CN104663447A - 一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，涉及钝叶瓦松（Orostachys malacophyllus）采用植物组织培养方式以达到快速繁育种苗的方法，以解决其传统繁殖方式存在繁殖系数低的问题。本发明以钝叶瓦松带芽茎段为外植体，经过外植体处理、诱导培养、继代培养、分化培养、生根及移栽等过程建立了钝叶瓦松组织培养再生体系，以期为景天科植物大量繁殖提供新的快速有效途径,为优良种质资源保存、野生资源的保护以及实现对景天科植物的可持续开发利用提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法。
背景技术
钝叶瓦松（Orostachys malacophyllus）为景天科瓦松属的二年生肉质草本植物。景天科植物，为多年生肉质草本，生于山坡或石上，品种繁多，全科植物35属，1600种，广泛分布于全球，如非洲、亚洲、欧洲，主产地为南非。中国有10属约240余种，全国各地均有分布。景天科植物植株一般矮小，肉质多汁，花开夏秋，小而多且花色各异，景天科植物耐旱力极强，栽培粗放管理，且具有一定得抗寒性，是园林中重要的观赏植物，尤其对于寒冷地区更是不可多得的园林绿化植物。我国具有极其丰富的景天科植物资源，但是仍有大部分的资源处于野生状态，有待于进一步的调查与研究。目前国内外关于景天科植物栽培繁殖方面的研究有相关报道，但涉及到的植物种类相对较少，可见对于景天科植物尤其是未经开发利用的野生资源的调查研究及探索其最适宜的繁殖方式对于合理的开发和利用景天科植物资源、保护日益减少的野生景天科资源具有重要的现实意义。
植物的组织培养技术是自20世纪以来科技进步的主要成果之一。组织培养技术既不会受到地理位置的限制、也不会受到季节的限制，它仅需要足够的实验材料，研究就可以进行，且遗传背景一致、生长周期短、成本低。钝叶瓦松作为一种颇具开发价值的野生花卉，有较强的抗旱、抗逆性，管理较粗放，自身繁衍能力也比较强，适应性广，群体种植绿化效果好，尤其对于冬季条件比较干旱寒冷地区的绿化具有极其重要的意义。由于人为过度的挖掘，致使钝叶瓦松野生资源遭到严重的破坏，蕴藏量急剧减少，因此有必要建立钝叶瓦松离体再生体系，既能解决过度开发景天科野生资源的问题，还能保存优良的种质资源，将更多的景天科植物应用到园林绿化中来，以丰富寒冷地区的园林绿化植物种类和品种，点缀城市景观，增加园林植物的品种多样性。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，本发明以钝叶瓦松带芽茎段为外植体，经过外植体处理、诱导培养、继代培养、分化培养、生根及移栽等过程建立了钝叶瓦松组织培养再生体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，包括以下的步骤：
（1）外植体消毒：采集钝叶瓦松健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒3～8min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导。接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照10～20小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成愈伤组织。培养2周后统计污染率、启动率和死亡率。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小并接种于增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～7天，然后置于每天光照13～16小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养，30天后统计愈伤组织的增殖倍数。多次反复切割进行继代培养，以得到更多的愈伤组织。
（4）分化培养：将步骤（2）或（3）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小并接种于分化培养基上进行丛生芽诱导培养。接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～16小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽。接种后定期观察愈伤组织的分化情况，30天后统计不定芽的分化率。
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的高度为0.1～0.5cm分化芽苗接种到壮苗培养中进行壮苗培养。接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～15小时，光照强度为3000～4000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至大部分试管苗高于3cm。一个月后统计高于3cm的不定芽数。
（6）生根培养：将步骤（5）过程获得的丛生芽切割成3.0～5.0cm带芽茎段并接种到生根培养基上进行诱导培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～15小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根。
（7）炼苗移栽：将步骤（6）获得的高3.0～5.0cm的根系发达且叶片展开的健壮试管苗在培养室内半开瓶口放置1～3天，然后完全敞口炼苗5～10天，洗净在根系上附着的培养基,移栽到珍珠岩:园土:蛭石＝1:1:1的混合基质中，移栽前一天将基质浇透水。保持湿度90%以上，以塑料薄膜覆盖5～10天后揭去，30天后统计成活率。
上述步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+1～4mg/L6-BA+0.2～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；
上述步骤（3）所述的增殖培养基为MS+0.1～1.0mg/LNAA+0.5～2mg/L 6-BA+0.01～0.5mg/L 2,4-D+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（4）所述的分化培养基为：MS+0.5～1.5mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（5）所述的壮苗培养基为：MS+0.5～1.0mg/L NAA+0.1～0.5mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（6）所述的生根培养基为：1/2MS+0.5～2.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
本发明的优点是：采用植物组织培养方式以达到快速繁育种苗的方法，以解决其传统繁殖方式存在繁殖系数低的问题。以钝叶瓦松带芽茎段为外植体，经过外植体处理、诱导培养、继代培养、分化培养、生根及移栽等过程建立了钝叶瓦松组织培养再生体系，以期为景天科植物大量繁殖提供新的快速有效途径,为优良种质资源保存、野生资源的保护以及实现对景天科植物的可持续开发利用提供理论依据。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）外植体消毒：采集钝叶瓦松健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗1h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒3min，用无菌水冲洗4次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导。接种后先在25℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照10小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃的条件下培养10 天在带芽莲段基部切口处出现少量结构致密绿色或黄绿色的愈伤，诱导率为81.67%。所述的诱导培养基为：MS+2mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小并接种于增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25℃条件下全暗培养4天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃的条件下培养，30天愈伤组织增殖倍数为4.67。多次反复切割进行继代培养，以得到更多的愈伤组织。所述的增殖培养基为MS+0.1mg/LNAA+1.2mg/L 6-BA+0.01mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。
（4）分化培养：将步骤（2）或（3）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小并接种于分化培养基上进行丛生芽诱导培养。接种后先在25℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃的条件下培养直至形成丛生芽。30天后统计不定芽的分化率为84.82%。所述的分化培养基为：MS+0.5mg/L NAA+15/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.5。
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的高度为0.1～0.5cm分化芽苗接种到壮苗培养中进行壮苗培养。接种后先在25℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照13小时，光照强度为3000lx，培养温度为25℃的条件下培养至大部分试管苗高于3cm。一个月后高于3cm的不定芽数达到67.45%。所述的壮苗培养基为：MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L IBA+18g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.5。
