CN1290401C - 满天星种苗的繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
满天星种苗的繁殖方法，利用组织培养技术繁殖满天星种苗，在改良MS培养基中，附加激素BA0.8-1.5mg/L，NAA0.2mg/L和马铃薯提取汁，并用0.7%的琼脂固化，按蔗糖30g/L，在pH值5.8-6、培养室温度26±2℃、光照强度1500-2000LX、光照时间12h/d下培养，用珍珠岩替代琼脂作生根基质，加入营养液。不加糖，也不通入CO2气体。本方法克服了满天星试管苗玻璃化现象，用珍珠岩替代琼脂作生根基质，效果远好于MS琼脂固化培养基，它发根整齐，根系发达，有利于后期的移栽成活，本方法简单、好操作、易推广，并简化满天星种苗规模化生产程序，降低了生产成本。
Description
技术领域：本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种植物满天星(Gypsophilapaniculata)种苗的繁殖方法。
背景技术：满天星(Gypsophila paniculata)又名丝石竹，它非常适合作插花材料，在消费市场上，与玫瑰、康乃馨、郁金香等齐名，是重要的切花品种。满天星观赏品种难收种，扦插繁殖系数低、速度慢，利用组织培养技术繁殖其种苗，对于它的切花规模化生产、保持品种优良特性都是及其重要的。满天星组培技术已有报道，但存在着满天星试管苗玻璃化，根系不发达，规模化生产方法复杂，难操作等缺点，本发明旨克服已有技术存在的不足，提供一种控制及无糖介质生根的方法。
发明内容：本发明的目的在于提供一种满天星种苗的繁殖方法，本方法在不改变原来培养条件下，仅对MS培养基进行改良，就能克服满天星试管苗玻璃化；用珍珠岩替代琼脂作生根基质，加入适量稀薄营养液，不加糖，也无须通入CO2气体，小苗在有限的密闭空间范围内，在原有培养室的条件下生根培养15-16d，效果远好于MS琼脂固化培养基，它发根整齐，根系发达，有利于后期的移栽成活。此方法简单、好操作、易推广，为简化满天星种苗规模化生产程序，降低生产成本提供了依据。
为了达到本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
满天星种苗的繁殖方法，利用组织培养技术繁殖满天星种苗，在改良MS培养基中，附加激素BA0.8-1.5mg/L，NAA0.2mg/L和马铃薯提取汁，并用0.7％的琼脂固化，按蔗糖30g/L，在PH值5.8-6、培养室温度26±2℃、光照强度1500-2000LX、光照时间12h/d下培养，用珍珠岩替代琼脂作生根基质，加入营养液。不加糖，也不通入CO2气体。
上述方法的改良MS培养基为在MS中补加NaH2PO4.H2O150mg/L，Ca(NO3)2.4H2O500mg/L，添加马铃薯提取汁200g/L。
上述方法珍珠岩消毒方法采用：未使用过的珍珠岩直接使用；使用过的珍珠岩先将其中的杂质拣出，然后在清水中清洗、浸泡，取出晒干之后放入高压灭菌锅内，125℃持续灭菌30分钟后用作生根基质。
上述方法中营养液为1/4MS无机盐添加1ppmNAA。
上述方法中马铃薯提取汁是取新鲜马铃薯，洗干净、去皮、切片，用蒸馏水和马铃薯的比例为2∶1煮开10分钟，纱布过滤后的汁液即可。
本发明的具体方法为：改良MS培养基是以MS中补加NaH2PO4.H2O150mg/L，Ca(NO3)2.4H2O500mg/L，以及马铃薯汁液200g/L，马铃薯汁液是取新鲜马铃薯，洗干净、去皮、切片，用蒸馏水和马铃薯的比例为2∶1煮开10分钟，过滤即可，然后附加激素BA0.8-1.5mg/L，NAA0.2mg/L，并用0.7％的琼脂固化，按蔗糖30g/L，在PH值5.8-6、培养室温度26±2℃、光照强度1500-2000LX、光照时间12h/d下培养，用珍珠岩替代琼脂作生根基质，使用过的珍珠岩先将其中的杂质拣出，然后在清水中清洗、浸泡，取出晒干之后放入高压灭菌锅内，125℃持续灭菌30分钟进行消毒，用作生根基质，并加入1/4MS无机盐和1ppmNAA的营养液，不加糖，不通入CO2气体。
具体实施方式：下面用本发明的实施例来进一步说明本发明，但本发明内容不以
实施例为限。
实施例1：
