CN110923247A - 大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用 - Google Patents
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Abstract
大麦条纹病（Barley leaf stripe）是大麦的主要病害之一，在大麦种植区普遍发生，严重影响到大麦的经济和营养价值。本发明获得了一种大麦条纹病（麦类核腔菌Pyrenophora graminea）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，通过RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因参与调控菌株生长分化，增强盐、干旱和重金属Cu2+胁迫耐受性，降低细胞壁强度，加强抑真菌剂（异菌脲和咪鲜胺）敏感性，调控毒性和致病性中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及大麦条纹病菌致病性基因Pgmiox的生物信息学分析及其调控菌丝生长速率；增强盐胁迫（0.8mol/L NaCl）、干旱胁迫（15% PEG）、和重金属胁迫（0.05mmol/L CuSO4·5H2O）耐受性；降低细胞壁强度；加强抑真菌剂（异菌脲和咪鲜胺）敏感性，该基因还有可能为抑真菌剂（戊唑醇和苯并咪唑）的靶位点；以及沉默该基因降低大麦条纹病（麦类核腔菌）的毒性和致病性的应用。
背景技术
大麦条纹病（Barley leaf stripe）是大麦的主要病害之一，在大麦种植区普遍发生。近年来，由于耕作制度的变化以及多年的连茬种植，该病害发生日趋严重，研究该病病原菌的致病机制就显得尤为重要。现已得知，该病是由种子带菌引起的系统侵染性真菌病害，其病原菌的无性阶段Drechslera graminea ( Rabenh & Schlecht) Schoemaker为禾内脐蠕孢，半知菌亚门、内脐蠕孢属，有性阶段Pyrenophora graminea为麦类核腔菌，子囊菌亚门、核腔菌属。
R.W.Medd等通过大量研究发现，大麦条纹病菌侵染植株的发病情况与是否产生植物毒素有关。A.HAEGI等研究该病原菌毒素成分得出，其中一类葡萄糖醛酸（D-Glucuronate）物质被抑制时，毒素危害能力明显降低。实验室前期分离甘肃大麦产区不同地区的条纹病病原菌，鉴定其致病力，筛选得到强致病力菌株QWC，并运用Illumina Hiseq2000平台对其进行全基因组测序。经KEGG和PHI基因功能注释得到与葡萄糖醛酸相关的两条通路，分别是抗坏血酸醛酸代谢途径（ascorbate and aldarate metabolism）和戊糖葡糖醛酸转化途径（pentose and glucuronate interconversions），并在此化合物上游分别注释出一个基因。
本研究运用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术研究抗坏血酸醛酸代谢途径上注释的基因Pgmiox，构建Pgmiox的干扰载体，通过PEG介导方法转化QWC菌株，并对干扰突变菌株和野生菌株的生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面进行分析，明确Pgmiox在大麦条纹病菌中致病性的功能机制，以期为大麦条纹病菌的致病机理和调控机理奠定基础，同时也为设计新型杀真菌剂筛选候选靶标基因。
现有技术存在的问题：现有技术中未见大麦条纹病（麦类核腔菌）Pgmiox基因及RNA干扰该基因应用的报道。
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，运用RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，该基因全长序列如SEQ ID NO：1所示，具体步骤如下：
1、大麦条纹病菌株的培养
制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成0.5-2cm2的小方块，称取重量200g，加1L蒸馏水煮沸20-30min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和15-17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5-10mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长3-7d。
2、Pgmiox基因的克隆
以QWC基因组DNA和cDNA为模板，使用引物miox-F1/ miox-R1（附图1）通过PCR扩增获得Pgmiox基因的DNA和cDNA序列，PCR产物经切胶、胶回收、连接载体pMD19-T Vector：pMD19-TVector（Simple） 1μL、目的片段 4μL、SolutionⅠ 5μL，缓慢混匀，轻离心3-10sec，16℃水浴连接12-16h、转化DH5α感受态细胞：制备含有100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LBA固体培养基平板，将80μL X-gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出-80℃保存的DH5α感受态细胞，冰上溶解，每50μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1-2h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于37℃培养箱中黑暗培养12-16h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
3、Pgmiox基因序列及生物信息学分析
测序结果表明Pgmiox基因的ORF框全长981bp，且DNA序列与cDNA序列一致，得出该基因没有内含子（附图2A）。利用网络在线SMART工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对Pgmiox进行蛋白结构域分析，该基因有一个Pfam域miox结构域（Myo-inositol oxygenase；78AA~326AA）（附图2B）。运用网络在线GOR4工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin ...page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α-螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici-repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor-jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici-repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
Pgmiox基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用，包括如下步骤：
1、干扰载体pSilent-1miox的构建
