CN108770333A - 小麦条锈病抗性基因及其使用方法 - Google Patents

小麦条锈病抗性基因及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于增强小麦和大麦植物对由小麦条锈病菌引起的小麦条锈病的抗性的组合物和方法。该组合物包含编码抗性(R)基因产物及其变体的核酸分子，以及包含该核酸分子的植物、种子和植物细胞。用于增强小麦和大麦植物对小麦条锈病的抗性的方法包括将编码R基因产物的核酸分子引入小麦或大麦植物细胞中。本发明另外提供了在农业中使用所述的小麦和大麦植物以限制小麦条锈病的方法。

Description

小麦条锈病抗性基因及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年11月3日提交的美国临时专利申请号62/250,136的权益，该申请的内容以引用方式全文并入本文。
关于以文本文件提交的序列表
序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表以电子方式通过EFS-Web提交，其中文件名为070294-0106SEQLST.TXT，于2016年11月1日创建，并且大小为440千字节，而且与说明书同时提交。在该ASCII格式的文档中所包含的序列表为说明书的一部分，并且以引用方式全文并入本文。
技术领域
本发明涉及基因分离和植物改良领域，特别涉及通过使用疾病抗性基因增强植物对植物疾病的抗性。
背景技术
在全世界小麦生产中，植物疾病导致显著的产量损失。锈病是最具破坏性的小麦疾病的一种。由小麦条锈病菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的小麦条锈病(也称为小麦黄锈病)是当今全球范围内最具破坏性的小麦疾病(RustTracker.org，得自互联网rusttracker.cimmyt.org/？page_id＝9；2015年10月5日登陆)。尽管已经证明包含对小麦条锈病菌的抗性(R)基因的小麦植物有效地限制由小麦条锈病引起的农业损失，但是近期出现了小麦条锈病菌的新物种，而R基因对其是无效的。虽然杀虫剂可以用于控制小麦条锈病，可是杀虫剂是昂贵的并且与农业的可持续强化不一致，而且在发展中国家，简而言之，杀虫剂是自给农民负担不起的。
农业的可持续性强化要求增加使用遗传解决方法，替代化学解决方法(例如杀虫剂)来保护农作物对病原体和害虫(Jones et al.(2014)Philos.T.Roy.Soc.B 369:20130087)。驯化的农作物的野生近源种(例如小麦)包含巨大多样性的可用的R基因，其为用于在小麦生产中可持续性疾病控制的有价值的来源。然而，用于引入R基因的传统方法通常涉及长的育种时间线，而破坏了与其他基因的有害等位基因的连锁。此外，当一次部署一个R基因时，在几个季节内，R基因可以被克服(McDonald and Linde(2002)Annu.Rev.Phytopathol.40:349-379)。除了小麦的野生近源种以外，作为小麦病原体的宿主的其他谷物物种具有成为用于在小麦生产中可持续性疾病控制的R基因来源的潜力。分子克隆可以同时引入多个R基因(Dangl et al.(2013)Science 341:746-751)，这可以延迟抗性突破病原体物种的进化，由此提供更持久的抗性(McDonald and Linde(2002)Annu.Rev.Phytopathol.40:349-379)。
发明概述
本发明提供了抗性(R)基因的核酸分子，所述的核酸分子能够赋予植物对导致植物疾病的至少一种病原体物种的抗性，特别是对导致锈病的柄锈菌属中的至少一种病原体物种的抗性。在一个实施方案中，本发明提供了包含R基因Rps6及其变体(包括例如直系同源物和非天然形成的变体)的核酸分子。在某些实施方案中，本发明提供了包含Rps6的核酸分子，其能够赋予植物(特别是小麦或大麦植物)对导致小麦条锈病的小麦条锈病菌(Pst)的抗性。
本发明进一步提供了在其基因组中包含本发明的一个或多个核苷酸构建体的植物、植物细胞和种子。所述的多核苷酸构建体包含编码本发明的抗性(R)蛋白质的核苷酸序列。此类R蛋白质由本发明的R基因编码。在优选的实施方案中，植物和种子为转基因谷物植物和种子，特别是小麦和大麦植物和种子，其已经使用本发明的一个或多个核苷酸构建体转化。优选地，与不包含所述的多核苷酸构建体的对照谷物植物的抗性相比，此类谷物植物包含对Pst的增强的抗性。
本发明提供了用于生产植物的方法，其中所述的植物具有对植物疾病的增强的抗性，特别是锈病，更特别是小麦条锈病。此类方法包括将包含本发明的R基因的核苷酸序列的多核苷酸构建体引入至少一种植物细胞中。在一些实施方案中，所述的多核苷酸构建体或其部分被稳定地引入植物细胞的基因组中，而在其他的实施方案中，所述的多核苷酸构建体不稳定地引入植物细胞的基因组中。用于生产具有对植物疾病的增强的抗性的植物的方法可以可任选地进一步包括使植物细胞再生成其基因组中包含所述的多核苷酸构建体的植物。优选地，此类植物相对于对照植物对植物疾病的抗性而言，包含对植物疾病的增强的抗性。在某些实施方案中，植物为小麦或大麦，其相对于对照小麦或大麦植物对Pst的抗性而言，包含对由Pst引起的小麦条锈病的增强的抗性。
本发明进一步提供了用于生产具有对小麦条锈病的增强的抗性的大麦植物的方法。该方法包括修饰大麦植物或其至少一个细胞中的抗性基因Rps6的非功能等位基因，从而形成功能等位基因，由此增强大麦植物对小麦条锈病的抗性。在本发明的方法中，修饰非功能等位基因包括将至少一种基因修饰引入非功能等位基因中。该基因修饰包括例如在非功能等位基因中至少一个碱基对的一个或多个的插入、删除和/或取代，由此产生功能等位基因。本发明另外地提供了通过这种方法生产的非转基因和转基因大麦植物和种子。
此外，还提供了使用本发明的植物在农业农作物生产中限制小麦条锈病的方法。所述的方法包括种植由本发明的植物生产的种子，特别是小麦或大麦种子，其中小麦或大麦种子包含本发明的至少一个基因R核苷酸序列，特别是Rps6核苷酸序列。所述的方法进一步包括在有利于植物生长和发育的条件下使植物生长，并且可任选地由所述的植物回收至少一粒种子。
此外，提供包含本发明的一个或多个核酸分子的非转基因和转基因植物、植物部分、种子、植物细胞、其他宿主细胞、表达盒和载体。
附图简述
图1.接种Pst的大麦栽培品种Abed Binder 12和Russell的宏观和微观的表型。
图2.在接种Pst分离株08/501的Abed Binder 12 x Russell F2群体上，萎黄病和定植情况的柱状图和双因素图。柱状图显示在F2群体中，萎黄病(A)和pCOL(B)的隔离。上图显示亲代和F1表型(A:Abed Binder 12，R:Russell)。(C)显示萎黄病与pCOL表型的关系的双因素图。分别以三角形和正方形显示Abed Binder 12和Russell的表型。
图3.在接种Pst的Abed Binder 12 x Russell F2群体中，萎黄病和pCOL表型的复合区间作图。基于1,000个排列，基于个体试验广度阈值(individual experiment-widethreshold)(虚线)，将LOD曲线对萎黄病(灰色)和pCOL(黑色)归一化(nLOD)。使用2cM的步长，并且x轴跨越AxR-Pst F2群体基因图谱的长度。
图4.Rps6的精细作图。(A)基因重组筛选的高分辨率基因图谱，其中包含2,894个配子。左侧显示的数字为标志物之间重组事件的数量。标志物的名称显示在右侧，并且在标志物名称之后的字母显示由单个WGS重叠群衍生的共隔离KASP标志物。(B)基于高分辨率基因图谱的物理图谱锚定。经测序的或者具有可用的BES的BAC为黑色，其他的BAC显示为灰色。基于标志物的锚定，显示截短的FPC320。
图5.在Rps6区域中，5个NLR候选基因的鉴定和基因作图。(A)Abed Binder 12 xRussell高分辨率F2图谱用于对Rps6进行精细作图。(B)双单倍体衍生的F2作图群体(DHMP)。连锁群左侧上的数字显示标志物之间重组事件的数量。
图6.Rps6的物理作图和候选基因NLR-A的基因模型。在上方显示容纳衍生自AbedBinder 12(AB12)的NLR-A、NLR-D和NLR-E的BAC克隆。在上方AB12的轨迹中表明NLR候选物NLR-A、NLR-D和NLR-E的位置，以及在基因座中的其他基因的位置，包括MLOC_8985(G1)、MLOC_41646(G2)和MLOC_19985(G3)。在下方AB12轨迹中，其他灰色的盒代表重复序列。3个其他的轨迹显示由Barke(Rps6)、Bowman(Rps6)和Morex(rps6)衍生的全基因组鸟枪重叠群的比对。
图7.单核苷酸多态性区分3种NLR-A单体型。(A)得自Abed Binder 12‘A’和Russell‘R’的gDNA，其是使用NLR-A特异性的8个PCR引物对扩增的。(B)上图：得自Rps6和rps6编号的gDNA，其是使用引物对A05/A11扩增的；下图：在8种Rps6的不同的编号中，使用TaqαI消化PCR扩增子来区分3种NLR-A单体型(NLR-A1、NLR-A2和nlr-a)。
图8.用于基于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化的NLR-A构建体的研发。左侧(LB)和右侧(RB)边界序列作为侧翼的T-DNA设计包含潮霉素抗性基因，其是通过35S启动子和nos终止子驱动的，其后为NLR-A的2.4kb启动子，外显子1、2和3，内含子3，外显子4，和1.8kb终止子。其他特征包括两个复制起始位点(pSa-ORI和colEI-ori)和卡那霉素抗性(npt1)。图8所示的构建体的实施方案包含在SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列。
序列表
使用核苷酸碱基的标准的字母缩写和氨基酸的3字母密码示出在所附的序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列符合在序列5'末端开始，向前进行(即，在各行的左至右)至3'末端的标准惯例。仅示出各核苷酸序列的一条链，但是应该理解互补链通过对所显示的链的任意参照而被包含在内。氨基酸序列符合在序列的氨基末端开始，向前进行(即，在各行的左至右)至羧基末端的标准惯例。
SEQ ID NO:1列出由大麦(Hordeum vulgare)‘Abed Binder 12’得到的R基因Rps6的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2列出由大麦‘Abed Binder 12’得到的Rps6的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以与包含SEQ ID NO:2的核酸分子的3'末端可操作地连接。
SEQ ID NO:3列出由大麦‘Abed Binder 12’得到的Rps6编码的R蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4列出细菌人工染色体(BAC)，BAC_4931-1-11E的核苷酸序列。该BAC为包含核苷酸序列的核酸分子，其中所述的核苷酸序列对应于其中定位有Rps6的大麦‘AbedBinder 12’的基因组的区域。
SEQ ID NO:5列出由大麦‘Hindmarsh’得到的Rps6的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以与包含SEQ ID NO:2的核酸分子的3'末端可操作地连接。
SEQ ID NO:6列出由大麦‘Hindmarsh’得到的Rps6编码的R蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7列出由大麦‘WBDC008’得到的Rps6的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以与包含SEQ ID NO:2的核酸分子的3'末端可操作地连接。
SEQ ID NO:8列出由大麦‘WBDC008’得到的Rps6编码的R蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9列出由大麦‘WBDC085’得到的Rps6的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以与包含SEQ ID NO:2的核酸分子的3'末端可操作地连接。
SEQ ID NO:10列出由大麦‘WBDC085’得到的Rps6编码的R蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11列出由大麦‘WBDC109’得到的Rps6的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以与包含SEQ ID NO:2的核酸分子的3'末端可操作地连接。
SEQ ID NO:12列出由大麦‘WBDC109’得到的Rps6编码的R蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13列出由大麦‘WBDC110’得到的Rps6的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以与包含SEQ ID NO:2的核酸分子的3'末端可操作地连接。
SEQ ID NO:14列出由大麦‘WBDC110’得到的Rps6编码的R蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15为实施例2中所述的并且在图8中示例显示的IHP_0205_NLR-A_构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16为IHP_0205_NLR-A_T-DNA构建体的部分的核苷酸序列，其中预计所述的构建体在使用包含IHP_0205_NLR-A_构建体的根癌土壤杆菌转化的过程中被转移至植物中。
SEQ ID NO:17为IHP_0205_NLR-A构建体的部分的核苷酸序列，其中所述的构建体包含NLR-A的序列。
SEQ ID NO:18-33为PCR引物，参照表4。
SEQ ID NO:34为实施例2中所述的IHP_0300_NLR-A_天然构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO:35为实施例2中所述的pBract202_TSL_pMla6_NLR-A_CDS_gDNA_tMla6构建体的核苷酸序列。
发明详述
现在参照附图，下文将更全面地描述本发明，其中示出本发明的一些实施方案，但不是全部的实施方案。事实上，这些发明可以以多种不同的形式体现，并且不应该解释成限制于本文列出的实施方案；而且提供这些实施方案，使得本发明公开满足应用的法律需要。在全文中，相同的数字是指相同的元件。
本文中列出的本发明的许多修改和其他的实施方案提醒本发明所属技术领域的任一技术人员，在上述说明书和相关的附图中呈现的教导的益处。因此，应该理解的是本发明不限于所公开的具体的实施方案，并且修改和其他的实施方案应该被包含在所附权利要求书的范围内。尽管在本发明中使用了具体的术语，但是它们仅是一般的且描述意义上的使用，不是为了限制的目的。
本发明涉及植物抗性(R)基因，特别是赋予植物对由植物病原体引起的植物疾病的抗性的R基因。本发明进一步涉及R基因的制图和分离，其中所述的R基因能够赋予大麦植物对由小麦条锈病菌(Pst)引起的多种小麦条锈病物种的抗性。如下文中公开，得自大麦(Hordeum vulgare)的命名为Rps6的Pst抗性基因精细地作图在大麦基因组的0.1cM区域。通过将Rps6基因座锚定于大麦物理图谱中，将该区域置于跨越267kb的物理区域的单指纹重叠群上。在对该区域测序后，鉴定编码结合核苷酸的富含亮氨酸的重复蛋白(NLR)的多个候选基因。在这些候选NLR基因中，测定NLR-A对应于Rps6。
本发明提供了包含R基因的核苷酸序列的核酸分子，特别是Rps6的核苷酸序列，以及其天然形成的(例如直系同源物和等位基因变体)和合成的或人工的(即，非天然形成的)其变体。R基因的这种核苷酸序列(在本发明中还称为R基因核苷酸序列)编码R蛋白质。本发明的R基因核苷酸序列包括但不限于野生型R基因(其包含天然启动子和包含编码区的3′相邻区)，cDNA序列，和仅包含编码区的核苷酸序列。这种R基因核苷酸序列的实例包括在SEQID NO:1、2、5、7、9、11和13中列出的核苷酸序列及其变体。在其中天然R基因启动子未用于驱动编码R蛋白质的核苷酸序列的表达的实施方案中，异源启动子可以与编码本发明的R蛋白质的核苷酸序列可操作地连接，从而驱动编码R蛋白质的核苷酸序列在植物中表达。
优选地，本发明的R蛋白质为功能R蛋白质，其能够赋予包含R蛋白质的植物以对由植物病原体引起的植物疾病的增强的抗性。更优选地，本发明的R蛋白质为功能R蛋白质，其能够赋予包含R蛋白质的大麦和/或小麦植物以对由至少一种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的增强的抗性。在本发明的一些实施方案中，本发明的R蛋白质包括对多种(即，2种或多种)小麦条锈病菌物种的广谱抗性。
本发明的功能R蛋白质是由本发明的功能等位基因编码的。如本文所用，除非另外陈述或者由使用的内容清楚可见，本发明的“R蛋白质的非功能等位基因”为以下的等位基因：其不能赋予包含杂合或纯合状态下的等位基因的植物以对至少一种特定植物病原体物种的抗性。
类似地，本发明的功能RPS6蛋白质是由本发明的功能Rps6等位基因编码的。如本文所用，除非另外陈述或者由使用的内容清楚可见，本发明的“Rps6的非功能等位基因”为以下的等位基因：其不能赋予包含杂合或纯合状态下的等位基因的大麦植物以对植物病原体(特别是至少一种Pst物种)的抗性。应该认识到这种“非功能等位基因”可以编码以下的蛋白质：其在大麦植物中包含生物活性或其他功能，然而在大麦植物中对于Pst或其他病原体而言，是非功能的。
本发明进一步提供了包含多核苷酸构建体的转基因植物，其中所述的构建体包含本发明的R基因核苷酸序列，特别是Rps6核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸构建体被稳定地引入植物的基因组中，而在其他的实施方案中，通过瞬时转化方法转化植物，并且多核苷酸构建体未稳定地引入植物的基因组中。用于植物的稳定的和瞬时转化的方法在本文其他处公开，或者在本领域中以其他方式已知。在本发明的优选的实施方案中，转基因植物为草类植物，特别是谷物植物，更特别是小麦或大麦植物。这种转基因植物包含对至少一种植物疾病的增强的抗性，特别是锈病，更特别是由至少一种、但优选的是多种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病。
在某些实施方案中，本发明的转基因植物包含多核苷酸构建体，其包含编码R蛋白质的核苷酸序列和可操作地连接以用于表达编码R蛋白质的核苷酸序列的异源启动子。异源启动子的选择可以取决于多种因素，例如所需的时机、位置和表达方式，以及对特定生物或非生物刺激的应答。目的启动子包括但不限于病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。
本发明进一步提供了用于生产具有对至少一种植物疾病的增强的抗性的植物的方法。所述的方法包括将本发明的多核苷酸构建体引入至少一种植物细胞中。在某些实施方案中，多核苷酸构建体被稳定地引入植物细胞的基因组中。如果需要，所述的方法可以进一步包括使植物细胞再生成在其基因组中包含所述的多核苷酸构建体的转基因的或转化的植物。优选地，这种再生植物为小麦或大麦植物，其包含对由植物病原体引起的植物疾病的增强的抗性。在某些实施方案中，再生植物为小麦或大麦植物，其包含对由多于一种植物病原体引起的多于一种植物疾病的增强的抗性。在某些其他的实施方案中，再生植物为小麦或大麦植物，其包含对由1、2、3、4、5或更多、或者甚至所有种类的特定植物病原体引起的植物疾病的增强的抗性。在本发明的优选的实施方案中，再生植物为小麦或大麦植物，其相对于对照小麦或大麦植物对由至少一种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的抗性而言，包含对由至少一种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的增强的抗性。在本发明的另一个优选的实施方案中，再生植物为小麦或大麦植物，其相对于对照小麦或大麦植物对由相同一组的小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的抗性而言，包含对由多种或者甚至所有已知的小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的增强的抗性。
在本发明的另一个优选的实施方案中，再生植物为小麦或大麦植物，其相对于对照小麦或大麦植物对由2、3、4、5或更多种不同的柄锈菌属菌种引起的2、3、4、5或更多种不同的锈病的抗性而言，包含对由2、3、4、5或更多种不同的柄锈菌属菌种引起的2、3、4、5或更多种不同的锈病的增强的抗性。2种或多种柄锈菌属菌种可以包括但不必一定包括小麦条锈病菌。本实施方案的再生小麦或大麦植物可以包含对由各个柄锈菌属菌种的1、2、3、4、5或更多种、或者甚至所有已知的物种引起的锈病的抗性。
本文公开的小麦和大麦植物在用于在农业农作物生产中限制小麦条锈病的方法中具有用途，特别是在小麦条锈病盛行的地区。本发明的方法包括种植由本发明的小麦植物或大麦植物生产的小麦种子或大麦种子，其中小麦种子或大麦种子包含本发明的至少一条R基因核苷酸序列，特别是Rps6核苷酸序列。所述的方法进一步包括使来源于种子的小麦或大麦植物在有利于小麦或大麦植物生长和发育的条件下生长，并且可任选地，由小麦或大麦植物收获至少一粒种子。
本发明另外地提供了用于鉴定显示对小麦条锈病的新赋予的或增强的抗性大麦植物的方法。所述的方法在育种对小麦条锈病具有抗性的大麦植物中具有用途。此类抗性大麦植物在大麦种子的农业生产中具有用途。所述的方法包括检测大麦植物中至少一个R基因的存在情况，特别是Rps6或其功能变体。在本发明的一些实施方案中，检测R基因的存在情况包括检测由大麦植物得到的基因组DNA中的完全R基因。但是，在优选的实施方案中，检测R基因的存在情况包括检测至少一种标志物在R基因中的存在情况。在本发明的其他的实施方案中，检测R基因的存在情况包括使用例如免疫检测方法(涉及对R蛋白质具有特异性的抗体)检测由R基因编码的R蛋白质的存在情况。
在用于鉴定显示对小麦条锈病的新赋予的或增强的抗性的大麦植物的方法中，检测大麦中R基因的存在情况可以涉及在本文其他处公开的或本领域中以其他方式已知的分子生物学技术的一种或多种，包括但不限于由大麦植物分离基因组DNA和/或RNA，通过PCR扩增而扩增包含R基因和/或其标志物的核酸分子，对包含R基因和/或标志物的核酸分子进行测序，通过核酸杂交鉴定R基因、R基因的标志物或转录物，以及实施免疫测定法用于检测由R基因编码的R蛋白质。应该认识到寡核苷酸探针和PCR引物可以设计成鉴定本发明的R基因，并且这种探针和PCR引物可以用于本文其他处公开的或本领域中以其他方式已知的方法中，用于快速鉴定大麦植物群体中一种或多种包含本发明的R基因的大麦植物。
根据所需的结果，本发明的多核苷酸构建体可以被稳定地引入植物细胞的基因组中，或者不能稳定地引入植物细胞的基因组中。例如如果所需的结果是为了生产稳定转化的植物，该植物具有对由至少一种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的增强的抗性，则所述的多核苷酸构建体可以例如被融合至适用于将多核苷酸构建体稳定地引入植物细胞基因组中的植物转化载体中。通常，稳定转化的植物细胞将再生成其基因组中包含多核苷酸构建体的转化的植物。这种稳定转化的植物能够通过有性和/或无性生殖在随后的传代中将多核苷酸构建体传送至后代植物中。植物转化载体、使用引入的多核苷酸构建体稳定地转化植物的方法以及由转化的植物细胞和组织使植物再生的方法对于单子叶植物和双子叶植物而言是本领域公知的，或者在本发明的其他处有所描述。
本发明提供了包含R基因的核酸分子。优选地，这种R基因能够赋予宿主植物以对至少一种植物病原体的至少一个物种的增强的抗性，其中所述的植物病原体在宿主植物上引起小麦秆锈病。在本发明的某些优选的实施方案中，这种R基因能够赋予小麦或大麦植物以对病原体的至少一个物种的增强的抗性，其中所述的病原体引起小麦秆锈病，为小麦条锈病菌。因此，这种R基因在农业生产中限制由小麦条锈病菌引起的小麦条锈病中具有用途。本发明的R基因包括但不限于其核苷酸序列在本文中公开的R基因，但还包括直系同源物和其他的变体，它们能够赋予小麦或大麦植物以对由至少一个物种，但优选为多个物种的小麦条锈病菌的引起的小麦秆锈病的抗性。本领域已知或本文其他处公开多种方法用于测定植物对由植物病原体引起的植物疾病的抗性，例如由小麦条锈病菌引起的小麦条锈病。
