CN116837024B - 一种利用农杆菌瞬时转化菰米种子进行基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种利用农杆菌瞬时转化菰米种子进行基因表达的方法，菰米种子愈伤组织诱导培养、继代培养后，挑选结构致密的愈伤组织进行预培养；将带有GFP基因的1305Ubi‑Ubi‑GFP‑H质粒转化至EHA105农杆菌或LBA4404农杆菌中，获取阳性农杆菌，培养至菌液在600nm波长下的OD值为0.02～0.5，获得侵染菌液，侵染预培养的愈伤组织，进行共培养与恢复培养，然后将其置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，计算其瞬时表达率。本发明通过含有GFP基因的农杆菌瞬时转化菰米种子，提高菰米瞬时转化效率，并在菰米中实现了外源基因表达和可视化观察，为后续更好地开展菰米功能基因研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用农杆菌瞬时转化菰米种子进行基因表达的方法。
背景技术
菰米是中国菰的颖果，是一种有着悠久历史的特色作物。菰米是一种重要的药食同源谷物，明代李时珍《本草纲目》等著作有将菰米用于辅助治疗消渴症(糖尿病)和胃肠疾病的记载。近年来，菰属植物营养成分的研究主要集中在其种子菰米中，菰米不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，而且含有抗性淀粉、膳食纤维、植物甾醇、花青素和原花青素等生物活性物质。与大米相比，菰米是一种高蛋白、低脂的健康食品，其生物活性和保健作用已被中国和韩国等东亚科学家广泛关注。菰米已经证实的生物活性和保健价值包括抗氧化活性、改善胰岛素抵抗、改善脂质毒性以及预防心血管疾病等。但是，中国菰自身也有一些局限性，比如菰米种子易落粒、株高过高、花期不集中、结实率低等，导致其不适用于大规模生产应用。
瞬时表达技术是指将目的基因导入受体细胞中以建立暂时性的高效表达体系，从而在相对较短的时间内使得目的基因大量表达的技术。由于瞬时表达不需要将外源基因整合到细胞的染色体上，并且不需要通过筛选，也不产生可稳定遗传的后代，故与稳定表达相比，瞬时表达具有简单、快速、周期短、效率高、生物安全性强等特点。发明人及其团队利用瞬时表达技术的优点，建立菰米的瞬时转化体系，不仅可以提高菰米的转化效率，而且为后续更好地开展菰米功能基因研究奠定技术基础。
发明人团队首先建立了一种菰米愈伤组织再生植株的方法(中国发明专利CN112753580A)，所用的外植体(菰米种子)取材方便，保存的菰米种子可以随时取用，不受季节限制，使用改良的基本培养基和优化的培养条件，仅用3个月即可得到健壮的再生植株。随后，在针对菰米功能基因研究的过程中，提出一种菰米遗传转化体系建立的方法(中国发明专利CN113637701A)，在第一个菰米专利的基础上，一方面通过优化菰米胚性愈伤的培养条件和培养方式以及优化愈伤再生的培养基，极大程度地提高菰米愈伤的再生效率，为农杆菌侵染提供优质的胚性愈伤受体材料，为转化奠定坚实的基础；另一方面通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，得到转化阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的菰米遗传转化体系。但是，上述菰米遗传转化体系建立的方法中，菰米遗传转化效率较低，基于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种利用农杆菌瞬时转化菰米种子进行基因表达的方法，利用菰米种子将含有绿色荧光蛋白(GFP)质粒的农杆菌瞬时转化菰米种子，优化了用于侵染的合适菌种、菌液浓度和共培养时间，提高了菰米瞬时转化效率，并在菰米中实现了外源基因表达和可视化观察，为后续更好地开展菰米功能基因研究奠定了技术基础。
本发明的技术方案是：
一种利用农杆菌瞬时转化菰米种子进行基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将消毒处理后的菰米种子接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养，然后进行继代培养，挑选结构致密的愈伤组织进行预培养；
