CN112877343B - 大麦条纹病致病性基因Pgr03723及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供大麦条纹病致病性基因Pgr03723及其应用，该基因来自麦类核腔菌Pyrenophora graminea。大麦条纹病属系统侵染性真菌病害，是大麦的主要病害之一，其病原菌主要有有性阶段和无性阶段，在世界各大麦种植区域均有分布，并且在上海、四川、浙江和江苏等长江流域地区受到严重危害。本发明通过RNA干扰技术获得Pgr03723干扰突变株，进一步提供了该基因参与调控菌株生长分化，为阐明大麦条纹病菌的致病机理、丰富植物病原菌的基因功能、大麦抗病新防治策略和抗病育种提供理论和现实意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物工程领域，具体涉及大麦条纹病菌致病性基因Pgr03723的生物信息学分析及其调控菌丝生长速率；此外，采用RNAi技术构建该基因的干扰载体，通过遗传转化获得干扰株，可降低大麦条纹病的致病性的应用。
背景技术
大麦条纹病(Pyrenophora graminea)属系统侵染性真菌病害，是大麦的主要病害之一，其病原菌主要有有性阶段和无性阶段，有性阶段称麦类核腔菌[Pyrenophoragraminea(Rabenk.)Ito et Kurib.]，属子囊菌亚门、核腔菌属，无性阶段称禾内脐蠕孢[Drechslera graminea(Rabenh.ex Sch1.)Shoemaker，属半知菌亚门、内脐蠕抱属；在自然界中常见到的是其无性阶段，有性阶段比较少见。病原菌侵染大麦叶片或叶鞘时，分生孢子一般呈柱状，浅黄色到黄褐色，多数直，两端半球形，一般在基细胞处最宽向端部稍尖，1-7个隔膜，大小50-125μm×14-25.5μm，通常在顶细胞或基细胞处形成次生分生孢子梗，脐点明显，深陷于基部细胞内。分生孢子梗由气孔伸出，单生或少数丛生，柱状直或弯曲，不分枝，浅褐色到褐色。
目前，开展病原致病性研究和抗病品种选育的核心技术主要为植物种质资源的抗病性鉴定。由于自然选择的压力、寄主植物的抗病性基因和病原物的致病基因的协同进化，不同的大麦条纹病菌株对同一个抗病基因往往会表现出毒性的差异，因此，大麦条纹病在菌丝形态、生理特征及致病性上存在在着阶梯性差异。对大麦对条纹病的初步研究，其目的在于了解大麦和条纹病病原物在不同的环境条件下的互作关系，以及大麦如何产生抗病现象的规律性，进而有效地预防大麦条纹病的发生，提高大麦的品质和产量。
本研究以大麦条纹病强致病力菌株QWC为材料，以基因组测序结果为基础，筛选出与大麦条纹病菌效应基因Pgr03723，并对其分离克隆，通过RNAi的方法研究其功能，并从菌丝的形态、显微结构和致病性方面验证其相关功能，明确效应蛋白Pgr03723在大麦条纹病菌中致病性的功能机制，为阐明大麦条纹病菌的致病机理、丰富植物病原菌的基因功能、大麦抗病新防治策略和抗病育种提供理论和现实意义。
现有技术存在的问题：现有技术中未见大麦条纹病(麦类核腔菌)Pgr03723基因及RNA干扰该基因应用的报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因Pgr03723，以应对该病害靶标基因的需求，运用RNA干扰技术获得Pgr03723干扰突变体，并从菌丝的形态、显微结构和致病性方面验证其相关功能，明确效应蛋白Pgr03723在大麦条纹病菌中致病性的功能机制为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
1.一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因Pgr03723，该基因全长序列如SEQ IDNO：1所示。
2.一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因Pgr03723获取方法，包括：
(1)大麦条纹病菌株的培养
制备PDA培养基：称取重量200g新鲜马铃薯，削皮并去芽眼切成2-4cm2的小方块，加1.2L蒸馏水煮沸20-30min，用纱布过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，在121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基至50℃时在超净工作台中倒数个平板，待培养基完全晾干后，将4℃保存的大麦条纹病菌菌株QWC用直径为5-10mm的打孔器在边缘打取菌饼并置于PDA培养基平板上生长7d。
(2)Pgr03723基因的克隆