本发明的方法在生产具有对由植物病原体引起的植物疾病的增强的抗性的植物中具有用途。通常，与对照植物对植物病原体的相同物种或多个物种的抗性相比，本发明的方法将主题植物对一种植物病原体物种或者2种或多种植物病原体物种的每一种的抗性增强或增加至少25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、500％或更高。除非另外陈述或者由使用内容显而易见，否则用于本发明的对照植物为不包含本发明的多核苷酸构建体的植物。优选地，对照植物与包含本发明的多核苷酸构建的植物是基本一致的(相同的物种、亚种和多样性)，不同之处在于所述的对照植物不包含所述的多核苷酸构建体。在一些实施方案中，所述的对照包含多核苷酸构建体，但是不包含在本发明的多核苷酸构建中的一个或多个R基因序列。
此外，本发明提供了通过本发明的方法产生的和/或包含本发明的多核苷酸构建体的转化的植物、种子和植物细胞。此外，提供了包含本发明的多核苷酸构建体的后代植物及其种子。本发明还提供了通过本发明的转化的植物和/或后代植物、以及由这种植物部分(意图用于人类和其他动物消耗或使用，包括但不限于宠物(例如狗和猫)和家畜(例如猪、奶牛、小鸡、火鸡和鸭子))产生的食物产物和其他农业产物产生的种子、蔬菜部分和其他植物部分。
本发明的方法可以用于增强植物对锈病的抗性，特别是由柄锈菌属的菌种引起的锈病，特别是由小麦条锈病菌引起的条锈病。用于本发明的方法中的优选的植物为草类植物，特别是谷物植物，更特别地大麦和小麦植物。
本发明涵盖分离的或基本纯化的多核苷酸(在本发明中还称为“核酸分子”、“核酸”等)或蛋白质(在本发明中还称为“多肽”)组合物，包括例如包含在所附的序列表中列出的序列的多核苷酸和蛋白质，以及这种多核苷酸和蛋白质的变体和片段。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质、或者其生物活性部分基本上或本质上不含正常情况下伴随或与多核苷酸或蛋白质相互作用的成分，如在其天然形成环境中发现的那些。因此，当通过重组技术生产时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质基本不含其他的细胞物质或培养介质，或者当化学合成时，基本不含化学前体或其他化学制品。最佳地，在衍生多核苷酸的有机体的基因组DNA中，“分离的”多核苷酸不含天然情况下位于所述的多核苷酸的侧翼(即，位于所述的多核苷酸的5'和3'末端的序列)的序列(最佳地，蛋白质编码序列)。例如在多个实施方案中，分离的多核苷酸可以包含核苷酸序列的少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb，其中在衍生所述的多核苷酸的细胞的基因组DNA中，所述的核苷酸序列天然情况下位于所述的多核苷酸的侧翼。基本不含细胞物质的蛋白质包括蛋白质的制备物，其具有少于大约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染性蛋白质。当本发明的蛋白质或其生物活性部分以重组方式生产时，最佳的培养介质表示化学前体或非目的蛋白质化学制品的少于大约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)。
本发明公开的多核苷酸及由其编码的蛋白质的片段和变体也涵盖在本发明的范围内。“片段”是指多核苷酸的部分或氨基酸序列及因此由其编码的蛋白质的部分。包含编码序列的多核苷酸的片段可以编码保留全长或天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段。备选地，用作杂交探针的多核苷酸的片段通常不编码保留生物活性或不保留启动子活性的蛋白质。因此，核苷酸序列的片段可以为至少大约20个核苷酸、大约50个核苷酸、大约100个核苷酸以及至多本发明的全长的多核苷酸。
作为天然R多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、125、150、175、200、300、400、500、1000、2000、5000、7500、10000、12500相邻的核苷酸，或者至多本文公开的全长R多核苷酸中存在的核苷酸的数量(例如SEQ ID NO:1的12800个核苷酸，和SEQ IDNO:2、5、7、9、11和13的3126个核苷酸)。
“变体”是指基本相似的序列。就多核苷酸而言，变体包括具有以下的多核苷酸：在5'和/或3'末端的删除(即，截短)；在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的删除和/或加入；和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然的”多核苷酸或多肽分别包括天然形成的核苷酸序列或氨基酸序列。就多核苷酸而言，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而编码本发明之一的R蛋白质的氨基酸序列的那些序列。天然形成的等位基因变体，例如可以使用公知的分子生物学技术鉴定的那些，例如下文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，例如通过使用例如定点诱变生成的那些，但是它们还编码本发明的R蛋白质。通常，本发明的特定的多核苷酸变体与特定多核苷酸具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，如通过本文其他处所述的序列比对程序和参数所测定的。在本发明的某些实施方案中，本发明的特定的多核苷酸变体将与选自SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和13的至少一个核苷酸序列具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，并且可任选地，包含非天然形成的核苷酸序列，该序列与选自在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和13中列出的至少一个核苷酸序列具有至少一个核苷酸修饰的不同，其中所述的核苷酸修饰选自至少一个核苷酸的取代，至少一个核苷酸的加入，和至少一个核苷酸的删除。
还可以通过比较变体多核苷酸编码的多肽与参照多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列一致性来评价本发明的特定的多核苷酸的变体(即，参照多核苷酸)。因此，公开了例如编码多肽的多核苷酸，其中所述的多肽与SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14的多肽具有给定的百分比序列一致性。可以使用本文其他处所述的序列比对程序和参数来计算任2个多肽之间的百分比序列一致性。在通过比较本发明的任意给定的一对多核苷酸所编码的2个多肽所共有的百分比序列一致性来评价所述的这对多核苷酸的情况下，2个编码的多肽之间的百分比序列一致性为至少大约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在本发明的某些实施方案中，本发明的特定的多肽的变体与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的至少一个全长氨基酸序列具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，并且可任选地，包含非天然形成的氨基酸序列，该序列与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的至少一个全长氨基酸序列具有至少一个核苷酸修饰的不同，其中所述的氨基酸修饰选自至少一个氨基酸的取代，至少一个氨基酸的加入，和至少一个氨基酸的删除。
“变体”蛋白质是指由天然蛋白质通过以下方式衍生的蛋白质：在天然蛋白质的N-末端和/或C-末端处的一个或多个氨基酸的删除(所谓的截短)；在天然蛋白质的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的删除和/或加入；或者在天然蛋白质的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代。这种变体可以得自例如遗传多态性或得自人为操作。R蛋白质的生物活性变体与由天然蛋白质的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列)具有至少大约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，如通过在本文中其他处所述的序列比对程序和参数所测定的。本发明的蛋白质的生物活性变体与所述的蛋白质可以具有1-15个氨基酸残基、1-10个、例如6-10、5个、4、3、2或者甚至1个氨基酸残基的不同。
本发明的蛋白质可以以多种方式改变，包括氨基酸取代，删除、截短和插入。用于这种操作的方法是本领域公知的。用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域公知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel et al.(1987)Methodsin Enzymol.154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker and Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York)和其中引用的参考文献。关于合适的氨基酸取代(不影响目的蛋白质的生物活性)的指导可以在Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到，该文献以引用方式并入本文。保守性取代(例如将一个氨基酸与具有相似性质的另一个氨基酸交换)可以是最佳的。
因此，本发明的基因和多核苷酸包括天然形成的序列以及突变体和其他变体形式。类似地，本发明的蛋白质涵盖天然形成的蛋白质和人工的或非天然形成的蛋白质以及它们的变体和修饰形式。更优选地，这种变体赋予包含该变体的植物或其部分以对由至少一种小麦条锈病菌物种的引起的小麦条锈病的增强的抗性。在一些实施方案中，在编码变体的DNA中形成的突变不会将所述的序列置于阅读框之外。最佳地，突变不会创建会产生二级mRNA结构的互补区。参见EP专利申请公开号75,444。
预计本文涵盖的蛋白质序列的删除、插入和取代在蛋白质的特征中不产生自由基变化。但是，在进行取代、删除或插入之前难以预计此类操作的确切作用时，本领域的技术人员将理解所述的作用将通过常规的筛选测定法来评价。换言之，可以通过下文公开的测定法来评价活性。
例如可以使用Rps6多核苷酸转化对于由小麦条锈病菌的特定的一个物种或多个物种引起的小麦条锈病是易感的小麦或大麦植物，然后所述的小麦或大麦植物再生成包含所述的多核苷酸的转化的或转基因的植物，并使用本领域已知的或本文中其他处所述的标准的抗性测定法，测试对由小麦条锈病菌的特定的一个物种或多个物种引起的小麦条锈病的抗性。本发明的优选的变体多核苷酸或多肽赋予或者能够赋予小麦或大麦植物对由小麦条锈病菌的至少一个物种，但是优选的2个或更多个物种的增强的抗性，其中已知所述的小麦条锈病菌在易感的小麦或大麦植物中导致小麦条锈病。
变体多核苷酸和蛋白质还涵盖由诱变和重组过程(例如DNA改组)衍生的序列和蛋白质。这种DNA改组策略是本领域已知的。例如参见Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameriet al.(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504-4509；Crameri et al.(1998)Nature 391:288-291以及美国专利号5,605,793和5,837,458。
本发明的多核苷酸可以用于由其他有机体，特别是其他植物，分离相应的序列。在这种方式中，诸如PCR、杂交等之类的方法可以用于基于与本文列出的序列的序列同源性来鉴定这种序列。基于与本文列出的完整序列或者其变体和片段的序列一致性而分离的序列被涵盖在本发明之内。这种序列包括作为本发明公开的序列的直系同源物的序列。“直系同源物”是指由共同的祖先基因衍生的基因，并且作为物种形成的结果，该基因在不同物种中发现。当在不同的物种中发现的基因的核苷酸序列和/或它们的编码蛋白质序列共有至少60％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性时，认为这些基因是直系同源物。在多种物种中，直系同源物的功能通常是高度保守的。因此，编码R蛋白质并且在严谨条件下与本文公开的或者以其他方式在本领域已知的至少一种R蛋白质杂交的分离的多核苷酸、或者它们的变体或片段被涵盖在本发明之内。
在一个实施方案中，本发明的直系同源物具有编码序列，其与在SEQ ID NO:2、5、7、9、11或13的至少一者中列出的核苷酸序列包含至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸序列一致性，和/或本发明的直系同源物编码蛋白质，其与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的氨基酸序列的至少一者包含至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸序列一致性。
作为NLR蛋白质，RPS6是由Rps6编码的R蛋白质，其包含某些保守的结构域。在RPS6的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的保守的结构域包含例如卷曲螺旋结构域(氨基酸39至189)、核苷酸结合结构域(氨基酸190至384)，和富含亮氨酸的重复结构域(氨基酸586至988)。优选地，本发明的变体RPS6蛋白质包含对应于上文公开的结构域的卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域。
在一些实施方案中，与本发明公开的RPS6蛋白质的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:3)相比，本发明的变体RPS6蛋白质包含与1个、2个或3个这种保守结构域的更高百分比的氨基酸序列一致性。优选地，这种变体包含与NLR蛋白质的1个、2个或3个保守结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的相应的一个或多个结构域，并且进一步包含与在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
应该认识到变体RPS6蛋白质中的结构域(对应于那些保守的结构域)以及其中任何特定的保守的氨基酸可以通过本领域那些技术人员已知的或者本文其他处公开的方法进行鉴定，例如多序列比对。进一步认识到在特定的变体RPS6中这种保守的结构域和保守的氨基酸的位置可以由SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列中的位置处改变，并且通过诸如多序列比对之类的方法，针对本发明的任何变体RPS6蛋白质，可以测定这种保守的结构域和保守的氨基酸的相应位置。
优选地，本发明的变体RPS6蛋白质以及编码它们的多核苷酸赋予或者能够赋予包含这种蛋白质或多核苷酸的大麦或小麦植物对至少一种小麦条锈病菌物种的增强的抗性，其中已知所述的小麦条锈病菌物种在易感的小麦或大麦植物中导致小麦条锈病。
在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应中，从而由任何目的植物提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常是本领域已知的，并且在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)中公开。还参见Inniset al.,eds.(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(AcademicPress,New York)；Innis and Gelfand,eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press,NewYork)和Innis and Gelfand,eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、套式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配的引物等方法。
在杂交技术中，已知多核苷酸的全部或部分被用作探针，该探针与由所选有机体得到的克隆基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即，基因组或cDNA文库)中存在的其他相应的多核苷酸选择性地杂交。杂交探针可以为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以使用可检测基团(例如32P)或任何其他的可检测标志物进行标记。因此，例如用于杂交的探针可以通过对基于本发明的多核苷酸合成的寡核苷酸进行标记而制成。制备用于杂交的探针以及构建cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并且在Sambrooket al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview,New York)中公开。
例如本发明公开的完整多核苷酸或者其一个或多个部分可以用作能够与相应的多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为了在多种条件下取得特异性杂交，这种探针包含那些在基因序列或者目的序列的cDNA中是独特的序列，并且最佳地，长度为至少大约10个核苷酸，最佳地长度为至少大约20个核苷酸。这种探针可以用于通过PCR扩增用于由所选植物得到的特定目的基因的相应多核苷酸。这种技术可以用于由所需的植物分离其他的编码序列，或者作为诊断测定法来测定植物中编码序列的存在情况。杂交技术包括铺板的DNA文库的杂交筛选(噬菌斑或集落，例如参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork))。
这种序列的杂交可以在严谨条件下实施。“严谨条件”或“严谨的杂交条件”是指在这样的条件下，探针将以比其他序列更高(例如超过背景至少2倍)的可检测程度与其靶序列杂交。严谨条件是序列依赖的，并且在不同的环境中不同。通过控制杂交的严谨性和/或洗涤条件，与探针具有100％互补性的靶序列可以被鉴定(同源探针)。备选地，可以调节严谨条件，从而允许序列中具有一些错配，使得更低程度的相似性被检测(异源探针)。通常，探针的长度少于大约1000个核苷酸，最佳地，长度少于500个核苷酸。
通常，严谨条件为其中在pH 7.0至8.3的盐浓度低于大约1.5M Na离子、通常为大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)并且温度为对于短探针(例如10至50个核苷酸)至少大约30℃和至少对于长探针(例如超过50个核苷酸)大约60℃的那些条件。严谨条件还可以通过加入不稳定试剂(例如甲酰胺)取得。示例性的低严谨条件包括在37℃使用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，以及在50℃至55℃在1x至2x SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中进行洗涤。示例性的中度严谨条件包括在37℃在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中进行杂交，以及在55℃至60℃在0.5x至1xSSC中进行洗涤。示例性的高严谨条件包括在37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中进行杂交，以及在60℃至65℃在0.1X SSC中进行洗涤。可任选地，洗涤缓冲剂可以包含大约0.1％至大约1％SDS。杂交的持续时间通常少于大约24小时，通常为大约4至大约12小时。洗涤时间的持续时间为至少足以达到平衡的时间长度。
特异性通常为杂交后洗涤的函数，重要的因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交物而言，Tm可以由Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的等式近似得到：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为一价阳离子的摩尔浓度；％GC为DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比；％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比；而L为碱基对中杂交物的长度。Tm为这样的温度(在所定义的离子强度和pH下)，在该温度下，50％互补性靶序列与完美匹配的探针杂交。每错配1％，Tm降低大约1℃，因此可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如如果寻求一致性≥90％的序列，则Tm可以降低10℃。通常，在所定义的离子强度和pH下，对于特定的序列及其互补物，将严谨条件选择为低于热熔点(Tm)大约5℃。然而，严格的严谨条件可以在低于热熔点(Tm)1、2、3或4℃采用杂交和/或洗涤；中度严谨条件可以在低于热熔点(Tm)6、7、8、9或10℃采用杂交和/或洗涤；低严谨条件可以在低于热熔点(Tm)11、12、13、14、15或20℃采用杂交和/或洗涤。利用等式、杂交和洗涤组合物、以及所需的Tm，那些普通技术人员将理解在杂交和/或洗涤溶液的严谨性中的改变本身就有所描述。如果所需的错配程度使得Tm低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，最佳的是增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。对核酸杂交的广泛的指导在Tijssen(1993)Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2(Elsevier,New York)和Ausubel et al.,eds.(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology,Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)中找到。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。
应该认识到本发明的R蛋白质编码序列涵盖包含核苷酸序列的多核苷酸分子，其中所述的核苷酸序列与SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和/或13的核苷酸序列是足够一致的。术语“足够一致的”在本发明中用于指第一氨基酸或核苷酸序列，其包含与第二氨基酸或核苷酸序列足够或最少数量的一致的或等同的(例如具有相似的侧链)氨基酸残基或核苷酸，使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构结构域和/或共同的功能活性。例如包含共同的结构结构域的氨基酸或核苷酸序列(具有至少大约45％、55％或65％一致性，优选为75％一致性，更优选为85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性)在本发明中定义为足够一致的。
为了测定2个氨基酸序列或2个核酸的百分比一致性，将序列比对以达到最佳比较的目的。2个序列之间的百分比一致性为多个序列所共有的相同位置的数量的函数(即，百分比一致性＝相同位置的数量/位置的总数量(例如重叠的位置)x 100)。在一个实施方案中，2个序列为相同的长度。2个序列之间的百分比一致性可以使用类似于下文所述的那些的技术来测定(允许或不允许空位)。在计算百分比一致性中，通常计数准确的匹配。
2个序列之间的百分比一致性的测定可以使用数学算法来完成。用于2个序列的比较的数学算法的优选的非限定性实例为Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法，修改在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中。这种算法被引入至Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，从而得到与本发明的多核苷酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质检索，从而得到与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位的比对，可以使用Gapped BLAST，如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述。备选地，PSI-Blast可以用于执行检测分子之间具有远距离关系的迭代检索。参见Altschul et al.(1997)如上文。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，使用各程序的缺省参数(例如可利用互联网ncbi.nlm.nih.gov上的XBLAST和NBLAST)。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限定性实例为Myers and Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法。这种算法被引入至ALIGN程序(2.0版)中，其为GCG序列比对软件包的部分。当使用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。还可以通过检查进行人工比对。
