CN104381126B - 骏枣脱毒组培快繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业繁育技术,尤其是一种涉及新疆地区骏枣工业化育苗脱毒组培快繁的技术。一种骏枣脱毒组培快繁技术，主要包括以下操作处理工艺步骤:(1)、骏枣枣树茎段外殖体快速启动；(2)、骏枣茎尖脱毒培养；(3)、骏枣脱毒组培苗增殖；(4)、骏枣脱毒组培苗生根培养。本发明是一种技术合理、操作简便，适用于工业化育苗，大大提高成活率，有效防止枣疯病的发生、经济实用的骏枣脱毒组培快繁技术。
Description
技术领域
本发明涉及农业繁育技术,尤其是一种涉及新疆地区骏枣工业化育苗脱毒组培快繁的方法。
背景技术
新疆幅员辽阔，水土光热资源丰富，昼夜温差大，具备发展枣树产业得天独厚的自然条件。骏枣含糖量高，干物质积累多，品质上乘，果品畅销，价格不断攀升，种植枣树成了新疆广大职工群众致富的重要途径。
骏枣原产山西，现为南疆和十四师主栽品种之一，该品种适应性较强，产量高而稳定。果大，适宜制干，品质优良，耐贮耐运。骏枣传统的繁殖方法主要有根蘖苗和嫁接苗，它们的不足之处是需要繁殖材料多，繁殖系数低，不能周年生产，容易传播病毒。而用组织培养方法快速繁殖脱毒苗，具有整株的遗传一致性，生长健壮，根系发达、移栽成活率高，果品品质好，产量高等优点，是发展优质、高产、高效商品化骏枣生产的重要手段。
枣病毒病致病力高，危害严重，不仅削弱树势，导致产量和果实品质下降，甚至引起枣树急剧衰退，严重限制骏枣产业的发展。树体一旦感病，终生携带。传统的病害防治技术和栽培技术难以治愈。我区多数枣树主栽品种对枣病毒病敏感，防治枣病毒病，培育骏枣脱毒苗已成为我区枣产业可持续发展的重要保证。鉴于枣树重要的经济价值及枣病毒病的严重破坏性，国内外从20世纪40年代开始就将枣病毒病作为枣树病害研究的焦点，先后研究枣病毒病的病原及其存在部位、主要传播途径、枣病毒病病原的接种及检测方法等。我国对骏枣病毒病的研究基本上处于空白状态。
新疆兵团计划枣树种植面积达到150万亩，而新疆每年只能满足不到一半的苗木需求，其余要靠从内地调运，骏枣苗木缺口较大，成为制约骏枣产业发展的关键。由于对枣苗的需求大,造成对枣树苗木质量的要求不严格，许多地方存在品种混杂，病虫害严重甚至有可能引进带有枣园毁灭性的枣疯病苗木等问题，以致骏枣品质差，产量低，远距离运输成活率低等不利因素存在。因此，采用骏枣脱毒技术、组织培养低成本工厂化快繁技术，批量生产，周年供应无病毒、根系发达、移栽成活率高的优质枣苗，是发展优质、高产、高效商品化骏枣生产的重要手段，也是促进骏枣产业发展中的急需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种技术合理、操作简便，适用于工业化育苗，大大提高成活率，有效防止枣疯病的发生、经济实用的骏枣脱毒组培快繁的方法。
本发明公开了一种骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于主要包括以下操作处理工艺步骤:
(1)、骏枣枣树茎段外殖体快速启动：
5～6月份采1～2年生根蘖苗，取3～5cm带枣腋芽的枣树茎段，清洗、杀菌消毒，经45～50℃热水处理50～60min后，使材料中的病毒钝化，将上述骏枣枣树茎段进行启动培养，所述启动过程中用到的培养基为MS+6-BA0.8～1.2mg/L+NAA0.15～0.25mg/L；
(2)、骏枣茎尖脱毒培养：
取上述启动培养后的枣树茎段，在解剖镜下剥离0.5～0.7cm的茎尖分生组织进行培养，脱毒苗培养基为MS+6-BA0.8～1.2mg/L+NAA0.25～0.35mg/L；得到的组培苗在37～39℃下进行热处理40～60d后，剥取0.1～0.3cm的茎尖，所得茎尖试管苗为脱除枣疯病的脱毒苗；
(3)、骏枣脱毒组培苗增殖：
以MS作为基本培养基，进行所述骏枣脱毒苗的增殖组培快繁，骏枣脱毒苗的最佳增殖培养基为MS+6-BA1.3～1.5mg/L+IBA0.7～0.9mg/L；在所述增殖培养基中添加有机物，有机物分别为：甘氨酸1.9～2.1mg/L、VB1为0.5～0.7mg/L、VB6为0.7～0.8mg/L、肌醇95～105mg/L、烟酸0.45～0.55mg/L；
(4)、骏枣脱毒组培苗生根培养：
当光照强度为1500～2500Lx，环境温度为24～26℃时，1/2MS培养基条件下，优化的生长素为：IBA1.4～1.6mg/L+NAA0.08～0.12mg/L+IAA0.45～0.55mg/L时，经过4～7代的增殖继代培养，对培养后的骏枣组培脱毒苗进行生根繁育。
所述的第(1)步骤中，所述的杀菌消毒最好是利用升汞进行5min～7min杀菌消毒。
所述第(1)步骤中所述的启动过程中用到的培养基最好为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L。
所述第(2)步骤中所述脱毒苗培养基最好为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L。
所述第(3)步骤中所述骏枣脱毒苗的最佳增殖培养基最好为MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L。
所述步骤(3)中各种有机物的浓度的最佳组合为：甘氨酸为2.0mg/L、VB1为0.6mg/L、肌醇为100mg/L、VB6为0.75mg/L、烟酸为0.5mg/L。
所述第(4)步骤中所述优化的生长素浓度和配比为IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/L。