本发明采用以MS中补加NaH2PO4.H2O150mg/L，Ca(NO3)2.4H2O500mg/L，添加马铃薯提取汁即取新鲜马铃薯，洗干净、去皮、切片，用蒸馏水和马铃薯的比例为2∶1煮开10分钟，纱布过滤后的汁液200g/L为改良MS培养基，附加激素BA0.8-1.5mg/L，NAA0.2mg/L，并用0.7％的琼脂固化，按蔗糖30g/L，在PH值5.8-6、培养室温度26±2℃、光照强度1500-2000LX、光照时间12h/d下培养，用珍珠岩替代琼脂作生根基质，使用过的珍珠岩先将其中的杂质拣出，然后在清水中清洗、浸泡，取出晒干之后放入高压灭菌锅内，125℃持续灭菌30分钟进行消毒，用作生根基质，并加入1/4MS无机盐和1ppmNAA的营养液，不加糖，也不通入CO2气体。
下面用本发明的详细试验过程和结果来阐述本发明。
1、材料和方法
用剪刀取8-10cm长健壮的满天星(Gypsophila paniculata)嫩枝，剥去叶片，不要损伤到叶芽和顶芽，常规消毒后，用解剖刀将顶芽切下，茎杆切割为带一对叶芽的小段，接入改良培养基中，放在培养室培养。
改良培养基为MS中补加NaH2PO4.H2O150mg/L，Ca(NO3)2.4H2O500mg/L，添加马铃薯提取汁200g/L，然后用0.7％的琼脂固化、蔗糖30g/L、PH值5.8-6。培养室温度26±2℃，光照强度1500-2000LX，光照时间12h/d。马铃薯提取汁的制法：称新鲜马铃薯，洗干净后去皮、切片，用蒸馏(蒸馏水和马铃薯的比例为2∶1)煮开10min，纱布过滤后的汁液即可。
珍珠岩消毒方法：新买来的珍珠岩可直接使用，无须消毒。使用过的必须消毒，首先将珍珠岩中的杂质拣出，然后装入编织袋，扎紧袋口，放入清水中清洗、浸泡，取出晒干之后放入高压灭菌锅内，125℃持续灭菌30min即可，取出备用。营养液为1/4MS无机盐添加1ppmNAA。
2、结果和讨论
2-1、芽诱导和增殖培养
外植体接种在(1)MS+BA1+NAA0.2、(2)改良MS+BA1+NAA0.2，培养基上诱导培养，它们使外植体隐芽萌动、伸长的能力基本相同，接种5天，肉眼就能看到，芽明显伸长，10天伸长2cm；21天伸长5-6cm，顶芽萌发8-12个不定芽，茎段萌发约8个不定芽。两种培养基上培养出的苗有差异，(1)诱导出透明状玻璃化试管苗的比例大，随着继代次数增加，正常苗趋于0，(2)诱导出的表现健壮正常，玻璃化苗在2％以下。将小苗切割为4-5段，用(2)或(3)改良MS+BA0.8+NAA0.2，继代增殖培养，每段组织能培养出8-12不定芽。如此循环增殖扩大，按25天为一个培养周期，每个周期增殖8倍计算，理论上，培养5个顶芽，半年后可获得一百多万苗。在继代培养中，增加BA的浓度，丛芽数会增加(表1)，但每个芽的生长势或粗壮程度会被削弱，从而影响下一次继代繁殖；在增殖培养过程中，可根据苗的生长势适当调整BA的浓度，经长期试验，BA浓度控制在0.8-1.5mg/l为佳。
表1 不同浓度的激素水平对不定芽形成的影响
| 激素及浓度 | 接种数 | 形成不定芽数 | 平均数 |
| BA1+NAA0.2 | 11 | 123 | 11.2 |
| BA2+NAA02 | 10 | 139 | 13.9 |
| BA3+NAA02 | 12 | 196 | 16.3 |
改变培养基成分，添加马铃薯汁，玻璃化苗能控制在2％以下，通过调节激素配比、增加糖、琼脂浓度，调配光照强度、时间、培养温度以及封口膜通气状况等综合措施与已有技术比较，方法更简便、易学，经济上也更合理。
2-2、生根和移栽
将小苗带顶芽切下2cm，转入以下培养基中进行生根培养试验，(4)MS+NAA0.2、(5)MS+NAA0.2、(6)MS+NAA0.2+IBA0.2、(7)MS+NAA0.2+IBA0.2，7天后可观察到，部分小苗茎杆上开始有白色根尖长出，生根情况不很整齐，20天后观察统计，结果表明：这四组培养基，后两组比前两组稍好，(7)比(6)稍好，其生根率约89％。根大多为气生根，生长在培养基上方，长在培养基里的很少，根又细又长相互缠绕，每条长2.5cm以上，出瓶时非常容易拉断或受伤，冲洗培养基时，再次受伤，此时进行移栽，感染死亡非常严重，成活率很低。为此，产生了用珍珠岩作基质，进行生根试验的想法。
