CN101390494B - 观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法 - Google Patents

Abstract

一种观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法，利用组织培养母本植株的二次过渡栽培和外植体综合灭菌及在培养基中添加消毒杀菌剂共培养以获得无菌体系的改良方法：植物组织培养是在无菌条件下实施；其过程：母本植株进行二次过渡栽培，即在珍珠岩或陶粒中栽培2～3周后；再移至水中进行水培，诱导含有较少内生菌的新芽后，取其新芽作为外植体进行组织培养；对材料进行初步消毒和低温预处理；在诱导培养基中添加2种不同用量的消毒杀菌剂，制备出能抑菌的诱导培养基；采用综合方法对外植体进行表面消毒。具有独特、简单、实惠、应用价值高特点；在较短时间内获得大量无菌体系，节约时间、人力、经费。使无菌外植体的获得率达到65～70％。

Description

观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法

技术领域

本发明属于生物技术领域中的植物组织培养技术；特别涉及一种观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法。

背景技术：

植物组培苗的工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加势必导致组培苗成本的提高，经济损失很大；因此，组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。

植物组织培养过程中造成污染的原因是多方面的，如：外植体的消毒不彻底或由内源菌引起的污染；操作污染和环境污染；继代培养中污染，除了操作不慎带菌外，继代材料在培养室也可能被螨传播的真菌污染。

我们在试验研究时发现，竹芋属植物组培时，其外植体(顶芽或侧芽)的消毒很难，很多人因消毒不过关而前功尽弃，这是观赏竹芋组培生产中必须首先解决的关键技术问题；要使观赏竹芋组培快繁从实验室走向产业化，形成商品化，让更多的植物组培苗走向市场，因此必须研究出一种有效、实用、快捷的外植体消毒方法。

竹芋的芽全部位于栽培基质内，且地下部分有较发达的通气组织；在我们所进行的大量试验中，通过各种方法甚至有些还是特别苛刻的消毒条件，但由于竹芋组织内部可能有寄生或或共生菌，多数竹芋组织材料均不能彻底灭菌，致使竹芋组织材料的无菌外植体获得率常常低于5％。

竹芋组织材料无菌外植体获得较难，材料带菌或因灭菌消毒时间太久引起褐变，均会影响外植体的分化；外植体的选择与灭菌是植物组培快繁中的重要环节，它由原培养材料、灭菌剂、灭菌方法等因素决定，寻找快速、高效的灭菌方法，减少污染瓶的丢弃，对于减少母本植株应用数量、降低种苗生产成本具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法。

本发明的技术方案是：

观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法是利用组织培养母本植株二次过渡栽培和外植体综合灭菌及在培养基中添加消毒杀菌剂共培养的改良方法，其特征在于：

1)植物组织培养是在无菌条件下实施；其过程包括：

2)母本植株进行二次过渡栽培，即在珍珠岩或陶粒中栽培2～3周后；再移至水中进行水培，诱导含有较少内生菌的新芽后，取其新芽作为外植体进行组织培养；

3)对材料进行初步消毒和低温预处理；

4)在诱导培养基中添加2种不同用量的消毒杀菌剂，制备出能抑菌的诱导培养基；

5)采用综合方法对外植体进行表面消毒。

本发明解决了观赏竹芋组织培养中无菌体系难以获得的难题，从而形成了一种简单、易行且在无菌条件下的植物组织培养方法；

我们解决了观赏竹芋组织培养中无菌体系难以获得的难题，从而形成了一种简单、易行且在无菌条件下的植物组织培养方法，该方法独特且简单实惠，应用价值高。

针对观赏竹芋组织培养传统技术难以获得无菌体系的问题，发明人进行了大量的研究工作，最终获得了利用组织培养母本植株二次过渡栽培和外植体综合灭菌及在培养基中添加消毒杀菌剂共培养的改良方法，从而在观赏竹芋组织培养时短时间内大量获得无菌体系，建立试管苗的无菌繁殖体系，进而为丛生芽的诱导与继代增殖培养和试管苗的批量化生产提供了物质基础和技术保障。

本发明旨在提供一种科学有效的观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新法；通过该方法在短时间内大量获得无菌体系，为丛生芽的诱导与继代增殖培养提供了大量无菌系。

本发明之目的通过如下的技术方案来实现：

1)引进盆栽的观赏竹芋种苗，剪去部分老根和老叶，洗净栽培基质，在500～800倍多菌灵溶液中浸泡20min，稍晾干后栽培于已洗净的大粒珍珠岩的竹筐中，用喷壶浇足水分，每天保湿，室温保持在25～30℃；每隔4～5天喷洒1次500～800倍多菌灵溶液；

2)无土栽培2～3周后，取出植株，洗净栽培基质，并剪去部分老根和老叶，用塑料定植篮固定植株，再移至水中进行水培，玻璃瓶中水位不能太高，只需淹没根系长的1/3即可，水中加入5～10ml专用水培营养液，将培养材料置于满足植物生长的温度、光照条件的房间或设施(如温室)内进行培养；每隔4～5天喷洒1次500～800倍多菌灵溶液；3～4周后，在茎节植株处能形成4-6厘米的新芽，以此新芽作为初步灭菌的外植体；