除非另外陈述，否则本发明提供的序列一致性/相似性值是指使用本发明的全长序列，并通过算法Clustal W(Nucleic Acid Research,22(22):4673-4680,1994)使用软件包Vector NTI Suite Version 7(InforMax,Inc.,Bethesda,MD,USA)中包含的程序AlignX使用缺省参数；或者其任何相当的程序来使用多重比对而获得的值。“相当的程序”是指任何序列比较程序，对于任意2个所考虑的序列而言，所述的程序生成这样的比对，与通过CLUSTALW(Version 1.83)使用缺省参数(可利用the European BioinformaticsInstitute website的互联网：ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html)生成的相应的比对比较时，所述的比对具有一致的核苷酸或氨基酸残基匹配以及一致的百分比序列一致性。
术语“多核苷酸”的使用不旨在将本发明限制为包含DNA的多核苷酸。本领域的那些普通技术人员将认识到多核苷酸可以包含核糖核苷酸，以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然形成的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
包含R蛋白质编码区的多核苷酸构建体可以在用于在植物或其他有机体中或者在目的宿主细胞中表达的表达盒中提供。所述的盒包含与R蛋白质编码区可操作地连接的5'和3'调节序列。“可操作地连接”是指2个或更多个元件之间的功能连接。例如目的多核苷酸或基因与调节序列(即，启动子)之间的可操作地连接是允许目的多核苷酸表达的功能连接。可操作地连接的元件可以是相邻的或非相邻的。当可操作地连接用于指2个蛋白质编码区的连接时，可操作地连接是指编码区处于相同的阅读框中。所述的盒可以另外地包含待共同转化至有机体中的至少一个其他的基因。备选地，其他的基因(多个)可以提供于多个表达盒中。这种表达盒与用于插入R蛋白质编码区至调节区的转录调节下的多个限制性位点和/或重组位点一起提供。表达盒可以另外包含选择性标志物基因。
表达盒沿着转录的5'-3'方向包含在植物、其他有机体或非人类宿主细胞中具有功能的转录和翻译起始区(即，启动子)，本发明的R蛋白质编码区，以及转录和翻译终止区(即，终止区)。调节区(即，启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或本发明的R蛋白质编码区对于宿主细胞或彼此而言可以是天然的/类似的。备选地，调节区和/或本发明的R蛋白质编码区对于宿主细胞或彼此而言可以是异源的。
如本文所用，关于核酸分子或核苷酸序列“异源的”是指起源于外来物种的核酸分子或核苷酸序列，或者如果起源于相同的物种，则通过谨慎的人类干预在组合物和/或基因组基因座中由其天然形式修饰得到。例如，与异源多核苷酸可操作地连接的启动子得自不同于衍生所述的多核苷酸的物种的物种，或者如果得自相同/类似的物种，则一个或两个启动子基本由它们的起源形式和/或基因组基因座修饰得到，或者启动子不是用于可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用，嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，其中所述的转录起始区对于编码序列而言是异源的。
本发明提供了至少包含本发明的核酸分子、表达盒和载体的宿主细胞。在本发明的优选的实施方案中，宿主细胞为植物细胞。在其他的实施方案中，宿主细胞选自细菌、真菌细胞和动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞为非人类动物细胞。然而，在一些其他的实施方案中，宿主细胞为体外培养的人类细胞。
尽管使用异源启动子表达R蛋白质可以是最佳的，但是可以使用相应的R基因的天然启动子。
终止区与转录起始区可以是天然的，与目的可操作地连接的R蛋白质编码区是天然的，与植物宿主可以是天然的，或可以由另一个来源衍生的(即，对于启动子、目的R蛋白质和/或植物宿主而言是外来的或异源的)，或它们的任意组合。常规的终止区可以得自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene 91:151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891-7903和Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。
在合适的情况下，可以优化多核苷酸，用于在转化植物中增加的表达。换言之，可以使用用于改进的表达的植物优选密码子合成多核苷酸。例如参见Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11 for a discussion of host-preferred codon usage。本领域中可利用多种方法用于合成植物优选的基因。例如参见美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，这些文献以引用方式并入本文。
已知其他的序列修饰用于增强在细胞宿主中的基因表达。这些包括删除编码伪多腺苷酸信号的、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列，和其他此类良好表征的序列(其可能有损于基因的表达)。可以将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，其是通过参照在宿主细胞中表达的已知基因来计算的。在可能的情况下，对序列进行修饰，从而避免预计的发夹二级mRNA结构。
所述的表达盒可以另外地包含5'前导序列。这种前导序列可以发挥增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，并且包括小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6126-6130)；马铃薯Y病毒属前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene 165(2):233-238)，MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology 154:9-20)和人类免疫球蛋白重链结合蛋白质(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature 353:90-94)；由苜蓿花叶病毒的衣壳蛋白质mRNA得到的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling et al.(1987)Nature 325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in MolecularBiology of RNA,ed.Cech(Liss,New York),pp.237-256)；以及玉米萎黄病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology 81:382-385)。还参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84:965-968。
在制备表达盒中，可以对多个DNA片段进行操作，从而以合适的方向提供DNA序列，并且如何合适，以合适的阅读框提供DNA序列。为此，可以使用接头或连接体来连接DNA片段，或者可以涉及其他的操作从而提供常规的限制性位点、除去多余的DNA、除去限制性位点等。就此目的而言，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代(resubstitution)，例如转换和颠换。
多种启动子可以用于本发明的实践中。可以根据所需的结果来选择启动子。核酸可以与构成型、组织优选的或用于植物中表达的其他启动子结合。这种构成型启动子包括例如核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBOJ.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他的构成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。
组织优选的启动子可以用于靶向特定植物组织中R蛋白质编码序列的增强的表达。这种组织优选的启动子包括但不限于叶优选的启动子、根优选的启动子、种子优选的启动子和茎优选的启动子。组织优选的启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco et al.(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3):495-505。对于弱表达而言，如果需要，可以修饰这种启动子。
通常，有利的是由诱导型启动子表达基因，特别是病原体诱导型启动子。这种启动子包括由致病相关蛋白质(PR蛋白质)得到的那些，其在被病原体感染后被诱导，例如PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。例如参见Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254；Uknes et al.(1992)Plant Cell 4:645-656和VanLoon(1985)Plant Mol.Virol.4:111-116。还参见WO 99/43819，这些文献以引用方式并入本文。
在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子受到关注。例如参见Marineau etal.(1987)Plant Mol.Biol.9:335-342；Matton et al.(1989)Molecular Plant-MicrobeInteractions 2:325-331；Somsisch et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2427-2430；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14972-14977。还参见Chen et al.(1996)Plant J.10:955-966；Zhang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2507-2511；Warner et al.(1993)Plant J.3:191-201；Siebertz et al.(1989)Plant Cell 1:961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)；并且本文引用的参考文献。用于玉米PRm基因的诱导型启动子受到特别关注，所述的基因的表达是由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导的(例如参见Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200)。
由靶物种得到的其他抗性基因的天然启动子也受到关注。这些启动子通常是病原体诱导型的，并且可能以合适的水平并且在合适的组织中表达抗性基因。这种启动子的实例为小麦的Sr57/Lr34、Sr33和Sr35启动子(Risk et al.(2012)Plant Biotechnol J 10:447-487；Periyannan et al.(2013)Science 341:786-788；Saintenac et al.(2013)Science 341:783-786)。
此外，当病原体通过伤口或昆虫损伤进入植物中时，伤口诱导型启动子可以用于本发明的构建中。这种伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449；Duan et al.(1996)Nature Biotechnology 14:494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford et al.(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208)；系统素(McGurl et al.(1992)Science 225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters 323:73-76)；MPI基因(Corderok et al.(1994)Plant J.6(2):141-150)等，这些文献以引用方式并入本文。
化学调节型启动子可以通过应用外源化学调节剂(regulator)用于调控(modulate)植物中基因的表达。根据目的，启动子可以为化学诱导型启动子，其中化学制品的应用诱导基因表达；或者为化学抑制型启动子，其中化学制品的应用抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于玉米In2-2启动子，其被苯磺酰胺除草剂安全剂活化；玉米GST启动子，其被用作出土前使用的除草剂的疏水性亲电子化合物活化；以及烟草PR-1a启动子，其被水杨酸活化。其他目的化学调节型启动子包括固醇类反应性启动子(例如参见Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425和McNellis et al.(1998)Plant J.14(2):247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)，以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(例如参见Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237,和美国专利号5,814,618和5,789,156)，这些文献以引用方式并入本文。
所述的表达盒还包含用于选择转化的细胞的选择性标志物基因。选择性标志物基因用于选择转化的细胞或组织。标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些；以及赋予对除草化合物的抗性的基因，除草化合物例如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D)。其他的选择性标志物包括表型标志物，例如β-半乳糖苷酶；以及荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)(Suet al.(2004)Biotechnol Bioeng 85:610-9 and Fetter et al.(2004)Plant Cell 16:215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:943-54 andKato et al.(2002)Plant Physiol 129:913-42)和黄色荧光蛋白(PhiYFPTM fromEvrogen,see,Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:943-54)。对于其他的选择性标志物，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6314-6318；Yao et al.(1992)Cell 71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkley et al.(1980)in The Operon,pp.177-220；Hu et al.(1987)Cell 48:555-566；Brown et al.(1987)Cell 49:603-612；Figge et al.(1988)Cell 52:713-722；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86:5400-5404；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2549-2553；Deuschleet al.(1990)Science 248:480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,University ofHeidelberg；Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1917-1921；Labow etal.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3952-3956；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27:1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919；Hlavka et al.(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology,Vol.78(Springer-Verlag,Berlin)；Gill et al.(1988)Nature 334:721-724。这些公开文献以引用方式并入本文。
上述选择性标志物基因的列举无意于进行限制。任何选择性标志物基因都可以用于本发明。
用于转化植物的多种植物转化载体和方法是可利用的。例如参见An,G.et al.(1986)Plant Pysiol.,81:301-305；Fry,J.,et al.(1987)Plant Cell Rep.6:321-325；Block,M.(1988)Theor.Appl Genet.76:767-774；Hinchee,et al.(1990)Stadler.Genet.Symp.203212.203-212；Cousins,et al.(1991)Aust.J.PlantPhysiol.18:481-494；Chee,P.P.and Slightom,J.L.(1992)Gene.118:255-260；Christou,et al.(1992)Trends.Biotechnol.10:239-246；D’Halluin,et al.(1992)Bio/Technol.10:309-314；Dhir,et al.(1992)Plant Physiol.99:81-88；Casas et al.(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA 90:11212-11216；Christou,P.(1993)In VitroCell.Dev.Biol.-Plant；29P:119-124；Davies,et al.(1993)Plant Cell Rep.12:180-183；Dong,J.A.and Mchughen,A.(1993)Plant Sci.91:139-148；Franklin,C.I.andTrieu,T.N.(1993)Plant.Physiol.102:167；Golovkin,et al.(1993)Plant Sci.90:41-52；Guo Chin Sci.Bull.38:2072-2078；Asano,et al.(1994)Plant Cell Rep.13；AyeresN.M.and Park,W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13:219-239；Barcelo,et al.(1994)Plant.J.5:583-592；Becker,et al.(1994)Plant.J.5:299-307；Borkowska et al.(1994)Acta.Physiol Plant.16:225-230；Christou,P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.5:17-27；Eapen et al.(1994)Plant Cell Rep.13:582-586；Hartman,et al.(1994)Bio-Technology 12:919923；Ritala,et al.(1994)Plant.Mol.Biol.24:317-325；和Wan,Y.C.and Lemaux,P.G.(1994)Plant Physiol.104:3748。
在本发明中有用途的植物转化载体包括例如T-DNA载体或质粒，其适用于在本文其他处公开的或者在本领域中以其他方式已知的土壤杆菌属介导的转化方法中。这种T-DNA载体或质粒的实例为IHP_0205_NLR-A_构建体(SEQ ID NO:15)、IHP_0300_NLR-A_天然构建体(SEQ ID NO:34)和pBract202_TSL_pMla6_NLR-A_CDS_gDNA_tMla6构建体(SEQ IDNO:35)。IHP_0205_NLR-A_构建体(SEQ ID NO:15)包含通过35S启动子和nos终止子驱动的潮霉素抗性基因，其后为NLR-A的2.4kb启动子，外显子1、2和3，内含子3，外显子4，以及1.8kb终止子，侧翼为左侧(LB)和右侧(RB)T-DNA边界序列，并且进一步包含2个复制起始位点(pSa-ORI和colEI-ori)以及卡那霉素抗性基因(npt1)。IHP_0300_NLR-A_天然构建体(SEQ ID NO:34)包含通过35S启动子和nos终止子驱动的潮霉素抗性基因，其后为包含所有的4个外显子和3个内含子的NLR-A的天然序列，其长度大约17kb，侧翼为左侧(LB)和右侧(RB)T-DNA边界序列，并且进一步包含2个复制起始位点(pSa-ORI和colEI-ori)以及卡那霉素抗性基因(npt1)。pBract202_TSL_pMla6_NLR-A_CDS_gDNA_tMla6构建体(SEQ ID NO:35)包含通过35S启动子和nos终止子驱动的潮霉素抗性基因，其后为1.2kb启动子序列，Mla6的464bp 5’UTR(GenBank编号No.AJ302293)，包含外显子1、2和3以及内含子1和2的NLR-A的天然编码序列，其为大约12kb，Mla6的47bp 3’-UTR，和得自Mla6的1.6kb终止子，侧翼为左侧(LB)和右侧(RB)T-DNA边界序列，并且进一步包含2个复制起始位点(pSa-ORI和colEI-ori)以及卡那霉素抗性基因(npt1)。
本发明的方法涉及将多核苷酸构建体引入植物中。“引入”是指将多核苷酸构建体以使得该构建体接近植物细胞内部的方式呈递给植物。本发明的方法不依赖于用于将多核苷酸构建体引入植物中的特定的方法，仅依赖于多核苷酸构建体接近植物的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸构建体引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定的转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定的转化”是指引入植物中的多核苷酸构建体整合至植物的基因组中，并且能够被其后代继承。“瞬时转化”是指引入植物中的多核苷酸构建体不整合至植物的基因组中。
就植物和植物细胞的转化而言，使用标准的技术将本发明的核苷酸序列插入本领域已知的适用于核苷酸序列在植物或植物细胞中表达的任何载体中。载体的选择取决于优选的转化技术以及待转化的靶植物物种。
