CN111642394B - 一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法 - Google Patents

一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于多肉植物繁殖技术领域，具体涉及一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法。本发明提供了一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基，包括独立分装的预处理培养基、愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根壮苗培养基。本发明提供的培养基组合不仅能够提高其繁殖率，还能够提高多肉丸叶海豹的成活率。

Description

一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方 法和多肉丸叶海豹栽培方法
技术领域
本发明属于多肉植物繁殖技术领域，具体涉及一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法。
背景技术
丸叶海豹(Adromischus Cooperi v.Festivus)为景天科天锦章属(水泡)多肉植物，是库珀/天锦章(Adromischus cooperi)的自然变种，分布于南非东开普敦Noorsveld。丸叶海豹是一种多年生多肉植物，较低矮，茎粗壮，身体表面光滑无毛，叶片相互簇拥，似天窗。适合生长在低温干燥的环境中，喜阳光，无需多水，喜干旱。甚得园艺爱好者的喜爱，是一种非常受欢迎的观赏植物，较珍贵。
丸叶海豹自花授粉难以得到种子，现有丸叶海豹的繁殖技术多以叶插扩繁为主，但由于其繁殖倍数低，生长缓慢，一片叶上繁殖1～2株，生长速度缓慢需要5～6个月，经济效益低，限制大面积推广，所以很难大规模繁殖，难以满足市场的需求。
植物组织培养技术是一种能快速、有效地获得克隆植株的方法，包括植物器官和体细胞胚胎发生两种主要方法，具有繁殖倍数大，繁殖规模大和保持相同遗传性状的特点。植物组织培养快繁技术包括愈伤组织诱导与增殖、诱导不定芽、生根、驯化移栽等步骤。驯化移栽工作是确保组培苗成活率的关键技术环节。在大棚或温室环境下，需要仔细认真的工人来完成此项工作。
现有的组培苗的移栽多将组培苗与培养基分开，再用清水清洗干净根部上残留的培养基。在分离和清洗小苗的过程中，很容易伤及根部或造成小苗断裂、脱落，导致小苗损伤或后期苗腐烂等损失。
丸叶海豹组培苗的根系为须根系，根倍数量较多，在培养基中根系纵横交错。如果采用现有驯化移栽技术，在组培苗和培养基的分离过程中将会发生多数根的被断掉，叶片或小苗被掰断，根系间的培养基清洗不干净而增加病原菌入侵小苗的导致小苗腐烂而降低成活率等影响经济效率的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法，本发明提供的培养基组合不仅能够提高其繁殖率，还能够提高多肉丸叶海豹的成活率。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案；
本发明提供了一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基，包括独立分装的预处理培养基、愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根壮苗培养基；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10～20mg/L细胞分裂素；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖20～30g/L、琼脂6.5～8g/L、6-BA 0.5～3.0mg/L和NAA0.5 mg/L；
所述增殖培养基以1/2MS、3/4MS或MS培养基为基本培养基，还包括20～30g/L蔗糖、1.0～3.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和6.5～8g/L琼脂；
所述不定芽诱导培养基以B5、N6、MS或WPM培养基为基本培养基，还包括0.9～2.1mg/L 6-BA和0.3～0.7mg/LNAA；
所述生根壮苗培养基以1/2WPM、1/2MS、1/2花宝、1/2N6或1/2B5培养基为基本培养基，还包括20～30g/L蔗糖、6.5～8g/L琼脂和0.1～0.5mg/L IAA。
优选的，所述预处理培养基、愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根壮苗培养基的pH值为5.6～6.0。
本发明提供了一种多肉丸叶海豹组培方法，包括以下步骤：
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
优选的，步骤(1)所述培养为暗培养；培养的时间为24～48h；培养的温度为21～25℃。
优选的，步骤(2)所述切块的厚度为2～3mm；所述培养时间为56～63天；所述培养的条件为温度21～25℃、光照12～16h/d和光照强度为1500～2500lx。
优选的，步骤(3)所述培养时间为56～63天；所述培养的温度为23～25℃、湿度为60～80％。
优选的，步骤(4)所述培养的时间为49～56天；所述培养条件为温度21～25℃、光照12～16h/d和光照强度为1500～2500lx。
优选的，步骤(5)所述不定芽的大小为0.5～1cm；所述组培苗的大小为1.5～2cm。