以大麦条纹病菌野生株QWC菌株基因组的cDNA为模板克隆Pgr03723基因，使用引物Pgr03723-F1/Pgr03723-R1(附图1)通过PCR扩增后进行产物的纯化、连接载体pMD19-TVector(pMD19-T Vector(Simple)1μL、目的片段4μL、Solution Ⅰ 5μL，缓慢混匀，轻离心5sec，16℃水浴连接过夜)、转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞(制备含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LBA固体培养基平板，将80μL X-gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出-80℃保存的大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，冰上溶解，每25μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入650μL LB液体培养基，37℃200rpm振荡培养1-2h，取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于37℃培养箱中黑暗培养12-14h)，筛选蓝白斑进行PCR鉴定后送测。
(3)Pgr03723基因序列及生物信息学分析
通过提取野生株QWC的RNA并反转录成cDNA，经过PCR扩增(附图2A)，连接pMD19-TVector(Simple)载体，转化大肠杆菌感受态细胞后，测序获得Pgr03723基因的cDNA序列，成功克隆到麦类核腔菌(P.graminea)的Pgr03723基因。将Pgr03723基因进行生物信息学分析，并运用在线软件进行预测分析，结果得出：根据ORFfinder软件分析Pgr03723基因全长1239bp，ExPASy软件翻译出Pgr03723编码413个氨基酸，ProtParam软件对其理化性质预测分析得出：Pgr03723编码蛋白的等电点约为6.09，该蛋白为酸性蛋白；蛋白分子量Mw是43.51KD，组成的氨基酸中丙氨酸(Ala)占比最多为14.3％，其次是甘氨酸(Gly)占7.7％；亲水性平均值(GRAVY)是-0.019；带正电荷残基总数(Arg+Lys)为33，带负电荷残基总数(Asp+Glu)为36；脂肪指数(Aliphatic index)为74.99；分子式是C1940H2996N504O591S21，原子总数为6052；不稳定性指数(instability index，II)为36.87，得出该蛋白为稳定的(II<40，即为稳定蛋白)。利用SOPMA工具预测分析其蛋白二级结构，无规卷曲(Random coil，Cc)占比最多为47.94％，最少的是β-转角(Beta turn，Tt)，其比率为5.81％，α-螺旋(Alphahelix，Hh)占到29.54％，延伸链(Extended strand，Ee)的占比为16.71％。(附图2B)；用ProtScale软件进行亲水性分析，0以上的峰值表示蛋白为疏水性，以下的峰值表示蛋白为亲水性，同时结合脂肪指数(Aliphatic index)和亲水性平均值(GRAVY)推断得出，Pgr03723编码的蛋白亲水性蛋白(附图2C)；NetPhos3.1 Server软件预测分析磷酸化位点得出：Pgr03723基因编码蛋白存在丝氨酸(Serine，Ser)，络氨酸(tyrosine，Tyr)和苏氨酸(Threonine，Thr)磷酸化位点(附图2D)；TMpred软件预测蛋白质跨膜区得出Pgr03723编码的蛋白存在跨膜区，预测其属于跨膜蛋白(附图2E)。
3.Pgr03723基因在大麦条纹病菌生长分化和致病性等方面的应用，包括如下步骤：
(1)干扰载体pSilent-1 Pgr03723的构建
以菌株QWC的cDNA为模板，使用引物Pgr03723-F1、Pgr03723-R1和Pgr03723-F2、Pgr03723-R2(附图1)分别扩增获得片段Pgr03723-1(492bp)和Pgr03723-2(492bp)。用KpnⅠ和Bgl II双酶切片段Pgr03723-1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段pSilent-1连接到载体pSilent-1上。然后将片段Pgr03723-2和pSilent-1Pgr03723-1用Xho Ⅰ和Hind III双酶切，用T4连接酶将片段Pgr03723-2连接到载体pSilent-1Pgr03723-1上，得到Pgr03723基因的干扰载体pSilent-1Pgr03723(附图3)。
(2)遗传转化与转化株的筛选