以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1-F1/miox1-R1和miox2-F1/miox2-R1（附图1）分别扩增获得片段miox1（334bp）和miox2（334bp）。用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent-1的XhoI-HindⅢ位点。然后将片段miox2和pSilent-1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent-1miox1的ApaⅠ-StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent-1miox（附图3）。
2、遗传转化与筛选
将QWC菌株置于酶解液（1%溶壁酶（Lywallzyme）+0.5%蜗牛酶（Snailase），以0.7mol/LNaCl稳渗剂配制）30℃温育4-6h，过滤未酶解菌丝，制备出原生质体，置于STC缓冲液（0.7mol/L蔗糖，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl（pH=7.5））中保存。通过PEG4000介导进行转化：取100-200μL STC重悬沉淀与5-10μg pSilent-1miox的质粒DNA混合，冰浴20min，加入100μL PTC（60% PEG4000，溶解在STC缓冲液中）混匀，冰浴20min，再逐滴加入800μL PTC，室温静置15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在15-20mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10-15mL含有70-90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有90-100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG-1/HYG-2（附图1）进行PCR鉴定筛选（附图4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
3、突变菌株生长分化的鉴定
将6个干扰菌株分别接种以下5种培养基中：基本培养基（MM）：NaNO3 6g、KCl 0.52g、MgSO4 0.152g、KH2PO4 1.52g、VB1 0.01g、微量元素1mL（母液：H3BO3 0.570g、MnCl2·4H2O0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，15-17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：V8果汁100mL、CaCO3 0.2g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：新鲜马铃薯200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，15-17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；△miox32：0.80，0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；△miox35：0.72，0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；△miox44：0.60，0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
4、突变菌株不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性和抑真菌剂敏感性的鉴定
将6个干扰菌株和QWC菌株分别接种在添加15% PEG、0.01mol/L H2O2、0.8mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养7d后，按照十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长速率V=T/P×100%,（T是在处理培养基上,野生株QWC和干扰株菌落的直径，P是在对照PDA培养基上菌落生长的直径），每个菌株处理重3皿（附图7）。如附图8A所示，在H2O2胁迫下，干扰株与QWC生长速率无显著差异。山梨醇胁迫下，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的径向生长速度分别是1.06，0.90，0.89，0.87，0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
5、突变菌株毒性和致病性的鉴定
将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基（9g蔗糖、5g酒石酸铵、1g NH4NO3、1gK2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.13g CaCl2·2H2O、0.1g NaCl、18.3mg FeSO4·7H2O、3.5mgZnSO4·7H2O、2mg MnCl2·4H2O）中，25-30℃黑暗培养18-25d后，过滤，得到粗毒素液体（附图9A），取20μl注射接种到离体大麦（两叶期）叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下，2-3d后观察发病状况，如附图9B所示，注射QWC菌株毒素的叶片完全发病，呈深褐色，叶片尖端发黄，注射干扰菌株毒素的叶片明显发病减弱，叶片呈绿色，仅注射部位呈褐色。
将含菌丝的琼脂块（直径：d=0.50cm）接种到离体大麦（两叶期）叶片上，将接种的大麦叶片置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，2-3d后观察叶片的病斑发生状况。如附图10C所示，菌株侵染离体大麦叶片，野生株QWC菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。采用“夹心法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染18-25d，盆栽播种14-20d后计算观察发病率及发病状况，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的发病率分别为：63.05%，40.99%，41.20%，43.12%，41.21%，39.87%和41.56%（附图10A），6个干扰菌株的发病率与对照比较显著降低。如附图10B所示，大麦叶片明显萎缩，发病较为严重，干扰株处理的叶片发病较弱。综上所述，大麦条纹病菌菌株Pgmiox基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。
附图说明
图1为本发明所用引物序列。
图2为Pgmiox基因生物信息学分析图。
其中A为Pgmiox基因全长DNA（1）和cDNA（2）扩增结果图，B为Pgmiox基因的功能域图，C为Pgmiox基因的蛋白二级结构预测图，D为Pgmiox基因系统发育分析图。
图3为Pgmiox基因干扰载体示意图。
