CN103688865B - 诱导培养基、及提高蝴蝶兰花梗成活率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱导培养基及一种可提高蝴蝶兰花梗成活率的方法，其中，所述诱导培养基为向1/2MS培养基中加入琼脂、白砂糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、羧苄青霉素、椰子汁、活性炭配制而成，如下组分在诱导培养基中的浓度分别为：琼脂7～9g/L、白砂糖15～30g/L、羧苄青霉素0～50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5～3mg/L、萘乙酸0.2～0.5mg/L、椰子汁0～100g/L、活性炭1～3g/L。本发明提供的诱导培养基，可作为蝴蝶兰花梗诱导培养基；本发明提供的可提高蝴蝶兰花梗的成活率的方法，具有成本低、灭菌污染率低、可有效提高灭菌后外植体成活率的特点。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养工厂化育苗培养技术领域，特别涉及一种在利用蝴蝶兰花梗为外植体进行初代培养时，可有效提高蝴蝶兰花梗成活率及诱导效果的方法。
背景技术
蝴蝶兰(Phalaenopsis B1.spp.)属热带气生兰，其花大，花期长，花色艳丽，色泽丰富，花形美丽别致，如蝴蝶翩翩起舞，因而得名。在热带兰中有“兰花皇后”之美称，是近年来最受欢迎的洋兰之一。
蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株很少发育侧芽，且种子极难萌发，对其进行常规性的繁殖，增殖速度很慢，故多采用组织培养的方法对其进行快速繁殖。外植体消毒是组织快繁的第一个环节，消毒彻底与否及消毒剂对外植体的损伤程度决定着离体培养系统能否成功建立，这也是限制组培快繁技术进一步应用的因素之一。目前，采用花梗腋芽作为外植体诱导培养蝴蝶兰的过程中，常常在初代诱导培养时，存在消毒不彻底，灭菌时对外植体伤害大，导致花梗成活率低等问题。羧苄青霉素是一种抗生素，目前多在医学上应用，主要用于绿脓杆菌及部分变形杆菌、大肠杆菌所引起的炎症等，少有见于组织培养应用上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导培养基，该诱导培养基可作为蝴蝶兰花梗诱导培养基；本发明同时还提供一种可提高蝴蝶兰花梗的成活率的方法，该方法具有成本低、灭菌污染率低、可有效提高灭菌后外植体成活率的特点。
本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种诱导培养基，所述诱导培养基为向1/2MS培养基中加入琼脂、白砂糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、羧苄青霉素、椰子汁、活性炭配制而成，如下组分在诱导培养基中的浓度分别为：琼脂7～9g/L、白砂糖15～30g/L、羧苄青霉素0～50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5～3mg/L、萘乙酸0.2～0.5mg/L、椰子汁0～100g/L、活性炭1～3g/L。
如下组分在诱导培养基中的浓度分别为：羧苄青霉素40～50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.5～3mg/L、萘乙酸0.4～0.5mg/L、椰子汁80～100g/L。
如下组分在诱导培养基中的浓度分别为：羧苄青霉素50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤3mg/L、萘乙酸0.5mg/L、椰子汁100g/L。
第二方面，本发明提供一种提高蝴蝶兰花梗成活率的方法，包括如下步骤：
1）把蝴蝶兰健壮母株上的成熟花梗剪成带一个芽的节段作为外植体，将其浸泡于200mg/L的羧苄青霉素溶液中，浸泡30min后取出晾干；
2）在无菌超净工作台上对外植体进行常规消毒，之后将其接种到诱导培养基中，培养14～18天左右，腋芽萌动膨大。
所述诱导培养基为向1/2MS培养基中加入琼脂、白砂糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、羧苄青霉素、椰子汁、活性炭配制而成。如下组分在诱导培养基中的浓度分别为：琼脂7～9g/L、白砂糖15～30g/L、羧苄青霉素0～50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5～3mg/L、萘乙酸0.2～0.5mg/L、椰子汁0～100g/L、活性炭1～3g/L。
优选的，如下组分在诱导培养基中的浓度分别为：羧苄青霉素40～50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.5～3mg/L、萘乙酸0.4～0.5mg/L、椰子汁80～100g/L。采用该优选培养基对花梗进行诱导培养，污染率可低至5.11%以下的水平，且萌发率可高达至94.13%，萌动时间短，仅为14～16天，综合评分高。