将野生株QWC菌株置于酶解液(10mg/ml溶壁酶+20mg/ml纤维素酶R-10，以1.2mol/L NaCl稳渗剂配制)30℃温育3h，过滤无菌溶液后重悬，悬浮液在30℃下80rpm/min摇3-4h，将悬浮液过滤到10m离心管中，室温1996rpm/min离心5min，用1.2mol/L NaCl清洗两次，最后重悬在NTC(1.2M NaCl+10mM Tris-HCl(PH＝7.5)+10mM CaCl2)溶液中保存。通过PEG4000介导进行转化：取100μLNTC重悬沉淀，加连有目的片段的载体质粒pSilent-Pgr03723约25μg，轻轻混匀，常温放置20min，按顺序依次加入200μL、200μL、800μLPTC，每次加入PTC都要缓慢混匀。然后室温静置15min，加入3mL rPD培养基轻轻混匀，最后25℃培养箱静置培养24h。静置培养后，一分为二，再分别与20mL rPDA培养基混匀，倒入培养皿中，待完全凝固后，密封置于25℃培养箱培养。仔细观察rPDA平板表面，若依稀形成可见菌落，在超净工作台中加盖20mL含有50μg/mL潮霉素B的PDA培养基，封口膜密封培养基平板，继续在25℃黑暗环境下培养，定时观察平板，至加盖的rPDA长出单菌落，用白枪头分别挑取这些菌落，接种到含有50μg/mL潮霉素B的新的PDA培养基平板中，将其编号继续培养筛选，连续传代培养三代，将可以稳定生长的转化子菌株接种于PDA培养基平板培养，使用快速裂解真菌微生物，使其释放核酸的试剂来快速提取基因组DNA，用潮霉素B特异性引物HYG-F/HYG-R进行PCR鉴定筛选，进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：66.04％、64.61％、23.31％、57.80％及59.64％，所需引物如附图1所示。
(3)突变菌株致病性的鉴定
选取干扰率最大的菌株Pgr03723-1和QWC(CK)菌株接种到PDA培养基中，25黑暗培养7d后，采用“三明治法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种20d后计算观察发病率及发病状况。菌株侵染离体大麦叶片，野生株QWC菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。野生株QWC和干扰株Pgr03723-1的发病率分别为：100％和31.66％(附图4)，干扰株Pgr03723-1的发病率与对照比较显著降低。综上所述，大麦条纹病菌菌株Pgr03723基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。
附图说明
图1为本发明所用引物序列。
图2为Pgr03723基因生物信息学分析图。
其中A为Pgr03723基因扩增结果及序列对比图，B为Pgr03723基因的蛋白二级结构预测图，C为Pgr03723基因的亲疏水性图，D为Pgr03723基因的磷酸化位点图，E为Pgr03723基因的跨膜区预测图。
图3为Pgr03723基因干扰载体示意图。
图4为干扰株与野生株的相对表达量、发病率及形态图。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供一种大麦条纹病致病性基因Pgr03723，该基因来自大麦条纹病菌(Pyrenophora graminea)，该基因CDS序列如序列表1所示。
实施例2
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因Pgr03723基因克隆及其RNA干扰转化子获得的方法，包括如下步骤：
1、Pgr03723基因的克隆及其生物信息学分析
制备PDA培养基：称取重量200g新鲜马铃薯，削皮并切成小方块，加1.2L蒸馏水煮沸20-30min，用纱布过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，在121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基至50℃时在超净工作台中倒数个平板，待培养基完全晾干后，将4℃保存的大麦条纹病菌菌株QWC用直径为5-10mm的打孔器在边缘打取菌饼并置于PDA培养基平板上生长7d。
以大麦条纹病菌野生株QWC菌株基因组的cDNA为模板克隆Pgr03723基因，使用引物Pgr03723-F1/Pgr03723-R1(附图1)通过PCR扩增后进行产物的纯化、连接载体pMD19-TVector(pMD19-T Vector(Simple)1μL、目的片段4μL、SolutionⅠ5μL，缓慢混匀，轻离心5sec，16℃水浴连接过夜)、转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞(制备含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LBA固体培养基平板，将80μL X-gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出-80℃保存的DH5α感受态细胞，冰上溶解，每25μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入650μL LB液体培养基，37℃200rpm振荡培养1-2h，取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于37℃培养箱中黑暗培养12-14h)，筛选蓝白斑进行PCR鉴定后送测。