下面通过实验分别对各步骤进行具体说明：
一、骏枣外植体快速启动技术：
骏枣无性系的建立是组织培养、工厂化生产的基础，而高效、大量无菌组培苗是迅速形成规模化生产的前提。骏枣是多年生木本植物，由于骏枣的生长特性及木质化程度、腋芽生长结构为无性系建立设置了很多困难，所以研究筛选出快速启动的培养基是骏枣脱毒种苗工厂化生产的重要步骤。
试验材料为优良枣树品种骏枣，取材于新疆农垦科学院林园所枣树苗圃基地。试验采用组织培养方法对外植体进行培养，再采用对组培苗茎尖加热方法进行脱毒苗培养。
外植体初始培养的启动快慢与当时取材的年龄、时间和部位有关：我们在外植体采取时间上做了3～4月份的硬枝水培后的枣芽、5～6月份萌发的枣头枝、8～9月份的枣头枝研究；外植体采用的部位做了枣头芽和带腋芽茎段的研究；外植体取材来源做了1～2年生根蘖苗萌发的枝条、1～2年生嫁接苗萌发的枝条、6年左右树龄萌发的枣头研究。
根据细胞分裂素和生长素效能与不同配比对骏枣快速启动培养的影响，我们选择以MS为基本培养，采用两种激素6－苄基腺嘌呤(6－BA)和萘乙酸(NAA)的不同配比对骏枣快速启动的试验。
在相同的培养条件下进行外植体培养，以5～6月份萌发的枣头枝容易启动成功，成芽率较高；1～2年生根蘖苗萌发的枝条启动比较容易；接入带腋芽茎段的会从腋芽处萌发出健壮的芽，比较适于外植体的培养；骏枣外植体的启动培养在MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L中生长的比较好，并且转接到同培养基中生长良好。
因此，在骏枣外植体启动培养过程中，5～6月份采1～2年生根蘖苗进行启动培养比较好，最适外植体部位是带腋芽茎段，最适外植体启动培养基为MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L，最适脱毒苗培养基为MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L。试验取得了良好的效果，使骏枣组培苗在35d左右得到52％的分化率，40d内增殖倍数在4，脱毒苗茎叶生长良好，为进一步进行增殖奠定了良好的基础。
下面是对骏枣离体培养的外植体启动研究试验。
(一)、材料与方法
1.1材料与来源：
试验材料为优良枣树品种骏枣，取材于新疆农垦科学院林园所枣树苗圃基地。
1.2试验方法
试验采用组织培养方法对外植体进行培养，再采用对组培苗茎尖加热方法进行脱毒苗培养。
1.2.1外植体的培养：把带有枣芽的枝条去掉大叶，截成3-5cm长的茎段，用稀释的洗洁精溶液洗涤15min，然后用自来水冲洗干净，放在超净工作台上，在无菌条件下，用70％的乙醇消毒30s，无菌水冲洗，用0.1％升汞消毒若干分钟，再用无菌水冲洗4～5遍，将接触消毒液的截面切掉，接入培养基中。
试验主要对外植体消毒过程中升汞的消毒时间、外植体采取时间、取材来源、取材部位、培养基成分等因素进行了研究。
外植体采取时间：3～4月份的硬枝水培后的枣芽，5～6月份萌发的枣头枝，8～9月份的枣头枝(详见表1-1)。外植体取材来源：1～2年生根蘖苗萌发的枝条，1～2年生嫁接苗萌发的枝条，6年左右树龄萌发的枣头(详见表1-2)。取材部位选择：枣头芽和带腋芽茎段(详见表1-3)。
外植体消毒时升汞的杀菌时间：3，5，7min(详见表1-4)；培养基的选择：以MS为基本培养基，琼脂0.5％，白糖30g/L，；pH值为6.5，采用两种激素6－苄基腺嘌呤(6－BA)和萘乙酸(NAA)的不同配比(详见表1-5)。培养条件为温度白天28℃，夜间25℃，光照强度为2500Lx,试验中每瓶接5个芽，35d周转一次。
1.2.2脱毒苗的培养：采用热处理与茎尖培养结合脱毒法。先把诱导出的试管苗在38℃光照培养箱内热处理60d。将经过热处理的试管苗在无菌条件下剥取0.1～0.3cm的茎尖，在启动培养基中培养出试管苗。检测茎尖试管苗，证明完全脱除了枣疯病。
快速启动培养基的选择：以MS为基本培养基，琼脂0.6％，白糖30g/L，；pH值为6.3，采用两种激素6－苄基腺嘌呤(6－BA)和萘乙酸(NAA)的不同配比(详见表6)。培养条件为25～28℃，光照强度为2500Lx，试验中每瓶接5个芽，40d切段增殖培养。
(二)、结果与分析
2.1不同取材时间对外植体启动的影响
由表1-1可以看出，在相同的培养条件下进行外植体培养，以5～6月份萌发的枣头枝容易启动成功，成芽率较高。
表1-1外植体取材时间不同对启动培养的影响
| 取材时间 | 接种数(个) | 成芽数(个) | 成芽率(％) |
| 3～4月份的硬枝水培后的枣芽 | 50 | 17 | 34 |
| 5～6月份萌发的枣头枝 | 50 | 26 | 52 |
| 8～9月份的枣头枝 | 50 | 21 | 42 |
2.2不同外植体来源对启动培养的影响
由表1-2可以看出，1～2年生根蘖苗萌发的枝条启动比较容易。
表1-2外植体不同来源对启动培养的影响
| 取材时间 | 接种数(个) | 成芽数(个) | 成芽率(％) |
| 1～2年生根蘖苗萌发的枝条 | 50 | 16 | 32 |
| 1～2年生嫁接苗萌发的枝条 | 50 | 8 | 16 |
| 6年左右树龄萌发的枣头 | 50 | 11 | 22 |
2.3不同部位外植体对启动培养的影响
10d后观察发现，在相同条件下，接入的枣头芽有许多褐化失去生芽能力，未褐化的芽枝条生长比较开张。而接入带腋芽茎段的会从腋芽处萌发出健壮的芽。由此可以看出，带腋芽茎段比较适于外植体的培养(表1-3)。
表1-3不同部位外植体对启动培养的影响
| 取材部位 | 接种数(个) | 成芽数(个) | 生长情况 |