本发明还提供了一种多肉丸叶海豹的栽培方法，包括以下步骤：采用所述组培方法处理无菌外植体，得到组培苗；将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
优选的，所述移栽前还包括驯化无根组培苗；所述驯化的时间为2～5天。
优选的，所述基质包括以下体积份的组分：1～2份珍珠岩、2～4份沙砾和1～2份泥炭土；所述基质的湿度为30～40％；所述培养的温度为15～25℃。
本发明提供了一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基，包括独立分装的预处理培养基、愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根壮苗培养基；所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10～20mg/L细胞分裂素；所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖20～30g/L、琼脂6.5～8g/L、6-BA 0.5～3.0mg/L和NAA0.5 mg/L；所述增殖培养基以1/2MS、3/4MS或MS培养基为基本培养基，还包括20～30g/L蔗糖、1.0～3.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和6.5～8g/L琼脂；所述不定芽诱导培养基以B5、N6、MS或WPM培养基为基本培养基，还包括0.9～2.1mg/L 6-BA和0.3～0.7mg/LNAA；所述生根壮苗培养基以1/2WPM、1/2MS、1/2花宝、1/2N6或1/2B5培养基为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L IAA。本发明提供的多肉丸叶海豹组培用组合培养基包括不同种类的培养基和不同浓度组合植物生长调节剂，提高不定芽的诱导率和丸叶海豹繁殖率；本发明提供的多肉丸叶海豹组培用组合培养基不仅能够提高其繁殖率，还能够提高多肉丸叶海豹的成活率。
附图说明
图1为丸叶海豹组培技术的流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基，包括独立分装的预处理培养基、愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根壮苗培养基；所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10～20mg/L细胞分裂素；所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖20～30g/L、琼脂6.5～8g/L、6-BA 0.5～3.0mg/L和NAA0.5 mg/L；所述增殖培养基以1/2MS、3/4MS或MS培养基为基本培养基，还包括20～30g/L蔗糖、1.0～3.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和6.5～8g/L琼脂；所述不定芽诱导培养基以B5、N6、MS或WPM培养基为基本培养基，还包括0.9～2.1mg/L6-BA和0.3～0.7mg/LNAA；所述生根壮苗培养基以1/2WPM、1/2MS、1/2花宝、1/2N6或1/2B5培养基为基本培养基，还包括20～30g/L蔗糖、6.5～8g/L琼脂和0.1～0.5mg/L IAA。
在本发明中，所述预处理培养基进一步优选以MS培养基为基本培养基，还包括11～19mg/L细胞分裂素；所述预处理培养基的pH值优选为5.6～6.0。在本发明中，细胞分裂素优选包括6-BA单独或玉米素。本发明对培养基组合原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规来源即可。预处理培养基中的高浓度细胞分裂素可促进细胞分裂同时也可提高愈伤组织诱导率。能够使得外植体形成蓬松的带颗粒的愈伤组织。
在本发明中，所述愈伤组织诱导21～29g/L、琼脂6～7.5g/L、6-BA 0.7～2.8mg/L和NAA0.5 mg/L。本发明对培养基组合原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规来源即可。愈伤组织诱导培养基能够促进细胞分裂，提高外植体的愈伤组织诱导率。
在本发明中，所述增殖培养基进一步优选以MS培养基为基本培养基，还包括21～29g/L蔗糖、1.1～2.9mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和6.6～7.9g/L琼脂。本发明对培养基组合原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规来源即可。增殖培养基能够促进细胞分裂的同时促进不定芽的分化。
在本发明中，所述不定芽诱导培养基进一步优选以MS培养基为基本培养基，还包括0.9～2.1mg/L 6-BA和0.3～0.7mg/LNAA。本发明对培养基组合原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规来源即可。不定芽诱导培养基能够促进愈伤组织分化发育形成不定芽。
在本发明中，所述生根壮苗培养基进一步优选以1/2WPM培养基为基本培养基，还包括20～30g/L蔗糖、6.5～8g/L琼脂和0.1～0.5mg/L IAA本发明对培养基组合原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规来源即可。生根壮苗培养基能够促进不定芽的伸长和粗壮。
所述预处理培养基、愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根壮苗培养基的pH值优选为5.6～6.0。