3)先对材料进行预处理：从水培容器中取生长旺盛的竹芋植株，除去根与叶，用自来水冲洗干净后，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡5min，取出毛巾将根状茎抹干，再放入0.1％的多菌灵溶液浸泡5min；把带芽茎段置于冰箱1d(4℃～5℃)后，并用10mg/L培福朗溶液预处理16～24h备用；

4)室内配制含有消毒杀菌剂的抑菌诱导培养基：这些消毒杀菌剂包括SDAs(一种广谱生物杀菌剂，性质稳定，耐高压灭菌，能与其它抗生素配合使用)(添加量为0.2～0.3％)、0.3％～0.5％的丙酸钠、0.3％～0.5％的苯甲酸钠(苯甲酸钠、丙酸钠等常用作食品中的防腐剂，能耐高温高压，使用比较方便)、0.5％～1.0％多菌灵(多菌灵不耐高温，需要采用过滤灭菌)；这些消毒杀菌剂可以单用，也可合用；并将培养基的PH值由5.8调至4.3～4.5；

5)外植体诱导材料的表面消毒：外植体消毒用70％～75％的乙醇溶液0.5～1.0min，3.0～5.0％的次氯酸钠和0.1％的升汞1∶1混合溶液浸泡12～14min，混合溶液中加2滴吐温-80，通过磁棒搅动或不断震荡摇动，无菌水冲洗5～6次，可减少对材料的杀伤作用；用解剖刀剥除芽鳞片，每剥一层鳞片，用0.1％升汞浸泡1.0min，，无菌水冲洗三次，直至剥至露出生长点为止；将已消毒的生长点放入含0.2～0.3％杀菌剂SDAs1/4MS无机盐中浸泡10～16min后接种；

6)接种后日常管理：将培养材料置于满足植物组织培养的温度(25±1℃)、光照条件(2000～2500lux)(16h/d光照)的房间或设施(如温室)内进行培养；

7)改善环境条件：接种室与培养室要定期做好消毒与净化，接种前工作台或接种箱要开紫外灯30min以上；培养室的相对湿度应控制在70％左右，相对湿度太高时可以用抽湿机抽湿；

8)接种人员应严格执行无菌操作，对接种中所需的工具，必须经严格灭菌后才能使用；在超净工作台的操作区内，不要放入过多的待用材料，避免气流被挡住；还要定期检查超净工作台的工作质量；

9)严查接种材料，淘汰被真菌与细菌污染的接种材料；

10)经常检查消毒锅的灭菌质量，若发现问题要立即检修；

11)检查培养容器是否存在问题；培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。

本发明具有以下优点和特点：

1.该技术具有独特且简单实惠、应用价值高等优点；将其应用到观赏竹芋组织培养时能在较短的时间内大量获得无菌体系，节约时间和人力和经费，具有很好的实际应用效果。

2.本方法利用组织培养母本植株二次过渡栽培和外植体综合灭菌及在培养基中添加消毒杀菌剂共培养的改良方法；与国内目前大多数人所采用的传统常规外植体灭菌方法相比，可以较好地解决了观赏竹芋组织培养中无菌体系难以获得的难题，使无菌外植体的获得率达到65～70％，大大高于传统常规外植体灭菌法(5％以下)。

附图说明

图1是观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法技术路线图

具体实施方式

观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法是利用组织培养母本植株二次过渡栽培和外植体综合灭菌及在培养基中添加消毒杀菌剂共培养的改良方法，其特征在于：

植物组织培养是在无菌条件下实施；其过程包括：母本植株进行二次的过渡栽培，即在珍珠岩或陶粒中栽培2～3周后，再移至水中进行水培，诱导出新芽后，取其新芽进行组织培养；采取外植体综合灭菌；在培养基中添加消毒杀菌剂，制备抑菌培养基；接种后；将培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的房间或设施内进行培养；本发明解决了观赏竹芋组织培养中无菌体系难以获得的难题，从而形成了一种简单、易行且在无菌条件下的植物组织培养方法；

下面通过具体实施例，进一步详细介绍本发明；

实施例1

1)从市场购入盆栽观赏竹芋“浪星”(紫背竹芋)种苗，洗净基质，剪去部分老根和老叶，在500倍多菌灵溶液中浸泡20min后栽于已洗净的珍珠岩中，用喷壶浇足水分，每天保湿，室温保持在25～28℃；每隔5天喷洒800倍多菌灵溶液1次；

2)3周后，挖出植株，洗净珍珠岩，再次剪去部分老根和老叶，移至水中进行水培，玻璃瓶中水位只需淹没根系长的1/3即可，水中加入10ml专用水培营养液，将水培材料置于满足植物生长的温度、光照条件的房间或设施(如温室)内进行培养；每隔5天喷洒800倍多菌灵溶液1次；3～4周后，在茎节植株处形成4-6厘米的新芽；

3)从水培容器中生长旺盛的“浪星”(紫背竹芋)植株上，用小刀切取4-6厘米长的新芽，冲洗干净后，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡5min，再放入0.1％的多菌灵溶液浸泡5min；置于冰箱1d(5℃)后备用；