从国外引入无糖培养微繁殖和闭锁型种苗生产的理念后，已有技术在非洲菊、绿巨人、玫瑰等花卉上进行了探索。其方法是去除培养基中的糖，从而降低污染率；用塑料泡沫、蛭石、珍珠岩、岩棉、陶粒、纤维素等多孔无机材料做培养基质；培养室采用闭锁型，以便控制温度、光照、湿度，提高CO2利用率，防止病菌进入。其创新之处在于，CO2代替糖作为碳源，降低微生物污染，促使培养物从异养到自养；用多孔无机材料作培养基质，改善了根区周围的小环境，有利于发根。但该方法要求培养室密闭，需要一套CO2供气系统，其前期投入较高。
在此原理基础上，为了降低生产成本，本发明对满天星进行了无糖介质生根方法的简化(简称为简化无糖培养)试验，该方法使用：珍珠岩消毒后用作满天星试管苗的生根基质，容器可选用无色透明塑料盒，或类似材质的容器，高不低于7cm，7-10cm之间较好，长、宽在30cm以内，以便于操作，本实施例采用的容器外型长、宽、高分别为30cm、20cm、8cm。把珍珠岩倒入盒中铺平，厚2.5cm，将试管苗从瓶中轻轻取出，用自来水洗干净，摘下3-4节，约3cm长的小枝条，扦插入珍珠岩中，插入深度0.8-1cm，株行距间隔为2×2cm，之后，浇营养液，营养液用量掌握在以珍珠岩吸水100％为好，用盖子盖严、密闭，放入培养室中培养(培养室为普通培养室，无CO2通气装置)，7d后拔出小苗就可看到与珍珠岩接触的地方以及切口处，有白色根尖长出，约有5个以上；15d后，拔出小苗就可以观察到，它已发育为须根系，上面沾满了珍珠岩，手拿小苗根茎部分，量根冠长、宽约为2×1.5cm，地上部分为2-3cm。此时，可将小苗直接移栽到营养土中，注意遮荫、保温、浇水，成活率在95％以上。
小苗在14-16d内移栽较合适，此时，根系和地上部的生长势处于最佳，20d后，小苗开始抽长、拔高，苗的品质及移栽成活率开始下降，全过程容器内湿度基本不变，基质中不加糖和其他有机物质，污染率趋于0；生根苗只要掌握在16d内移栽，就可以保证较高的移栽成活率，从生产成本角度看，它节省了时间、节约了能源；它具备了无糖微培养的优势和意义，节省了闭锁培养室和CO2供气装置的投资。此外，本发明简化无糖培养可以在实验室内进行，方法简单，劳动强度低，与培养基生根比较，生根率高、根系发育好、出苗时不伤根，有利于移栽成活(表2)。
表2 满天星在琼脂固化培养基与简化无糖培养中生根及移栽后的情况比较
| 生根方法 | 提供无根苗数 | 生根数 | 生根率 | 移栽数 | 成活数 | 移栽成活率 |
| 1/2MS+NAA0.2+IBA0.2 | 210 | 187 | 89％ | 500 | 233 | 47％ |
| 简化无糖培养 | 600 | 538 | 97％ | 500 | 476 | 95％ |
本发明结果表明：以改良MS为基本培养基，附加激素BA0.8-1.5mg/L(单位下同)，NAA0.2，其培养效果最佳，玻璃化试管苗，可控制在2％以下。将小苗从试管中取出，洗去培养基，摘取3-4节约3cm长的枝条，插入事先准备好的，盛有无糖介质珍珠岩的无色透光塑料密闭容器中，浇稀薄营养液，放入普通培养室进行生根培养，5-7d后小苗开始发根，16d根系发育完好，移到室外营养杯中栽培，注意保温、遮荫、浇水，成活率在95％以上。
Claims (1)
1、满天星种苗的繁殖方法，利用组织培养技术繁殖满天星种苗，其特征在于在MS中加入NaH2PO4.H2O150mg/L，Ca(NO3)2.4H2O500mg/L的改育MS培养基中加入新鲜马铃薯经洗净、去皮、切片，用蒸馏水和马铃薯的比例为2∶1煮开10分钟，纱布过滤后的马铃薯汁液200g/L，然后附加激素BA0.8-1.5mg/L，NAA0.2mg/L，并用0.7％的琼脂固化，按蔗糖30g/L，在PH值5.8-6、培养室温度26±2℃、光照强度1500-2000LX、光照时间12h/d下培养，用珍珠岩替代琼脂作生根基质，使用过的珍珠岩先将其中的杂质拣出，然后在清水中清洗、浸泡，取出晒干之后放入高压灭菌锅内，125℃持续灭菌30分钟进行消毒，用作生根基质，并加入1/4MS无机盐和1ppmNAA的营养液，不加糖，也不通入CO2气体。
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