CN109380085A - 一种望江南组织培养再生体系构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种望江南组织培养再生体系构建方法，通过无性快繁技术获得株性稳定望江南种苗的技术方法。本发明以望江南未成熟胚为外植体，经过种子消毒、胚愈伤组织诱导、分化培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤构建了望江南组织培养再生体系，既解决望江南优质种苗缺乏的问题，又可为今后开展望江南遗传转化工作奠定基础。

Description

一种望江南组织培养再生体系构建方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种望江南组织培养再生体系构建方法。
背景技术
望江南为豆科植物，取其干燥成熟种子。主产广东、广西。秋季采收成熟种子晒干。味微苦。具有清热明目，润肠。 用于肝热头痛，眩晕，目赤肿痛，便秘。望江南植物组织培养技术具有加速育种进程、缩短繁殖时间、改良植物品质、节省空间、减少劳动、可终年生产、不受自然条件限制等特点，可有效解决望江南品种选育耗时长的问题。近年来望江南组织培养研究方面取得了一定的进展，但依然存在一些问题，如外植体褐化现象严重、出梢率低、生根困难、移栽大田成活率低等，使组织培养技术在望江南中的应用受到很大的限制。因此，非常有必要建立系统的望江南离体快繁体系，为今后对望江南进行品质遗传改良奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种望江南组织培养再生体系构建方法，本发明以望江南未成熟胚为外植体，经过种子消毒、胚愈伤组织诱导、分化培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤构建了望江南组织培养再生体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种望江南组织培养再生体系构建方法，包括以下的步骤：
步骤（1），种子消毒：选择未成熟果子，去叶后于洗衣粉水浸泡34min，刷净后自来水冲洗3h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒35s后用无菌水洗10次，再用0.1%升汞溶液消毒29min，用无菌水冲洗7次后备用；
步骤（2），胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.6cm×0.6cm×0.6cm接种到诱导培养基上,先在25～28℃条件下全暗培养46天，然后置于每天光照16小时，光照强度为3300lx，直至诱导形成胚性愈伤组织；诱导培养基为：ER+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA35 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7。
步骤（3），分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照18小时，光照强度为2800lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽；分化培养基为：ER+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖19g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.7；
步骤（4），生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为5.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照17小时，光照强度为1800lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；生根培养基为：1/2MS+IBA0.2mg/L+GGR1.0mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7。
步骤（5），炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约9cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗8天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和黄沙泥混合成的基质中并定植于大田中。
与现有技术相比本发明的优点是：目前国内关于望江南组培快繁技术尚未成熟，而本发明具有简单、易行、经济的特点。通过本发明育成的望江南试管苗移栽成活率达到90%以上，可以有效解决望江南种苗缺乏的问题。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）种子消毒：选择未成熟果子，去叶后于洗衣粉水浸泡15min，刷净后自来水冲洗2h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒6s后用无菌水洗6次，再用0.1%升汞溶液消毒12min，用无菌水冲洗5次后备用，接种一周后统计污染率可低至3%。
（2）胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm接种到诱导培养基上,先在28℃条件下全暗培养30天，然后置于每天光照12小时，光照强度为1400x，直至诱导形成胚性愈伤组织，愈伤组织诱导率为67%。所述的诱导培养基为ER+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA35 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7。
（3）分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在28℃条件下全暗培养8天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2900lx，置于培养温度为28℃的条件下培养直至形成丛生芽。所述的分化培养基为ER+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖19g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.7。
（4）生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为6.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养9天，然后置于每天光照15小时，光照强度为1900lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率为89%。所述的生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L+GGR1.0mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7。
（5）炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约9cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗8天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和黄沙泥混合成的基质中并定植于大田中，移栽成活率可达92.6%。
实施例2：
（1）种子消毒：选择未成熟果子，去叶后于洗衣粉水浸泡16min，刷净后自来水冲洗3h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒8s后用无菌水洗9次，再用0.1%升汞溶液消毒11min，用无菌水冲洗9次后备用，接种一周后统计污染率可低至6%。
（2）胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm接种到诱导培养基上,先在28℃条件下全暗培养31天，然后置于每天光照13小时，光照强度为1400x，直至诱导形成胚性愈伤组织，愈伤组织诱导率为63%。所述的诱导培养基为ER+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA33 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7。
（3）分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在28℃条件下全暗培养9天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2800lx，置于培养温度为28℃的条件下培养直至形成丛生芽。所述的分化培养基为ER+6-BA1.2mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7。
（4）生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为6.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养9天，然后置于每天光照15小时，光照强度为2400lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率为85.2%。所述的生根培养基为1/2MS+IBA0.4mg/L+GGR1.5mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7。
（5）炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约12cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗9天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和黄沙泥混合成的基质中并定植于大田中，移栽成活率可达90%。

Claims (1)

1.一种望江南组织培养再生体系构建方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤（1），种子消毒：选择未成熟果子，去叶后于洗衣粉水浸泡34min，刷净后自来水冲洗3h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒35s后用无菌水洗10次，再用0.1%升汞溶液消毒29min，用无菌水冲洗7次后备用；
步骤（2），胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.6cm×0.6cm×0.6cm接种到诱导培养基上,先在25～28℃条件下全暗培养46天，然后置于每天光照16小时，光照强度为3300lx，直至诱导形成胚性愈伤组织；诱导培养基为：ER+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA35 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7；
步骤（3），分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照18小时，光照强度为2800lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽；分化培养基为：ER+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖19g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.7；
步骤（4），生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为5.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照17小时，光照强度为1800lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；生根培养基为：1/2MS+IBA0.2mg/L+GGR1.0mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.7；
步骤（5），炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约9cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗8天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和黄沙泥混合成的基质中并定植于大田中。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104663447A (zh) * 2015-03-01 2015-06-03 陈凤佳 一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法
CN104686332A (zh) * 2015-02-22 2015-06-10 刘木娇 一种茶树组织培养再生体系构建方法
CN106135005A (zh) * 2016-08-26 2016-11-23 李军 一种小松子组织培养再生体系构建方法

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