| 枣头芽 | 40 | 16 | 弱小，易分叉 |
| 带腋芽茎段 | 40 | 20 | 健壮单株 |
2.4不同杀菌时间对外植体启动培养的影响
在对外植体进行升汞杀菌时，时间的长短对外植体成活和污染有很大关系。由表1-4可以看出，升汞杀菌5min和7min时污染较少，但7min成活率比较低。
表1-4不同杀菌时间对外植体启动培养的影响
| 处理 | 接种数(个) | 污染数(个) | 成活数(个) | 成活率(％) |
| 升汞杀菌3min | 50 | 32 | 9 | 18 |
| 升汞杀菌5min | 50 | 13 | 18 | 36 |
| 升汞杀菌7min | 50 | 11 | 12 | 24 |
2.5不同激素配比对外植体启动培养的影响
由表1-5可以看出，骏枣外植体的启动培养在MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L中生长的比较好，并且转接到同培养基中生长良好。
表1-5不同激素配比对外植体启动培养的影响
2.6不同激素配比对脱毒苗培养的影响
由表6可以看出，脱毒苗培养在MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L中生长的比较好，并且增殖到同培养基中生长良好。
表6不同激素配比对脱毒苗培养的影响
二、枣树热处理与茎尖培养结合高效脱毒技术：
热处理脱毒技术已经在枣病毒病的脱除中得到了成功的应用。田砚亭等从秋冬季节的患枣病毒病的病树基部采l～2年生根蘖条，以45～50℃热水浸泡lh后水培，然后取水培芽进行组培，经检测成功地脱除了植原体；戴洪义报道采用6年生典型枣病毒病病株上的1年生从枝，用50℃热水浸泡10～20min后扦插。在成活株中未发现病株；所获无性系试管苗及移栽苗经鉴定完全脱除了植原体，并在生产中推广应用。这种湿热脱毒结合高温培养脱毒的方法也是目前常用的一种枣树热处理脱毒方法，但热处理法不能彻底脱除病毒，而且恒温处理植株易死亡。
茎尖培养脱毒是建立在植物分生组织中生长点附近的病毒很少或者不含病毒的理论基础上的。枣树茎尖脱毒一般取0.1～1.0cm的茎尖分生组织进行培养，可获得脱除枣病毒病病原的脱毒苗。茎尖脱毒法由于茎尖培养成活率与茎尖大小呈正相关，而脱毒率又与茎尖大小呈负相关，操作难度相对较大。
将热处理和茎尖培养结合起来可以取更长的茎尖，大大提高茎尖培养的成活率，且对脱毒效果没有太大的影响。我们将带病枝条经45～50℃热水处理60min后，使材料中的病毒钝化，之后在解剖镜下剥离0.5～0.7cm的茎尖分生组织进行培养，得到的组培苗在38℃下进行热处理40～60d后，剥取0.1～0.3cm的茎尖，所得茎尖试管苗可完全脱除枣疯病。不但提高了接种成活率，而且获得了脱枣病毒病病原的健壮植株。
由于病原体是通过韧皮部的筛管在树体内运行，通过38℃高温处理组培苗可以钝化病毒，然后剥取微茎尖(切到韧皮部的机会少)脱毒率高。热处理过程中很多试管苗不耐高温死去，随着处理时间的延长，死亡率提高，成活株数减少，在处理70d时，试管苗全部死亡。将茎尖苗送到石河子大学进行植物学症状鉴定法和PCR扩增检测，对枣疯病病原类菌质体的脱毒率进行检测。经过病毒检测，处理30d脱毒率达到75％，处理40d和处理60d，脱毒率都达到100％。因此，骏枣热处理天数应在40d和60d之间。
(一)、材料和方法
1.1材料来源：
试验材料为枣树品种骏枣，取材于新疆农垦科学院林园所枣树苗圃基地。
1.2试验方法：
试验采用组织培养方法对外植体45～50℃热水处理60min后，使材料中的病毒钝化，采用外植体快速启动方法获得组培苗，之后在解剖镜下剥离0.8～1.0cm的组培苗茎尖分生组织进行培养，得到的组培苗在38℃下进行热处理40～60d后，剥取0.3一0.5cm的茎尖，进行培养，获得脱枣疯病病原的组培苗。
1.2.1不同培养基对骏枣脱毒启动的影响
以MS为基本培养基，6－BA取0.5、1.0、1.5mg/L3个水平，NAA取0.1、0.3、0.5mg/L3个水平，采用L9(34)正交试验设计9个处理，每处理接种15瓶，每瓶接3个芽。
琼脂0.6％，白糖30g/L，pH值为6.3。培养条件为25～28℃，光照强度为2500Lx，白天14h，培养35d。
1.2.2不同培养基对骏枣茎尖脱毒处理的影响
我们将用同一启动培养基配方上的组培苗茎尖0.8～1.0cm左右，接种到MS培养基不同激素浓度配比的培养基上。以MS为基本培养基，琼脂0.6％，白糖30g/L；pH值为6.3，采用两种激素6－苄基腺嘌呤(6－BA)和萘乙酸(NAA)的不同配比(见表2)。每处理接种10瓶，每瓶接5个芽。培养条件为25～28℃，光照强度为2500Lx，白天14h，培养35d。
1.2.3不同热处理对茎尖脱毒的影响
将启动培养成功的茎尖组培苗放在光照培养箱内，温度逐渐升高，当温度升到38℃时，进行计时，分别取热处理30、40、60、70d进行对比，30d转接1次，每组接40瓶，每瓶接种5个芽，2次重复取平均值。病毒检测在石河子大学用PCR方法进行检测。
(二)结果与分析：
2.1不同培养基对骏枣脱毒启动的影响
从表2-1可以发现，由极差分析可以看出,在骏枣脱毒启动培养中，NAA对芽的启动影响最大，6－BA次之。6－BA中浓度0.5mg/L效果最好，随着浓度的升高，成活率下降；NAA浓度0.3mg/L成芽率影响较大，成芽率最高。骏枣脱毒启动培养的最佳培养基为MS+6－BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L。
表2-1不同培养基对骏枣脱毒启动的影响