通过提取野生株QWC的RNA并反转录成cDNA，经过PCR扩增(附图2A)，连接pMD19-TVector(Simple)载体，转化大肠杆菌感受态细胞后，测序获得Pgr03723基因的cDNA序列，成功克隆到麦类核腔菌(P.graminea)的Pgr03723基因。将Pgr03723基因进行生物信息学分析，并运用在线软件进行预测分析，结果得出：根据ORFfinder软件分析Pgr03723基因全长1239bp，ExPASy软件翻译出Pgr03723编码413个氨基酸，ProtParam软件对其理化性质预测分析得出：Pgr03723编码蛋白的等电点约为6.09，该蛋白为酸性蛋白；蛋白分子量Mw是43.51KD，组成的氨基酸中丙氨酸(Ala)占比最多为14.3％，其次是甘氨酸(Gly)占7.7％；亲水性平均值(GRAVY)是-0.019；带正电荷残基总数(Arg+Lys)为33，带负电荷残基总数(Asp+Glu)为36；脂肪指数(Aliphatic index)为74.99；分子式是C1940H2996N504O591S21，原子总数为6052；不稳定性指数(instability index，II)为36.87，得出该蛋白为稳定的(II<40，即为稳定蛋白)。利用SOPMA工具预测分析其蛋白二级结构，无规卷曲(Random coil，Cc)占比最多为47.94％，最少的是β-转角(Beta turn，Tt)，其比率为5.81％，α-螺旋(Alphahelix，Hh)占到29.54％，延伸链(Extended strand，Ee)的占比为16.71％。(附图2B)；用ProtScale软件进行亲水性分析，0以上的峰值表示蛋白为疏水性，以下的峰值表示蛋白为亲水性，同时结合脂肪指数(Aliphatic index)和亲水性平均值(GRAVY)推断得出，Pgr03723编码的蛋白为亲水性蛋白(附图2C)；NetPhos3.1 Server软件预测分析磷酸化位点得出：Pgr03723基因编码蛋白存在丝氨酸(Serine，Ser)，络氨酸(tyrosine，Tyr)和苏氨酸(Threonine，Thr)磷酸化位点(附图2D)；TMpred软件预测蛋白质跨膜区得出Pgr03723编码的蛋白存在跨膜区，预测其属于跨膜蛋白(附图2E)。
2、干扰载体pSilent-1 Pgr03723的构建
以菌株QWC的cDNA为模板，使用引物Pgr03723-F1、Pgr03723-R1和Pgr03723-F2、Pgr03723-R2(附图1)分别扩增获得片段Pgr03723-1(492bp)和Pgr03723-2(492bp)。用KpnⅠ和Bgl II双酶切片段Pgr03723-1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段pSilent-1连接到载体pSilent-1上。然后将片段Pgr03723-2和pSilent-1Pgr03723-1用Xho Ⅰ和Hind III双酶切，用T4连接酶将片段Pgr03723-2连接到载体pSilent-1Pgr03723-1上，得到Pgr03723基因的干扰载体pSilent-1Pgr03723(附图3)。
3、遗传转化与转化株的筛选
将野生株QWC菌株置于酶解液(10mg/ml溶壁酶+20mg/ml纤维素酶R-10，以1.2mol/L NaCl稳渗剂配制)30℃温育3h，过滤无菌溶液后重悬，悬浮液在30℃下80rpm/min摇3-4h，将悬浮液过滤到10m离心管中，室温1996rpm/min离心5min，用1.2mol/L NaCl清洗两次，最后重悬在NTC(1.2M NaCl+10mM Tris-HCl(PH＝7.5)+10mM CaCl2)溶液中保存。通过PEG4000介导进行转化：取100μLNTC重悬沉淀，加连有目的片段的载体质粒pSilent-Pgr03723约25μg，轻轻混匀，常温放置20min，按顺序依次加入200μL、200μL、800μLPTC，每次加入PTC都要缓慢混匀。然后室温静置15min，加入3mL rPD培养基轻轻混匀，最后25℃培养箱静置培养24h。静置培养后，一分为二，再分别与20mL rPDA培养基混匀，倒入培养皿中，待完全凝固后，密封置于25℃培养箱培养。仔细观察rPDA平板表面，若依稀形成可见菌落，在超净工作台中加盖20mL含有50μg/mL潮霉素B的PDA培养基，封口膜密封培养基平板，继续在25℃黑暗环境下培养，定时观察平板，至加盖的rPDA长出单菌落，用白枪头分别挑取这些菌落，接种到含有50μg/mL潮霉素B的新的PDA培养基平板中，将其编号继续培养筛选，连续传代培养三代，将可以稳定生长的转化子菌株接种于PDA培养基平板培养，使用快速裂解真菌微生物，使其释放核酸的试剂来快速提取基因组DNA，用潮霉素B特异性引物HYG-F/HYG-R进行PCR鉴定筛选，进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：66.04％、64.61％、23.31％、57.80％及59.64％，所需引物如附图1所示。
实施例3