本发明提供了一种多肉丸叶海豹组培方法，包括以下步骤：
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
本发明将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体。所述培养优选为暗培养；培养的时间优选为24～48h；培养的温度优选为21～25℃。所述无菌外植体优选为多肉丸叶海豹的叶片，进一步优选为经过消毒和杀菌的叶片，所述消毒和杀菌优选包括以下步骤：将多肉丸叶海豹的外植体依此用水冲洗、用洗衣粉搓洗、用消毒液浸泡、无菌水冲洗和用杀菌培养基浸泡；所述用水冲洗的时间优选为15～30min；所述洗衣粉的用量优选为1～2g，能够去除部分附着在叶表面的灰尘和微生物。所述消毒液优选为含0.1～0.2％(体积比)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的84消毒液；所述消毒液浸泡的时间为3～5min，能够去除大部分微生物；所述无菌水冲洗的次数优选为5～6次；所述无菌水冲洗后优选还优选包括用灭菌滤纸吸干表面水分；所述杀菌培养基优选以MS培养基为基本培养基，还包括250～500mg/L羧苄青霉素或头孢噻肟；所述杀菌培养基浸泡的时间为20～30min，进一步杀菌以免液体培养时发生污染。
得到预培养外植体后，本发明将所述预培养外植体切块，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织。在本发明中，所述切块的厚度优选为2～3mm；所述培养的时间优选为56～63天，更优选为60天；所述培养的条件优选为温度21～25℃、光照12～16h/d和光照强度为1500～2500lx，所述接种时优选包括将切割面接触到培养基，使外植体能够充分接触培养基，有利于提高蓬松的带颗粒的愈伤组织诱导率。
得到愈伤组织后，本发明将所述愈伤组织接种到所述，得到增殖愈伤组织。所述培养时间优选为56～63天，更优选为60天；所述培养的温度优选为23～25℃、湿度优选为60～80％。增殖培养基上培养能够提高愈伤组织增殖率的同时促进不定芽的分化。
得到增殖愈伤组织后，本发明将所述增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽。所述培养的时间优选为49～56天，更优选为56天；所述培养条件优选为温度21～25℃、光照12～16h/d和光照强度为1500～2500lx。将增殖愈伤组织种到不定芽诱导培养基上培养能够提高不定芽的分化速度和不定芽的诱导率。
得到不定芽后，本发明将所述不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。所述不定芽的大小优选为0.5～1cm；所述组培苗的大小优选为1.5～2cm。将不定芽接种到生根壮苗培养基上培养使得不定芽的伸长，粗壮和生根，进而获得健壮的小苗。
本发明还提供了一种多肉丸叶海豹的栽培方法，包括以下步骤：采用前述技术方案所述组培方法处理无菌外植体，得到组培苗；将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
本发明采用所述组培方法处理无菌外植体，得到组培苗，将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗。所述去掉根部后，本发明优选还包括将所得组培苗转移到无菌空瓶子中培养，得到无根组培苗，目的是避免从切口感染病原菌导致植物感染；所述培养的时间优选为3～7天，从而使得切口愈合，防止病原菌通过伤口处感染组培苗。
得到无根组培苗后，本发明将无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。所述移栽前优选还包括驯化无根组培苗；所述驯化的时间为2～5天；所述驯化优选包括将无根组培苗置于凉爽通风处晾晒。所述基质优选包括以下体积份的组分：1～2份珍珠岩、2～4份沙砾和1～2份泥炭土；所述基质的湿度为30～40％；所述培养的温度为15～25℃。本发明的基质为透气性比较好的颗粒状基质，其湿度低，可防止无根苗的烂根、烂苗的发生，保证小苗的成活率。
下面结合实施例对本发明提供的一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法。进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1-1
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10mg/L细胞分裂素；
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖30g/L、琼脂8g/L、6-BA 0.5mg/L和NAA 0.5mg/L；观察愈伤组织的诱导情况。
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
所述增殖培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、1.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和8g/L琼脂；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基以B5培养基为基本培养基，还包括1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
所述生根壮苗培养基以1/2WPM培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.4mg/L IAA。