2.2不同培养基对骏枣茎尖脱毒处理的影响
试验发现6－BA和NAA对高温处理下的骏枣组培苗产生明显影响，在茎尖培养阶段6－BA对植物细胞促进分裂和延迟衰老的作用充分表现在分化效率上(表2-2)，2.0mg/L的诱导茎尖分化效果明显高于0.5mg/L6－BA，所以在茎尖培养阶段要以高浓度的组合对茎尖分化有利。但6－BA浓度高于2.0mg/L抑制了苗的高度和叶片的正常开展，茎尖成活率也下降，因此，脱毒茎尖苗培养在MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L中生长的比较好。
表2-2不同培养基对骏枣茎尖脱毒处理的影响
2.3不同热处理对骏枣茎尖脱毒的影响
由于病原体是通过韧皮部的筛管在树体内运行，通过38℃高温处理组培苗可以钝化病毒，然后剥取微茎尖(切到韧皮部的机会少)脱毒率高。试验在光照培养箱内对骏枣组培苗高温38℃热处理30，40，60，70天，中间换一次培养基。热处理过程中很多试管苗不耐高温死去，随着处理时间的延长，死亡率提高，成活株数减少，在处理70d时，试管苗全部死亡。30d时成活率是56％，40d只有38％，60d时仅为18％。在超净工作台上体视镜下剥取骏枣热处理组培苗0.3～0.5cm的茎尖，接种在启动培养基上，培养出茎尖苗。将茎尖苗送到石河子大学进行植物学症状鉴定法和PCR扩增检测，对枣疯病病原类菌质体的脱毒率进行检测。经过病毒检测，处理30d脱毒率达到75％，处理40d和处理60d，脱毒率都达到100％。因此，骏枣热处理天数应在40d和60d之间。
表2-3不同热处理对骏枣茎尖脱毒的影响
| 处理天数 | 接种数(个) | 成活率(％) | 脱毒率(％) |
| 30d | 50 | 43 | 75 |
| 40d | 50 | 32 | 100 |
| 60d | 50 | 18 | 100 |
| 70d | 50 | 0 |
三、骏枣脱毒组培苗增殖技术：
高效优质的组培苗增殖是进行脱毒种苗无性繁殖、工厂化生产的保证，并且为组培苗高效生根提供了保证。在植物组培快繁中，提高繁殖系数，是组培快繁的关键。影响繁殖系数的因素很多，如基本培养基的种类、激素的种类配比和浓度、碳源的种类和浓度、有机物的种类和浓度等。对于激素的种类配比和浓度对繁殖系数的影响研究较多，有机物的种类和浓度对植物组培繁殖系数影响方面的研究较少，而对骏枣脱毒苗组培快繁时繁殖系数影响的研究没见报道。在骏枣脱毒苗的组培快繁中，基本培养基的选定和培养基中添加的有机物的种类和浓度，直接影响到繁殖系数的提高，为提高骏枣脱毒苗的繁殖系数，对培养基中添加的甘氨酸、VB1、VB6、肌醇、烟酸等有机物种类和浓度对骏枣脱毒苗组培快繁中的影响和作用以及不同激素的种类配比和浓度对繁殖系数的影响作了研究。
(一)、材料与方法：
1.1不同激素的种类配比和浓度对繁殖系数的影响。
本试验使用骏枣的脱毒试管苗。脱毒苗经过组织培养，形成丛芽，分切后移入供试培养基中。每个处理接种15瓶，每种激素的种类配比和浓度设置2个重复，每瓶培养基中接种4棵骏枣芽。
将经过检测脱毒的试管苗进行组培快繁，以MS为基本培养基，6－BA取0.5、1.0、1.5、2.0mg/L4个水平，IBA取0.1、0.3、0.5、0.8mg/L4个水平，采用L16(49)正交试验设计16个处理。切取骏枣丛生芽，分别接种于上述激素的种类配比和浓度培养基上，在光照培养室中进行恒温培养。观察骏枣脱毒苗的生长情况和繁殖系数的变化情况，记录试验结果，并对结果进行分析。
1.2有机物种类和浓度对骏枣脱毒苗组培快繁中的影响和作用
本试验所用骏枣为骏枣的脱毒试管苗。脱毒苗经过组织培养，形成丛芽，分切后移入供试培养基中。每种培养基设置5个重复，每瓶培养基中接种4棵骏枣芽。
本试验将MS作为基本培养基。通过改变MS培养基中的甘氨酸、VB1、VB6、肌醇、烟酸等有机物的加入量进行对比试验。即在配制好的没有加入有机物的MS培养基中，加入激素6－BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L，然后根据L16(45)正交试验方法，按照表3-1中设计的有机物的量分别加入甘氨酸、VB1、VB6、肌醇、烟酸等五种有机物。
切取骏枣丛生芽，分别接种于上述培养基上，在光照培养室中进行恒温培养。观察骏枣脱毒苗的生长情况和繁殖系数的变化情况，40d后，计数骏枣繁殖形成的丛芽数量，计算出每棵骏枣所形成的丛芽数，此即为本种骏枣的繁殖系数，记录试验结果，并对结果进行分析研究。
1.3培养条件
pH调整为6.4～7；白糖为30g/L，琼脂为0.5％；光照强度2500Lx；光照时间14h/d；培养温度为温度白天28℃，夜间23℃；培养时间为每个周期40d。
(二)、结果和分析
2.1不同激素的种类配比和浓度对繁殖系数的影响
增殖系数直接关系到组培苗繁殖快慢，是反映增殖效果的一个指标，只有最佳的细胞分裂素与细胞生长素的浓度配比，才能达到理想的增殖效果。从表1的结果可以看出，随着6－BA浓度的增大，增殖系数不断增大，但6－BA浓度超过1.5mg/L时，增殖系数下降，随着IBA浓度的增大，增殖系数不断增加。极差分析结果显示，在骏枣脱毒苗的增殖过程中，6－BA比IBA对增殖影响大，当6一BA浓度为1.5mg/L时，增殖系数最大。因此，骏枣脱毒苗的最佳增殖培养基为MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L。
表3-1不同激素的种类配比和浓度对繁殖系数的影响
2.2有机物种类和浓度对骏枣脱毒苗组培快繁中的影响和作用：