用于构建植物表达盒并且将外来核酸引入植物中的方法是本领域公知的，而且之前已经描述。例如可以使用肿瘤诱导型(Ti)质粒载体将外来DNA引入植物中。用于外来DNA递送的其他方法涉及PEG介导的原生质体转化、电穿孔、微注射晶须以及用于直接DNA吸收的基因枪或微粒轰击的使用。这种方法是本领域已知的。(Vasil等人的美国专利号5,405,765；Bilang et al.(1991)Gene 100:247-250；Scheid et al.,(1991)Mol.Gen.Genet.,228:104-112；Guerche et al.,(1987)Plant Science 52:111-116；Neuhause et al.,(1987)Theor.Appl Genet.75:30-36；Klein et al.,(1987)Nature 327:70-73；Howell etal.,(1980)Science208:1265；Horsch et al.,(1985)Science 227:1229-1231；DeBlocket al.,(1989)Plant Physiology 91:694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach,eds.)Academic Press,Inc.(1988)和Methods in PlantMolecular Biology(Schuler and Zielinski,eds.)Academic Press,Inc.(1989))。转化的方法取决于待转化的植物细胞、所用的载体的稳定性、基因产物的表达水平以及其他参数。
将核苷酸序列引入植物细胞并随后插入植物基因组中的其他合适的方法包括Crossway et al.(1986)Biotechniques 4:320-334所述的微注射；Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606所述的电穿孔；Townsend等人的美国专利号5,563,055、Zhao等人的美国专利号5,981,840所述的土壤杆菌介导的转化；Paszkowski etal.(1984)EMBO J.3:2717-2722所述的直接基因转移；以及在以下所述的弹道粒子加速：例如Sanford等人的美国专利号4,945,050；Tomes等人的美国专利号5,879,918；Tomes等人的美国专利号5,886,244；Bidney等人的美国专利号5,932,782；Tomes et al.(1995)“DirectDNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,”inPlant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg andPhillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6:923-926)；和Lec1 transformation(WO 00/28058)。还参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science andTechnology 5:27-37(洋葱)；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)InVitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8:736-740(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309(玉米)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6:559-563(玉米)；Tomes的美国专利号5,240,855；Buising等人的美国专利号5,322,783和5,324,646；Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into IntactPlant Cells via Microprojectile Bombardment,”in Plant Cell,Tissue,and OrganCulture:Fundamental Methods,ed.Gamborg(Springer-Verlag,Berlin)(玉米)；Klein etal.(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8:833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311:763-764；Bowen等人的美国专利号5,736,369(谷物)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合科)；De Wet et al.(1985)in TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman et al.(Longman,NewYork),pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports 9:415-418 andKaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D’Halluin etal.(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75:407-413(水稻)；Osjodaet al.(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(玉米，通过根癌土壤杆菌)，所有这些文献均以引用方式并入本文。
本发明的多核苷酸可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而被引入植物中。通常，这种方法涉及将本发明的多核苷酸构建体引入病毒DNA或RNA分子中。此外，应该认识到本发明的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。将多核苷酸构建体引入植物中并表达其所编码的蛋白质的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)是本领域已知的。例如参见美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931，这些文献以引用方式并入本文。
如果需要，可以在配制物中制备修饰的病毒或修饰的病毒核酸。这种配制物以已知的方式制备(例如参见US 3,060,084，EP-A 707 445(用于液体浓缩物)，Browning,“Agglomeration”,Chemical Engineering,Dec.4,1967,147-48,Perry’s ChemicalEngineer’s Handbook,4th Ed.,McGraw-Hill,New York,1963,pages 8-57及以下，WO 91/13546，US 4,172,714，US 4,144,050，US 3,920,442，US 5,180,587，US 5,232,701，US 5,208,030，GB 2,095,558，US 3,299,566，Klingman,Weed Control as a Science,JohnWiley and Sons,Inc.,New York,1961，Hance et al.Weed Control Handbook,8th Ed.,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1989和Mollet,H.,Grubemann,A.,Formulation technology,Wiley VCH Verlag GmbH,Weinheim(Germany),2001,2.D.A.Knowles,Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations,KluwerAcademic Publishers,Dordrecht,1998(ISBN 0-7514-0443-8)，例如通过使用适用于农用化学品的配制物的辅助物质延伸活性化合物，例如溶剂和/或载体，如果需要可以使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂，对于种子处理配制物而言，还可任选地使用着色剂和/或粘结剂和/或胶凝剂。
在特定的实施方案中，可以使用本领域已知的多种瞬时转化方法将本发明的多核苷酸构建体和表达盒提供给植物。这种方法包括例如微注射或粒子轰击。例如参见Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202:179-185；Nomura et al.(1986)PlantSci.44:53-58；Hepler et al.(1994)PNAS Sci.91:2176-2180和Hush et al.(1994)J.Cell Science 107:775-784，所有这些文献以引用方式并入本文。备选地，可以使用本领域已知的技术，将多核苷酸瞬时转化至植物中。这种技术包括病毒载体系统和根癌土壤杆菌介导的瞬时表达，如本文其他处所述。
已经转化的细胞可以根据传统的方式生长成植物。例如参见McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后，这些植物可以生长，并且使用相同转化的菌株或不同的菌株授粉，所得的杂交物具有经鉴定的所需表型特征的构成型表达。可以生长2代或更多代，以确保所需的表型特征的表达被稳定地保持，遗传，然后得到收获后确保所需的表型特征被表达的种子。按照这种方式，本发明提供了转化的种子(还称为“转基因种子”)，其具有稳定地引入基因组中的本发明的多核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。
在本发明的某些实施方案中，在本发明的R基因基因座处的非功能等位基因的核苷酸序列可以经在植物体内修饰，形成功能等位基因，其提供对至少一种植物病原体物种的抗性。在本发明的一个实施方案中，在大麦植物中存在于Rps6基因座处的非功能等位基因可以经修饰，形成功能等位基因，其提供对例如小麦条锈病菌的至少1个、2个、3个或4个物种的抗性。在本发明的另一个实施方案中，在大麦植物中存在于Rps6基因座处的非功能等位基因可以经修饰，形成功能等位基因，其提供对至少2个柄锈菌属的至少1个、2个、3个或4个物种的抗性，其中所述的柄锈菌属在大麦植物中引起锈病。例如处于Rps6基因座处的非功能等位基因可以经修饰，由此形成修饰的等位基因包含在SEQ ID NO:1中列出的Rps6核苷酸序列。在另一个实例中，处于Rps6基因座处的非功能等位基因可以经修饰，由此形成修饰的等位基因包含编码序列(其包含在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的核苷酸序列或其变体)，和/或编码氨基酸序列(其包含在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列或其变体)。
本领域已知的用于修饰植物基因组中的DNA的任何方法都可以用于在植物体内修饰R基因的核苷酸序列，例如将非功能等位基因的核苷酸序列修饰成提供对植物病原体的抗性的功能等位基因的核苷酸序列。在植物基因组中对DNA的这种修饰包括例如插入、删除、取代和它们的组合。可以使用本领域已知的任何方法进行插入、删除和取代，例如通过在本文中其他处所述的或本领域中以其他方式已知的基因组编辑技术。
插入包括将至少一个核苷酸或碱基对(bp)插入本发明的R基因的等位基因中。插入可以包括将任意尺寸的DNA片段插入基因组中。插入的DNA可以为1bp长、1-5bp长、5-10bp长、10-15bp长、15-20bp长、20-30bp长、30-50bp长、50-100bp长、100-200bp长、200-300bp长、300-400bp长、400-500bp长、500-600bp长、600-700bp长、700-800bp长、800-900bp长、900-1000bp长、1000-1500bp。
删除包括由本发明的R基因的等位基因删除至少一个bp。如本文所用，“删除”是指由DNA上除去一个或多个核苷酸或碱基对。如本发明所提供，R基因的等位基因中的删除可以为除去至少1个、至少20个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1000个、至少5000个或更多bp。
取代包括使用另一个bp替代来自本发明的R基因的等位基因的至少1bp。如本文所用，“取代”是指使用不相同的核苷酸或碱基对替代来自DNA的一个或多个核苷酸或碱基对。当取代包含2个或更多个核苷酸时，在等位基因的DNA序列内，2个或更多个核苷酸可以是相邻的或不相邻的。如本文所提供，R基因的等位基因中的取代可以为替代至少1个、至少20个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1000个、至少5000个或更多的碱基对。在一些实施方案中，取代可以为例如转录区、5’非翻译区、3’非翻译区、外显子或内含子的整个等位基因或者它们的任何部分或多个部分的核苷酸序列。
在本发明的某些实施方案中，在R基因基因座处的非功能等位基因的修饰为纯合修饰。“纯合修饰”是指在植物的特定基因组中，所述的修饰在R基因基因座的2个等位基因处。在其他的情况下，R基因基因座基因的修饰为杂合的，即，在植物的基因组中，所述的修饰仅在R基因基因座的一个等位基因处。应该认识到本发明的植物包括例如农作物植物，其具有二倍体或多倍体(例如三倍体或六倍体)的基因组，包括同源多倍体和异源多倍体。同源多倍体是具有超过2组染色体的有机体，所有的染色体均衍生自相同的物种。异源多倍体是具有2组或更多组完整染色体的有机体，其中所述的染色体衍生自不同的物种。根据特定的农作物植物，可以使用本发明公开的方法，修饰植物R基因基因座处的1、2、3、4、5、6或更多个等位基因。
用于修饰植物基因组中的DNA的本领域已知的此类方法包括例如基因组编辑技术，例如涉及靶向诱变、同源重组和突变育种的方法。靶向诱变或类似的技术在美国专利号5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972，5,871,984和8,106,259中公开，所有这些文献的全文以引用方式并入本文。用于基因修饰或基因替代(包括同源重组)的方法可以涉及使用锌指核酸酶(ZFN)，TAL(转录激活子样)效应子核酸酶(TALEN)，规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)/CRISPR相关的核酸酶(CRISPR/Cas核酸酶)或者归位内切酶(经改造的核酸内切酶，使得植物、其他有机体或宿主细胞的基因组中的特异性识别序列处的双链断裂)来诱导DNA中的双键断裂。例如参见Durai et al.,(2005)Nucleic Acids Res 33:5978-90；Maniet al.(2005)Biochem Biophys Res Comm335:447-57；美国专利号7,163,824、7,001,768和6,453,242；Arnould et al.(2006)J Mol Biol 355:443-58；Ashworth et al.,(2006)Nature 441:656-9；Doyon et al.(2006)J Am Chem Soc 128:2477-84；Rosen et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34:4791-800；和Smith et al.,(2006)Nucleic Acids Res34:e149；美国专利申请公开No.2009/0133152；和美国专利申请公开号2007/0117128，所有这些文献的全文以引用方式并入本文。
TAL效应子核酸酶(TALEN)可以用于制造在植物基因组中特异性识别序列处的双链断裂，用于通过同源重组的基因修饰或基因替代。TAL效应子核酸酶为可以用于制造在植物或其他有机体基因组中特异性靶序列处的双链断裂的一类序列特异性核酸酶。TAL效应子核酸酶是通过使天然的或改造的转录激活子样(TAL)效应子或其功能部分与核酸内切酶(例如FokI)的催化结构域融合而创建的。独特的模块化TAL效应子DNA结合结构域可以设计具有潜在的任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此，TAL效应子核酸酶的DNA结合结构域可以被改造成识别特异性DNA靶位点，由此用于制造在所需的靶序列处的双链断裂。参见WO2010/079430；Morbitzer et al.(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze andBoch(2010)Virulence 1:428-432；Christian et al.Genetics(2010)186:757-761；Li etal.(2010)Nuc.Acids Res.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704和Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29:143–148，所有这些文献均以引用方式并入本文。
CRISPR/Cas核酸酶系统还可以用于制造在植物基因组中特异性识别序列处的双链断裂，用于通过同源重组的基因修饰或基因替代。CRISPR/Cas核酸酶为RNA向导的(简单向导RNA，简称为sgRNA)DNA核酸内切酶系统，其在与所设计的RNA同源的DNA链段中执行序列特异性双链断裂。可以设计序列的特异性(Cho S.W.et al.,Nat.Biotechnol.31:230-232,2013；Cong L.et al.,Science 339:819-823,2013；Mali P.et al.,Science 339:823-826,2013；Feng Z.et al.,Cell Research:1-4,2013)。
此外，ZFN可以用于制造在植物基因组中特异性识别序列处的双链断裂，用于通过同源重组的基因修饰或基因替代。锌指核酸酶(ZFN)为融合蛋白质，其包含用于DNA切割的FokI限制性核酸内切酶蛋白质的部分以及锌指蛋白质，锌指蛋白质识别特异性的设计的基因组序列并且切割在这些序列处的双链DNA，由此产生游离的DNA末端(Urnov F.D.et al.,Nat Rev Genet.11:636-46,2010；Carroll D.,Genetics.188:773-82,2011)。
使用位点特异性核酸酶(例如本发明上文所述的那些)使DNA断裂可以增加断裂区中的同源重组率。因此，将上文所述的这种效应子与核酸酶偶联能够在包含加入、删除和其他修饰的基因组中生成靶向的变化。
突变育种也可以用于本文提供的方法和组合物中。突变育种方法可以涉及例如将植物或种子暴露于诱变剂，特别是化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)；以及选择在Rps6基因中具有所需的修饰的植物。而且，其他的诱变剂可以用于本文公开的方法中，包括但不限于辐射，例如X射线、γ射线(例如钴60或铯137)、中子(例如在原子反应器中通过铀235的核裂变的产物)、β辐射(例如由放射性同位素发射的，例如磷32或碳14)和紫外辐射(优选为2500至2900nm)，以及化学诱变剂，例如碱基类似物(例如5-溴-尿嘧啶)、相关的化合物(例如8-乙氧基咖啡因)、抗生素(例如链黑菌素)、烷化剂(例如硫芥、氮芥、环氧化物、乙烯胺、硫酸酯、磺酸酯、砜、内酯)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶。突变育种的其他细节可以在“Principals of Cultivar Development”Fehr,1993 Macmillan Publishing Company中找到，该文献的公开内容以引用方式并入本文。
本发明的核酸分子、表达盒、载体和多核苷酸构建体可以用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。本发明的优选的植物为草类植物，包括禾本科中的驯化的和非驯化的物种，例如草坪草、甘蔗、谷物植物和竹子。更优选的植物为谷物植物，包括但不限于小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、黑麦、稷、二粒小麦和黑小麦。
如本文所用，术语“大麦植物”通常是指作为大麦(Hordeum vulgare)物种的成员的植物，包括但不限于具有落粒穗的二棱大麦(野生大麦；之前归类为H.spontaneumK.Koch)、具有不落粒穗的二棱大麦(之前归类为H.distichum L.)、具有不落粒穗的六棱大麦(之前归类为H.hexastichum L.)和具有落粒穗的六棱大麦(之前归类为H.agriocrithonAber)。
如本文所用，术语“小麦植物”通常是指作为小麦属(Triticum)的一员或者在小麦族(Triticeae tribe)内另一个属的一员的植物，特别是能够与至少一种小麦属物种形成种间杂交物的另一个属的一员。小麦族内这种另一个属的实例为山羊草属(Aegilops)和黑麦属(Secale)。
本发明的小麦植物包括例如驯化的或非驯化的植物。本发明的小麦植物包括但不限于下述小麦属(Triticum)、山羊草属(Aegilops)和黑麦属(Secale)物种：普通小麦(T.aestivum)、栽培一粒小麦(T.monococcum)、圆锥小麦(T.turgidum)、野生一粒小麦(T.boeoticum)、提莫菲维小麦(T.timopheevii)、乌拉尔图小麦(T.urartu)、粗山羊草(A.tauschii)、黑麦(S.cereale)及它们的杂交物。本发明中所包含的普通小麦亚种的实例包括普通(普通小麦)、密穗(密穗小麦)、莫迦(莫迦小麦)、瓦维洛夫(瓦维洛夫小麦)、斯卑尔脱(T.spelta)和sphaecrococcum(shot wheat)。本发明中所包含的圆锥小麦亚种的实例为圆锥、波斯、二粒、硬质、paleocoichicum、波兰、东方和野生二粒。本发明中所包含的栽培一粒小麦亚种的实例为一粒(单粒)和aegilopoide。在本发明的一个实施方案中，小麦植物为圆锥小麦物种的一员；具体为硬质小麦亚种的一员，例如Ciccio、Colosseo或Utopia栽培品种。应该认识到本发明的小麦植物可以是驯化的或非驯化的小麦植物。
本发明还涵盖了包含本发明的R基因的黑小麦植物、黑小麦植物部分和黑小麦植物细胞。如本文所用，“黑小麦植物”是指通过将黑麦植物(黑麦)与四倍体小麦植物(例如圆锥小麦)或六倍体小麦植物(例如普通小麦)杂交而创建的植物。本发明还包括通过本文所述的黑小麦植物产生的种子，以及在本文所述的黑小麦植物附近控制杂草的方法。如本文所用，术语“小麦植物”涵盖了黑小麦植物，除非另外陈述或由使用内容显而易见。
目的植物物种的实例包括但不限于辣椒(辣椒属(Capsicum)的物种；例如甜辣椒(Capsicum annuum)、灯笼辣椒(C.baccatum)、中华辣椒(C.chinense)、灌木状辣椒(C.frutescens)、绒毛辣椒(C.pubescens)等)、番茄(Lycopersicon esculentum)、烟草(Nicotiana tabacum)、茄子(Solanum melongena)，矮牵牛(矮牵牛属(Petunia)的物种；例如Petunia x hybrida或Petunia hybrida)，豌豆(Pisum sativum)，菜豆(Phaseolusvulgaris)，苞米或玉米(Zea mays)，芸苔属(Brassica)的物种(例如甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))、特别是用作种籽油来源的那些芸苔属的物种，苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)，稷(例如珍珠稷(Pennisetum glaucum)，黍稷(Panicum miliaceum)、粟(Setaria italica)、龙爪稷(穇子(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamus tinctorius)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachis hypogaea)，棉(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，草莓(例如非洲草莓(Fragaria×ananassa)、野草莓(Fragaria vesca)、麝香草莓(Fragaria moschata)、弗吉尼亚草莓(Fragaria virginiana)、智利草莓(Fragaria chiloensis))，甘薯(金叶甘薯(Ipomoea batatus))，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea)的物种)，椰子(Cocos nucifera)，油棕(例如棕榈(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))，菠萝(Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属(Citrus)的物种)，可可(Theobroma cacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(香蕉属(Musa)的物种)，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangifera indica)，橄榄(Oleaeuropaea)，番木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳洲坚果(Macadamia integrifolia)，扁桃(Prunus amygdalus)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum)的物种)，燕麦(Avena sativa)，大麦(Hordeum vulgare)，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和其他的短柄草属(Brachypodium)的物种，柳枝稷(Panicumvirgatum)，草坪草(例如草地早熟禾(Poa pratensis)、高羊茅(Festuca arundinacea)、羊茅属(Festuca)的物种、狗牙根(Cynodon dactylon)、狗牙根属(Cynodon)的物种、多年生黑麦草(Lolium perenne)、多花黑麦草(Lolium multiflorum)、翦股颖(Agrostispalustris)、结缕草(Zoysia japonica),结缕草属(Zoysia)的物种、斑叶钝叶草(Stenotaphrum secundatum)、假俭草(Eremochloa ophiuroides))，蔬菜，观赏植物和针叶树。在具体的实施方案中，本发明的植物为农作物植物(例如玉米、高粱、小麦、稷、水稻、大麦、燕麦、甘蔗、苜蓿、大豆、花生、向日葵、棉、红花、芸苔属的物种、莴苣、草莓、苹果和和柑橘等)。