(6)将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
实施例1-2
实施例1-2的愈伤组织诱导培养基6-BA的浓度为1mg/L，其余处理均与实施例1-1相同。
实施例1-3
实施例1-3的愈伤组织诱导培养基6-BA的浓度为1.5mg/L，其余处理均与实施例1-1相同。
实施例1-4
实施例1-4的愈伤组织诱导培养基6-BA的浓度为2mg/L，其余处理均与实施例1-1相同。
实施例1-5
实施例1-5的愈伤组织诱导培养基6-BA的浓度为2.5mg/L，其余处理均与实施例1-1相同。
实施例1-6
实施例1-6的愈伤组织诱导培养基6-BA的浓度为3mg/L，其余处理均与实施例1-1相同。
试验方法：实施例1-1～1-6中，将步骤(2)预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织后，均对愈伤组织的生长情况进行观察。
培养60d后通过观察和数据调查结果得来的，诱导率的计算方法为：诱导率＝(诱导愈伤组织的外植体数/接种的外植体数)x100％。本试验中MS养基上没有添加任何植物生长调节剂的培养基上接种的外植体的为实验组，其诱导率为0％。
试验结果：不同浓度6-BA处理对愈伤组织诱导的影响如表1所示。由表1可知，MS添加0.5～1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的培养基上培养的外植体的愈伤组织诱导率呈随浓度的提高而增加的趋势，MS添加2.0～3.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的固体培养基上培养的外植体的愈伤组织诱导率呈随浓度的提高逐渐降低的趋势，但其差异并不很明显。丸叶海豹叶片外植体在MS添加1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的培养基上的愈伤组织诱导效果最好，高达90％。
表1不同6-BA激素浓度对丸叶海豹愈伤组织的诱导影响
Figure GDA0003205968670000091
实施例2-1-1
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10mg/L细胞分裂素
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖30g/L、琼脂8g/L、6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L；观察愈伤组织的诱导情况。
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
所述增殖培养基以1/2MS培养基为基本，还包括1.0mg/L 6-BA和0.2mg/L IBA(具体见表2)，还包括30g/L蔗糖和8g/L琼脂；观察愈伤组织的增殖情况，称愈伤组织的重量，计算增殖率；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基以B5培养基为基本培养基，还包括0.9mg/L 6-BA和0.3mg/LNAA；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
所述生根壮苗培养基以1/2MS)培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.4mg/L IAA。
(6)将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
实施例2-1-2
实施例2-1-2的增殖培养基6-BA的浓度为2.0mg/L，其余处理均与实施例2-1-1相同。
实施例2-1-3
实施例2-1-3的增殖培养基6-BA的浓度为3.0mg/L，其余处理均与实施例2-1-1相同。
实施例2-2-1
实施例2-2-1的增殖培养基以MS培养基为基本，其余处理均与实施例2-1-1相同。
实施例2-2-2
实施例2-2-2的增殖培养基以MS培养基为基本，其余处理均与实施例2-1-2相同。
实施例2-2-3
实施例2-2-3的增殖培养基以MS培养基为基本，其余处理均与实施例2-1-3相同。
实施例2-3-1
实施例2-3-1的增殖培养基以3/4MS培养基为基本，其余处理均与实施例2-1-1相同。
实施例2-3-2
实施例2-3-2的增殖培养基以3/4MS培养基为基本，其余处理均与实施例2-1-2相同。
实施例2-3-3
实施例2-3-3的增殖培养基以3/4MS培养基为基本，其余处理均与实施例2-1-3相同。
对比例1
对比例1的增殖培养基以MS培养基为基本，6-BA的浓度为0mg/L，其余处理均与实施例2-1-1相同。
试验方法：实施例2-1～2-3中，将步骤(3)增殖培养后，均对愈伤组织的增殖情况进行观察。愈伤组织增殖倍数＝(60天后的愈伤组织重量-开始接种的愈伤组织重量)/开始接种的愈伤组织重量。
不同培养基和植物生长调节剂对愈伤组织增殖的影响如表2所示，将愈伤组织转接到1/2MS,3/4MS和MS添加不同组合的6-BA和IBA的培养基上培养两个月之后愈伤组织均呈深绿色，蓬松，愈伤组织上分化出深绿色的小芽，增殖效果好。
在1/2MS培养基添加1～3mg/L 6-BA组合0.2mg/L IBA的培养基上培养的愈伤组织增殖倍数分别为11.3、49.65和9.18，愈伤组织上分化的芽小而少。
3/4MS培养基添加1～3mg/L组合0.2mg/L IBA的培养基上培养的愈伤组织增殖倍数为11.78、10.55和9.57，愈伤组织呈绿色或淡绿色的块儿状。
MS培养基添加1～3mg/L组合0.2mg/L IBA的培养基上培养的愈伤组织增殖倍数为14.59、11.57和10.89，愈伤组织呈淡绿色，易碎的颗粒状的结构，分化的芽多、大。
