CN103250647A - 籼稻光温敏核不育系双8s成熟胚愈伤组织诱导方法 - Google Patents

籼稻光温敏核不育系双8s成熟胚愈伤组织诱导方法 Download PDF

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夏石头
陈锦
肖浪涛
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Abstract

本发明提供一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，包括如下步骤：1）将经灭菌消毒的双8S带胚米粒接种到N6大量50ml/L+MS微量10ml/L+MSV铁盐10ml/L+VB110mg/L+VB310mg/L+VB610mg/L+2,4-D2.5mg/L+6-BA0.2mg/L+水解酪蛋白400mg/L+脯氨酸500mg/L+肌醇100mg/L+植物凝胶3.2g/L+蔗糖30g/L的诱导培养基上暗室培养10-12天；2）将获得的愈伤组织转入新的诱导培养基暗室培养10-12天，获得双8S成熟胚愈伤组织。本发明的方法有效解决了双8S成熟胚愈伤组织诱导率低、褐化严重和大面积生根的问题。

Description

籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法
技术领域
本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法。
背景技术
为了进一步提升水稻产量和提高水稻应对极端天气状况的能力，人们不得不把希望寄托于基因工程技术。现在水稻转基因研究领域应用的最为广泛的转基因方法是农杆菌介导的水稻遗传转化法，而这种转化方法都是以愈伤组织作为农杆菌侵染的受体材料，所以高效率诱导出高质量的愈伤组织对于整个水稻转基因研究领域有着重要意义。
目前，粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基已经有了比较成熟的培养基配方和愈伤组织诱导方案。但是在籼稻愈伤组织培养方面一直没有找到合适的通用诱导培养方案，各种诱导培养基之间通用性较差，诱导效果不够理想，主要表现在诱导率低、生根率太高以及愈伤组织褐化严重等问题。所以现在人们往往是针对每一种籼稻品种摸索一种特定的针对其的最适诱导培养基。
发明内容
针对籼稻超级稻母本核雄性不育系双8S采用已有诱导方法组培时存在的诱导率低、生根率太高以及愈伤组织褐化严重等问题，本发明的目的在于提供一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法。
本发明提供的一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，包括如下步骤：
1）第一次诱导培养：获得经灭菌消毒的双8S带胚米粒，接种到N6大量50ml/L+MS微量10ml/L+MSV铁盐10ml/L+VB110mg/L+VB310mg/L+VB610mg/L+2,4-D2.5mg/L+6-BA0.2mg/L+水解酪蛋白400mg/L+脯氨酸500mg/L+肌醇100mg/L+植物凝胶3.2g/L+蔗糖30g/L的诱导培养基上，放入暗室培养10-12天，获得愈伤组织；
2）愈伤组织继代培养：将步骤1）获得的愈伤组织切下，转入新的诱导培养基，放入暗室培养10-12天，获得双8S成熟胚愈伤组织。
其中，步骤1）所述灭菌消毒为将带胚的米粒放入体积百分比75%的乙醇溶液浸泡90s，无菌水洗2次，次氯酸钠溶液浸泡30min，无菌水洗5-8次后干燥。
其中，步骤1）所述第一次诱导培养，用9cm口径培养皿进行，接种量为32-35粒双8S带胚米粒每个培养皿。
其中，步骤2）所述愈伤组织继代培养，用9cm口径培养皿进行，接种量为22-25粒愈伤组织每个培养皿。
其中，所述诱导培养基的pH值为5.83。
其中，所述暗室培养的培养温度为28℃。
本发明还提供所述的一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法在双8S繁育中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明的方法可以大幅度提高籼稻超级稻母本双8S成熟胚愈伤组织诱导率，统计结果显示诱导率大于90%。
（2）在以往的愈伤组织诱导试验过程中，愈伤组织褐化严重和大面积生根现象一直是影响愈伤组织诱导率和愈伤组织品质的两个重要因素。而采用本发明的方法后，降低了愈伤组织诱导过程中的长根率（长根率=0），同时褐化现象显著降低，得到了质地均匀色泽淡黄的愈伤组织，改善了愈伤组织品质。
（3）在诱导培养12d后切下愈伤组织接入新的培养基进行继代培养，这样的培养方式既不影响愈伤组织品质又可以增加愈伤组织质量300%以上。
（4）诱导出的大块体积愈伤组织可以切碎成小块，进行农杆菌转化试验，在愈伤组织诱导过程中更换了一次培养基，把整个愈伤组织诱导时间缩约为20至24d。