图4为干扰株的PCR验证。1泳道为阴性对照野生菌株QWC，2泳道为阳性对照干扰载体pSilent-1miox。3-8号泳道分别为：△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54，6个干扰突变菌株均含有潮霉素片段。
图5为干扰株和野生株在5种营养培养基的生长形态。
图6为干扰株和野生株在5种营养培养基的生长曲线。
图7为干扰株和野生株在不同环境胁迫、细胞壁抑制剂和抑真菌剂培养基的生长形态。
其中A为0.01mol/L H2O2和1mol/L山梨醇胁迫，B为0.8mol/L NaCl、15% PEG和0.5mmol/L CuSO4·5H2O胁迫，C为0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS和0.2mg/mL CFW胁迫，D为0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
图8为干扰株和野生株在不同环境胁迫、细胞壁抑制剂和抑真菌剂培养基的生长速率图。
其中A为0.01mol/L H2O2和1mol/L山梨醇胁迫，B为0.8mol/L NaCl、15% PEG和0.5mmol/L CuSO4·5H2O胁迫，C为0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS和0.2mg/mL CFW胁迫，D为0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
图9为毒素试验图
其中A图为菌株粗毒素提取图，B图为菌株粗毒素注射大麦叶片图（标尺为1cm）
图10为致病性试验图
其中A图为菌株发病率图，B图为盆栽大麦叶片致病性图，C图为离体大麦叶片致病性图（标尺为1cm）。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供一种大麦条纹病致病性基因Pgmiox，该基因全长序列如序列表1所示。
实施例2
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因Pgmiox基因克隆及其RNA干扰转化子获得的方法，包括如下步骤：
1、Pgmiox基因的克隆及其生物信息学分析分析
制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成1cm2的小方块，称取重量200g，加1L蒸馏水煮沸20min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长7d。
以QWC基因组DNA和cDNA为模板，使用引物miox-F1/ miox-R1（附图1）通过PCR扩增获得Pgmiox基因的DNA和cDNA序列，PCR产物经切胶、胶回收、连接载体pMD19-T Vector：pMD19-T Vector（Simple） 1μL、目的片段 4μL、SolutionⅠ 5μL，缓慢混匀，轻离心5sec，16℃水浴连接14h、转化DH5α感受态细胞：制备含有100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LBA固体培养基平板，将80μL X-gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出-80℃保存的DH5α感受态细胞，冰上溶解，每50μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1.5h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于37℃培养箱中黑暗培养13h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
测序结果表明Pgmiox基因的ORF框全长981bp，且DNA序列与cDNA序列一致，得出该基因没有内含子（附图2A）。利用网络在线SMART工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对Pgmiox进行蛋白结构域分析，该基因有一个Pfam域miox结构域（Myo-inositol oxygenase；78AA~326AA）（附图2B）。运用网络在线GOR4工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin ... page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α-螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici-repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor-jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici-repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
2、干扰载体pSilent-1miox的构建
以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1-F1/miox1-R1和miox2-F1/miox2-R1（附图1）分别扩增获得片段miox1（334bp）和miox2（334bp）。用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent-1的XhoI-HindⅢ位点。然后将片段miox2和pSilent-1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent-1miox1的ApaⅠ-StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent-1miox（附图3）。
3、遗传转化与筛选
将QWC菌株置于酶解液（1%溶壁酶（Lywallzyme）+0.5%蜗牛酶（Snailase），以0.7mol/LNaCl稳渗剂配制）30℃温育4h，过滤未酶解菌丝，制备出原生质体，置于STC缓冲液（0.7mol/L蔗糖，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl（pH=7.5））中保存。通过PEG4000介导进行转化：取100μL STC重悬沉淀与10μg pSilent-1miox的质粒DNA混合，冰浴20min，加入100μLPTC（60% PEG4000，溶解在STC缓冲液中）混匀，冰浴20min，再逐滴加入800μL PTC，室温静置15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在15mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10mL含有90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG-1/HYG-2（附图1）进行PCR鉴定筛选（附图4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
实施例3
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因Pgmiox的应用，包括如下步骤：
1、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌毒性和致病性方面应用