蔬菜包括但不限于番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、四季豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(山黧豆属(Lathyrus)的物种)和黄瓜属(Cucumis)的成员，例如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括例如杜鹃花(杜鹃花属(Rhododendron)的物种)、八仙花(绣球(Macrophylla hydrangea))、木槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(玫瑰属(Rosa)的物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)的物种)、水仙(水仙属(Narcissus)的物种)、矮牵牛花(碧冬茄(Petunia hybrida))、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
如本文所用，术语“植物”意图涵盖在任何成熟或发育阶段的植物，取自或衍生自任何这种植物的任何植物部分或多个部分，除非内容中另外清楚地说明。如本文所用，术语“植物”包括例如植物细胞、植物原生质体、可以再生成植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛以及在植物或植物的部分中是完好的植物细胞(例如胚芽、花粉、胚珠、种子、块茎、繁殖体、叶、花、枝、果实、根、根尖、花药等)。植物部分包括但不限于植物器官、茎、根、花、胚珠、雄蕊、叶、胚芽、分生区、植物组织、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、植物细胞、原生质体等。术语“植物”还意图涵盖种子。再生的植物的后代、变体和突变体也包含在本发明的范围内，只要这些植物部分包含引入的多核苷酸即可。如本文所用，“后代”和“后代植物”包括植物的任何后代，而不论其是由有性生殖和/或无性生殖得到的，除非内容中另外明确地陈述，或者由使用内容显而易见。
在本发明的一些实施方案中，使用编码本发明的R蛋白质的多核苷酸构建体转化植物细胞。如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述的基因产物的转录和/或翻译。由DNA分子“表达”或“生产”蛋白质或多肽是指编码序列的转录和翻译，从而产生蛋白质或多肽，而由RNA分子“表达”或“生产”蛋白质或多肽是指RNA编码序列的翻译，从而产生蛋白质或多肽。编码R蛋白质的多核苷酸构建体和核酸分子的实例在本发明的其他处描述。
术语“DNA”或“RNA”在本发明中的使用无意于将本发明限制为包括DNA或RNA的多核苷酸分子。本领域的那些普通技术人员将认识到本发明的方法和组合物涵盖多核苷酸分子，其由脱氧核糖核苷酸(即，DNA)、核糖核苷酸(即，RNA)、或者核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合构成。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然形成的分子和合成的类似物，包括但不限于核苷酸类似物或者修饰的主链残基或键，其是合成的、天然形成的和非天然形成，其具有与参照核酸相似的结合性质，并且以与参照核苷酸相似的方式代谢。这种类似物的实例包括但不限于磷硫酰酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA))。本发明的多核苷酸分子还涵盖多核苷酸分子的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。此外，本领域那些普通技术人员理解的是本发明公开的核苷酸序列还涵盖示例性核苷酸序列的互补。
本发明描绘了用于生产具有对由植物病原体引起的植物疾病的增强的抗性的植物的组合物和方法，特别是用于生产具有对由Pst引起的小麦条锈病的增强的抗性的植物的组合物和方法，更特别地用于生产具有对由Pst引起的小麦条锈病的增强的抗性的小麦或大麦植物的组合物和方法。“对植物疾病的抗性”或“疾病抗性”是指植物避免由于植物-病原体相互作用的结果而导致的疾病症状。换言之，防止一种或多种病原体导致一种或多种植物疾病和相关的疾病症状，或者备选地，由一种或多种病原体导致的疾病症状减少或减轻。
本发明涵盖了本文或者在随附的序列表和/或附图中公开的多核苷酸构建体，其包括但不限于包含选自SEQ ID NO:17-19中的核苷酸序列的多核苷酸构建体。本发明进一步涵盖了包含这种多核苷酸构建体的至少一种的植物、植物细胞、宿主细胞和载体，以及由这种植物产生的食物产品。此外，本发明涵盖了包含这种多核苷酸构建体的至少一种的植物在本文其他处公开的方法中的用途，例如在农业农作物生产中限制小麦条锈病的方法。
植物病原体包括例如细菌、昆虫、线虫、真菌、卵菌等。本发明的优选的病原体为真菌病原体，特别是导致锈病的真菌病原体，包括但不限于早熟禾锈病(Pucciniabrachypodii)(紫假雀麦锈病)、冠柄柄锈菌(Puccinia coronata)(冠锈病)、小麦秆锈病菌(Puccinia graminis)(秆锈病)、小麦条锈病(Puccinia striiformis)(条锈病)、小麦假条锈病(Puccinia pseudostriiformis)(条锈病)、Puccinia pseudo-hordei(大麦草条锈病)、Puccinia gansensis(条锈病)、Puccinia striiformoides(条锈病)、Pucciniahordei(大麦叶锈病)、隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)(小麦叶锈病)、Puccinia sorghi(玉米叶锈病)、Puccinia poae-nemoralis、早熟禾柄锈菌(Puccinia poarum)、Pucciniaemaculata和Uromyces dactylidis。据信，本发明的Rps6核苷酸序列能够赋予对由这些真菌病原体的一种或多种引起的锈病的抗性。参见Castro et al.(2003)Theor.Appl.Genet.107:922-930，Derevnina et al.(2015)Theor.Appl.Genet.128:187-197和Niks et al.(2013)Eur.J.Plant Pathol.136:393-405；以引用方式并入本文。本发明的其他目的植物病原体为小麦白粉病菌(Blumeria graminis)(白粉病)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(还称为M.oryzae；枯萎病)。已经报告在大麦的两份图谱中，对白粉病和枯萎病的抗性在Rps6临近，表明Rps6除了能够赋予条锈病抗性以外，还能够赋予对白粉病和/或枯萎病的抗性。参见et al.(1996)Theor.Appl.Genet.93:48-56，以引用方式并入本文。
在优选的实施方案中，本发明提供了植物和生产植物的方法，其中所述的植物包含对至少一种小麦条锈病菌物种的增强的抗性。在其他的优选的实施方案中，本发明提供了植物和生产植物的方法，其中所述的植物包含对多种小麦条锈病菌物种的增强的抗性。如本文所用，“多种物种”意图指至少2种特定植物病原体物种，但是优选地为3、4、5或更多种植物病原体物种。
其他目的真菌病原体为在谷物农作物植物中导致疾病的那些，例如包括裸散黑粉菌(Ustilago nuda)(大麦散黑穗病)、小麦散黑粉菌(Ustilago triticiv)(小麦散黑穗病)、黑散黑粉菌(Ustilago nigra)(大麦假松黑穗病)、燕麦散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麦散黑穗病)、燕麦坚黑粉菌(Ustilago kolleri)(燕麦坚黑穗病)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米黑粉病)。
用于主要农作物的其他病原体包括：大豆：大豆疫霉菌(Phytophthoramegasperma fsp.glycinea),壳球孢菌(Macrophomina phaseolina),立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum),尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum),Diaporthe phaseolorum var.sojae(大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae)),Diaporthe phaseolorum var.caulivora,齐整小核菌(Sclerotium rolfsii),大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii),大豆灰斑病菌(Cercospora sojina),大豆霜霉病菌(Peronospora manshurica),束状刺盘孢(Colletotrichum dematium)(平头炭疽菌(Colletotichum truncatum)),多主棒孢(Corynespora cassiicola),大豆壳针孢(Septoria glycines),Phyllosticta sojicola,链格孢(Alternaria alternata),丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae p.v.glycinea),野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris p.v.phaseoli),Microsphaera diffusa,半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum),大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata),大豆花叶病毒(Soybean mosaicvirus),Glomerella glycines,烟草环斑病毒(Tobacco Ring spot virus),烟草线条病毒(Tobacco Streak virus),豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi),瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum),终极腐霉(Pythium ultimum),德巴利腐霉(Pythium debaryanum),番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus),大豆胞囊镰刀菌(Heterodera glycinesFusarium solani)；加拿大油菜：白锈菌(Albugo candida),白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae),油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans),立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani),核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum),芸苔生链格孢(Mycosphaerellabrassicicola),终极腐霉(Pythium ultimum),寄生霜霉(Peronospora parasitica),粉红镰刀菌(Fusarium roseum),链格孢(Alternaria alternata)；苜蓿：苜蓿黄萎病菌(Clavibacter michiganese subsp.insidiosum),终极腐霉(Pythium ultimum),畸雌腐霉(Pythium irregulare),七叶树腐霉(Pythium splendens),德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum),瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum),大豆疫霉(Phytophthoramegasperma),三叶草霜霉(Peronospora trifoliorum),Phoma medicaginisvar.medicaginis,苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis),苜蓿假盘菌(Pseudopezizamedicaginis),苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicaginis),尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum),黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum),Xanthomonas campestrisp.v.alfalfae,Aphanomyces euteiches,Stemphylium herbarum,Stemphylium alfalfae,三叶草刺盘孢(Colletotrichum trifolii),Leptosphaerulina briosiana,条纹尾孢霉(Uromyces striatus),三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum),苜蓿担孢子菌(Stagonospora meliloti),葱叶枯病菌(Stemphylium botryosum),Leptotrichilamedicaginis；小麦：Pseudomonas syringae p.v.atrofaciens,冰草条黑粉病(Urocystisagropyri),半透明黄单胞菌(Xanthomonas campestris p.v.translucens),丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae p.v.syringae),链格孢(Alternaria alternata),蜡叶芽枝霉(Cladosporium herbarum),禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum),大刀镰刀菌(Fusarium culmorum),小麦散黑穗病菌(Ustilago tritici),小麦子囊菌(Ascochyta tritici),单隔孢溃疡病菌(Cephalosporium gramineum),Collotetrichum graminicola,小麦白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici),小麦柄锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici),小麦叶锈病菌(Puccinia reconditaf.sp.tritici),小麦条锈病菌(Puccinia striiformis),Pyrenophora tritici-repentis,壳针孢(Septoria nodorum),叶枯病菌(Septoria tritici),Septoria avenae,小麦基腐病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides),立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani),禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis),小麦赤霉病菌(Gaeumannomyces graminisvar.tritici),瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum),多雄腐霉(Pythium arrhenomanes),终极腐霉(Pythium ultimum),麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana),大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus),雀麦花叶病毒(Brome Mosaic Virus),土传小麦花叶病毒(Soil Borne Wheat Mosaic Virus),小麦线条花叶病毒(Wheat Streak Mosaic Virus),小麦梭斑病毒(Wheat Spindle Streak Virus),美国小麦条纹病毒(American WheatStriate Virus),麦角菌(Claviceps purpurea),小麦腥黑粉菌(Tilletia tritici),腥黑粉菌(Tilletia laevis),小麦散黑穗病菌(Ustilago tritici),小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica),立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),Pythium arrhenomannes,Pythium gramicola,瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum),高原病毒(High PlainsVirus),欧洲小麦条纹病毒(European wheat striate virus)；向日葵：向日葵霜霉病菌(Plasmopora halstedii),核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum),黄化病植原体(AsterYellows),向日葵壳针孢(Septoria helianthi),向日葵茎溃疡病菌(Phomopsishelianthi),向日葵链格孢(Alternaria helianthi),百日草链格孢(Alternariazinniae),灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),Phoma macdonaldii,菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina),菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum),稻根霉菌(Rhizopus oryzae),无根根霉菌(Rhizopus arrhizus),匍茎根霉菌(Rhizopusstolonifer),向日葵柄锈菌(Puccinia helianthi),大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae),Erwinia carotovorum pv.carotovora,顶孢头孢霉(Cephalosporiumacremonium),隐地疫霉(Phytophthora cryptogea),Albugo tragopogonis；苞米：禾生毛盘孢(Colletotrichum graminicola),串珠镰刀菌(Fusarium moniliformevar.subglutinans),斯氏欧文菌(Erwinia stewartii),轮枝镰刀菌(F.verticillioides),玉米赤霉(Gibberella zeae)(禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)),Stenocarpella maydi(马伊德壳色单隔孢(Diplodia maydis)),畸雌腐霉(Pythium irregulare),德巴利腐霉(Pythium debaryanum),禾生腐霉菌(Pythiumgraminicola),华丽腐霉(Pythium splendens),终极腐霉(Pythium ultimum),瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum),黄曲霉(Aspergillus flavus),玉米平脐蠕孢O,T(Bipolarismaydis O,T)(异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)),炭色长蠕孢I、II和III(Helminthosporium carbonum I,II&III)(Cochliobolus carbonum),玉米大斑病菌I、II和III(Exserohilum turcicum I,II&III),带梗蠕孢菌(Helminthosporiumpedicellatum),玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis),叶点霉(Phyllosticta maydis),Kabatiella maydis,高粱紫斑病(Cercospora sorghi),玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis),Puccinia sorghi,Puccinia polysora,菜豆壳球孢(Macrophominaphaseolina),草酸青霉菌(Penicillium oxalicum),稻黑孢菌(Nigrospora oryzae),蜡叶芽枝霉(Cladosporium herbarum),月状弯孢菌(Curvularia lunata),苹果弯孢菌(Curvularia inaequalis),苍白弯孢霉(Curvularia pallescens),Clavibactermichiganense subsp.nebraskense,绿色木霉(Trichoderma viride),玉米矮花叶病毒A和B(Maize Dwarf Mosaic Virus A&B),小麦线条花叶病毒(Wheat Streak Mosaic Virus),玉米枯黄矮小病毒(Maize Chlorotic Dwarf Virus),Claviceps sorghi,燕麦假单胞菌(Pseudonomas avenae),Erwinia chrysanthemi pv.zea,胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora),玉米矮化螺原体(Corn stunt spiroplasma),大孢子菌(Diplodiamacrospora),大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora),Peronosclerospora