通过L16(45)进行的正交试验结果比较表明：在骏枣脱毒苗组培快繁时，MS培养基添加的有机物中，甘氨酸对骏枣脱毒苗组培繁殖系数的影响最大，是影响骏枣繁殖系数的主要有机物因子。并且，甘氨酸的不同水平1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L，其K值分别是33、50、35、29，表明：在培养基中，甘氨酸浓度不是愈高愈好，而是有一个适宜的范围，甘氨酸浓度以2.0mg/L为最适宜。
各种有机物因子的影响作用，由大到小依次为：甘氨酸→VB6→肌醇→VB1→烟酸，在以MS作为基本培养基，进行骏枣脱毒苗的组培快繁时，各种有机物的浓度的最佳组合为：甘氨酸(2.0mg/L)+VB1(0.6mg/L/)+肌醇(100mg/L)+VB6(0.75mg/L)+烟酸(0.5mg/L)。此种有机物的浓度组合，恒温培养40d，繁殖系数可达到5.5以上。
表3-2不同浓度的有机物对骏枣脱毒苗繁殖系数的影响
3.1不同激素的种类配比和浓度对繁殖系数的影响试验表明，在骏枣脱毒苗的增殖过程中，6－BA比IBA对增殖影响大，当6一BA浓度为1.5mg/L时，增殖系数最大，6－BA浓度超过1.5mg/L时，增殖系数下降，随着IBA浓度的增大，增殖系数不断增加但超过0.8mg/L容易生根，不利于增殖扩繁。因此，骏枣脱毒苗的最佳激素浓度配比为6-BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L。
3.2有机物种类和浓度对骏枣脱毒苗组培快繁中的影响和作用
试验在原有实验筛选出组培快繁脱毒骏枣苗的基本培养基为MS培养基，调节激素浓度为6－BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L的基础上进行。甘氨酸对骏枣脱毒苗组培繁殖系数的影响最大，是影响骏枣繁殖系数的主要有机物因子。并且，甘氨酸浓度不是愈高愈好，而是有一个适宜的范围，甘氨酸浓度以2.0mg/L为最适宜。各种有机物因子的影响作用，由大到小依次为：甘氨酸→VB6→肌醇→VB1→烟酸，在以MS作为基本培养基，进行骏枣脱毒苗的组培快繁时，各种有机物的浓度的最佳组合为：甘氨酸(2.0mg/L)+VB1(0.6mg/L/)+肌醇(100mg/L)+VB6(0.75mg/L)+烟酸(0.5mg/L)。
3.3本研究发现，骏枣脱毒苗增殖培养的最佳激素浓度配比为6-BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L，在基本培养基和激素浓度相同的情况下，各种有机物的浓度的最佳组合为：甘氨酸(2.0mg/L)+VB1(0.6mg/L/)+肌醇(100mg/L)+VB6(0.75mg/L)+烟酸(0.5mg/L)。因此，骏枣脱毒苗增殖培养最佳培养基为：MS+甘氨酸(2.0mg/L)+VB1(0.6mg/L/)+肌醇(100mg/L)+VB6(0.75mg/L)+烟酸(0.5mg/L)+6-BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L。在此条件下，骏枣增殖扩繁系数可达5.5以上。
四、骏枣脱毒组培苗生根技术研究：
组培苗的生根是植物离体繁殖的关键步骤，生根培养在组培过程中有巨大的作用，关系到移栽成活的问题。然而枣树是木本植物，枣树脱毒组培苗生根是比较困难的工作。枣树在组培瓶内生根，受多种因素影响，生根率较低且不稳定。
影响枣树组培苗生根的因素，可以归纳为两方面，一是组培苗本身的基因型及其生理状态，另一方面是生根培养过程中的培养基、不同激素配比和培养条件。
枣树在田间扦插非常难生根，但在组培条件下，经过多代的继代培养，其内源激素水平发生了变化，形态上小型化，组织幼嫩，有利于产生不定根。经过一年多的研究，我们发现，继代培养次数对于枣树组培苗的生长状况有很大影响，继代次数少时，嫩茎的叶片大，茎粗壮，节间短，生根较难；随着继代次数的增加，嫩茎叶片变小，叶色浅绿，芽的增殖系数增加，生根率提高，较易生根。
植物组织培养生根阶段，降低培养基中大量元素和微量成分的浓度，可提高大多数植物的生根能力。当MS培养基浓度降低至1/2时，有利于根系生长；生根培养基只添加生长素，无需细胞分裂素，生长素的种类和浓度对生根率有明显的影响。枣树根的诱导和根的生长，需要生长素的浓度不同，较高的浓度有利于不定根的诱导，但对新生根的生长有抑制作用；黑暗条件对枣树的生长存在抑制作用，且植株生长矮小，生根能力降低；环境温度对植株生根影响较大。环境温度低时，植株生长缓慢，根系较小。当环境温度适宜时，植株生长健壮，根系发达，叶片较大；当环境温度过高时，植株根系较小，叶片小且黄绿色。
(一)、材料和方法
1.1材料来源
本试验材料来源于经过脱毒培养的骏枣组培苗。
1.2试验方法
1.2.1继代次数骏枣组培苗生根的影响。
将无菌培养的骏枣脱毒组培不定芽切成1cm大小后，接入1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.6％，pH值为6.3，温度为25±2℃，白天14h,光照2500Lx，每培养30d继代增殖一次。记录继代培养次数对枣树生根率、平均生根数做调查。
1.2.2MS浓度对骏枣脱毒苗生根的影响。
将无菌培养的骏枣不定芽切成1cm大小后分别接入1/4MS、1/2MS、3/4MS、MS、2MS共5种培养基中，培养基其他成分为IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.6％，pH值为6.3，温度为25±2℃，白天14h,光照2500Lx，培养30d，调查组培苗根及茎叶的生长情况，生根率的大小，根数多少和根长比较。
