且使7个最终突变体经历测序。提供可接受序列数据的6个突变体用于支架比对(mut_10.6、mut_20.2、mut_78-9、mut_109.2、mut_125.5和mut_134.3)。其中一个突变体(mut_10.6)表现为比其余突变体具有更高的杂合度。由于在映射的读段中的严格过滤以及通过与其他突变体的比较，这些杂合的SNP看起来是真实的，而不是非特异性读段比对的产物。发现一些候选支架是对mut_10.6中的SNP突变杂合的。在评价候选支架时，考虑到了这一事实。

方法.

读段质量控制

测序的文库QC用fastqc评价。来自野生型(wt)和突变体的所有读段都具有良好质量，并且因此不需要微调。

重复元件的掩蔽

品系42(wt＝R)和沙融山羊草参考组件使用RepeatMasker和小麦族重复数据库作为重复源，对重复元件掩蔽。

对品系42(wt)及其突变体的MutChromSeq

根据Sanchez-Martin等人(2016，同上)概述的方法经过一些修改进行比对。最初的方案产生许多非特异性比对，可能是由于来自其他染色体的污染，并且这使得在许多支架中筛选SNP变得困难。特别地，使用mem比对器代替原始方案的aln比对器。此外，比对后对映射的读段的过滤是严格的，能够消除非特异性比对。这种方法的缺点是读段深度较低，并且有可能错过一些真正的SNP。后来候选支架的可视化有助于缓解这个问题。为了鉴定SNP，使用了用不同的比对器和严格/宽松参数检索的结果，以及视觉检查。

对chr6S片段的MutChromSeq

品系42(wt)组件具有91,266个支架和12,647的基因组组件(N50)的中位重叠群尺寸以及具有小至445bp的支架。在最坏的情况下，感兴趣的基因可能被分在两个支架之间。这将使该基因无法被MutChromSeq检测到。为了使这种可能性最小化，在整个6S染色体上采用了“伪”MutChromSeq方法。首先，经历诱变的小麦重组体染色体6B(r6B；具有来自沙融山羊草染色体6S^sh的基因渗入的小麦染色体6B)被分为25kb、50kb、75kb和100kb的片段，并且对这些片段进行MutChromSeq(4次)，就好像它们是组装的支架一样。这种方法产生更大数目的SNP，因为参考和突变体来源于不同的遗传背景。然而，检测由EMS产生的突变并且从不同遗传背景之间的多态性中区分这些突变可以通过消除所有突变体和wt共有的SNP并且仅考虑独特的SNP来完成。这种“伪”MutChromSeq方法还提供了另外的验证水平：来自标准MutChromSeq的候选支架应该映射至染色体6S^sh片段上由“伪”MutChromSeq检索到的基因组位置。

支架可视化

将候选支架用综合基因组学查看器(Integrative Genomics Viewer，IGV)进行单独可视化，以验证或弃去推定的SNP。为了更好地了解候选物，在此步骤中使用来自使用不同比对器和用不同参数的结果的比对的读段。

支架与参考的比对

Gmap和blastn用于评价支架包含小麦还是沙融山羊草DNA。中国春小麦基因组参考组件(IWGSC_RefSeq_v1.0)染色体6B和Brande Wulff提供的Ae_sharonensis_v1染色体6S^sh组件(未公布数据)用作参考。为此目的，Gmap是更好的比对器，因为它可以找到全长的全局比对，而blast通常检索更碎片化的局部比对。因此，在使用参数(最小覆盖率90％和最小同一性90％)的情况下，Gmap有时不产生任何击中。发生这种情况主要存在两个原因，第一，支架是伪象(artifact)，以及第二，参考基因组不包含支架的序列。后者被认为更有可能发生在沙融山羊草基因组，因为小麦参考是更精选的(curated)基因组。因此，如果gmap没有检索到击中，支架更有可能来自沙融山羊草。良好的候选支架也应该映射在使用GBS标志物突出显示的33-50.4Mb窗口中或附近。