sorghi,菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis),玉蜀黍霜指霉(Peronosclerosporamaydis),甘蔗霜霉病菌(Peronosclerospora sacchari),玉米丝黑穗病菌(Sphacelothecareiliana),Physopella zeae,玉米头孢霉(Cephalosporium maydis),顶孢头孢霉(Cephalosporium acremonium),玉米褪绿斑驳病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus),高原病毒(High Plains Virus),印度玉米花叶病毒(Maize Mosaic Virus),玉米雷亚多非纳病毒(Maize Rayado Fino Virus),玉米条纹病毒(Maize Streak Virus),玉米斑纹病毒(Maize Stripe Virus),玉米粗矮病毒(Maize Rough Dwarf Virus)；高粱：玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum),C.sublineolum,高粱紫斑病菌(Cercospora sorghi),Gloeocercospora sorghi,Ascochyta sorghina,丁香假单胞菌(Pseudomonas syringaep.v.syringae),Xanthomonas campestris p.v.holcicola,须芝草假单胞菌(Pseudomonasandropogonis),紫柄锈菌(Puccinia purpurea),菜豆壳球孢(Macrophominaphaseolina),Perconia circinata,串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme),链格孢(Alternaria alternata,)高粱靶斑病(Bipolaris sorghicola),高粱蠕孢菌(Helminthosporium sorghicola),月状弯孢菌(Curvularia lunata),Phoma insidiosa,燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)(Pseudomonas alboprecipitans),蜀黍座枝孢(Ramulispora sorghi),蜀黍生座枝孢(Ramulispora sorghicola),Phyllacharasacchari,丝轴黑粉菌(Sporisorium reilianum)(玉米丝黑穗病菌(Sphacelothecareiliana)),炭疽菌(Sphacelotheca cruenta),Sporisorium sorghi,甘蔗花叶病(Sugarcane mosaic H),玉米矮花叶病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus A&B),Clavicepssorghi,立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),直立顶孢霉(Acremonium strictum),Sclerophthona macrospora,蜀黍指霜霉(Peronosclerospora sorghi),菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis),禾生指梗霉(Sclerospora graminicola),禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),多雄腐霉(Pythiumarrhenomanes),禾生腐霉菌(Pythium graminicola)等；番茄：密执安棒状杆菌(Corynebacterium michiganense pv.michiganense),番茄细菌性斑点病菌(Pseudomonassyringae pv.tomato),青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum),皰病黄单胞菌(Xanthomonas vesicatoria),疮痂病菌(Xanthomonas perforans),番茄早疫病菌(Alternaria solani),Alternaria porri,集束菌属的菌种,番茄叶霉病菌(Fulvia fulvaSyn.Cladosporium fulvum),番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.lycopersici),鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)/辣椒拟粉孢(Oidiopsis taurica),致病疫霉(Phytophthora infestans),其他的疫霉属物种,番茄假尾孢叶斑(Pseudocercosporafuligena Syn.Cercospora fuligena),齐整小核菌(Sclerotium rolfsii),茄壳针孢菌(Septoria lycopersici),根结线虫属的物种；马铃薯：青枯菌(Ralstoniasolanacearum),青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum),胡萝卜软腐欧文氏菌亚种(Erwinia carotovora subsp.)马铃薯黑胫亚种(Atroseptica Erwinia carotovorasubsp.Carotovora),果胶杆菌亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.Atrosepticum),荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),密执克杆菌亚种(Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus),Corynebacterium sepedonicum,斯氏链霉菌(Streptomyces scabiei),Colletotrichum coccodes,烟草赤星病菌(Alternaria alternate),Mycovellosiella concors,马铃薯灰斑病菌(Cercosporasolani),菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina),甘薯小核菌(Sclerotiumbataticola),Choanephora cucurbitarum,马铃薯锈病菌(Puccinia pittieriana),Aecidium cantensis,索兰尼氏链格孢(Alternaria solani),镰刀霉的物种,茄生茎点霉(Phoma solanicola f.foveata),灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),富克尔核盘菌(Botryotinia fuckeliana),致病疫霉(Phytophthora infestans),腐霉属的物种,Phomaandigena var.andina,枯叶格孢腔菌(Pleospora herbarum),Stemphylium herbarum,菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum),Spongospora subterranean Rhizoctonia solani,水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris),座坚壳属的物种,Dematophora sp.,茄壳针孢菌(Septoria lycopersici),茄病长蠕孢(Helminthosporium solani),Polyscytalumpustulans,齐整小核菌(Sclerotium rolfsii),罗耳阿太菌(Athelia rolfsii),Angiosorus solani,黑细基格孢(Ulocladium atrum),黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum),V.dahlia,Synchytrium endobioticum,核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum),青枯菌(Candidatus Liberibacter solanacearum)；香蕉：香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae),蜜环菌(Armillaria mellea),发光假蜜环菌(Armillaria tabescens),青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum),Phyllachora musicola,球腔菌(Mycosphaerellafijiensis),Rosellinia bunodes,假单胞菌的物种,pestalotiopsis leprogena,Cercospora hayi,植物青枯菌(Pseudomonas solanacearum),椰子泻血病菌(Ceratocystis paradoxa),可可黄萎病菌(Verticillium theobromae),Trachysphaerafructigena,香蕉枝孢霉(Cladosporium musae),Junghuhnia vincta,Cordanajohnstonii,Cordana musae,Fusarium pallidoroseum,香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae),可可黄萎病菌(Verticillium theobromae),镰刀霉的物种,支顶孢属的物种,柱枝双胞霉属的物种,Deightoniella torulosa,Nattrassia mangiferae,Dreschsleragigantean,Guignardia musae,苹果干腐病菌(Botryosphaeria ribis),腐皮镰刀菌(Fusarium solani),Nectria haematococca,尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),丝核菌的物种,香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae),Uredo musae,香蕉尾孢霉(Uromycesmusae),Acrodontium simplex,Curvularia eragrostidis,Drechslera musae-sapientum,Leptosphaeria musarum,播散拟盘菌(pestalotiopsis disseminate),椰子泻血病菌(Ceratocystis paradoxa),Haplobasidion musae,Marasmiellus inoderma,植物青枯菌(Pseudomonas solanacearum),香蕉穿孔线虫(Radopholus similis),柯柯豆毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae),Fusarium pallidoroseum,可可黄萎病菌(Verticillium theobromae),掌状拟盘菌(pestalotiopsis palmarum),Phaeoseptoriamusae,稻瘟病菌(Pyricularia grisea),串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme),弗基克罗氏赤霉(Gibberella fujikuroi),胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora),菊欧文菌(Erwinia chrysanthemi),马铃薯卷蛾(Cylindrocarpon musae),花生根结线虫(Meloidogyne arenaria),南方根结线虫(Meloidogyne incognita),爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica),咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae),Pratylenchusgoodeyi,最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus),Pratylenchus reniformia,核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum),Nectria foliicola,Mycosphaerella musicola,假假稻孢霉(Pseudocercospora musae),Limacinula tenuis,贻贝霉(Mycosphaerella musae),多节螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus),螺旋线虫(Helicotylenchusdihystera),黑孢霉(Nigrospora sphaerica),Trachysphaera frutigena,Ramichloridium musae,和可可黄萎病菌(Verticillium theobromae)。
本发明的组合物和方法的非限定性实例如下：
1.包含选自以下的一员的核酸分子：
(a)大麦Rps6基因；
(b)在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11、13、15、34或35中列出的核苷酸序列；
(c)编码在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；
(d)与在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和13中列出的全长核苷酸序列的至少一种具有至少85％核苷酸序列一致性的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性；以及
(e)编码与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性。
2.实施方案1的核酸分子，其中核酸分子为分离的核酸分子。
3.实施方案1或2的核酸分子，其中核酸分子是非天然形成的。
4.实施方案1或2的核酸分子，其中大麦Rps6基因是位于大麦植物基因组中对应于SEQ ID NO:4的区域中的大麦Rps6基因。
5.实施方案1-4的任意一项的核酸分子，其中(d)或(e)的核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的蛋白质。
6.实施方案5的核酸分子，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
7.表达盒，其包含实施方案1-6的任意一项的核酸分子和可操作地连接的异源启动子。
8.载体，其包含实施方案1-6的任意一项的核酸分子或实施方案7的表达盒。
9.宿主细胞，其是使用实施方案1-6的任意一项的核酸分子、实施方案7的表达盒或实施方案8的载体转化的。
10.实施方案9所述的宿主细胞，其中宿主细胞为植物细胞、细菌、真菌细胞或动物细胞。
11.实施方案9或10的宿主细胞，其中植物细胞为大麦植物细胞、小麦植物细胞或二穗短柄草植物细胞。
12.植物或种子，其是使用实施方案1-6的任意一项的核酸分子、实施方案7的表达盒或实施方案8的载体转化的。
13.实施方案12的植物或种子，其中植物为小麦植物或大麦植物，并且种子为小麦种子或大麦种子。
14.转基因植物或种子，其包含稳定地引入其基因组中的多核苷酸构建体，所述的构建体包含选自以下的一员：
(a)大麦Rps6基因；
(b)在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11或13中列出的核苷酸序列；
(c)编码在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；
(d)与在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和13中列出的全长核苷酸序列的至少一种具有至少85％核苷酸序列一致性的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性；以及
(e)编码与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性。
15.实施方案14的转基因植物或种子，其中(d)或(e)的核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的蛋白质。
16.实施方案15的转基因植物或种子，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
17.实施方案14-16的任意一项的转基因植物或种子，其中多核苷酸构建体包含(b)-(e)的任意一项的核苷酸序列，并且进一步包含可操作地连接以用于核苷酸序列在植物中表达的启动子。
18.实施方案17的转基因植物或种子，其中启动子选自病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。
19.实施方案14-18的任意一项的转基因植物或种子，其中转基因植物或种子相对于对照植物的抗性而言，包含对由多种小麦条锈病菌引起的小麦条锈病的增强的抗性。
20.实施方案14-19的任意一项的转基因植物或种子，其中转基因植物为转基因小麦植物，并且转基因种子为转基因小麦种子。
21.实施方案14-19的任意一项的转基因植物或种子，其中转基因植物为转基因大麦植物，并且转基因种子为转基因大麦种子。
22.实施方案14-19的任意一项的转基因植物或种子，其中转基因植物为转基因二穗短柄草植物，并且转基因种子为转基因二穗短柄草种子。
23.实施方案14-22的任意一项的转基因植物或种子，其中多核苷酸构建体为异源核酸分子。
24.用于生产具有对植物疾病的增强的抗性的植物的方法，所述的方法包括将多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞中，所述的多核苷酸构建体包含选自以下的一员：
(a)大麦Rps6基因；
(b)在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11或13中列出的核苷酸序列；
(c)编码在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；
(d)与在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和13中列出的全长核苷酸序列的至少一种具有至少85％核苷酸序列一致性的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对植物疾病的抗性；以及
(e)编码与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对植物疾病的抗性。
25.实施方案24的方法，其中(d)或(e)的核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的蛋白质。
26.实施方案25的方法，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
27.实施方案24-26的任意一项的方法，其中植物疾病为锈病。
28.实施方案24-27的任意一项的方法，其中病原体为柄锈菌属。
29.实施方案24-28的任意一项的方法，其中植物为草类植物。
30.实施方案24-29的任意一项的方法，其中植物为谷物植物。
31.实施方案24-30的任意一项的方法，其中植物为大麦、小麦或二穗短柄草。
32.实施方案24-31的任意一项的方法，其中多核苷酸构建体被稳定地引入植物细胞的基因组中。
33.实施方案24-32的任意一项的方法，其中大麦、小麦或二穗短柄草植物细胞再生成其基因组中包含所述的多核苷酸构建体的大麦、小麦或二穗短柄草植物。
34.实施方案24-33的任意一项的方法，其中多核苷酸构建体包含(b)-(e)的任意一项的核苷酸序列，并且进一步包含可操作地连接以用于所述的核苷酸序列在植物中表达的启动子。
35.实施方案34的方法，其中启动子选自病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。
36.实施方案31-35的任意一项的方法，其中包含所述的多核苷酸构建体的大麦、小麦或二穗短柄草植物相对于对照大麦植物、小麦或二穗短柄草的抗性而言，包含对由至少一种小麦条锈病菌引起的小麦条锈病的增强的抗性。
37.实施方案31-35的任意一项的方法，其中包含所述的多核苷酸构建体的大麦、小麦或二穗短柄草植物相对于对照大麦植物、小麦或二穗短柄草的抗性而言，包含对由多种小麦条锈病菌引起的小麦条锈病的增强的抗性。
38.通过实施方案24-37的任意一项的方法生产的植物。
39.实施方案38的植物的种子，其中种子包含所述的多核苷酸构建体。
40.用于生产具有对小麦条锈病的增强的抗性的大麦植物的方法，所述的方法包括在大麦植物或其至少一个细胞中修饰抗性基因Rps6的非功能等位基因，从而形成功能等位基因，由此增强大麦植物对小麦条锈病的抗性。
41.实施方案40的方法，其中所述的修饰非功能等位基因包括引入至少一种基因修饰，其选自在非功能等位基因中的至少一个碱基对的插入、删除和取代。
42.实施方案40或41的方法，其中所述的修饰非功能等位基因包括选自靶向诱变、同源重组和突变育种中的至少一员。
43.实施方案40-42的任意一项的方法，其中功能等位基因包含选自以下的核苷酸序列：
(a)在SEQ ID NO:1中列出的所述的核苷酸序列；
(b)包含用于在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列的编码序列的核苷酸序列；以及
(c)编码与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性。
44.实施方案43的方法，其中(c)的多肽包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域。
45.实施方案44的方法，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
46.实施方案40-45的任意一项的方法，其中大麦植物相对于对照大麦植物的抗性而言，包含对由多种小麦条锈病菌引起的小麦条锈病的增强的抗性。
47.通过实施方案40-46的任意一项的方法生产的大麦植物。
48.实施方案47的大麦植物的种子，其中种子包含所述的多核苷酸构建体。
49.在农业农作物生产中限制小麦条锈病的方法，所述的方法包括种植根据实施方案12-23、39和48的任意一项的种子，并且在有利于植物的生长和发育的条件下使所述的植物生长。
50.实施方案49的方法，进一步包括由所述的植物收获至少一粒种子。
51.实施方案49或50的方法，其中种子为小麦种子或大麦种子。
52.实施方案12-23、38、39、47和48的任意一项的植物或种子在农业中的用途。
53.使用实施方案12-23、38、39、47和48的任意一项的植物或种子生产的人类或动物食物产品。
54.包含选自以下的氨基酸序列的多肽：
(a)由在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
(b)由在SEQ ID NO:2、5、7、9、11或13中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
(c)在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列；以及
(d)与在SEQ ID NOS:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％序列一致性的氨基酸序列，其中包含所述的氨基酸序列的多肽能够赋予包含所述的多肽的小麦或大麦植物对条锈病的抗性，并且可任选地，其中所述的多肽不是天然形成的。
55.实施方案54的多肽，其中(d)的多肽包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域。
56.实施方案55的多肽，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
57.实施方案54-56的任意一项的多肽，其中多肽为分离的多肽。