(2)将带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的1305Ubi-Ubi-GFP-H质粒转化至EHA105或LBA4404农杆菌菌株中，28℃培养2d后挑取单克隆，经PCR反应、电泳检测获取阳性农杆菌；将阳性农杆菌转入YEB液体培养基中培养，将得到的菌液离心收集菌体，使用侵染缓冲液进行重悬，至菌液在600nm波长下的OD值为0.02～0.5，获得侵染菌液；
(3)利用侵染菌液侵染预培养的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织接种于共培养基中进行共培养，温度22±2℃暗培养2～4d；然后将经共培养的愈伤组织转接于恢复培养基中，温度28℃±2℃黑暗培养3d；将恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，若愈伤组织在紫外光下出现绿色荧光，则表明外源目的基因在菰米愈伤组织中成功表达，计算其瞬时表达率。
其中，GFP瞬时表达率的计算公式为：GFP瞬时表达率(％)＝GFP阳性愈伤组织粒数/侵染愈伤组织粒数×100％。
上述侵染后的愈伤组织接种于共培养基中进行共培养的时间为2～4d，例如可以是2d、2.5d、3d、3.5d或4d等，但不限于所列举的数值，该范围内其他未列举的数值同样适用。
上述菌液在600nm波长下的OD值为0.02～0.5，例如可以是0.02、0.05、0.1、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5等，但不限于所列举的数值，该范围内其他未列举的数值同样适用。
进一步的，所述农杆菌菌株为EHA105或LBA4404农杆菌菌株中的任一种，共培养时间为3d，菌液在600nm波长下的OD值为0.2。
进一步的，所述农杆菌菌株为EHA105或LBA4404农杆菌菌株中的任一种，共培养时间为2d，菌液在600nm波长下的OD值为0.2。
进一步的，所述步骤(1)中，外植体的消毒：选取合适菰米种子，将菰米种子用75％乙醇浸泡30～60s，用20％次氯酸钠浸泡20min，灭菌水清洗5～7次，直至澄清，浸泡过夜。
诱导培养：将消毒处理后的菰米种子用解剖刀在显微镜下把胚部切下，将其接种于诱导培养基中萌发，进行愈伤组织的诱导培养，诱导培养的条件为：暗培养，温度28±2℃，培养4～5周后，得到胚性愈伤组织。
继代培养：除去幼胚萌发出的幼芽和玻璃化愈伤组织，选择淡黄色、结构致密的愈伤组织继续在诱导培养基上继代培养，继代培养条件为：暗培养，温度28±2℃；挑选呈现致密的愈伤组织进行7～9d的预培养，培养条件为：暗培养，温度28±2℃。
进一步的，所述步骤(1)中，诱导培养基的配方为：每升培养基含MS盐4.43g；2mg/mL2,4-D 1mL；水解酪蛋白0.5g；蔗糖30g；肌醇0.1g；植物凝胶3g；pH为5.7。
上述步骤(2)中，将带有外源目的基因的质粒转化至农杆菌感受态细胞，农杆菌感受态细胞为EHA105农杆菌菌株，质粒为含有绿色荧光蛋白(GFP)的1305Ubi-Ubi-GFP-H植物表达载体，于28℃恒温培养箱培养，挑取单克隆；获取阳性农杆菌。
进一步的，所述步骤(2)中，YEB液体培养基中添加50mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平。将阳性农杆菌单克隆转入YEB液体培养基中，并于摇床中过夜培养，将摇好的菌液进行常温离心，离心条件为1000～2000rpm、5min，离心后倒掉上清液、收集菌体，使用侵染缓冲液进行重悬。
进一步的，所述步骤(2)中，侵染缓冲液每升包括N6(含微量元素)4g、200μM/mL乙酰丁香酮1mL、10mg/mL 2,4-D 200μL、水解酪蛋白1g；蔗糖30g；肌醇0.1g；葡萄糖10g。
进一步的，所述步骤(3)中，将经过预培养的愈伤组织浸泡于侵染菌液中进行侵染20min，侵染后的愈伤组织在共培养基上共培养3d。