结果

由于仅6个突变体具有可接受的序列数据，并且由于在检查携带6个或7个突变体中的SNP的支架时缺乏明确的候选物，因此选择具有4个或更多个突变体中的SNP的支架用于进一步检查，只要这些支架映射至沙融山羊草染色体6S^sh而不映射至中国春小麦的染色体6B。良好的候选支架也被定义为具有最有可能由EMS即G/C至A/T产生的SNP。理想地，在考虑所有突变体时，这些SNP应该在不多于～10kb的基因组距离内传播。最后，候选支架应该映射至CS的染色体6B中的33-50.4Mb基因组窗口。

符合以上描述要求的候选物概述于下表6中。在这些候选物中，在沙融山羊草染色体6S^sh上的以下支架是感兴趣的：映射在57.5Mbp周围的支架19799；映射在57.4Mbp周围的支架00757；映射在57.7Mbp周围的支架1934717，映射在56.7Mbp周围的支架1548600以及映射在44Mbp周围的支架20860。这些支架与标志物2-3HS2相关，并且位于沙融山羊草的6S^sh上的34-62Mbp的基因组区域中(存在于如由PCR标志物1-9(表3)定义的所有抗性品系中的最小区域)，显示与锈病抗性相关。此外，这些支架包含位于或接近潜在抗性基因的SNP。

表6：选择的支架的数据

*映射至染色体上的不同位置

实施例6：一个或更多个锈病抗性基因

一个或更多个锈病抗性基因鉴定如下：

1.对所有可得的易感突变体，抗性亲本品系(42和34)，沙融山羊草和Galil植物在以下支架中的SNP区域进行Sanger测序：支架19799；支架00757；支架1934717；支架1549600；支架20860。进行Sanger测序以便比较抗性品系和易感品系，并且验证SNP的存在。

2.鉴定潜在抗性基因的编码序列，并且验证编码序列中或附近的SNP的存在。

3.克隆潜在的基因。

4.通过转化将一个或更多个潜在抗性基因的序列引入易感小麦栽培品种中，并且检查转化的植物对锈病的抗性，验证一个或更多个基因的功能。根据Ishida等人(2015，同上)描述的方法进行转化。如上文“材料和方法”部分和实施例4描述的，检查转化的植物的易感性和抗性。

以上具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用现有的知识，容易地为各种应用修改和/或调整此类具体实施方案而不需要过度实验且不背离一般概念，且因此，此类调整和修改应当并且预期被包含在本公开的实施方案的等效方式的含义和范围内。应理解的是，本文使用的措辞或术语是为了描述而非限制的目的。用于进行各种本公开的功能的工具、材料和步骤可采取多种替代形式而不背离本发明。

Claims (40)

1.一种小麦植物，所述小麦植物在其基因组中包含赋予或增强所述小麦植物对叶锈病病害和条锈病病害的抗性的异源多核苷酸区段，其中所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少80％同源的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分。

4.根据权利要求1所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:2组成的组的核酸序列及其任何组合至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的核酸序列。

5.根据权利要求4所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:2的任一项中列出的核酸序列及其任何组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段包含指定为2-3HS2的核酸标志物，其中所述2-3HS2标志物被一对引物扩增，该对引物包含含有SEQID NO:32中列出的核酸序列的正向引物和含有SEQ ID NO:33中列出的核酸序列的反向引物。

7.根据权利要求6所述的小麦植物，其中所述2-3HS2标志物包含与SEQ ID NO:34中列出的核酸序列至少90％同源的核酸序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段包含沙融山羊草(Aegilops sharonensis)登记物TH548的染色体6S^sh的片段，所述沙融山羊草登记物TH548的种子已经以登记号NCIMB 43567保藏于作为国际保藏机构的NCIMB Ltd.。