4)配制抑菌诱导培养基：在MS基本培养基中添加SDAs0.2％、0.3％的丙酸钠，并加入诱导芽所需的细胞分裂素和生长素，将培养基的PH值由5.8调至4.3～4.5；

5)外植体表面消毒：外植体先用75％的乙醇溶液1.0min，无菌水冲洗4次；3％的次氯酸钠和0.1％的升汞1∶1混合溶液(加吐温-80 2滴)浸泡14min，不断震荡摇动，无菌水冲洗5次；用解剖刀剥除芽鳞片，每剥一层鳞片，用0.1％升汞浸泡1.0min，，无菌水冲洗3次，直至剥至露出生长点为止；将已消毒的生长点放入含0.2～0.3％杀菌剂SDAs1/4MS无机盐中浸泡10min后接种；

6)接种后日常管理：将培养材料置于满足植物组织培养的温度(25±1℃)、光照条件(2000～2500lux)(16h/d光照)的房间或设施(如温室)内进行培养；30～35天左右开始萌发出新的丛生芽，以后视生长情况可转入继代增殖培养；

7)日常管理与其他组培要求一致。

Claims (1)

1.一种观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法，其特征在于：利用组织培养母本植株的二次过渡栽培和外植体综合灭菌及在培养基中添加消毒杀菌剂共培养以获得无菌体系的改良方法；植物组织培养是在无菌条件下实施，其过程包括：

1)母本植株进行二次过渡栽培，即在珍珠岩中栽培2～3周后；再移至水中进行水培，诱导含有较少内生菌的新芽后，取其新芽作为外植体进行组织培养；

2)对材料进行初步消毒和低温预处理；

3)在诱导培养基中添加2种不同用量的消毒杀菌剂，制备出能抑菌的诱导培养基；

4)外植体进行表面消毒；

其具体方法为：

(1)引进盆栽的观赏竹芋种苗，剪去部分老根和老叶，洗净栽培基质，在500～800倍多菌灵溶液中浸泡20min，稍晾干后栽培于已洗净的大粒珍珠岩的竹筐中，用喷壶浇足水分，每天保湿，室温保持在25～30℃；每隔4～5天喷洒1次500～800倍多菌灵溶液；

(2)无土栽培2～3周后，取出植株，洗净栽培基质，并剪去部分老根和老叶，用塑料定植篮固定植株，再移至水中进行水培，玻璃瓶中水位不能太高，只需淹没根系长的1/3即可，水中加入5～10ml专用水培营养液，将培养材料置于满足植物生长的温度、光照条件的房间或设施，温室内进行培养；每隔4～5天喷洒1次500～800倍多菌灵溶液；3～4周后，在茎节植株处能形成4-6厘米的新芽，以此新芽作为初步灭菌的外植体；

(3)先对材料进行预处理：从水培容器中取生长旺盛的竹芋植株，除去根与叶，用自来水冲洗干净后，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡5min，取出毛巾将根状茎抹干，再放入0.1％的多菌灵溶液浸泡5min；把带芽茎段置于冰箱的4℃～5℃处理1d后，用10m g/L培福朗溶液预处理16～24h备用；

(4)室内配制含有消毒杀菌剂的抑菌诱导培养基：消毒杀菌剂为：一种性质稳定，耐高压灭菌并能与其它抗生素配合使用的广谱生物杀菌剂SDAs，添加量为0.2～0.3％，和丙酸钠0.3％～0.5％；并将培养基的pH值由5.8调至4.3～4.5；

(5)外植体诱导材料的表面消毒：外植体消毒用70％～75％的乙醇溶液0.5～1.0min，3.0～5.0％的次氯酸钠和0.1％的升汞1∶1混合溶液浸泡12～14min，混合溶液中加2滴吐温-80，通过磁棒搅动或不断震荡摇动，无菌水冲洗5～6次，减少对材料的杀伤作用，用解剖刀剥除芽鳞片，每剥一层鳞片，用0.1％升汞浸泡1.0min，，无菌水冲洗三次，直至剥至露出生长点为止；将已消毒的生长点放入含0.2～0.3％杀菌剂SDAs的1/4MS无机盐中浸泡10～16min后接种；

(6)接种后日常管理：将培养材料置于满足植物组织培养的温度：25±1℃、光照条件：2000～2500lux；16h/d光照的房间或设施；温室内进行培养；

(7)改善环境条件：接种室与培养室要定期做好消毒与净化，接种前工作台或接种箱要开紫外灯30min以上；培养室的相对湿度应控制在70％，相对湿度太高时用抽湿机抽湿；

(8)接种人员应严格执行无菌操作，对接种中所需的工具，必须经严格灭菌后才能使用；在超净工作台的操作区内，不要放入过多的待用材料，避免气流被挡住；还要定期检查超净工作台的工作质量；

(9)严查接种材料，淘汰被真菌与细菌污染的接种材料；

(10)经常检查消毒锅的灭菌质量，若发现问题要立即检修；

(11)检查培养容器是否存在问题；培养容器封口用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜，塑料盖用久了易老化，密封性差，会造成污染。

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