进一步的，所述步骤(3)中，共培养基的配方为：每升培养基含N6(含微量元素)4g、200μM/mL乙酰丁香酮1mL、10mg/mL 2,4-D 200μL、水解酪蛋白1g；蔗糖30g；肌醇0.1g；葡萄糖10g；植物凝胶3g；pH为5.7。
进一步的，所述步骤(3)中，恢复培养基的配方为：每升培养基含MS盐4.43g；水解酪蛋白0.5g；2mg/mL 2,4-D 2mL；1mg/mL 6-BA 100μL；200mg/mL特美汀2mL；肌醇0.1g；蔗糖30g；植物凝胶3g，pH为5.7。
上述步骤(3)中，共培养结束后，进行愈伤组织的恢复培养与绿色荧光蛋白(GFP)观察：将经共培养的愈伤组织均匀且稀疏地转接于恢复培养基中，温度28℃±2℃黑暗培养3d；将恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况。
本发明的有益效果：
本发明通过含有绿色荧光蛋白(GFP)质粒的农杆菌瞬时转化菰米种子，并优化农杆菌菌株、菌液浓度和共培养时间来提高菰米的瞬时转化效率，在菰米中实现外源基因表达和可视化观察，为后续更好地开展菰米功能基因研究奠定了技术基础。
根据转入1305Ubi-Ubi-GFP-H的菰米愈伤组织在紫外光的激发下会发绿色荧光的现象，本发明采用体式荧光显微镜观察菰米瞬时转化愈伤组织绿色荧光来鉴定外源目的基因在菰米愈伤组织中的成功表达，该鉴定方法操作简单、快速且效率高。
附图说明
图1为诱导愈伤组织的过程图，其中，A为选取的菰米种子的样品形态图；B为将消毒处理的菰米种子接种于诱导培养基上进行愈伤诱导；C为菰米初级愈伤组织；D为菰米胚性愈伤组织。
图2为1305Ubi-Ubi-GFP-H质粒载体的物理图谱。
图3为EHA105阳性农杆菌菌液在600nm波长下的OD值(0.02、0.05、0.1、0.2、0.5)和不同共培养时间(2d、3d、4d)对愈伤组织瞬时表达率的比较分析图。
图4为在体式荧光显微镜下观察共培养2d、3d、4d时愈伤组织荧光瞬时表达量的图片，其中，A为在紫外光下共培养2d时愈伤组织荧光表达量；B为在白光下共培养2d时愈伤组织状态图；C为在紫外光下共培养3d时愈伤组织荧光表达量；D为在白光下共培养3d时愈伤组织状态图；E为在紫外光下共培养4d时愈伤组织荧光表达量；F为在白光下共培养4d时愈伤组织状态图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例采用的生物材料菰米种子采集于江苏省淮安市金湖县白马湖村。
实施例1
本实施例提供了一种利用农杆菌瞬时转化菰米种子进行基因表达的方法，包括以下步骤：
外植体的消毒：
去除菰米种子的颖壳，选择干净饱满、大小一致、表面光滑、无霉点、无斑点的种子(见图1A)，表面用75％酒精檫拭干净后再用75％乙醇浸泡30～60s，之后用无菌水冲洗2次，弃废液；用20％次氯酸钠浸泡20min，期间置于回旋式振荡器，转速130r/次，使种子与消毒剂充分地接触，倒掉废液后用灭菌水清洗5～7次，加灭菌水再于回旋式振荡器以转速130r/次震荡3h后，用灭菌水清洗3～5次，直至澄清，浸泡过夜。
诱导培养：
将消毒处理的菰米种子用解剖刀在显微镜下把胚部切下，将其接种于浓度为2mg/L的2,4-D，pH 5.7诱导培养基MS上(见图1B)，培养条件为温度28±2℃、暗培养，4～5周可获得愈伤组织(见图1C)。
继代培养：
除去幼胚萌发出的幼芽和玻璃化愈伤组织，选择淡黄色、结构致密的愈伤组织继续在诱导培养基上继代培养，培养条件为温度28±2℃、暗培养。农杆菌共培养前挑选呈现致密的愈伤组织置于继代培养基上进行7～9d的预培养(见图1D)。
阳性农杆菌的获取：
将1305Ubi-Ubi-GFP-H质粒(见图2)转化至EHA105农杆菌中，随后挑取单克隆，经PCR反应、电泳检测获取阳性农杆菌。
阳性农杆菌菌液的制备：