进一步优选的，如下组分在诱导培养基中的浓度分别为：羧苄青霉素50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤3mg/L、萘乙酸0.5mg/L、椰子汁100g/L。采用该进一步优选的诱导培养基，诱导培养效果最佳。
步骤2中，进行接种之前，先用已消毒的手术刀切除花梗两端与消毒剂接触过的切口，之后再接种到培养基中，每瓶接种5个茎段。
优选的，步骤2中，进行培养的条件为：温度25±1℃，光照强度1500～1800lx，光暗交替12h/12h，即光照12小时和不光照12小时交替进行。
所述常规消毒是指用75%酒精浸泡30s，之后再用0.1%升汞浸泡15min。
本发明的技术方案具有如下有益效果：
本发明在蝴蝶兰花梗灭菌过程中，首先采用200mg/L羧苄青霉素溶液浸泡花梗，这样可杀死花梗表面的杂菌，降低污染率，对外植体的伤害较小，有助于提高花梗灭菌后的成活率。
本发明进一步在诱导培养基中添加羧苄青霉素，在培养过程中，可进一步对外植体的内生菌产生明显的抑制作用，可减少组培过程中的污染，同时，这对花梗生长没有明显的抑制作用，而且还起到了促进腋芽萌发，缩短萌动时间的效果。
本发明进一步在诱导培养基中添加椰子汁，可有效提高蝴蝶兰腋芽的健壮度，椰子汁中富含活性物质，对腋芽萌发和芽体发育有明显的促进作用。
在本发明的诱导培养基中添加0.3%活性炭可以有效抑制褐化现象，提高花梗成活率。
诱导培养基中采用白砂糖作为碳源，在对花梗成活率和萌发率不影响的前提下，可有效降低成本。
采用本发明的方法对外植体进行灭菌及培养，具有成本低、灭菌污染率低、外植体成活率高、腋芽萌发速度快等特点，污染率可降低至4.25%。
本发明利用羧苄青霉素浸泡花梗和加入培养基中的手段，可有效提高蝴蝶兰花梗灭菌后的成活率，减少杀菌剂对外植体的伤害，同时促进腋芽萌发，缩短萌发时间。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1～7
1）配制实施例1～7所用的诱导培养基
实施例1～7的诱导培养基为向1/2MS培养基中添加琼脂、白砂糖、活性炭、椰子汁、羧苄青霉素、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸配制而成，琼脂、白砂糖、活性炭、椰子汁、羧苄青霉素、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸在实施例1～7的诱导培养基中的浓度均参见表1所示。表1中的诱导培养基编号1～7号分别依次对应于实施例1～7的诱导培养基。配置实施例1～7的诱导培养基后，将它们分别装于1～7号瓶中。所用的1/2MS培养基，其配方表如下表2所示，表2中所述的用量是指在配制1升1/2MS培养基时的用量，1/2MS培养基中的大量元素的用量为标准MS培养基的大量元素用量的一半。
表1诱导培养基各成分使用浓度
表21/2MS培养基的成分及其用量（用量是指在1升1/2MS培养基中的用量）
在配制诱导培养基时，a)可预先按照表2配制1/2MS培养基作为基础母液，然后将6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、椰子汁、活性炭加入到基础母液中，混匀后备用；b)将琼脂倒入煮沸的自来水中煮化，接着再倒入白砂糖，待溶化后，取琼脂-白砂糖溶液加入到基础母液中定容至1L，加盖灭菌备用；c)用75%酒精消毒抗生素羧苄青霉素小瓶封口后，用一次性医用注射器向小瓶中注入无菌水配成羧苄青霉素母液，用过滤灭菌器进行过滤灭菌后待用；d)待b中灭菌后培养基温度冷却至40～50℃时，在无菌的超净工作台上向培养基中加入c中过滤灭菌后的羧苄青霉素母液，混匀，配成诱导培养基。实施例1～7的各诱导培养基中琼脂、白砂糖、活性炭、椰子汁、羧苄青霉素、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸的用量参照表1。在配制诱导培养基时，除各种营养元素母液采用蒸馏水配制外，其他组分均可用自来水替代蒸馏水进行配制，这样可间接简化了组培程序和成本。
2）花梗消毒
把蝴蝶兰成熟花梗剪成带一个芽的节段，芽上下各留1.5～2cm的长度，浸泡于200mg/L的羧苄青霉素溶液中，30min后取出晾干；之后置于无菌超净工作台上，用75%酒精浸泡30s，无菌水洗3次，然后用0.1%升汞浸泡15min，无菌水洗5次。
3）花梗接种及培养
在无菌超净工作台中进行接种，用已消毒的手术刀切除花梗两端与消毒剂接触的切口，接种于实施例1～7的各诱导培养基中，每瓶接种5个带芽节段，接种后用已消毒的瓶塞封口。接种后，将培养瓶置于人工培养室中，各培养瓶所处培养环境的参数如下：温度25±1℃、光照强度1500～1800lx、光暗交替12h/12h。