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因Pgr03723参与调控麦类核腔菌致病性的应用，包括：
选取干扰率最大的菌株Pgr03723-1和QWC(CK)菌株接种到PDA培养基中，25黑暗培养7d后，采用“三明治法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种20d后计算观察发病率及发病状况。菌株侵染离体大麦叶片，野生株QWC菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。野生株QWC和干扰株Pgr03723-1的发病率分别为：100％和31.66％(附图4)，干扰株Pgr03723-1的发病率与对照比较显著降低。综上所述，大麦条纹病菌菌株Pgr03723基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
<110> 甘肃农业大学
<120> 大麦条纹病致病性基因Pgr03723及其应用
<160>1
<210>1
<211>1242bp
<212> DNA
<213> 大麦条纹病菌-麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）
<400>
1 ATGCATTTCA CTAGCTCCCC TCTCTACTTC GCCGTCGTTG GCTTATCATC CTCATCTGCT
61 GTCCTTGCAG GTGTCCTGCC CTACGCACAA TGCGGTGGCA AGACCTTCAA GGGTGATAGC
121 ACCTGCGCTG AGGGCTGGTC TTGTGTCAAG ATCAACGACT GGTACAGCCA GTGTGTTCCA
181 GTTCCTGCTT GCACTGCTGG CCCGACTGAC CCGACCTTCA ACGCCACTCT CCCAGTCGCC
241 ACGCCTGCTG CGGTTGTCTC GCCCACACCT GCTGCCTCTC CCGCCAACAA CTCTGCCCCC
301 GCACCCAACG TTGCCGGCAA CGGCGCCAAC GGCGCCAAGT GCAACCTCGA TGCCGTCATG
361 AAGGCCAAGG GTAAGAAGTA CCTTGGTGTC GCCACCGACC AAGGCCTCCT CACCCGCGAC
421 AAGAACGCCG ACATCGTCAA GGCCAACTTT GGTTGCGTCA CCCCTGAGAA CAGCATGAAG
481 TGGGATGCCA CCGAAGGCAC CCAGGGCCAA TTCACCCTTT CCGGTGCCAA CTACCTCGTC
541 GACTTTGCTA CCAAGAATGA CAAGCTGGTC CGTGGCCACA CCACCGTCTG GCACTCGCAA
601 CTCCCTACCT GGGTCTCCTC CATCACCGAC AAGACCAAGC TCACCGAGGT CATGGTCGCC
661 CATATCAAGA AGCTCATGAC CACCTACGCC GGCAAGGTCT ACGCCTGGGA CGTAGTCAAC
721 GAGATCTTCG CCGAAGAAGG CGGTTTCCGC TCCTCAGTCT TCTACAATGT TCTCGGCGAA
781 GACTTTGTCG CTACCGCCTT CGCAGCTGCC AAAGCCGCCG ACCCAGAGGC TAAACTCTAC
841 ATCAACGACT ACAACCTTGA CAGCCCCAGC TACGCAAAGA CAAAGGCCAT GGCATCCCAC
901 GTCAAGAAGT GGATCGCCGC TGGTGTTCCC ATCGACGGCA TCGGCTCCCA GTCCCATCTT
961 TCTGGCGTCT GGCCCATGTC TGATGTTCCT GCTGCTATGG AGCTTCTCTG CGGTTCCGCC
1021 CCCGAATGCG CAATGACTGA GCTCGACATC AAGGGTGGAG CGGCAAAGGA CTACAAGACT
1081 GCCTTTGACG CTTGCCTGAA CCAGAAGAAC TGTGTCGGCG TTACCATTTG GGGTGTTAGC
1141 GACAAGACCT CATGGATTGG CGCTGCTGCT ACCCCGTTGT TGTTCGATAA TAGCTTCCAG
1201 GCTAAGCCTG CTTACAACGA GCTTTGCTCG GCGCTTGCTT AA
Claims (1)
1.Pgr03723基因在降低麦类核腔菌致病性中的应用，其特征在于所述Pgr03723的全长序列如SEQ ID NO：1所示；采用干扰Pgr03723基因表达实现所述降低麦类核腔菌致病性的应用。
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