表2不同培养基和植物生长调节剂对愈伤组织增殖的影响
Figure GDA0003205968670000111
实施例3-1
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10mg/L细胞分裂素
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖20～30g/L、琼脂8g/L、6-BA 1.5mg/L和NAA 0.5mg/L；观察愈伤组织的诱导情况。
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
所述增殖培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、2.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和8g/L琼脂；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基以B5培养基为基本培养基，还包括1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
所述生根壮苗培养基以1/2花宝培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.4mg/L IAA。
(6)将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
实施例3-2
实施例3-2的不定芽诱导培养基以N6培养基为基本培养基，其余处理均与实施例3-1相同。
实施例3-3
实施例3-3的不定芽诱导培养基以MS培养基为基本培养基，其余处理均与实施例3-1相同。
实施例3-4
实施例3-4的不定芽诱导培养基以WPM培养基为基本培养基，其余处理均与实施例3-1相同。
观察愈伤组织的增殖情况。
试验结果：
B5培养基上，愈伤组织生长状况良好，偶尔呈蓬松的空泡状，不定芽诱导率一般，丛生不定芽，颜色为半透明翠绿色，不定芽大多数为形态不明显的圆形突起，不定芽的平均增殖倍数为5.25。
N6培养基上，愈伤组织生长良好，呈深绿色，分化的不定芽数量较少，芽鞘发白，形态不明显，增殖倍数为3.54。
MS培养基上，愈伤组织颜色翠绿，生长状况最好，分化的不定芽数量较多，不定芽形态比较明显，增殖倍数为7.86。
WPM培养基上，愈伤组织的生长不好，偶尔在愈伤组织上观察到分化的不定芽，数量最少，芽分布稀疏，增殖倍数为3.12。
实施例4-1
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10mg/L细胞分裂素
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖30g/L、琼脂8g/L、6-BA2.0 mg/L和NAA 0.5mg/L；观察愈伤组织的诱导情况。
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
所述增殖培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、3.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和8g/L琼脂；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括1.5mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
所述生根壮苗培养基以1/2N6培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.4mg/L IAA。
(6)将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
实施例4-2
实施例4-2的不定芽诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，其余处理均与实施例4-1相同。
实施例4-3
实施例4-3的不定芽诱导培养基以1/4MS培养基为基本培养基，其余处理均与实施例4-1相同。
实施例4-4
实施例4-4的不定芽诱导培养基以1/8MS培养基为基本培养基，其余处理均与实施例4-1相同。
试验方法：将经增殖培养60天后的增殖愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养28d时，在体视显微镜下观察分化的芽点，培养到60d时，肉眼调查愈伤组织上分化的芽。
不定芽诱导率＝(产生不定芽的外植体数/接种总外植体数)×100％。
试验结果：愈伤组织转接到不同梯度MS含1.5mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA的培养基上培养15d时，愈伤组织上开始膨大，在显微镜下观察到大量的小芽点，35d后形成肉眼也能分辨的小芽。60d后发芽较完全，分化的芽形态较完整为丛生芽，其不定芽的诱导率分别为MS为93.3％，不定芽增殖倍数为5.67。
1/2MS培养基的不定芽诱导率为85％，不定芽增殖倍数为6.46；
1/4MS培养基的不定芽诱导率为96.7％，增殖倍数为10.17；
1/8MS培养基的不定芽诱导率为为83.3％，增殖倍数为9.87。
因此，1/4MS含1.5mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA培养基对不定芽诱导效果最佳。
实施例5-1