58.实施方案54-57的任意一项的多肽，其中多肽是非天然形成的。
本发明的方法和组合物的其他实施方案在本发明的其他处描述。
以下实施例以示意性并且非限定性的方式提供。
实施例
实施例1：对Rps6的分离和精细作图
Rps6的作图：在接种Pst分离株08/501和08/21的Abed Binder 12和Russell之间，观察到不同的表型。Russell较少显示脓疱，但是具有定植的清晰的显微表型(图1)。我们使用Pst分离株08/501(AxR-Pst)接种Abed Binder 12 x Russell F2群体。使用Pst定植(pCOL)的宏观和微观评价，对亲代、F1和92个F2植物进行表型分型。对于AxR-Pst F2群体未观察到脓疱形成，但是对于萎黄病和pCOL观察到隔离(图2A-2B)。观察到萎黄病与pCOL之间强烈相关(r2＝0.88)(图2C)。F1显示与Abed Binder 12相似的抗性表型。为了作图对Pst的抗性，我们使用大麦寡核苷酸测定法对AxR-Pst F2群体进行表型分型(BOPA1；1,536SNP-based markers；Close et al.2009)。在Abed Binder 12和Russell之间，鉴定了总计535个多态性OPA标志物，并且它们用于生成具有8个连锁群的基因图谱。此外，26个CAPS标志物和28个Sequenom MassARRAY标志物用于在7个连锁群上生成由589种标志物构成的精细图谱，代表了362个非冗余的标志物单体型以及1,131cM的总遗传距离。在AxR-Pst群体上使用具有萎黄病和pCOL表型的复合区间作图的数量性状基因座(QTL)分析鉴定了在染色体7H的长臂上的主效基因座(其是由Abed Binder 12贡献的)(图3)。对于萎黄病和pCOL，QTL分别形成57.7％和69.4％的表型变异。在这两种情况下，定位于169.7cM的标志物U32_7356_p1是最强烈连锁的标志物(表1)。
表1.在接种Pst分离株08/501的Abed Binder 12 x Russell F2群体中，由萎黄病和pCOL表型的复合区间作图得到的重要QTL
a染色体
b实验广度阈值
c加性效应估计，正值表示Abed Binder 12贡献的抗性
d显性效应估计
e显性与加性效应比值的评估
f表型变异百分比说明
精细作图Rps6：基于大麦中可利用的基因组源我们进行重组筛选，并使用标志物饱和基因座。使用由F3植物收集的种子进行重组筛选，其中所述的F3植物在F2:3家族(仅针对Rps6是隔离的)中对于Rps6是杂合的。由Sequenom标志物S_43900和S_3446分别生成KASP标志物K_2547604b和K_1579285b，并且用作跨越涵盖Rps6的6.0cM区域的侧翼标志物。总计表征2,894个配子，鉴定侧翼标志物之间的135个重组事件。使用具有重组染色体的个体进行后代测试，并且评分为纯合的或对于抗性隔离的或者纯合易感的。通过以下执行Rps6区间的标志物饱和：(1)比较衍生自栽培品种Barke、Bowman和Morex的基因组重叠群，从而鉴定SNP；或者(2)将由Abed Binder 12和Russell上的RNAseq得到的读值与锚定于Rps6区域的全基因组鸟枪(WGS)重叠群比对(IBGSC(2012)Nature 491:711-716；Mascher et al.(2013)Plant J.76:718-727)。进行这些分析两次，其中最初使用来自IBGSC参照锚定(其在127.12cM至129.21cM之间包含78个重叠群)的锚定的重叠群(IBGSC(2012)Nature 491:711-716)。之后，基于更新的锚定，对更大的区间进行研究，其中所述的区间在126.20cM至131.44cM之间包含1,345个重叠群(Mascher et al.(2013)Plant J.76:718-727)。将RNAseq数据与WGS重叠群比对，并进行人工策划，从而鉴定Abed Binder 12和Russell之间的SNP多态性。总计102个SNP成功转化成Kompetitive Allele Specific PCR(KASP)标志物，并且在重组个体上在Rps6区域中进行测量。总而言之，代表30个WGS重叠群的49个KASP标志物作图在Rps6侧翼标志物之间。在精细级别下，在大麦POPSEQ中，相对于目前的锚定而言，以不同的顺序作图的重叠群锚定多个重叠群，但是在粗略的级别下，保留一般的顺序。所述的标志物折叠成18个标志物库(marker bin)并且使Rps6定位于0.1cM区域中，其侧翼为K_361382(近端)和K_37596(远端)(图4)。Rps6位于距离近端标志物的0.07cM处，并且在它们之间观察到仅2个重组事件。相反，仅单一的重组事件将远端标志物与Rps6区分开。
Rps6在大麦的物理图谱中的锚定：使用可用的BES以及在Rps6区域中鸟枪测序的BAC，将Rps6基因座锚定于大麦物理图谱中(IBGSC(2012)Nature 491:711-716)。在近端区域中，基于BES和测序的BAC将多个KASP标志物作图于在FPC 8887上的物理图谱上。利用目前可用的信息，尚不清楚FPC 8887是否基于我们的标志物顺序而正确地取向。标志物K_58199定义了FPC 320上的边界，表明K_361382位于K_58199和K_57421之间的物理顺序上(图4)。Rps6与标志物K_57421和K_49978共隔离，所述的标志物均作图于FPC 320的近端区域。K_58199至K_1579285的整个远端区域均良好地锚定于FPC320。在所述的区域上所注释的基因包括重叠群1579877上的MLOC_18254，以及存在于重叠群49978和37596上的2个NLR。基于我们重组筛选的分辨率，高度可信基因模型MLOC_65262存在于重叠群49978上，并且与Rps6共隔离，而重叠群37596上的NLR通过重要的重组事件隔离。MLOC_65262优选地在根中表达，并且在Morex中在叶中几乎不表达或不表达(IBGSC(2012)Nature 491:711-716)。
在Rps6区域中的候选基因分析：为了鉴定在Rps6基因座处的候选NLR基因，我们使用现有的大麦基因组源结合得自6个大麦编号的转录组组件。我们基于所述的区域的连锁作图，选择容纳Rps6的区域(图5)。利用标志物共线性，我们鉴定了锚定于衍生自栽培品种Morex、Barke和Bowman的Rps6区域的665 WGS重叠群(IBGSC(2012)Nature 491:711-716)(表2)。在16个基因库(genetic bin)中锚定重叠群，并且每个基因库都包含1至442个可变数量的重叠群。为了检查锚定的序列信息中候选基因的存在情况，我们使用基序比对和检索工具(MAST)，根据Jupe等人报告的参数和基序((2012)BMC Genomics 13:75)，对与NLR有关的基序进行检索。11个WGS重叠群包含NLR基序(表3)。将这些重叠群比较，从而鉴定是否在各亲代中鉴定到相似的重叠群。事实上，我们观察到编号与重叠群(折叠成5个同源群)之间的冗余。我们临时将重叠群中容纳的假定的NLR命名为NLR-A、NLR-B、NLR-C、NLR-D和NLR-E。通过MAST分析鉴定的仅Morex重叠群与NLR-D同源群分组，并且在高分辨率的遗传图谱中为与Rps6共隔离的高度可信基因MLOC_65262(表3)。在大麦物理图谱中由Morex重叠群37596鉴定的第二注释的NLR未使用MAST分析鉴定，这是因为仅询问在IBGSC的初始锚定中所包含的重叠群(IBGSC(2012)Nature 491:711-716)。然而，BLAST分析表明重叠群37596上注释的NLR与NLR-E同源群分组。甚至在高分辨率遗传图谱中通过重要的重组事件将NLR-E与Rps6分离。
表2.在Rps6区域中锚定的WGS重叠群
表3.在Rps6区域中5个候选NLR基因的鉴定
在Rps6基因座处候选基因的表达分析：为了更详细地研究5个NLR候选基因，我们使用用于容纳Rps6或rps6的6个重要编号(编号为Abed Binder 12、Golden Promise、Barke、SusPtrit、Russell和Manchuria)的转录物组件为每个基因建立表达特征谱(表3)。容纳NLR基序的WGS重叠群用于检索对应于NLR候选物的转录物的组件。引人注意的是，在容纳Rps6的编号中，仅检测到对应于NLR-A的转录物，显示在抗性的和易感的基因型之间清楚的表达多态性(表3)。在Rps6编号中发现的NLR-A转录物中，没有明显的等位基因多样性。相反，NLR-E在Rps6和rps6编号之间显示逆表达多态性。由Russell和Manchuria(rps6)衍生的NLR-E转录物与Barke/Bowman(Rps6)WGS重叠群的比较表明单一同义取代。这(与高分辨率遗传图谱中将NLR-E(K_37596ab)与Rps6隔离的重要的重组事件偶联)排除NLR-E作为候选基因。我们未检测到NLR-B或NLR-D的任何表达。这符合NLR-D(MLOC_65262)在大麦高度可信的基因组件中作为根表达的基因的注释(IBGSC(2012)Nature491:711-716)。在NLR-C的情况下，我们未观察到区分Rps6与rps6编号的任何表达多态性。
NLR-A的基因模型：通过将Abed Binder 12NLR-A转录物与Barke重叠群2780081(使用MAST分析最初鉴定为容纳NLR-A)进行比对，我们构建NLR-A的基因模型(表3)。我们观察到完美的比对，除了在Abed Binder 12转录物的5’处的大约600bp序列。因此，我们使用未比对的5’序列检索锚定的Barke WGS重叠群，并鉴定与5’序列比对的另外的Barke重叠群(重叠群54347)(图6)。通过联系Barke重叠群并再次比对Abed Binder 12 NLR-A转录物，我们组装NLR-A的全基因模型(图6)。该模型提出NLR-A由4个外显子和3个内含子构成。有趣的是，第二个内含子的长度为大约8.8kbp。然而，根据Barke重叠群的POPSEQ锚定，重叠群54347锚定于重叠群2780081远端4.4cM处。
对在Rps6基因座处的候选基因进行作图：基因作图排除NLR-E作为候选基因，并且显示NLR-D与Rps6共隔离。我们还想将NLR-A、NLR-B和NLR-C作图于高分辨率的遗传图谱中，以查看它们是否与Rps6基因座相关定位。我们开始于基于PCR的策略，用于鉴定NLR-A的SNP标志物。为此，我们沿着联系的Barke重叠群54347和2780081的长度设计PCR引物。在AbedBinder 12和Russell基因组DNA上使用这些引物的PCR扩增显示在Abed Binder 12和Russell之间清楚地存在/缺乏多态性(图7)。该结果与Russell转录组中缺乏NLR-A转录物同时发生。然而，由Russell gDNA不能扩增NLR-A，意味着在Abed Binder 12 x Russell作图群体中，不可能精确地作图NLR-A，这是因为其是显性标志物。因此，我们假设，在已知容纳Rps6或rps6的不同的编号中，可以扩增NLR-A。
使用SusPtrit x Golden Promise双单倍体(DH)遗传图谱，我们鉴定了2个DH系，其在缺乏其他基因的情况下容纳Rps6或rps6。使用这些系以及用于RNAseq分析的重要编号，我们使用8个引物对来PCR扩增gDNA，其中所述的引物对扩增NLR-A的5’和3’末端。我们在8个不同的编号中观察到3个NLR-A单体型，我们将其命名为NLR-A1、NLR-A2和nlr-a(表4)。包含编号Abed Binder 12、Barke、Golden Promise和SusPtrit x Golden Promise DH系64(DH-064)的Rps6代表了对所测试的所有引物显示100％扩增的NLR-A1单体型。Russell和Manchuria(都对小麦条锈病菌是易感的)未显示任何对引物的扩增(nlr-a单体型)。然而，SusPtrit和SusPtrit x Golden Promise DH系21(DH-021)显示对所测试的引物50％的成功扩增，并且代表了NLR-A2单体型。PCR扩增子的Sanger测序表明SNP处于在SusPtrit和Golden Promise等位基因之间的NLR-A的假定的NBS结构域中。使用这种SNP，我们研发了显示不同单体型的清楚差异的CAPS标志物(图7)。在nlr-a编号中缺乏任何扩增子表明在这些系中，NLR-A被删除。为了作图NLR-A，我们将DH-021与DH-064杂交，从而创建DH衍生的F2作图群体(DHMP)。使用43个KASP标志物构建连锁图谱，其中所述的标志物包含用于NLR-A和NLR-E的标志物。NLR-A和NLR-E与K_366867共隔离。基于与Abed Binder 12 x Russell高分辨率作图群体的标志物共线性，其将NLR-A和NLR-E定位于Rps6基因座处(图5)。NLR-D标志物在DHMP群体中不是多态性的，并且我们不能测定NLR-D在DHMP群体中的位置。
表4. 8个引物对区分3种NLR-A单体型
为了作图NLR-B和NLR-C，我们基于在Barke和Morex WGS重叠群(容纳所述的基因)之间鉴定的SNP来设计标志物。NLR-B作图于Rps6的远端，并且排除该基因作为Rps6的候选基因(图5)。NLR-C标志物在高分辨率的遗传图谱中不是多态性的，但是我们能够作图NLR-C在DHMP群体中在Rps6的远端(图5)。综上，这些结果排除NLR-B、NLR-C和NLR-E作为Rps6的候选基因。在Rps6和rps6(容纳多个编号)之间存在假定的删除区域(容纳NLR-A)和清楚的表达多态性支持NLR-A作为Rps6的候选基因。
Rps6基因座的物理图谱：我们使用Abed Binder 12BAC文库开始对Rps6区域的物理作图。PCR筛选(使用2组引物)鉴定容纳NLR-A的单一BAC克隆(引物对A02/A08和A05/A11；图6)。我们使用具有C4-P6化学品的SMRT小室，使用Pacific Biosciences长读值测序技术对BAC克隆进行测序，并且能够构建和注释单一的相邻BAC序列(图6)。克隆主要由重复且低复杂度序列构成(表5)。而且，克隆容纳3种CNL基因：NLR-A、NLR-D和NLR-E(图6和表5)。在大麦低可信基因集合中注释的3种额外基因的标记在BAC上鉴定为：MLOC_8985.1、MLOC_41646.1和MLOC_19985.1。所有这3个均注释为未知蛋白，但是InterPro扫描表明MLOC_19985.1包含F-box结构域。NLR-A、NLR-D和NLR-E的比较显示在氨基酸水平下(大约60％)和在DNA编码序列中(大约70％)，基因之间的高度同源性(表6和7)。尽管具有相似性，但是Abed Binder 12 RNAseq读值与BAC重叠群的比对可以区分NLR-A、NLR-D和NLR-E，并且证明与NLR-E和NLR-D相比，NLR-A是高度表达的(图6)。该结果证明了使用RNAseq数据的新组件进行的早期表达分析。NLR-A、NLR-D和NLR-E的物理连锁与这些基因在高分辨率和DHMP作图群体中的遗传连锁一致。我们使用标志物K_49978(NLR-D)和K_37596(NLR-E)将BAC克隆锚定于Abed Binder 12 x Russell遗传图谱上。单一的重组事件将这些标志物隔离，并且定义了Rps6基因座的远端物理区域。Rps6近端标志物K_361382未存留在BAC克隆中，并且近端物理区域的边界仍有待定义。由Barke、Bowman和Morex衍生的全基因组鸟枪序列重叠群比对发现在Barke和Bowman中存在NLR-A，而该区域在Morex中不存在(图6)。
表5.容纳NLR-A的Abed Binder 12 BAC克隆4931-1-11E的注释
表6.全长NLR-A、NLR-D和NLR-E之间的氨基酸和DNA相似性
表7.NLR-A、NLR-D和NLR-E的NBS和LRR结构域的氨基酸相似性
由多种编号鉴定Rps6：为了研究在大麦中Rps6的频率，我们组装了一组134个编号，其包括野生型、地方品种、优良二棱大麦和优良六棱大麦(表8)。使用小麦条锈病菌分离株08/21接种该组，并使用萎黄病和感染的宏观观察以及使用微观测定法pCOL和pPUST来进行表型分型。我们开始进行杂交区块(crossing block)，从而生成隔离对小麦条锈病菌的抗性的群体。使用系统发育关系和表型信息来选择在杂交中用作亲本品系的抗性编号，其中所述的信息是收集用于大麦多样性小组，从而取得多样性的代表样品。创建总计13个F2群体和2个BC1群体，并且在各种情况下，易感亲代为Manchuria，一种六棱栽培品种(表9)。使用衍生自亲代编号的OPA基因分型数据，对各群体鉴定与Rps6和2个另外已知的基因座(Rpst1和Rpst3)连锁的多态性标志物。将OPA标志物转换成KASP标志物，并且对于各F2群体，最少93个个体进行测定。使用pCOL和pPUST将各群体进行表型分型，并且单标记回归用于弄清楚在各群体中，通过Rps6说明的百分变异率。此外，我们还分析了3种现有的群体，包括RIL和2个DH群体。总之，我们分析了18个群体，其代表了由各系统发育分支得到的多样性(表9)。在多个编号中检测Rps6，其为群体的40％(15个里有6个)贡献了抗性(表10和11)。
表8.用于接种小麦条锈病菌的大麦的编号
表9.使用小麦条锈病菌接种的18个结构化群体
表10.在多个制图群体中对小麦条锈病菌具有抗性的复合区间制图
Chr：染色体。
杂交：通过母系x父系确定杂交方向，等位基因的命名分别母亲A和父亲B。
AEE：等位基因效应估计，负值和正值分别表明抗性是由A等位基因和B等位基因贡献的。
PVE：表型变异百分比说明。
表11.在接种小麦条锈病菌的多种大麦F2群体中，在Rpst1、Rps6和Rpst3基因座处的标志物-性状相关性
Chr：染色体。
杂交：通过母系x父系确定杂交方向，等位基因的命名分别母亲A和父亲B。
AEE：等位基因效应估计，负值和正值分别表明抗性是由A等位基因和B等位基因贡献的。
DEE：显性效应估计。
PVE：表型变异百分比说明。
NLR-A与Rps6的相关性：选择总计38个编号用于转录组测序(表12)。使用HiSeq2000或HiSeq 2500系统进行RNAseq，并且成对端读值为100bp或150bp。使用Trinity组装转录组，并且BLAST用于鉴定NLR-A的存在或缺乏情况。我们鉴定了NLR-A的表达与Rps6基因座处抗性的表达的强烈相关性(表12)。总之，发现7个编号表达NLR-A和Rps6；并且发现15个编号缺乏NLR-A和Rps6的表达。使用衍生自38个大麦编号的RNAseq，在NLR-A的基因组序列上实施Tophat比对。大部分编号均包含相同的编码序列，包括Abed Binder 12、Aramir、Barke、BCD12、BCD47、Commander、Emir、Finniss、Golden Promise、Pallas、Sultan 5和WBDC013，而编号Hindmarsh、WBDC008、WBDC085、WBDC109和WBDC110相对于Abed Binder 12等位基因而言，包含多态性。此外，基于与NLR-A比对的WGS重叠群，发现Bowman与AbedBinder 12一致(图6)。相对于Abed Binder 12，WBDC008具有最多的多态性，16个同义突变和5个非同义突变。非同义突变包括Q95E(WBDC008、WBDC109、WBDC110)、N148K(WBDC008、WBDC085、WBDC109、WBDC110)、S535P(Hindmarsh)、L539S、W665L和K680E(WBDC008)、和A920V(WBDC109和WBDC110)。
表12.分别基于表达和作图，NLR-A和Rps6在多种大麦编号中的相关性
NLR-A的分子克隆：涵盖NLR-A转录物的基因组区域长度为12.8kb。这种基本尺寸主要是由于内含子2，其长度为8.8kb。之前使用大的T-DNA构建体使用基于土壤杆菌属的转化面临困难；因此，我们采用以下的克隆策略：可以保留用于NLR-A的启动子和终止子的天然基因组序列，但是除去内含子2或内含子1和2。研发PCR引物，从而将NLR-A扩增成2部分：片段1包含2.4kb启动子，外显子1和2，以及内含子1，以及大约一半的内含子2；并且片段2包含一部分外显子3，内含子3，外显子4和1.8kb终止子区域。2个区域均是由衍生自AbedBinder 12基因组DNA(包含NLR-A)的BAC扩增得到的，克隆至pCR-XL-TOPO载体中，转化至大肠杆菌(E.coli)中并测序。在平行试验中，由Abed Binder 12 RNA生成的cDNA用于扩增NLR-A的完整编码序列(片段3)，克隆至pSC-B载体中，转化至大肠杆菌中，并测序。T-DNA构建体的设计包含由35S启动子和nos终止子驱动的潮霉素抗性基因，其后为NLR-A的2.4kb启动子，外显子1、2和3，内含子3，外显子4和1.8kb终止子。研发引物，该引物由克隆的片段1、2和3扩增得到，从而确保40个碱基对重叠存在于所有3个片段和骨架载体pBract202之间。使用Gibson组件来组装片段，并用于根癌土壤杆菌转化(图8)。
材料和方法
遗传材料：Abed Binder 12(PI 327961)、Russell(PI 483127)和Manchuria(CIho2330)得自the United States Department of Agriculture,Agricultural ResearchService(USDA-ARS)Grain Resources Information Network(GRIN)。编号SusPtrit和Golden Promise得自Rients Niks(Wageningen UR)。编号Barke得自Nils Stein(Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung)。
病原体材料：使用小麦条锈病菌分离株08/501或08/21进行病原体测试。小麦条锈病菌分离株由The National Institute for Agricultural Botany于2008年收集。小麦条锈病菌分离株08/21和08/501夏孢子是分散的，并且分别保持在易感小麦cvs.Solstice和Victo上。
接种测定法：对于植物接种而言，将种子播种于草炭基堆肥上。使用16h光和8h暗循环，在18℃白天和11℃夜晚下使植物在环境受控的室中生长，并且由金属卤化物灯泡(Philips MASTER HPI-T Plus 400W/645E40)提供光照。在第一片叶完全出现并且在第二片叶出现之前，在14天大的幼苗上进行接种。通过将新鲜的孢子与滑石粉末以重量比1:16混合来制备接种物。压缩空气泵用于将接种物散布至定位于旋转平台上的幼苗上。在接种后，将育苗钵密封于塑料袋中，并储存在6℃的黑暗中，从而得到成功发芽所需的高湿度。在接种后48至72小时后，使幼苗返回至环境是受控的生长室中。在接种后14天，对疾病症状评分。
表型分型：使用表型分型级别对接种小麦条锈病菌的植物进行评分，其中所述的表型分型级别测量萎黄病(叶发黄)和感染(脓疱形成)的宏观表型。在连续的9点级别(0至4分，并且以0.5递增)上对植物单独地评分。得分反映了表达疾病症状的接种的叶表面的百分比。0分表明无表达表型(0％覆盖率)，而4分表明广泛地表达表型(100％覆盖率)。就微观表型分型而言，使用剪刀收获接种幼苗的第一片叶，并放置于填充1.0M KOH和一滴表面活性剂的15mL离心管中(Silwet L-77,Loveland Industries Ltd.)。将管在37℃温育12至16小时。倒出KOH溶液，并使用15mL的50mM Tris HCL-pH7.5将叶洗涤3次。然后，将叶样品在2.0％w/v染色溶液中在4℃温育过夜，其中所述的染色溶液包含与溶解于50mM Tris HCL中的异硫氰酸荧光素(WGA-FITC；Sigma Aldrich；L4895-10MG)缀合的麦胚凝集素。使用无菌水洗涤叶，并固定在显微载玻片上。使用具有GFP滤波器的荧光显微镜在5x物镜下在蓝光激发下观察固定物。各视场(FOV)为2.72mm x 2.04mm。在覆盖叶的长度和宽度的非重叠FOV中，通过评估定植和脓疱形成的数量来收集数据。通过将值0、0.5和1分配给各FOV，疾病症状评估为低于15％、15至50％或者高于50％。相对于各叶中FOV的数量，通过取平均值来计算百分定植率(pCOL)和脓疱形成(pPUST)得分(0至100％)。
DNA提取：根据适用于基于96孔形式的基于CTAB的方案(其由(Stewart and Via(1993)BioTechniques 14:748-750)修改得到，提供PCR级基因组DNA)，由叶组织提取得自所有群体的DNA。