附图说明
图1：实施例2第一次诱导培养12d后双8S愈伤组织照片。
图2：实施例2第一次诱导培养12d后切下的双8S愈伤组织照片。
图3：实施例2继代培养12d后的双8S愈伤组织照片。
图4：实施例3第一次诱导培养12d后两种培养基上的愈伤组织照片。
图5：实施例3继代培养12d后两种培养基上的愈伤组织照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1诱导培养基配法
诱导培养基的配方为：N6大量50ml/L+MS微量10ml/L+MSV铁盐10ml/L+VB110mg/L+VB310mg/L+VB610mg/L+2,4-D2.5mg/L+6-BA0.2mg/L+水解酪蛋白400mg/L+脯氨酸500mg/L+肌醇100mg/L+植物凝胶3.2g/L+蔗糖30g/L。
几种培养基相关母液的配方见表1。
表1：几种培养基相关母液的配方
Figure BDA00003293378600041
培养基配好后调节pH值至5.83并定容到1000mL，然后翻入高压灭菌炉做灭菌处理，保持121℃30min。取出培养基放入超净工作台待其温度降至50℃左右时倒9cm口径圆形培养皿40个（每皿约25mL），新倒好的培养基敞开培养皿盖放在超净工作台内风吹30-60min，让培养基适当干燥些并确保培养皿盖上无水珠。
实施例2籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织培养
1种子成熟胚消毒
取活度高的籼稻光温敏核不育系双8S种子若干，脱壳后选取其中带胚的米粒（注意：去除发黑、发黄米粒）。放入已高温灭菌过的三角瓶，加入体积百分比75%的乙醇水溶液至没过米粒并手动轻轻震荡约90s，倒去乙醇，再加两倍无菌水洗涤两次次。倒去无菌水，再加入与酒精等量的次氯酸钠溶液，并放入28℃暗室摇床150rpm摇30min。消毒完后倒去次氯酸钠溶液再用无菌水洗涤5-8次。取出米粒转入已消毒并垫有四层滤纸的空培养皿，待滤纸吸水饱和后把米粒转入另一个垫有三层无菌滤纸的培养皿中，摊开并在超净工作台上大风力吹2h-3h至米粒干燥。
2第一次诱导培养
选取带有完整胚的干净米粒均匀接入诱导培养基，诱导密度每皿32-35粒为宜。将成熟胚接入诱导培养基并封口膜封口后，放入暗室28℃培养，培养时间约为10至12d，时间不宜过长，否则容易引起愈伤组织褐化影响品质。28℃暗室诱导培养12d后的照片见图1，可以看出诱导出的愈伤组织色泽淡黄、大小均匀、颗粒圆润饱满且组织结构紧密，基本没有褐化现象，品质好。统计长根率、诱导率等，结果见表2。
表2双8S成熟胚诱导培养12d后
长根率（%） 芽长/cm 愈伤组织质量/mg 诱导率/％
双8S 0 2.01 11.9 96.7
从表2中都可以看出诱导过程中基本没有出现长根现象，愈伤组织诱导效率相对于其他籼稻愈伤组织诱导试验的诱导率高出许多，诱导率达到90%以上，长出的芽长相比其他籼稻愈伤组织诱导试验数据短将近20%，统计结果显示双8S特别适合于这套诱导方法。
3愈伤组织继代培养
待第一次诱导培养10-12d后取出，将长出的愈伤组织切下，切下的愈伤组织见图2，将切下的愈伤组织转入新的诱导培养基，接种密度保持在22-25粒，然后放入暗室28℃继代培养10-12d，培养完成后可以得到优质愈伤组织。诱导培养12d后，继代培养12d后的愈伤组织见图3，可以看出愈伤组织依然色泽淡黄颗粒圆润饱满，基本没有褐化现象，此时愈伤组织平均粒重约为43.8mg。
实施例3植物凝胶和琼脂粉对水稻双8S成熟胚愈伤组织诱导培养和继代培养的影响
按照实施例1的配方的培养基为植物凝胶培养基，以琼脂粉替代实施例1配方中的植物凝胶配制的培养基为琼脂粉培养基。
以两种培养基，按照实施例2的方法进行双8S成熟胚愈伤组织第一次诱导培养和继代培养。
第一次诱导培养12d后的两种培养基上的愈伤组织照片见图4，使用植物凝胶诱导培养基诱导的愈伤组织大小均匀，色泽淡黄，两种培养基培养均基本没有出现褐化现象。统计第一次诱导培养12d后的长根率、诱导率等，结果见表3。
表3植物凝胶和琼脂粉培养基对双8S愈伤组织诱导的影响
诱导培养基 长根率(%) 芽长/cm 愈伤组织质量/mg 诱导率/％
植物凝胶 0 2.01 11.9 96.7
琼脂粉 21.22 2.79 12.0 78.78
结果显示，双8S在这两个培养基上的诱导培养效果差异明显，在长根率、芽长以及诱导率等方面都表现出极显著差异，植物凝胶诱导培养基在长根率、芽长以及诱导率等多方面指标均要好于琼脂粉诱导培养基。
诱导培养12d后，继代培养12d后的两种培养基上的愈伤组织照片见图5，可以明显看出，使用植物凝胶诱导培养基的愈伤组织大小均匀，色泽淡黄，基本没有出现褐化现象，而使用琼脂粉诱导培养基继代培养出的愈伤组织有一定比例明显褐化。而高品质的愈伤组织有利于后期的转化试验，可以提高转化效率。
综上，使用植物凝胶的诱导培养基更适于进行双8S成熟胚诱导培养。