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10mg/L细胞分裂素
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖30g/L、琼脂8g/L、6-BA2.5 mg/L和NAA 0.5mg/L；观察愈伤组织的诱导情况。
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
所述增殖培养基以3/4MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、1.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和8g/L琼脂；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基设置不同处理：以1/4MS培养基为基本培养基，还包括6-BA浓度为0.9mg/L，对应的NAA浓度为0.3mg/L，观察不定芽的生成情况；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
所述生根壮苗培养基以1/2B5培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.4mg/L IAA。
(6)将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
实施例5-2
实施例5-2的不定芽诱导培养基6-BA浓度为1.2mg/L，其余处理均与实施例5-1相同。
实施例5-3
实施例5-3的不定芽诱导培养基6-BA浓度为1.5mg/L，其余处理均与实施例5-1相同。
实施例5-4
实施例5-4的不定芽诱导培养基6-BA浓度为1.8mg/L，其余处理均与实施例5-1相同。
实施例5-5
实施例5-5的不定芽诱导培养基6-BA浓度为2.1mg/L，其余处理均与实施例5-1相同。
试验方法：将诱导的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基，培养基如下：增殖培养基分别为1/2MS、3/4MS和MS培养基添加1.0～3.0mg/L 6-BA和0.1～0.2mg/L IBA的9组。接种之前，在超净工作台上称分装培养基的培养皿的重量，接种后再称重培养皿和愈伤组织的重量。培养两个月左右，称愈伤组织的重量，计算增殖率。
开始接种的鲜重(g)＝接种后的培养皿的重量-接种前培养皿的重量。
增殖倍数＝(最后愈伤组织的鲜重-开始接种的鲜重)/开始愈伤组织重量。
试验结果：愈伤组织转接到1/4MS含不同激素组合的培养基上培养14d时，愈伤组织上分化出无数的绿色的小颗粒，25d之后，可观察形态比较明显的丛生不定芽。
1/4MS+0.9mg/L 6-BA和0.3mg/LNAA的培养基上，不定芽诱导率达82％，生长良好，但形态一般，增殖倍数8.67；
1/4MS+1.2mg/L 6-BA和0.4mg/L NAA的培养基上不定芽诱导率为80％，丛生不定芽，数量较多，不定芽之间连接比较疏松，增殖倍数为6.77；
1/4MS+1.5mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA培养基上不定芽数量较多，形态比较完整，生长良好，不定芽诱导率为80％，增殖倍数为10.17；
1/4MS+1.8mg/L 6-BA和0.6mg/L NAA的培养基上不定芽诱导率为77.5％，不定芽诱导率较低，生长一般，增殖倍数为5.67；
1/4MS+2.1mg/L6-BA和0.7mg/L NAA的培养基上不定芽诱导率为72.5％不定芽芽鞘开始发白，随培养时间的增加芽鞘发白的现象更严重，增殖倍数为3.48。
综上所示，丸叶海豹不定芽诱导最适培养基和激素组合为1/4MS+1.5mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA。
实施例6-1
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10mg/L细胞分裂素
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖20～30g/L、琼脂8g/L、6-BA 3.0mg/L和NAA 0.5mg/L；观察愈伤组织的诱导情况。
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
所述增殖培养基以3/4MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、2.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和8g/L琼脂；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基以1/4MS培养基为基本培养基，还包括1.2mg/L 6-BA和0.4mg/LNAA；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
所述生根壮苗培养基以1/2WPM培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.4mg/L IAA。
(6)将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
实施例6-2
实施例6-2的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基本培养基，其余处理均与实施例6-1相同。
实施例6-3
实施例6-3的生根壮苗培养基以1/2花宝培养基为基本培养基，其余处理均与实施例6-1相同。