9.根据权利要求8所述的小麦植物，其中所述片段包含存在于沙融山羊草染色体6S^sh从34Mbp位置至62Mbp位置中的核酸序列。

10.根据权利要求8-9中任一项所述的小麦植物，其中所述沙融山羊草染色体6S^sh的片段包含选自由以下组成的组的至少一个支架或其一部分：位于58Mbp周围的具有SEQ IDNO:1的核酸序列的支架19799；位于57.5Mbp周围的具有SEQ ID NO:3的核酸序列的支架00757；位于57.7Mbp周围的具有SEQ ID NO:31的核酸序列的支架1934717；位于56Mbp周围的具有SEQ ID NO:23的核酸序列的支架1549600；位于44Mbp周围的具有SEQ ID NO:2的核酸序列的支架20860；位于32Mbp周围的具有SEQ ID NO:4的核酸序列的支架1540406；位于33Mbp周围的具有SEQ ID NO:5的核酸序列的支架1900261；位于34Mbp周围的具有SEQ IDNO:6的核酸序列的支架1933170；位于35Mbp周围的具有SEQ ID NO:7的核酸序列的支架1531163；位于35Mbp周围的具有SEQ ID NO:8的核酸序列的支架1927703；位于38Mbp周围的具有SEQ ID NO:9的核酸序列的支架1895355；位于38Mbp周围的具有SEQ ID NO:10的核酸序列的支架1931208；位于39Mbp周围的具有SEQ ID NO:11的核酸序列的支架1935984；位于42Mbp周围的具有SEQ ID NO:12的核酸序列的支架1913977；位于43Mbp周围的具有SEQ IDNO:13的核酸序列的支架1916860；位于44Mbp周围的具有SEQ ID NO:14的核酸序列的支架1891763；位于44Mbp周围的具有SEQ ID NO:15的核酸序列的支架1937448；位于46Mbp周围的具有SEQ ID NO:16的核酸序列的支架1896571；位于47Mbp周围的具有SEQ ID NO:17的核酸序列的支架1528020；位于47Mbp周围的具有SEQ ID NO:18的核酸序列的支架1935712；位于48Mbp周围或57Mbp周围的具有SEQ ID NO:19的核酸序列的支架1893110；位于51Mbp周围的具有SEQ ID NO:20的核酸序列的支架1898148；位于51Mbp周围的具有SEQ ID NO:21的核酸序列的支架1934541；位于56Mbp周围的具有SEQ ID NO:22的核酸序列的支架1538547；位于56Mbp周围的具有SEQ ID NO:24的核酸序列的支架1872406；位于58Mbp周围的具有SEQID NO:25的核酸序列的支架1889560；位于58Mbp周围的具有SEQ ID NO:26的核酸序列的支架75951；位于59Mbp周围的具有SEQ ID NO:27的核酸序列的支架1893791；位于61Mbp周围的具有SEQ ID NO:28的核酸序列的支架1892710；位于57.5Mbp周围的具有SEQ ID NO:29的核酸序列的支架1926247；位于57.4Mbp周围的具有SEQ ID NO:30的核酸序列的支架1929618；及其任何组合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段缺乏SEQID NO:35、SEQ ID NO:36或其组合中列出的核酸序列。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段位于所述小麦植物的染色体6B中。

13.根据权利要求12所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段位于所述小麦植物染色体6B上约33Mbp至约50Mbp之间的位置处。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的小麦植物，其中所述异源多核苷酸区段是还包含至少一个调节元件的核酸构建体。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的小麦植物，所述小麦植物是农业栽培品种。

16.根据权利要求12-15中任一项所述的小麦植物，所述小麦植物选自由以下组成的组：对包含所述异源多核苷酸区段的染色体6B纯合的植物和对包含天然小麦染色体6B的染色体6B以及包含所述异源多核苷酸区段的染色体6B杂合的植物。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的小麦植物，所述小麦植物与在其基因组中不包含所述异源多核苷酸区段的对应的植物相比显示出增强的对叶锈病病害和条锈病病害的抗性或耐受性的表型。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的小麦植物，其中所述叶锈病病害由真菌叶锈菌(Puccinia triticina)引起，并且所述条锈病病害由真菌条锈菌(Puccinia striiformis)引起。

19.一种小麦植物，所述小麦植物在其基因组中包含异源多核苷酸区段，所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列，其中所述多核苷酸赋予或增强所述小麦植物对由真菌柄锈菌属(Puccinia)引起的病害的抗性。

20.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列，其中所述多核苷酸在被引入小麦植物时，赋予或增强所述小麦植物对叶锈病病害和条锈病病害的抗性。

21.根据权利要求20所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少80％同源的核酸序列。

22.根据权利要求20所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含至少一个支架，所述至少一个支架具有SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分。