Claims (7)

1.一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）第一次诱导培养：获得经灭菌消毒的双8S带胚米粒，接种到N6大量50ml/L+MS微量10ml/L+MSV铁盐10ml/L+VB110mg/L+VB310mg/L+VB610mg/L+2,4-D2.5mg/L+6-BA0.2mg/L+水解酪蛋白400mg/L+脯氨酸500mg/L+肌醇100mg/L+植物凝胶3.2g/L+蔗糖30g/L的诱导培养基上，放入暗室培养10-12天，获得愈伤组织；
2）愈伤组织继代培养：将步骤1）获得的愈伤组织切下，转入新的诱导培养基，放入暗室培养10-12天，获得双8S成熟胚愈伤组织。
2.如权利要求1所述一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，其特征在于，步骤1）所述灭菌消毒为将带胚的米粒放入体积百分比75%的乙醇溶液浸泡90s，无菌水洗2次，次氯酸钠溶液浸泡30min，无菌水洗5-8次后干燥。
3.如权利要求1所述一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，其特征在于，步骤1）所述第一次诱导培养，用9cm口径培养皿进行，接种量为32-35粒双8S带胚米粒每个培养皿。
4.如权利要求1所述一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，其特征在于，步骤2）所述愈伤组织继代培养，用9cm口径培养皿进行，接种量为22-25粒愈伤组织每个培养皿。
5.如权利要求1所述一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基的pH值为5.83。
6.如权利要求1所述一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述暗室培养的培养温度为28℃。
7.权利要求1-6任一项所述的一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法在双8S繁育中的应用。
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