1.2.3不同生长激素浓度配比对骏枣生根的影响
将脱毒组培苗长到3cm左右时，进行生根培养，以1/2MS为基本培养基，IBA取0.5、1.0、1.5mg/L3个水平，NAA取0.1、0.3、0.5mg/L3个水平，IAA取0.1、0.3、0.5mg/L3个水平，采用L9(34)正交试验设计9个处理，每处理接种15瓶，每瓶接5株试管苗，重复3次，生长30d，观察记录生根率、根均长和平均生根条数。
1.2.4不同光照强度对骏枣脱毒组培苗生根的影响
试验1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.6％，pH值为6.3，温度为25±2℃，光照强度分别为0，1000，1500，2500，5000Lx，每培养35d继代增殖一次。记录光照强度对枣树生长状况、生根率、平均生根数的影响。
1.2.5不同环境温度对骏枣脱毒组培苗生根的影响
试验1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.6％，pH值为6.3，光照强度为2500Lx，培养温度分别为15，20，25，30，35℃每培养35d继代增殖一次。记录环境温度对枣树生长状况、生根率、平均生根数的影响。
(二)、结果与分析
2.1继代次数骏枣组培苗生根的影响。
由表4-1可以看出，骏枣脱毒组培苗在前3代之内生根率低于30％，生根苗的平均根数不足2条；5代时，生根率达65％，平均根数3条多，8代以后，生根率稳定在80％以上，生根条数平均可达5条以上，但苗较弱，玻璃化苗数量增多，无效苗占比加大，因此，转接生根培养要增殖4代以上为好，继代增殖培养最好控制在8代以内。
表4-1继代次数骏枣组培苗生根的影响
2.2MS浓度对骏枣脱毒苗生根的影响。
由表4-2可知，培养基浓度为1/2MS时，组培苗根及茎叶的生长显著
优于其他处理，生根率高达80％，根数多且较长，每株平均生根5.0条，根长达3.5cm；培养基浓度过高或过低均不利于组培苗茎叶及根的生长，在1/4MS处理中，根数少且短，植株叶片发黄。2MS处理中，组培苗生长缓慢，株高增长受到抑制，植株矮小。因此，骏枣组培生根培养基以1/2MS培养基为佳。
表4-2MS浓度对骏枣脱毒苗生根的影响
2.3不同生长激素浓度配比对骏枣组培苗生根的影响。
通过正交设计对不同浓度生长素之间以及它们的浓度配比进行了对比，结果见表4-3。极差分析结果IBA对骏枣脱毒苗生根影响最大，NAA次之，IAA最弱。随IBA浓度增加，生根率不断增大，随着NAA浓度的增加，生根率逐减，IAA最佳浓度为0.5mg/L，因此，骏枣脱毒苗的最佳生根培养基为1/2MS+IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/L。
表4-3不同生长激素浓度配比对骏枣组培生根的影响
2.4不同光照强度对骏枣脱毒组培苗生根的影响
试验表明：黑暗条件对骏枣脱毒苗的生长存在抑制作用，且植株生长矮小，生根极少；当光照强度为1500～2500Lx时，植株生长状况良好，且叶片较大，生根数量多；当光照强度增加到5000Lx时，植株生长较慢，叶片发黄，生根数减少。
表4-4不同光照强度对骏枣脱毒组培苗生根的影响
2.5不同环境温度对骏枣脱毒组培苗生根的影响
通过研究不同环境温度下骏枣脱毒组培苗的生根情况，发现：当环境温度为15℃时，植株生长缓慢，根系较小；当环境温度为25℃时，植株生长健壮，根系发达，叶片较大，色泽亮绿；当环境温度为35℃时，骏枣脱毒组培苗植株根系较小，叶片小且黄绿色(见表4-5)。部分组培苗茎尖枯死，时间越长，组培苗死亡越多，超过75d全部死亡。
表4-5不同光照强度对骏枣脱毒组培苗生根的影响
(三)、小结
3.1试验结果表明，MS培养基浓度对试管苗生根影响较大，试管苗在1/2MS培养基中生根效果良好，生根率高达80％，根数多且较长，每株平均生根5.0条，根长达3.5cm，且茎叶生长旺盛。
3.2骏枣脱毒组培苗在前3代之内生根率低于30％，生根苗的平均根数不足2条；5代时，生根率达65％，8代以后，生根率稳定在80％以上，但苗较弱。因此，转接生根培养要增殖4代以上为好，继代增殖培养控制在8代以内。
3.3不同浓度的生长素对枣树组培苗生根起着非常重要的作用。IBA对骏枣脱毒苗生根影响最大，NAA次之，IAA最弱。骏枣脱毒苗的最佳生根培养基为1/2MS+IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/L。
3.4骏枣脱毒组培苗生根率与光照和环境温度有密切的关系，当光照强度为1500～2500Lx时，组培苗生长状况良好，且叶片较大，生根数量多；当环境温度为25℃时，植株生长健壮，根系发达，叶片较大，色泽亮绿。因此骏枣组培苗适宜的光照条件是1500～2500Lx，环境温度在25±2℃。
3.5在环境条件适宜，1/2MS培养基条件下，优化的生长素浓度和配比为IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/L时，经过4代以上的增殖继代后的骏枣组培脱毒苗生根率最高可达90％左右，基本能满足工厂化生产的条件。
与现有技术相比，本发明的优点：本申请通过骏枣枣树外置体的快速启动技术研究、茎尖培养结合热处理脱毒技术的研究、病毒检测技术研究、无毒苗的继代增殖技术研究、生根和移栽、硬枝扦插技术研究、低成本工厂化快繁技术研究等方面的技术集成运用，批量生产优质无毒枣树苗木，达到优质丰产，促进骏枣产业发展的目的。本发明是一种技术合理、操作简便，适用于工业化育苗，大大提高成活率，有效防止枣疯病的发生、经济实用的骏枣脱毒组培快繁的方法。