实施例6-4
实施例6-4的生根壮苗培养基以1/2N6培养基为基本培养基，其余处理均与实施例6-1相同。
实施例6-5
实施例6-5的生根壮苗培养基以1/2B5培养基为基本培养基，其余处理均与实施例6-1相同。
试验方法：将0.5～1.0cm大小的芽切成单株接种到1/2WPM、1/2MS、1/2花宝、1/2N6、1/2B5培养基添加0.4mg/L IAA的固体培养基，诱导生根壮苗,培养60d后记录生根数并计算其生根率。
生根率＝(产生不定根的外植体数/接种总外植体数)×100％。
试验结果：如表3所示，不定芽转接到生根培养基15d后开始逐渐生根。45d后，生根比较完全。
在1/2WPM培养基上生根的小苗健壮，根长且壮，纵横交错，较密；
在1/2MS培养基上诱导的根为须根，但根短根数少，苗比较健康。
在1/2N6培养基上诱导的根壮，根短数量多，苗小；
在1/2花宝培养基上诱导的根为脚长，根数较多，苗健康；
在1/2B5培养基上诱导的根细长，根不壮，苗小。
1/2WPM为91.1％、1/2花宝为90％、1/2N6为88.8％、1/2B5为73.3％、1/2MS为64.4％，因此，诱导生根最佳培养基为1/2WPM。
表3不同种类培养基对丸叶海豹生根的影响
Figure GDA0003205968670000181
实施例7-1
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10mg/L细胞分裂素
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖30g/L、琼脂8g/L、6-BA 1.5mg/L和NAA 0.5mg/L；观察愈伤组织的诱导情况。
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
所述增殖培养基以3/4MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、3.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和8g/L琼脂；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基以1/4MS培养基为基本培养基，还包括1.5mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
所述生根壮苗培养基以1/2WPM培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.1mg/L IAA。
(6)将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
实施例7-2
实施例7-2的生根壮苗培养基IAA浓度为0.2mg/L，其余处理均与实施例7-1相同。
实施例7-3
实施例7-3的生根壮苗培养基IAA浓度为0.3mg/L，其余处理均与实施例7-1相同。
实施例7-4
实施例7-4的生根壮苗培养基IAA浓度为0.4mg/L，其余处理均与实施例7-1相同。
实施例7-5
实施例7-5的生根壮苗培养基IAA浓度为0.5mg/L，其余处理均与实施例7-1相同。
试验方法：将0.5～1.0cm大小的芽切成单株接种到1/2WPM、1/2MS、1/2花宝、1/2N6、1/2B5培养基添加0.4mg/L IAA的固体培养基，诱导生根壮苗,培养56～60d后记录生根数并计算其生根率。
生根率＝(产生不定根的外植体数/接种总外植体数)×100％。
试验结果：不同IAA激素浓度对丸叶海豹生根的影响如表4所示，生长状况均为良好,生根率较高。
表4不同IAA激素浓度对丸叶海豹生根的影响
Figure GDA0003205968670000191
应用例1
(1)将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体(图1A)；
所述预处理培养基以MS培养基为基本培养基，还包括10mg/L细胞分裂素
(2)将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织(图1B)；
所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括蔗糖30g/L、琼脂8g/L、6-BA 1.5mg/L和NAA 0.5mg/L；观察愈伤组织的诱导情况。
(3)将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、1.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和8g/L琼脂；
(4)将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽(图1C)；
所述不定芽诱导培养基以1/4MS培养基为基本培养基，还包括1.8mg/L6-BA和0.6mg/LNAA；
(5)将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗(图1D、E)。
所述生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括0.1mg/L IAA。
(6)栽培方法：将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养(图1F)，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