挑取阳性单克隆菌落至带有50mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB液体培养基(1g/L的酵母提取物、5g/L的蛋白胨、5g/L的牛肉浸膏、0.493g/L的MgSO4.7H2O和pH＝7.0)，并于摇床(28℃、200rpm)中过夜培养，将摇好的菌液进行1500rpm、5min常温离心，倒掉上清，收集菌体；使用侵染缓冲液进行重悬，每升侵染缓冲液具体包括N6(含微量元素)4g、200μM/mL乙酰丁香酮1mL、10mg/mL 2,4-D 200μL、水解酪蛋白1g；蔗糖30g；肌醇0.1g；葡萄糖10g；使其菌液在600nm波长下的OD值为0.2，获得侵染菌液，随后室温下静置0.5～1h。
农杆菌菌液的侵染：
将预培养7～9d的状态良好的、分裂旺盛的小颗粒愈伤组织用小勺收集至50mL的无菌离心管中，用侵染菌液侵染愈伤组织20min，期间不时轻轻晃动。
愈伤组织的共培养：
倒掉侵染菌液，将侵染后的愈伤组织倒于已添加一张滤纸和两张吸水纸的90×25mm的一次性培养皿中，轻轻摇晃培养皿，吸干愈伤组织表面残留菌液后，将小颗粒愈伤组织接种于共培养基中进行3d的共培养，培养条件为：温度22±2℃，暗培养。
愈伤组织的恢复培养与绿色荧光蛋白(GFP)观察：
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀且稀疏地转接于恢复培养基中，温度28℃±2℃黑暗培养3d；将恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，若愈伤组织在紫外光下出现绿色荧光，则表明外源目的基因在菰米愈伤组织中成功表达，计算其瞬时表达率，得到GFP瞬时表达率为84％。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，菌液与愈伤组织的共培养时间为2d；
结果：将恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，通过绿色荧光显示，证明外源目的基因在菰米愈伤组织中成功表达，计算得到其GFP瞬时表达率为83％。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于，采用LBA4404农杆菌菌株；
结果：将恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，通过绿色荧光显示，证明外源目的基因在菰米愈伤组织中成功表达，计算得到其GFP瞬时表达率为83％。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于，采用LBA4404农杆菌菌株，并且其菌液与愈伤组织的共培养时间为2d；
结果：将恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，通过绿色荧光显示，证明外源目的基因在菰米愈伤组织中成功表达，计算得到其GFP瞬时表达率为82％。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于，菌液在600nm波长下的OD值为0.02，并且菌液与愈伤组织共培养时间为4d；
结果：将恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，通过绿色荧光显示，证明外源目的基因在菰米愈伤组织中成功表达，计算得到其GFP瞬时表达率为82％。
试验例1
试验步骤：分别制备不同的EHA105阳性农杆菌菌液浓度，菌液在600nm波长下的OD值为：0.02、0.05、0.1、0.2、0.5，每一种浓度(OD值)的菌液侵染后的愈伤组织，分别在三个不同的共培养时间(2d、3d、4d)下进行共培养；得到如图3所示的结果：
对比EHA105农杆菌菌液的菌液浓度(0.02、0.05、0.1、0.2、0.5)和不同共培养时间(2d、3d、4d)对愈伤组织瞬时表达率的影响，结果发现，不同菌液侵染浓度和不同共培养时间均表现出显著性差异。共培养2d和3d时，随菌液浓度的增加，GFP瞬时表达率整体呈现出先增加后减小的趋势；共培养4d时，GFP瞬时表达率整体呈现出不断减小的趋势。其中，共培养3d时，菌液在600nm波长下的OD值为0.2时，GFP瞬时表达率最高，为84％；共培养2d时，菌液在600nm波长下的OD值为0.2时，GFP瞬时表达率最高，为83％；共培养4d时，菌液在600nm波长下的OD值为0.02时，GFP瞬时表达率最高，为82％。