对比例1～7
对比例1～7分别依次与实施例1～7基本相同，不同点在于，对比例1～7在步骤2）中没有将花梗浸泡于200mg/L的羧苄青霉素溶液中的步骤。
实施例1～7接种于诱导培养基中的花梗培养14～18天左右，发现腋芽萌动膨大。将实施例1～7和对比例1～7接种于诱导培养基中的花梗诱导培养30天后，对各培养瓶中蝴蝶兰花梗的污染率及萌发率进行统计，实验数据见表3。
表3培养30天后的实验数据
表3中，萌发率为扣除污染瓶后，萌发芽数/无菌芽数×100%
表3中，综合评价y=〔（1-污染率）+萌发率〕×100/萌动时间
由表3可以看出，在同样的诱导培养条件下，采用本发明羧苄青霉素浸种后污染率出现明显下降，特别是在诱导培养基添加一定量的羧苄青霉素（3号、4号、5号、6号诱导培养基）时，综合评分不仅没有降低，反而还有所提高。在实施例7和实施例3～6相比，其中因没有添加羧苄青霉素，其污染率明显增多，萌发率下降，腋芽萌动时间略为延迟，可见，添加羧苄青霉素能有效地降低花梗消毒的污染率，有利于提高萌发率，缩短萌发时间；从表3可以看出，6-卞氨基腺嘌呤是花梗萌发的主要诱因，在一定的浓度范围内能促进花梗的萌动及生长发育。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基为向1/2MS培养基中加入琼脂、白砂糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、羧苄青霉素、椰子汁、活性炭配制而成，在诱导培养基中的浓度分别为：琼脂7-9g/L、白砂糖15-30g/L、羧苄青霉素10-50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3mg/L、萘乙酸0.2-0.5mg/L、椰子汁80-100g/L、活性炭1-3g/L。
2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，在诱导培养基中的浓度分别为：羧苄青霉素40-50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.5-3mg/L、萘乙酸0.4-0.5mg/L、椰子汁80-100g/L。
3.根据权利要求2所述的诱导培养基，其特征在于，在诱导培养基中的浓度分别为：羧苄青霉素50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤3mg/L、萘乙酸0.5mg/L、椰子汁100g/L。
4.一种提高蝴蝶兰花梗成活率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）把蝴蝶兰健壮母株上的成熟花梗剪成带一个芽的节段作为外植体，将其浸泡于200mg/L的羧苄青霉素溶液中，浸泡30min后取出晾干；
2）在无菌超净工作台上对植体进行常规消毒，之后将其接种到诱导培养基中进行诱导培养；
所述诱导培养基为向1/2ms培养基中加入琼脂、白砂糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、羧苄青霉素、椰子汁、活性炭配制而成，在诱导培养基中的浓度分别为：琼脂7-9g/L、白砂糖15-30g/L、羧苄青霉素10-50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3mg/L、萘乙酸0.2-0.5mg/L、椰子汁80-100g/L、活性炭1-3g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在诱导培养基中的浓度分别为：羧苄青霉素40-50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.5-3mg/L、萘乙酸0.4-0.5mg/L、椰子汁80-100g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在诱导培养基中的浓度分别为：羧苄青霉素50mg/L、6-苄氨基腺嘌呤3mg/L、萘乙酸0.5mg/L、椰子汁100g/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）中，进行接种之前，先用已消毒的手术刀切除花梗两端与消毒剂接触过的切口，之后再接种到培养基中，每瓶接种5个节段。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）中，进行诱导培养的条件为：温度25±1°C，光照强度1500-18001x，光暗交替12h/12h。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述常规消毒是指用75%酒精浸泡30s，之后再用0.1%升汞浸泡15min。
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