具体实施方式
实施例1：
一种骏枣脱毒组培快繁的方法，主要包括以下操作处理工艺步骤:
(1)、骏枣枣树茎段外殖体快速启动：
5月份采1年生根蘖苗，取3cm带枣腋芽的枣树茎段，清洗、杀菌消毒，经45℃热水处理60min后，使材料中的病毒钝化，将上述骏枣枣树茎段进行启动培养，所述启动过程中用到的培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；
(2)、骏枣茎尖脱毒培养：
取上述启动培养后的枣树茎段，在解剖镜下剥离0.5cm的茎尖分生组织进行培养，脱毒苗培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L；得到的组培苗在37℃下进行热处理40d后，剥取0.3cm的茎尖，所得茎尖试管苗为脱除枣疯病的脱毒苗；
(3)、骏枣脱毒组培苗增殖：
以MS作为基本培养基，进行所述骏枣脱毒苗的增殖组培快繁，骏枣脱毒苗的最佳增殖培养基为MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L；在所述增殖培养基中添加有机物，有机物分别为：甘氨酸为2.0mg/L、VB1为0.6mg/L、肌醇为100mg/L、VB6为0.75mg/L、烟酸为0.5mg/L；
(4)、骏枣脱毒组培苗生根培养：
当光照强度为1500Lx，环境温度为26℃时，1/2MS培养基条件下，优化的生长素为：IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/L时，经过4代的增殖继代培养，对培养后的骏枣组培脱毒苗进行生根繁育。增殖继代后的骏枣组培脱毒苗生根率最高可达90％，基本能满足工厂化生产的条件。
实施例2：
一种骏枣脱毒组培快繁的方法，主要包括以下操作处理工艺步骤:
(1)、骏枣枣树茎段外殖体快速启动：
6月份采2年生根蘖苗，取4cm带枣腋芽的枣树茎段，清洗、杀菌消毒，经48℃热水处理55min后，使材料中的病毒钝化，将上述骏枣枣树茎段进行启动培养，所述启动过程中用到的培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.15mg/L；
(2)、骏枣茎尖脱毒培养：
取上述启动培养后的枣树茎段，在解剖镜下剥离0.6cm的茎尖分生组织进行培养，脱毒苗培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.25mg/L；得到的组培苗在38℃下进行热处理50d后，剥取0.1cm的茎尖，所得茎尖试管苗为脱除枣疯病的脱毒苗；
(3)、骏枣脱毒组培苗增殖：
以MS作为基本培养基，进行所述骏枣脱毒苗的增殖组培快繁，骏枣脱毒苗的最佳增殖培养基为MS+6-BA1.3mg/L+IBA0.7mg/L；在所述增殖培养基中添加有机物，有机物分别为：甘氨酸1.9mg/L、VB1为0.5mg/L、VB6为0.7mg/L、肌醇95mg/L、烟酸0.45mg/L；
(4)、骏枣脱毒组培苗生根培养：
当光照强度为2000Lx，环境温度为25℃时，1/2MS培养基条件下，优化的生长素为：IBA1.4mg/L+NAA0.08mg/L+IAA0.52mg/L时，经过5代的增殖继代培养，对培养后的骏枣组培脱毒苗进行生根繁育。
实施例3：
一种骏枣脱毒组培快繁的方法，主要包括以下操作处理工艺步骤:
(1)、骏枣枣树茎段外殖体快速启动：
6月份采1年生根蘖苗，取5cm带枣腋芽的枣树茎段，清洗、杀菌消毒，经49℃热水处理50min后，使材料中的病毒钝化，将上述骏枣枣树茎段进行启动培养，所述启动过程中用到的培养基为MS+6-BA0.9mg/L+NAA0.18mg/L；
(2)、骏枣茎尖脱毒培养：
取上述启动培养后的枣树茎段，在解剖镜下剥离0.7cm的茎尖分生组织进行培养，脱毒苗培养基为MS+6-BA0.9mg/L+NAA0.28mg/L；得到的组培苗在39℃下进行热处理55d后，剥取0.1cm的茎尖，所得茎尖试管苗为脱除枣疯病的脱毒苗；
(3)、骏枣脱毒组培苗增殖：
以MS作为基本培养基，进行所述骏枣脱毒苗的增殖组培快繁，骏枣脱毒苗的最佳增殖培养基为MS+6-BA1.4mg/L+IBA0.85mg/L；在所述增殖培养基中添加有机物，有机物分别为：甘氨酸2.1mg/L、VB1为0.7mg/L、VB6为0.8mg/L、肌醇102mg/L、烟酸0.52mg/L；
(4)、骏枣脱毒组培苗生根培养：
当光照强度为2300Lx，环境温度为24℃时，1/2MS培养基条件下，优化的生长素为：IBA1.6mg/L+NAA0.11mg/L+IAA0.53mg/L时，经过6代的增殖继代培养，对培养后的骏枣组培脱毒苗进行生根繁育。
实施例4：
一种骏枣脱毒组培快繁的方法，主要包括以下操作处理工艺步骤:
(1)、骏枣枣树茎段外殖体快速启动：
5月份采2年生根蘖苗，取5cm带枣腋芽的枣树茎段，清洗、杀菌消毒，经50℃热水处理58min后，使材料中的病毒钝化，将上述骏枣枣树茎段进行启动培养，所述启动过程中用到的培养基为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.25mg/L；
(2)、骏枣茎尖脱毒培养：
取上述启动培养后的枣树茎段，在解剖镜下剥离0.6cm的茎尖分生组织进行培养，脱毒苗培养基为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.35mg/L；得到的组培苗在38℃下进行热处理60d后，剥取0.2cm的茎尖，所得茎尖试管苗为脱除枣疯病的脱毒苗；
(3)、骏枣脱毒组培苗增殖：