共培养3～4d时，当菌液浓度不断增加时，GFP瞬时表达率也随着发生变化，但总体来看，GFP瞬时表达率都超过60％，瞬时表达率较高。
试验例2
将共培养2d、3d与4d获得的恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，如图4所示，通过体式荧光显微镜下观察通过共培养2d(图4A、4B)、3d(图4C、4D)、4d(图4E、4F)的愈伤组织，发现不同共培养天数对荧光表达量有显著差异，共培养2d后得到的愈伤组织几乎无GFP点数，而随着共培养天数增加，共培养3d和4d后，GFP点数逐渐增多，绿色荧光明显。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种利用农杆菌瞬时转化菰米种子进行基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将消毒处理后的菰米种子胚部接种于诱导培养基中萌发，进行愈伤组织的诱导培养，诱导培养的条件为：暗培养，温度28±2℃，培养4~5周后，得到胚性愈伤组织；选择淡黄色、结构致密的愈伤组织继续在诱导培养基上继代培养，培养条件为：暗培养，温度28±2℃；挑选呈现致密的愈伤组织进行7~9 d的预培养，培养条件为：暗培养，温度28±2℃；
诱导培养基的配方为：每升培养基含MS盐4.43 g；2 mg/mL 2,4-D 1 mL；水解酪蛋白0.5 g；蔗糖30 g；肌醇0.1 g；植物凝胶3 g；pH为5.7；
（2）将带有绿色荧光蛋白基因的1305Ubi-Ubi-GFP-H质粒转化至EHA105或LBA4404农杆菌菌株中，28℃培养2d后挑取单克隆，经PCR反应、电泳检测获取阳性农杆菌；将阳性农杆菌转入YEB液体培养基中培养，将得到的菌液离心收集菌体，使用侵染缓冲液进行重悬，至菌液在600 nm波长下的OD值为0.02或0.2，获得侵染菌液；
其中，YEB液体培养基中添加50 mg/mL卡那霉素和50 mg/mL利福平，培养后的离心条件为1000~2000 rpm、5 min；
侵染缓冲液每升包括含微量元素的N6 4 g、200 µM/mL乙酰丁香酮1 mL、10 mg/mL 2,4-D 200 µL、水解酪蛋白1 g；蔗糖30 g；肌醇0.1 g；葡萄糖10 g；
（3）将经过预培养的愈伤组织浸泡于侵染菌液中进行侵染20 min，将侵染后的愈伤组织接种于共培养基中进行共培养，温度22±2℃暗培养2~4 d；其中，在600 nm波长下的OD值为0.2的菌液侵染后的愈伤组织共培养时间为2~3d，在600 nm波长下的OD值为0.02的菌液侵染后的愈伤组织共培养时间为4d；然后将经共培养的愈伤组织转接于恢复培养基中，温度28℃±2℃黑暗培养3 d；将恢复培养后的愈伤组织置于体式荧光显微镜下观察侵染情况，若愈伤组织在紫外光下出现绿色荧光，则表明外源目的基因在菰米愈伤组织中成功表达，计算其瞬时表达率；
其中，共培养基的配方为：每升培养基含含微量元素的N6 4 g、200 µM/mL乙酰丁香酮1mL、10 mg/mL 2,4-D 200 µL、水解酪蛋白1 g；蔗糖30 g；肌醇0.1 g；葡萄糖10 g；植物凝胶3 g；pH为5.7；
恢复培养基的配方为：每升培养基含MS盐4.43 g；水解酪蛋白0.5 g； 2 mg/mL 2,4-D2 mL；1 mg/mL 6-BA 100 µL；200 mg/mL特美汀2 mL；肌醇0.1 g；蔗糖30 g；植物凝胶3 g，pH为5.7。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，选取合适菰米种子，其消毒处理的过程为：将菰米种子用75%乙醇浸泡30~60 s，用20%次氯酸钠浸泡20 min，灭菌水清洗5~7次，直至澄清，浸泡过夜。
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| GR01 | Patent grant | ||
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