将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基（9g蔗糖、5g酒石酸铵、1g NH4NO3、1gK2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.13g CaCl2·2H2O、0.1g NaCl、18.3mg FeSO4·7H2O、3.5mgZnSO4·7H2O、2mg MnCl2·4H2O）中，25℃黑暗培养20d后，过滤，得到粗毒素液体，空白诱导培养基为对照CK，6个干扰菌株的颜色明显比QWC淡，野生株粗毒素液体呈现深褐色，干扰株液体呈淡黄色（附图9A）。取20μl注射接种到离体大麦（两叶期）叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下，3d后观察发病状况，如附图9B所示，注射QWC菌株毒素的叶片完全发病，呈深褐色，叶片尖端发黄，注射干扰菌株毒素的叶片明显发病减弱，叶片呈绿色，仅注射部位呈褐色。
将含菌丝的琼脂块（直径：d=0.50cm）接种到离体大麦（两叶期）叶片上，将接种的大麦叶片置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，3d后观察叶片的病斑发生状况。如附图10C所示，菌株侵染离体大麦叶片，野生株QWC菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。采用“夹心法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种20d后计算观察发病率及发病状况，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的发病率分别为：63.05%，40.99%，41.20%，43.12%，41.21%，39.87%和41.56%（附图10A），6个干扰菌株的发病率与对照比较显著降低。如附图10B所示，大麦叶片明显萎缩，发病较为严重，干扰株处理的叶片发病较弱。综上所述，大麦条纹病菌菌株Pgmiox基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。
2、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌生长分化方面应用
将6个干扰菌株分别接种以下5种培养基中：基本培养基（MM）：NaNO3 6g、KCl 0.52g、MgSO4 0.152g、KH2PO4 1.52g、VB1 0.01g、微量元素1mL（母液：H3BO3 0.570g、MnCl2·4H2O0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：V8果汁100mL、CaCO3 0.2g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：新鲜马铃薯200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；△miox32：0.80，0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；△miox35：0.72，0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；△miox44：0.60，0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
3、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌在不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性和抑真菌剂敏感性方面应用
将6个干扰菌株和QWC菌株分别接种在添加15% PEG、0.01mol/L H2O2、0.8mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养7d后，按照十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长速率V=T/P×100%,（T是在处理培养基上,野生株QWC和干扰株菌落的直径，P是在对照PDA培养基上菌落生长的直径），每个菌株处理重3皿（附图7）。如附图8A所示，在H2O2胁迫下，干扰株与QWC生长速率无显著差异。山梨醇胁迫下，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的径向生长速度分别是1.06，0.90，0.89，0.87，0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
综上所述：Pgmiox具有促进菌丝生长分化，增强盐、干旱和重金属Cu2+胁迫耐受性，加强抑真菌剂（异菌脲和咪鲜胺）敏感性，调控菌株毒性和致病性的功能。沉默该基因具有降低大麦条纹病（麦类核腔菌）的毒性和致病性的应用，敲除Pgmiox使抑真菌剂（戊唑醇和苯并咪唑）失去靶位点，在灭真菌剂方面具有应用。
有益效果：本发明提供了一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，通过RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 大麦条纹病菌-麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)
<400> 1
atggcacccg gcgccatctt cgagacgccc aacgtggctg aagacttcaa caatcaccgc 60
gatggccttg ctcttgaggc tacctcagat gccatcgacg acgtcaacgt gctcaaggca 120
gccttgaaag tcaaaaacgg cactgcaagc caaaaagaaa aggacatcta cgagcagtca 180
cagttcgatg ccgaaaaaga caagacacag ttccgccaat acgaagaagc atgcgaccgc 240
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ctcaacacat taatcgatga atcagaccca gacacctcac tctcccaaat cgagcacctc 420
ctccaatctg ctgaggctat tcgtcgtgac ggaaagccac gctggtttca actcgtcgga 480
ctcattcacg atcttggcaa actactcttc ttcttcgacg catgcggtca atgggacgtc 540
gtcggcgaca cattccccgt aggctgtgcc tactccccca agatcatcta cccggataca 600
ttcaaaaaca acccagacta caacgacgac atctatagca ccgagcacgg catctacacg 660
cccggatgcg gcatggacaa tgtcatgcta agctggggtc atgacgaata cctatatcac 720
atcatgaagg atcaatcaag aatccctgaa gaaggattag ctatgatcag gtatcactcc 780