以MS作为基本培养基，进行所述骏枣脱毒苗的增殖组培快繁，骏枣脱毒苗的最佳增殖培养基为MS+6-BA1.45mg/L+IBA0.9mg/L；在所述增殖培养基中添加有机物，有机物分别为：甘氨酸1.95mg/L、VB1为0.65mg/L、VB6为0.78mg/L、肌醇105mg/L、烟酸0.55mg/L；
(4)、骏枣脱毒组培苗生根培养：
当光照强度为2500Lx，环境温度为24℃时，1/2MS培养基条件下，优化的生长素为：IBA1.55mg/L+NAA0.12mg/L+IAA0.55mg/L时，经过7代的增殖继代培养，对培养后的骏枣组培脱毒苗进行生根繁育。
实施例5：
与实施例1相比，其不同地方在于：所述的第(1)步骤中，所述的杀菌消毒是利用升汞进行5min杀菌消毒。
实施例6：
与实施例1相比，其不同地方在于：所述的第(1)步骤中，所述的杀菌消毒是利用升汞进行6min杀菌消毒。
实施例7：
与实施例1相比，其不同地方在于：所述的第(1)步骤中，所述的杀菌消毒是利用升汞进行7min杀菌消毒。
Claims (10)
1.一种骏枣脱毒组培快繁的方法，主要包括以下操作处理工艺步骤:
(1)、骏枣枣树茎段外植体快速启动：
5～6月份采1～2年生根蘖苗，取3～5cm带枣腋芽的枣树茎段，清洗、杀菌消毒，经45～50℃热水处理50～60min后，使材料中的病毒钝化，将上述枣树茎段进行启动培养，所述启动培养中用到的培养基为MS+6-BA0.8～1.2mg/L+NAA0.15～0.25mg/L；
(2)、骏枣茎尖脱毒培养：
取上述启动培养后的枣树茎段，在解剖镜下剥离0.5～0.7cm的茎尖分生组织进行培养，脱毒苗培养基为MS+6-BA0.8～1.2mg/L+NAA0.25～0.35mg/L；得到的组培苗在37～39℃下进行热处理40～60d后，剥取0.1～0.3cm的茎尖，接种在启动培养基上，所得茎尖试管苗为脱除枣疯病的脱毒组培苗；
(3)、骏枣脱毒组培苗增殖：
以MS作为基本培养基，进行骏枣脱毒组培苗的增殖组培快繁，骏枣脱毒组培苗的增殖培养基为MS+6-BA1.3～1.5mg/L+IBA0.7～0.9mg/L；其中MS培养基中有机物的浓度分别为：甘氨酸1.9～2.1mg/L、VB1为0.5～0.7mg/L、VB60.7～0.8mg/L、肌醇95～105mg/L、烟酸0.45～0.55mg/L；
(4)、骏枣脱毒组培苗生根培养：
在光照强度为1500～2500Lx，环境温度为24～26℃，1/2MS培养基条件下，生长素为：IBA1.4～1.6mg/L+NAA0.08～0.12mg/L+IAA0.45～0.55mg/L时，对骏枣组培进行生根培养，生根培养的继代次数为4～7代。
2.如权利要求1所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述的杀菌消毒是利用升汞进行5min～7min杀菌消毒。
3.如权利要求1或2所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述的启动培养中用到的培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L。
4.如权利要求1或2所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述步骤(2)中所述脱毒苗培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L。
5.如权利要求3所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述步骤(2)中所述脱毒苗培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L。
6.如权利要求1或2所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述步骤(3)中所述骏枣脱毒组培苗的最佳增殖培养基为MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L。
7.如权利要求5所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述第(3)步骤中所述骏枣脱毒组培苗的增殖培养基为MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.8mg/L。
8.如权利要求1或2所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述步骤(3)中有机物的浓度的组合为：甘氨酸为2.0mg/L、VB10.6mg/L、肌醇为100mg/L、VB60.75mg/L、烟酸0.5mg/L。
9.如权利要求7所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述步骤(3)中有机物的浓度为：甘氨酸2.0mg/L、VB10.6mg/L、肌醇100mg/L、VB60.75mg/L、烟酸0.5mg/L。
10.如权利要求1或2所述的骏枣脱毒组培快繁的方法，其特征在于所述步骤(4)中生长素浓度和配比为IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/L。
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Granted publication date: 20160608 Termination date: 20171006 |