23.根据权利要求20所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含与选自由SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:2组成的组的核酸序列及其任何组合至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的核酸序列。

24.根据权利要求20-23中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述异源多核苷酸区段包含指定为2-3HS2的核酸标志物，其中所述2-3HS2标志物被一对引物扩增，该对引物包含含有SEQ ID NO:32中列出的核酸序列的正向引物和含有SEQ ID NO:33中列出的核酸序列的反向引物。

25.根据权利要求24所述的分离的多核苷酸，其中所述2-3HS2标志物包含与SEQ IDNO:34中列出的核酸序列至少90％同源的核酸序列。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含沙融山羊草登记物TH548的染色体6S^sh的片段，所述沙融山羊草登记物TH548的种子已经以登记号NCIMB 43567保藏于作为国际保藏机构的NCIMB Ltd.。

27.根据权利要求26所述的分离的多核苷酸，其中所述片段包含存在于沙融山羊草染色体6S^sh从34Mbp位置至62Mbp位置中的核酸序列。

28.根据权利要求20-27中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸区段缺乏SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36中列出的核酸序列或其组合。

29.根据权利要求20-28中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述叶锈病病害由真菌叶锈菌引起，并且所述条锈病病害由真菌条锈菌引起。

30.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含权利要求20-29中任一项所述的分离的多核苷酸，还包含至少一个调节元件。

31.一种用于产生对叶锈病病害和条锈病病害具有增强的抗性的小麦植物的方法，所述方法包括将异源多核苷酸区段引入对锈病病害易感的小麦植物的至少一个细胞中，从而产生与对应的对照植物相比对所述锈病病害具有增强的抗性的小麦植物，所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31中任一项列出的核酸序列至少70％同源的核酸序列。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源多核苷酸区段是分离的多核苷酸，所述方法包括将根据权利要求20-29中任一项所述的分离的多核苷酸或根据权利要求30所述的核酸构建体转化到所述小麦植物的至少一个细胞中。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源多核苷酸区段是分离的多核苷酸，所述方法包括通过使用人工工程化核酸酶使所述至少一个细胞经历基因组编辑将根据权利要求20-29中任一项所述的分离的多核苷酸或根据权利要求30所述的核酸构建体引入所述小麦植物的至少一个细胞中。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源多核苷酸区段形成沙融山羊草登记物TH548的染色体6S^sh的一部分，所述方法包括使所述沙融山羊草登记物TH548与对所述锈病病害易感的小麦植物杂交。

35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中将所述异源多核苷酸区段引入所述易感小麦植物的至少一个细胞的染色体6B中。

36.一种用于选择对叶锈病病害和条锈病病害具有增强的抗性的小麦植物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供多于一个植物，每一个植物包含含有赋予或增强小麦栽培品种对叶锈病病害和条锈病病害的抗性的异源多核苷酸区段的至少一个细胞，其中所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其一部分至少70％同源的核酸序列；并且

b.选择与对照小麦植物或预定抗性评分值相比对所述锈病病害显示出增强的抗性的植物；

从而选择对所述锈病病害具有增强的抗性的植物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中选择对所述锈病病害抗性的植物包括用选自由引起叶锈病病害的叶锈菌和引起条锈病病害的条锈菌组成的组的真菌及其组合接种所述多于一个植物，并且在表型上选择抗性的植物。

38.一种用于鉴定和选择具有增强的对叶锈病抗性和条锈病抗性的小麦植物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供多于一个小麦植物；

b.检查从所述多于一个小麦植物中的每一个获得的核酸样品中异源多核苷酸区段的存在，所述异源多核苷酸区段包含至少一个支架，所述至少一个支架具有与SEQ ID NO:1-31的任一项中列出的核酸序列或其部分至少70％同源的核酸序列；任选地

c.检查从所述多于一个小麦植物中的每一个获得的核酸样品中具有SEQ ID NO:34中列出的核酸序列的标志物的存在；并且

d.选择包含所述异源多核苷酸区段的小麦植物。

39.根据权利要求31-38中任一项所述的方法，其中所述对照植物是对所述锈病病害易感的小麦植物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述对照植物具有相同的遗传背景。

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