ttctaccctt ggcacactgg tggtgcgtac aagtggatga tgaacgacaa ggacgtgcgc 840
atgttggacg cagtcagggc cttcaacccg tacgatctgt acagcaagag tgatgaggta 900
ccaaaggtcg aggacctgaa agagtactac atggacatta ttgacgagtt cattggtaaa 960
gacaagaagc tcaagtggtg a 981
Claims (7)
1.大麦条纹病致病性基因Pgmiox，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
2.大麦条纹病致病性基因Pgmiox获取方法，包括：（1）大麦条纹病菌株的培养；（2）Pgmiox基因的克隆；（3）Pgmiox基因序列及生物信息学分析。
3.根据权利要求2所述的大麦条纹病致病性基因Pgmiox获取方法，其特征在于，所述步骤（1）大麦条纹病菌株的培养包括制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成0.5-2cm2的小方块，称取重量200g，加1L蒸馏水煮沸20-30min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和15-17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5-10mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长3-7d；所述步骤（2）Pgmiox基因的克隆包括以QWC基因组DNA和cDNA为模板，通过PCR扩增获得Pgmiox基因的DNA和cDNA序列，PCR产物经切胶、胶回收、连接载体pMD19-T Vector：pMD19-T Vector 1μL、目的片段4μL、Solution Ⅰ 5μL，缓慢混匀，轻离心3-10sec，16℃水浴连接12-16h、转化DH5α感受态细胞、蓝白斑筛选及鉴定后测序；所述步骤（3）Pgmiox基因序列及生物信息学分析包括Pgmiox基因的DNA序列与cDNA序列一致，得出该基因没有内含子，利用网络在线SMART工具对Pgmiox进行蛋白结构域分析，运用网络在线GOR4工具对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，用BLAST程序分析蛋白相似性，利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法构建系统进化树。
4.权利要求1所述的大麦条纹病致病性基因Pgmiox在调控菌株生长分化中的应用，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
5.权利要求1所述的大麦条纹病致病性基因Pgmiox在增强盐、干旱和重金属Cu2+胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
6.权利要求1所述的大麦条纹病致病性基因Pgmiox在降低细胞壁强度，加强抑真菌剂敏感性，调控毒性和致病性中的应用，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
7.根据权利要求4、5和6中任何一项所述的Pgmiox基因的应用，其特征在于，所述应用的验证方法包括如下步骤：步骤（1）干扰载体pSilent-1miox的构建包括以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1-F1/miox1-R1和miox2-F1/miox2-R1分别扩增获得片段miox1和miox2，用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent-1的XhoI-HindⅢ位点，然后将片段miox2和pSilent-1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent-1miox1的ApaⅠ-StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent-1miox；
（2）遗传转化与筛选包括用酶解液制备出QWC菌株的原生质体，通过PEG4000介导转化，获得转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG-1/HYG-2进行PCR鉴定筛选，随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株进行荧光定量PCR分析干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、90.56%、90.75%和88.03%；
（3）突变菌株生长分化的鉴定包括将6个干扰菌株分别接种以下5种培养基中：基本培养基：NaNO3 6g、KCl 0.52g、MgSO4 0.152g、KH2PO4 1.52g、VB1 0.01g、微量元素1mL、葡萄糖10g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基：NaNO3 1.8g、葡萄糖10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，15-17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基：V8果汁100mL、CaCO3 0.2g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基：新鲜马铃薯200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，15-17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L，以野生菌株QWC为对照，每个菌株设置3次重复；
（4）突变菌株不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性和抑真菌剂敏感性的鉴定包括将6个干扰菌株和QWC菌株分别接种在添加15% PEG、0.01mol/L H2O2、0.8mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，每个菌株设置3次重复；
（5）突变菌株毒性和致病性的鉴定包括将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基中，25-30℃黑暗培养18-25d后，过滤，得到粗毒素液体，取20μl注射接种到离体大麦叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，2-3d后观察发病状况，将含菌丝的琼脂块种到离体大麦叶片上，将接种的大麦叶片置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，2-3d后观察叶片的病斑发生状况，采用“夹心法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种20d后计算观察发病率及发病状况。
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