具体为：以2000株组培苗为材料，在超净工作台上，用镊子取2cm大小的小苗放入消毒过不锈钢盘子里，用解剖刀切掉组织培养小苗的根部并去掉基部的2片老叶，将切下来头部转移到干净的无培养基的空瓶子里等5天，等切口愈合，太小的小苗重新转接到壮苗培养基，减少组培苗的损失。伤口愈合之后，取出去根的小苗放在育苗盘里，在凉爽通风处晾晒驯化3天(图1G)。将晾好的小苗移栽到基质。基质的配比为珍珠岩、沙砾、泥炭土按照2：4：2的比例混合基质，移栽时基质的湿度为约在40％。移栽的育苗盘转到遮阳、通风处，移栽2～3天后喷水使基质保持40％的湿度，20℃。
对比例1
以2000株组培苗为材料，采用现有的组织培养苗的驯化移栽技术，将丸叶海豹组培苗连同培养基从培养瓶倒入到加入自来水的塑料盆中，在水中用手指轻轻捏碎根部沾附的培养基并分离成单株。将沾附的培养基捏碎后，在水中轻轻漂洗，使培养基脱离根部，重复几次，直至洗净为止并舍弃无根苗、掰断苗或不适合移栽的小苗。移栽驯化条件与应用例1相同。
试验结果：处理一组培苗切割根部的成苗率为99％，其在基质中的成活率高达95％以上。小苗移栽后7d左右开始发须状根，14d左右小苗基部切割处发生多个细根，约28d左右时，开始长出新叶。小苗的成活率95％以上。
培苗在大棚环境条件下经清洗沾附的培养基之后成苗率为80％左右，被掰断的小苗约为10％左右，大小不合适或无根而被弃掉的小苗占8％左右。小苗的生长缓慢。小苗带跟移栽后10～15d左右开始发生新根，期间有些秒发生烂根、烂苗的而死掉，约2％左右。小苗移栽约40d左右时，开始长出新叶，成活率约为85％。
表明本发明的多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法能够提高多肉丸叶海豹的成活率。
本发明提供了一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法，本发明提供的培养基组合不仅能够提高其繁殖率，还能够提高多肉丸叶海豹的成活率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基，其特征在于，由独立分装的预处理培养基、愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根壮苗培养基组成；
所述预处理培养基由MS培养基和10~20 mg/L细胞分裂素组成；
所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、蔗糖20~30 g/L、琼脂6.5 ~8 g/L、6-BA 0.5~3.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L组成；
所述增殖培养基由1/2MS或3/4 MS或MS培养基、20~30 g/L蔗糖、1.0~3.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L IBA和6.5~8 g/L琼脂组成；
所述不定芽诱导培养基由B5或N6或MS或WPM培养基、0.9~2.1mg/L 6-BA和0.3~0.7 mg/L NAA组成；
所述生根壮苗培养基由1/2 WPM或1/2 MS或1/2花宝培养基、20~30 g/L蔗糖、6.5~8 g/L琼脂和0.1~0.5mg/L IAA组成。
2.如权利要求1所述的组合培养基，其特征在于，所述预处理培养基、愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根壮苗培养基的pH值为5.6~6.0。
3.一种多肉丸叶海豹组培方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述组合培养基进行组培，包括以下步骤：
（1）将无菌外植体接到所述预处理培养基上培养，得到预培养外植体；
（2）将预培养外植体切块后，接种到所述愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
（3）将愈伤组织接种到所述增殖培养基上培养，得到增殖愈伤组织；
（4）将增殖愈伤组织种到所述不定芽诱导培养基上培养，得到不定芽；
（5）将不定芽接种到所述生根壮苗培养基上培养，得到组培苗。
4.如权利要求3所述的组培方法，其特征在于，步骤（1）所述培养为暗培养；培养的时间为24~48 h；培养的温度为21~25℃。
5.如权利要求3所述的组培方法，其特征在于，步骤（2）所述切块的厚度为2~3mm；
所述培养时间为56~63天；
所述培养的条件为温度21~25℃、光照12 ~16 h/d和光照强度为1 500~2 500 lx。
6.如权利要求3所述的组培方法，其特征在于，步骤（3）所述培养时间为56~63天；所述培养的温度为23~25℃、湿度为60~80%。
7.如权利要求3所述的组培方法，其特征在于，步骤（4）所述培养的时间为49~56天；所述培养条件为温度21~25℃、光照12~16 h/d和光照强度为1500~2500 lx。
8.如权利要求3所述的组培方法，其特征在于，步骤（5）所述不定芽的大小为0.5~1 cm；
所述组培苗的大小为1.5~2 cm。
9.一种多肉丸叶海豹的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求3~8任一项所述组培方法处理无菌外植体，得到组培苗；将所述组培苗去掉根部，得到无根组培苗；将所述无根组培苗移栽至基质上培养，得到生根的多肉丸叶海豹苗。
10.如权利要求9所述的栽培方法，其特征在于，所述移栽前还包括驯化无根组培苗；
所述驯化的时间为2~5天；
所述基质包括以下体积份的组分：1~2份珍珠岩、2~4份沙砾和1~2份泥炭土；
所述基质的湿度为30~40%；
所述培养的温度为15~25℃。
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