Abed Binder 12 x Russell F2遗传图谱的构建：使用PicoGreen dsDNA定量测定法(Life Technologies；P11496)评估gDNA的浓度，并归一化至60ng/μL。在the Universityof California,Los Angeles Southern California Genotyping Consortium(LosAngeles,CA,USA)(Close et al.2009)进行使用大麦BOPA1设计的寡核苷酸测定法(OPA)基因分型，其中所述的设计包括1,536个基于SNP的标志物。研发其他的标志物作为切割扩增多态性序列(CAPS)或者Sequenom MassARRAY标志物，从而桥接在非连锁的染色体臂之间的间隙，并增加标志物密度。对于CAPS标志物的研发而言，我们使用CAPS Designer(可得自互联网：solgenomics.net/tools/caps_designer/caps_input.pl)来鉴定II型限制性酶，其在多态性位置进行消化。通过混合2μL缓冲剂(10x)，0.4μL dNTPs，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，0.2μL Taq聚合酶，2μL gDNA(10ng/mL)和14.6μL H2O，准备CAPS标志物PCR反应。PCR循环开始于在94℃5分钟的初始变性步骤，然后进行以下循环：在94℃20秒，在56℃退火30秒和在72℃引物延伸1分钟，总计35个循环。所述的过程结束于在72℃最终延伸5分钟，然后保持在16℃。根据用于个别酶的制造商提供的说明书进行消化。使用电泳分离限制性片段，其中使用溴化乙锭染色的2.0％TBE琼脂糖凝胶。使用Bio-Rad ChemDoc XRS+成像系统取得凝胶图像，并人工对标志物进行评分。GBS CAPS标志物如(Kota et al.(2008)Funct.Integr.Genomics 8:223-233)中所述。用于CAPS标志物的所有引物和限制性酶在ESM 1中详细描述。对于Sequenom标志物的研发而言，以IUPAC格式提取SNP序列，并且具有40至60bp的侧翼序列。该序列用作引物设计的模板，其中使用MassARRAY软件v3.1用于多重至32个SNP测定法。在the Iowa State University Genomic Technologies Facility(Ames,IA,USA)进行Sequenom基因分型。用于Sequenom标志物的所有SNP和WGS重叠群源信息在ESM 2中详细描述。
遗传图谱的构建：使用包含535个大麦OPA的589个标志物(Close et al.(2009)BMC Genomics 10:582)、26个CAPS标志物和28个Sequenom标志物构建遗传图谱。使用JoinMap v4(Kyazma B.V.,Wageningen,Netherlands)，其中使用缺省参数以及4.0的独立LOD阈值。使用Kosambi作图功能来估计遗传距离。通过与目前的大麦的OPA一致性遗传图谱(-Amatriaín et al.(2011)Plant Genome 4:238-249)和使用两点连锁测试(使用R/qtl(v1.33-7))比较，评价遗传图谱的完整性。
QTL和ANOVA分析：使用QTL Cartographer(v1.17j)执行复合区间作图谱，其中使用模型6，选择5种背景标志物，步长2cM，并且窗口尺寸为10cM(Basten et al.(1994)“Zmap–a QTL cartographer,”in:Smith et al.(eds)Proceedings of the 5th WorldCongress on Genetics Applied to Livestock Production:Computing Strategies andSoftware,Guelph,Ontario,Canada)。使用Eqtl模块，在H0:H3模型下提取显著的QTL，其中使用试验广度阈值(EWT)，该阈值是使用1,000个排序计算的，并使用α<0.05的阈值再次选择背景标志物(Doerge and Churchill(1996)Genetics 142:285-294；Lauter et al.(2008)Plant Genome 1:99-110)。使用R/qtl执行测试个体标志物的连锁情况的ANOVA分析。
转录组测序和组装：对表12中所述的编号，在播种后18天，由第一片叶和第二片叶收获叶组织。将样品在液氮中新鲜冷冻，并储存在-80℃。将样品在液氮冷却的研钵中进行匀浆。根据制造商的方案，使用TRI试剂(Sigma-Aldrich；T9424)由样品提取RNA。通过使用RQ1Rnase free DNase(Promega；M6101)处理样品，除去DNA。根据RNA Cleanup方案(Qiagen；产品No.74104)，使用RNeasy小型旋转柱纯化样品。使用RNA Nano Chips(AgilentTechnologies；产品no.5067-1511)，在Agilent 2100Bioanalyzer上评估RNA样品的品质和完整性。使用Illumina TruSeq RNA文库制备(Illumina；RS-122-2001)构建Abed Binder12和Russell RNA文库。预计用于Abed Binder12和Russell的最终文库插入物尺寸分别为411和339bp。在Hiseq 2000/2500的一个泳道上，使用100bp成对端读值来测序Barcoded文库。这种生成的32.0和59.3百万个成对端读指分别用于Abed Binder 12和Russell。在TheGenome Analysis Centre(Norwich,UK)进行所有的文库制备和测序。使用FastQC评估RNAseq数据品质，并使用参数设定为ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10、LEADING:3、TRAILING:3、SLIDINGWINDOW:4:15和MINLEN:100的Trimmomatic(v0.32)除去读值。这些参数将除去具有接头序列、模糊碱基或者使读值品质大幅降低的所有读值。使用Trinity(v2013-11-10)，使用缺省参数，形成转录组组件。
在Rps6基因座处用于饱和的标志物研发：通过2种方法指导初始标志物的研发，从而鉴定锚定于Rps6区域的序列。这包括基于标志物共线性以及现有的遗传图谱，鉴定锚定的单基因簇(unigene)(Moscou et al.(2011)PLoS Genet 7:e1002208；-Amatriaín et al.(2011)Plant Genome 4:238-249；Potokina et al.(2008)Plant J.53:90-101)，以及基于大麦基因组拉链鉴定直系同源的水稻基因(Mayer et al.(2011)Plant Cell 23:1249-1263)。选择包含38个基因的水稻染色体6上的区域(Os06g43140至Os06g43900)。由cv.Morex WGS组件(IBGSC(2012)Nature 491:711-716)返回的最佳BLASTn命中用作用于使用Primer3(libprimer3release 2.3.6)的PCR引物设计的模板。使用blastall(v2.2.23)执行所有的BLASTn查询。Abed Binder 12和Russell gDNA用作用于PCR扩增和Sanger测序的模板。通过使用Seqman软件(DNAstar Lasergene v11)比对序列文件，鉴定SNP。然后，使用上文所述的Cleaved Amplified Polymorphic Sequences或Sequenom MassARRAY iPLEX，利用SNP研发标志物。
随后的标志物研发涉及：(1)比较由cvs.Barke、Bowman和Morex衍生的基因组重叠群；或者(2)将Abed Binder 12和Russell RNAseq比对的读值与锚定于Rps6区域的WGS重叠群比较(IBGSC(2012)Nature 491:711-716；Mascher et al.(2013)Plant J.76:718-727)。Geneious(v8.1.6)用于读值比对，其中使用具有缺省参数和数据可视化的Geneious作图功能(Kearse et al.(2012)Bioinformatics 28:1647-1649)。使用在(Ramirez-Gonzalez etal.(2015)Bioinformatics 31:2038-2039)中所述的类似的方法，将SNP转换成Kompetitive Allele Specific PCR(KASP)标志物。所有的WGS重叠群源信息、SNP、KASP标志物模板和引物都在ESM 3中详细描述。在the John Innes Centre Genotyping Facility(Norwich,UK)执行KASP测定法。
重组筛选和表型分型：使用由F3植物收集的种子进行重组筛选，其中所述的F3植物选自单一的F2:3家族，该家族对于Rps6而言是杂合的。Sequenom标志物转换成KASP标志物，并用作侧翼标志物以鉴定重组染色体。使用具有重组染色体的个体进行2个独立的后代测试。针对萎黄病和感染的宏观观察，对每个重复中每个家族的总计16个个体进行评分。
实施例2：使用Rps6转化大麦并针对小麦条锈病抗性进行测试
Yeo等人((2014)Theor.Appl.Genet.127:325–337)之前建立了双单倍体群体SusPtrit x Golden Promise(SxGP DH)，以鉴定可转化的大麦编号，该大麦编号对大麦的多种异源锈病菌也是易感的。我们发现，编号SxGP DH-47对小麦条锈病是易感的，并且之前显示对土壤杆菌属基转化呈感受态(Yeo et al.(2014)Theor.Appl.Genet.127:325–337)。如Bartlett等人所述((2008)Plant Methods 4:22)进行SxGP DH-47大麦的转化，修改之处在于使用根癌土壤杆菌感染未成熟的胚性愈伤组织，而不使用未成熟的胚。简言之，由在温室中生长的大麦植物收获未成熟的胚，胚的直径为大约1.5至2mm。与Bartlett等人((2008)Plant Methods 4:22)所述的相反，将除去胚轴的未成熟的胚放置在愈伤组织诱导介质上大约4周。使用包含以下物质的根癌土壤杆菌菌株AGL1接种未成熟的胚性愈伤组织：(1)T-DNA质粒IHP_0205_NLR-A_构建体(SEQ ID NO:15)、T-DNA质粒IHP_0300_NLR-A_天然构建体(SEQ ID NO:34)或T-DNA质粒pBract202_TSL_pMla6_NLR-A_CDS_gDNA_tMla6构建体(SEQID NO:35)；以及(2)pSoup质粒。将愈伤组织与根癌土壤杆菌共同培养2天。转化过程中的所有其他的步骤等同于Bartlett等人所述((2008)Plant Methods 4:22)。
使由半合子T0植物(包含T-DNA插入物)衍生的种子(T1)生长2周，使用小麦条锈病菌分离株08/21进行接种，然后针对抗性或易感性评分，如上文实施例1中所述(参见材料和方法部分中的“接种测试”)。测试多个独立的T-DNA插入事件。在各试验中，针对抗性的和易感的表型对个别T1植物进行评分，并且通过使T-DNA插入物的存在/缺乏与抗性/易感性关联，建立Rps6功能的确认。
实施例3：Rps6对小麦的转化及针对小麦条锈病抗性的测试
如Periyannan等人所述((2013)Science 341:786-788)实施小麦(普通小麦“Fielder”)的转化。T-DNA插入物包含得自大麦的用于NLR-A(SEQ ID NO:17)的原始启动子和编码序列，包含在一个T-DNA质粒(SEQ ID NO:15、34或35)中，如实施例2所述，以及NLR-A(SEQ ID NO:2)的开放阅读框的基因组片段(其与得自小麦的高表达NLR基因的启动子和终止子融合)。如上文实施例2中所述，针对大麦，进行转化的小麦植物对小麦条锈病的抗性或易感性的表型筛选。
实施例4：Rps6对二穗短柄草的转化及针对小麦条锈病抗性的测试
基本上如Vain等人所述((2008)Plant Biotechnol.J.6:236–245；doi:10.1111/j.1467-7652.2007.00308.x)，进行模式草种二穗短柄草的转化。T-DNA插入物包含得自大麦的用于NLR-A(SEQ ID NO:17)的原始启动子和编码序列，包含在一个T-DNA质粒(SEQ IDNO:15、34或35)中，如实施例2所述，以及NLR-A(SEQ ID NO:2)的开放阅读框的基因组片段(其与得自小麦的高表达NLR基因的启动子和终止子融合)。如上文中Dawson等人所述((2015)Front.Plant Sci.6:876；doi:10.3389/fpls.2015.00876)，进行对小麦条锈病的抗性或易感性的表型筛选。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)的冠词的语法对象。例如“一个元件”是指一个或多个元件。
在整个说明书中，词语分词形式的“包含”或其变体(例如动词形式的“包含”或分词形式的“包含”)应该理解为意味着涵盖所陈述的元件、整数或步骤，或者元件、整数或步骤的组，但是不排除任何其他的元件、整数或步骤，或者元件、整数或步骤的组。
在本说明书中提及的所有公开和专利申请表明了本发明所属技术领域的那些技术人员的水平。所有公开和专利申请均以引用方式并入本文，如同每一份个别的公开或专利申请特意地且单独地表明以引用方式并入本文。
尽管为了达到清楚理解的目的，通过示例说明和实例相当详细地描述了上述发明，但是显而易见的是某些变化和修改可以在所附的权利要求书的范围内实施。

Claims (58)

1.包含选自以下的一员的核酸分子：
(a)大麦Rps6基因；
(b)在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11、13、15、34或35中列出的核苷酸序列；
(c)编码在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；
(d)与在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和13中列出的全长核苷酸序列的至少一种具有至少85％核苷酸序列一致性的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性；以及
(e)编码与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性。
2.权利要求1的核酸分子，其中核酸分子为分离的核酸分子。
3.权利要求1或2的核酸分子，其中核酸分子是非天然形成的。
4.权利要求1或2的核酸分子，其中大麦Rps6基因是位于大麦植物基因组中对应于SEQID NO:4的区域中的大麦Rps6基因。
5.权利要求1-4的任意一项的核酸分子，其中(d)或(e)的核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的蛋白质。
6.权利要求5的核酸分子，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
7.表达盒，其包含权利要求1-6的任意一项的核酸分子和可操作地连接的异源启动子。
8.载体，其包含权利要求1-6的任意一项的核酸分子和权利要求7的表达盒。
9.宿主细胞，其是使用权利要求1-6的任意一项的核酸分子、权利要求7的表达盒或权利要求8的载体转化的。
10.权利要求9的宿主细胞，其中宿主细胞为植物细胞、细菌、真菌细胞或动物细胞。
11.权利要求9或10的宿主细胞，其中植物细胞为大麦植物细胞、小麦植物细胞或二穗短柄草植物细胞。
12.植物或种子，其是使用权利要求1-6的任意一项的核酸分子、权利要求7的表达盒或权利要求8的载体转化的。
13.权利要求12的植物或种子，其中植物为小麦植物或大麦植物，并且种子为小麦种子或大麦种子。
14.转基因植物或种子，其包含稳定地引入其基因组中的多核苷酸构建体，所述的构建体包含选自以下的一员：
(a)大麦Rps6基因；
(b)在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11或13中列出的核苷酸序列；
(c)编码在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；
(d)与在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和13中列出的全长核苷酸序列的至少一种具有至少85％核苷酸序列一致性的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性；以及
(e)编码与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性。
15.权利要求14的转基因植物或种子，其中(d)或(e)的核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的蛋白质。
16.权利要求15的转基因植物或种子，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
17.权利要求14-16的任意一项的转基因植物或种子，其中多核苷酸构建体包含(b)-(e)的任意一项的核苷酸序列，并且进一步包含可操作地连接以用于所述的核苷酸序列在植物中表达的启动子。
18.权利要求17的转基因植物或种子，其中启动子选自病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。
19.权利要求14-18的任意一项的转基因植物或种子，其中转基因植物或种子相对于对照植物的抗性而言，包含对由多种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的增强的抗性。
20.权利要求14-19的任意一项的转基因植物或种子，其中转基因植物为转基因小麦植物，并且转基因种子为转基因小麦种子。
21.权利要求14-19的任意一项的转基因植物或种子，其中转基因植物为转基因大麦植物，并且转基因种子为转基因大麦种子。
22.权利要求14-19的任意一项的转基因植物或种子，其中转基因植物为转基因二穗短柄草植物，并且转基因种子为转基因二穗短柄草种子。
23.权利要求14-22的任意一项的转基因植物或种子，其中多核苷酸构建体为异源核酸分子。
24.用于生产具有对植物疾病的增强的抗性的植物的方法，所述的方法包括将多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞中，所述的多核苷酸构建体包含选自以下的一员：
(a)大麦Rps6基因；
(b)在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11或13中列出的核苷酸序列；
(c)编码在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；
(d)与在SEQ ID NO:1、2、5、7、9、11和13中列出的全长核苷酸序列的至少一种具有至少85％核苷酸序列一致性的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对植物疾病的抗性；以及
(e)编码与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对植物疾病的抗性。
25.权利要求24的方法，其中(d)或(e)的核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的蛋白质。
26.权利要求25的方法，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
27.权利要求24-26的任意一项的方法，其中植物疾病为锈病。
28.权利要求24-27的任意一项的方法，其中病原体为柄锈菌属。
29.权利要求24-28的任意一项的方法，其中植物为草类植物。
30.权利要求24-29的任意一项的方法，其中植物为谷物植物。
31.权利要求24-30的任意一项的方法，其中植物为大麦、小麦或二穗短柄草。
32.权利要求24-31的任意一项的方法，其中多核苷酸构建体被稳定地引入植物细胞的基因组中。
33.权利要求24-33的任意一项的方法，其中大麦、小麦或二穗短柄草植物细胞再生成其基因组中包含所述的多核苷酸构建体的大麦、小麦或二穗短柄草植物。
34.权利要求24-33的任意一项的方法，其中多核苷酸构建体包含(b)-(e)的任意一项的核苷酸序列，并且进一步包含可操作地连接以用于所述的核苷酸序列在植物中表达的启动子。
35.权利要求34的方法，其中启动子选自病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。
36.权利要求31-35的任意一项的方法，其中包含所述的多核苷酸构建体的大麦、小麦或二穗短柄草植物相对于对照大麦植物、小麦或二穗短柄草的抗性而言，包含对由至少一种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的增强的抗性。
37.权利要求31-35的任意一项的方法，其中包含所述的多核苷酸构建体的大麦、小麦或二穗短柄草植物相对于对照大麦植物、小麦或二穗短柄草的抗性而言，包含对由多种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的增强的抗性。
38.通过权利要求24-37的任意一项的方法生产的植物。
39.权利要求38的植物的种子，其中种子包含所述的多核苷酸构建体。
40.用于生产具有对小麦条锈病的增强的抗性的大麦植物的方法，所述的方法包括在大麦植物或其至少一个细胞中修饰抗性基因Rps6的非功能等位基因，从而形成功能等位基因，由此增强大麦植物对小麦条锈病的抗性。
41.权利要求40的方法，其中所述的修饰非功能等位基因包括引入至少一种基因修饰，其选自在非功能等位基因中的至少一个碱基对的插入、删除和取代。
42.权利要求40或41的方法，其中所述的修饰非功能等位基因包括选自靶向诱变、同源重组和突变育种中的至少一员。
43.权利要求39-42的任意一项的方法，其中功能等位基因包含选自以下的核苷酸序列：
(a)在SEQ ID NO:1中列出的所述的核苷酸序列；
(b)包含用于在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列的编码序列的核苷酸序列；以及
(c)编码与在SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中所述的核酸分子能够赋予包含所述的核酸分子的植物对小麦条锈病的抗性。
44.权利要求43的方法，其中(c)的多肽包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域。
45.权利要求44的方法，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
46.权利要求40-45的任意一项的方法，其中大麦植物相对于对照大麦植物的抗性而言，包含对由多种小麦条锈病菌物种引起的小麦条锈病的增强的抗性。
47.通过权利要求40-46的任意一项的方法生产的大麦植物。
48.权利要求47的大麦植物的种子，其中种子包含所述的多核苷酸构建体。
49.在农业农作物生产中限制小麦条锈病的方法，所述的方法包括种植根据权利要求12-23、39和48的任意一项的种子，并且在有利于植物的生长和发育的条件下使所述的植物生长。
50.权利要求49方法，进一步包括由所述的植物收获至少一粒种子。
51.权利要求49或50的方法，其中种子为小麦种子或大麦种子。
52.权利要求12-23、38、39、47和48的任意一项的植物或种子在农业中的用途。
53.使用权利要求12-23、38、39、47和48的任意一项的植物或种子生产的人类或动物食物产品。
54.包含选自以下的氨基酸序列的多肽：
(a)由在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
(b)由在SEQ ID NO:2、5、7、9、11或13中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
(c)在SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14中列出的氨基酸序列；以及
(d)与在SEQ ID NOS:3、6、8、10、12和14中列出的全长氨基酸序列的至少一种具有至少85％序列一致性的氨基酸序列，其中包含所述的氨基酸序列的多肽能够赋予包含所述的多肽的小麦或大麦植物对条锈病的抗性，并且可任选地，其中所述的多肽不是天然形成的。
55.权利要求54的多肽，其中(d)的多肽包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域。
56.权利要求55的多肽，其中卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸的重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:3中相应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
57.权利要求54-56的任意一项的多肽，其中多肽为分离的多肽。
58.权利要求54-57的任意一项的多肽，其中多肽是非天然形成的。
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