（6）生根培养：将步骤（5）过程获得的丛生芽切割成3.0～5.0cm带芽茎段并接种到生根培养基上进行诱导培养，接种后先在25℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照13小时，光照强度为3000lx，培养温度为25℃的条件下培养15天即开始生根，生根率为97.54%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.8mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。
（7）炼苗移栽：将步骤（6）获得的高3.0～5.0cm的根系发达且叶片展开的健壮试管苗在培养室内半开瓶口放置1天，然后完全敞口炼苗5天，洗净在根系上附着的培养基,移栽到珍珠岩:园土:蛭石＝1:1:1的混合基质中，移栽前一天将基质浇透水。保持湿度90%以上，以塑料薄膜覆盖7天后揭去，移栽30天后成活率为89.61%。
实施例2：
（1）外植体消毒：采集钝叶瓦松健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗2h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒10s后用无菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒5min，用无菌水冲洗6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导。接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为28℃的条件下培养13 天在带芽莲段基部切口处出现少量结构致密绿色或黄绿色的愈伤，诱导率为84.86%。所述的诱导培养基为：MS+4mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+19g/L蔗糖+3.9g/L琼脂，pH为5.8。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小并接种于增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28℃条件下全暗培养6天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为28℃的条件下培养，30天愈伤组织增殖倍数为4.38。多次反复切割进行继代培养，以得到更多的愈伤组织。所述的增殖培养基为MS+0.2mg/LNAA+1.6mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。
（4）分化培养：将步骤（2）或（3）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小并接种于分化培养基上进行丛生芽诱导培养。接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照15小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为28℃的条件下培养直至形成丛生芽。30天后统计不定芽的分化率为86.92%。所述的分化培养基为：MS+1.5mg/L NAA+20/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.8。
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的高度为0.1～0.5cm分化芽苗接种到壮苗培养中进行壮苗培养。接种后先在28℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照14小时，光照强度为3500lx，培养温度为28℃的条件下培养至大部分试管苗高于3cm。一个月后高于3cm的不定芽数达到70.16%。所述的壮苗培养基为：MS+0.8mg/L NAA+0.3mg/L IBA+21g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.8。
（6）生根培养：将步骤（5）过程获得的丛生芽切割成3.0～5.0cm带芽茎段并接种到生根培养基上进行诱导培养，接种后先在28℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照14小时，光照强度为3500lx，培养温度为28℃的条件下培养17天即开始生根，生根率为94.27%。所述的生根培养基为：1/2MS+1.2mg/L NAA+23g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.8。
（7）炼苗移栽：将步骤（6）获得的高3.0～5.0cm的根系发达且叶片展开的健壮试管苗在培养室内半开瓶口放置2天，然后完全敞口炼苗7天，洗净在根系上附着的培养基,移栽到珍珠岩:园土:蛭石＝1:1:1的混合基质中，移栽前一天将基质浇透水。保持湿度90%以上，以塑料薄膜覆盖5天后揭去，移栽30天后成活率为91.25%。
Claims (6)
1.一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）外植体消毒：采集钝叶瓦松健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒3～8min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用;
（2）愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导,接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照10～20小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成愈伤组织,培养2周后统计污染率、启动率和死亡率;
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小并接种于增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～7天，然后置于每天光照13～16小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养，30天后统计愈伤组织的增殖倍数,多次反复切割进行继代培养，以得到更多的愈伤组织;
（4）分化培养：将步骤（2）或（3）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小并接种于分化培养基上进行丛生芽诱导培养,接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～16小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽,接种后定期观察愈伤组织的分化情况，30天后统计不定芽的分化率;
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的高度为0.1～0.5cm分化芽苗接种到壮苗培养中进行壮苗培养,接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～15小时，光照强度为3000～4000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至大部分试管苗高于3cm,一个月后统计高于3cm的不定芽数;
（6）生根培养：将步骤（5）过程获得的丛生芽切割成3.0～5.0cm带芽茎段并接种到生根培养基上进行诱导培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～15小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；
（7）炼苗移栽：将步骤（6）获得的高3.0～5.0cm的根系发达且叶片展开的健壮试管苗在培养室内半开瓶口放置1～3天，然后完全敞口炼苗5～10天，洗净在根系上附着的培养基,移栽到珍珠岩:园土:蛭石＝1:1:1的混合基质中，移栽前一天将基质浇透水,保持湿度90%以上，以塑料薄膜覆盖5～10天后揭去，30天后统计成活率。
2.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+1～4mg/L6-BA+0.2～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为MS+0.1～1.0mg/LNAA+0.5～2mg/L 6-BA+0.01～0.5mg/L 2,4-D+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（4）所述的分化培养基为：MS+0.5～1.5mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
5.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（5）所述的壮苗培养基为：MS+0.5～1.0mg/L NAA+0.1～0.5mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
6.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（6）所述的生根培养基为：1/2MS+0.5～2.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150603 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |