CN108935088A - 一种提高蓝莓外植体辐射诱变率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物辐射育种技术，旨在提供一种提高蓝莓外植体辐射诱变率的方法。包括：将蓝莓胚性愈伤组织置于钴⁶⁰半致死剂量的减半剂量进行重复辐射，得到胚性愈伤组织；继代增殖扩繁，再生成M0代苗；培育至开花结果，与未经辐射的目标品种进行自然杂交，收获杂交果实，得到以辐射为父母本的M1代杂交种子；培育辐射杂交种子，获得辐射杂交苗；优选结果后的目标性状，取目标材料进行组培快繁，获得不同目标性状的M2代蓝莓辐射谱系。本发明提高了辐射诱变率，降低了辐射致死率，增加辐射后有效苗的数量提高了辐射工作效率，解决蓝莓辐射育种过程中遇到的原始材料多辐射后有效材料少，辐射材料易褐变死亡、辐射诱变率低等问题。

Description

一种提高蓝莓外植体辐射诱变率的方法

技术领域

本发明属于植物辐射育种技术，具体涉及一种提高蓝莓外植体材料辐射诱变率的方法。

背景技术

蓝莓属于杜鹃花科越橘属植物，因富含花青苷，具有较突出的天然保健功效，符合现代人的康养生活理念，已成为世界范围的保健水果。中国蓝莓近年来发展很快，生产面积和从业人员数量均已达到世界领先，但单产和果实品质还远落后于世界蓝莓先进生产国，其中国外品种难以适应中国多样的气候和环境条件是主要原因之一。目前国内生产上的蓝莓主栽品种均引自国外，不适应中国南北方复杂的气候和环境条件，特别难适应中国南方地区有机质含量极低的土壤条件，生产上死树、品质变劣和产量降低等现象屡屡出现。

由于中国蓝莓野生种质资源缺乏和传统的杂交育种种质资源狭窄、亲缘关系太近、杂交周期长等原因，国内蓝莓育种难以在短期内获得超过现有品种的优良种质材料。寻求新的种质资源应用到杂交育种中去，更有利于培育出适应性、品质等方面超出现有品种的品系。利用理化因素诱变植物材料是创制新种质的一种方法，利用放射性元素开展辐射育种是诱变常用方法之一。辐射育种技术在我国水稻、小麦等禾本科草本植物中得到广泛运用，并选育出系列优良品种，由于草本植物再生能力强繁殖周期短，常选用种子、组培苗等作为辐射材料，对于木本植物来说，种子繁殖苗幼年期太长，普通外植体再生能力弱导致辐射诱变时诱变率低，辐射材料易褐变死亡，成苗率低等缺点。

诱变育种是利用理化因素诱发变异，再对突变体进行选择育成新品种的方法。与常规育种相比，可在短时间内获得有利用价值的突变体。选择适宜的诱变剂量是获得突变体材料的重要保障。在一定范围内，增加剂量可以提高突变频率，但也会增加植物的生理损伤，因此选择剂量应遵循既达到较多的变异，又不致于过大损伤植株为宜。一般认为，随着剂量的增加，存活率逐渐下降，突变频率则逐渐上升。目前国内外一般采用临界剂量和半致死剂量来确定辐射的适宜剂量，也有使用更低剂量的趋势。不同的植物对辐射敏感性不同，适宜的剂量是辐射诱变育种成功的关键因素之一。

目前的育种实践中，尚未见辐射育种在蓝莓上的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种提高蓝莓外植体辐射诱变率的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种提高蓝莓外植体辐射诱变率的方法，包括：

取蓝莓无菌培养苗，经愈伤组织培养和胚性愈伤组织诱导，在得到胚性愈伤组织后(如图1，2)，进行以下操作：

(1)将胚性愈伤组织置于钴⁶⁰半致死剂量的减半剂量进行重复辐射，得到经过多次辐射的胚性愈伤组织；

(2)将经过辐射的胚性愈伤组织继代增殖扩繁，淘汰褐变死亡的部分，获得经过辐射诱变的材料；继续诱导胚性愈伤组织，让其再生成M₀代苗；

(3)培育经辐射诱变的蓝莓组培苗至开花结果，与未经辐射的目标品种进行自然杂交，收获杂交果实，获得以辐射为父母本的M₁代杂交种子；

(4)培育辐射杂交种子，获得辐射杂交苗；优选辐射杂交苗结果后的目标性状；取目标材料进行组培快繁，获得不同目标性状的M₂代蓝莓辐射谱系。

本发明中，所述步骤(1)具体包括：

(1.1)确定蓝莓胚性愈伤组织的钴⁶⁰辐射半致死剂量

将蓝莓胚性愈伤组织置于不同剂量的钴⁶⁰辐射井内进行辐射，辐射后继代于愈伤组织增殖培养基中继代增殖培养，统计致死率，并将致死率45-55％的剂量确定为半致死剂量；

(1.2)蓝莓胚性愈伤组织钴⁶⁰的低剂量反复辐射

将胚性愈伤组织置于减半的半致死剂量钴⁶⁰辐射源中辐射1次，取出后继代于愈伤组织增殖培养基中复壮培养30-40天，再次置于相同剂量的钴⁶⁰辐射源中辐射；重复该操作2-3次，以增加变异率。

本发明中，所述钴⁶⁰辐射半致死剂量为8Gy/min，减半的半致死剂量为4Gy/min。(Gy为辐射剂量单位戈瑞，1Gy相当于辐射授予每千克质量组织或器官的能量为1焦耳。)

本发明中，在对胚性愈伤组织进行辐射前，必须先进行胚性愈伤诱导和组织切片鉴定(如图3)；复壮培养时，培养容器采用250ml罐头瓶或马铃薯瓶，每瓶接种数量4-5块。

本发明中，所述步骤(2)具体包括：

(2.1)辐射诱变后的胚性愈伤组织增殖扩繁

对经过多次辐射组织，以新鲜的愈伤组织增殖培养基进行继代增殖扩繁；为防止污染和褐变的交叉感染，接种操作时每瓶接种1块材料，继代增殖培养过程中进行暗培养，及时去除褐变和死亡的愈伤组织；

(2.2)辐射诱变后的胚性愈伤组织的再生成苗

将步骤(2.1)中获得的经过扩繁的辐射愈伤组织，接种于胚状体再生培养基，诱导成苗后继代扩繁2-3次，得到M₀代组培苗；其中，胚状体再生培养基的成分为WPM+TDZ0.1mg/L+ZT 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+活性炭0.5g/L；

(2.3)室内瓶外生根培养

取健壮的蓝莓辐射诱变组培苗M₀代，剪去粘有培养基的下端，扦插于混合生根基质里，室内继代培养条件下，生根培养3-4周；其中，

混合生根基质的配制方法：按体积比2∶1混合苔藓和蛭石后，再按10∶1的重量比例将苔藓-蛭石混合物与生根营养液混匀；

生根营养液的配制方法：配制1L的WPM培养基，加水稀释至5L；继续添加IBA，使溶液中的IBA浓度为10mg/L，调节pH值到4.5；煮沸灭菌后冷却，即得到生根营养液。

本发明中，所述愈伤组织增殖培养基中包括WPM+CPPU 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L+番茄汁10g/L。

本发明中，在步骤(2.1)的继代增殖培养过程中，将生长缓慢的材料和生长旺盛材料分开培养，对于生长缓慢的愈伤组织材料添加双倍激素配比的增殖培养基，其成分包括：WPM+CPPU 1.0mg/L+ZT 1.0mg/L+番茄汁10g/L。

本发明中，所述步骤(3)具体包括：

(3.1)将辐射诱变的蓝莓组培生根苗在适宜的环境条件下充分炼苗后，移栽上盆并移入苗圃进行正常管理，培育1年后开花结果；培育过程中根据分枝数量、枝条粗度及高度区分生长缓慢和生长较快的辐射苗，分别收集生长较快和缓慢蓝莓植株的种子；

(3.2)选择未辐射的目标品种苗，与步骤(3.1)中收获的两类种子苗分栽培行进行混植；混植后与外界进行组织隔离，到开花结果时在隔离区内释放蜜蜂，让未辐射的目标品种与经辐射诱变的品种间自然杂交结果，其杂交种子为M₁代；

(3.3)分别收集两类M₁代杂交种子，并按照常规方法培育成苗。

本发明中，所述步骤(3.1)中移栽上盆时，所使用的移栽基质按下述方法制备：按照质量份数称取泥炭70份、珍珠岩10份、稻壳10份、黄心土8份、控释肥2份，混拌均匀，消毒后灌装至50孔或72孔的穴盘中，移栽前浇透水备用。

本发明中，所述步骤(4)具体包括：

(4.1)辐射杂交种子按常规方法播种、催芽，培育容器苗；培育1-2年后定植于田间，并在其两旁定植未辐射相同父母本杂交苗作为对照，同时培育至开花结果；

(4.2)进行辐射种质目标材料的鉴定

以正常父母本杂交植株为对照，根据辐射杂交后代生长发育及开花结果情况，对于果实品质、生育期和抗逆性等方面进行田间筛选鉴定；

(4.3)建立辐射谱系

连续观察3-5年，根据果实大小、糖度、抗逆性、成熟期确认品质性状突出的辐射株系和材料，采集其幼嫩新梢按照常规方法进行组培快繁，并进行编号登记，建立M₂代蓝莓辐射育种谱系。

本发明中，所述愈伤组织增殖培养基、激素、生根营养液等，其具体成分均属于本领域公知通用的材料，其配置方式也属于本领域公知通用技术，本发明不再赘述。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明选择了完全保有母本优良性状的杂合子材料胚性愈伤组织为外植体，以低剂量高频次辐射、外植体辐射后再增殖扩繁增大有效苗数量等方法，提高了辐射诱变率，降低了辐射致死率，增加辐射后有效苗的数量提高了辐射工作效率，解决蓝莓辐射育种过程中遇到的原始材料多辐射后有效材料少，辐射材料易褐变死亡、辐射诱变率低等问题。

2、与现有同类技术相比，本发明具有下述技术优点：

①步骤1中选择的可再生的胚性愈伤组织，组织致密再生频率高，一小块胚性愈伤组织经过增殖培养后可再生50-200棵苗。作为辐射材料，细胞小而核大，实验表明其对钴⁶⁰辐射源的耐受性大大增强，从而提高了辐射半致死剂量，增加了诱变率；另外，通过半致死辐射剂量减半的反复多次辐射，降低了单次辐射致死率而提高了辐射诱变率。

②步骤2采用辐射胚性愈伤组织的增殖扩繁和再生技术，淘汰褐变及死亡的辐射材料，并适度扩繁未死亡的材料，在辐射初期材料不变的情况下，增大变异苗数量，增加辐射诱变苗的成苗率。

③步骤3对辐射材料分长势强弱情况进行培育，通过加强栽培管理，尽可能保持辐射变异范围，进行目标品种杂交并培育成苗，让辐射性状在田间表现以利于选择；

④步骤4以正常材料为对照，优选目标种质材料，并通过组培扩繁扩大繁殖，及时及早的固定变异并扩大材料数量，有利于后续杂交育种工作中种质资源的及时利用。

附图说明

图1为胚性愈伤组织块。

图2为辐射前的胚性愈伤组织。

图3胚性愈伤组织鉴定显微电镜照片(放大40倍)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供了增加蓝莓外植体辐射诱变率的方法，取蓝莓无菌培养苗，经愈伤组织培养和胚性愈伤组织诱导，在得到胚性愈伤组织(如图1)的基础上再进行以下操作：

步骤1、胚性愈伤组织钴⁶⁰低剂量反复多次辐射。

分二个步骤进行。首先，确定蓝莓胚性愈伤组织钴⁶⁰辐射半致死剂量。将诱导获得的蓝莓胚性愈伤组织材料置于钴⁶⁰辐射井内进行不同剂量辐射实验，辐射后及时继代于愈伤组织增殖培养基(WPM+CPPU 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L+10g/L番茄汁)中培养，统计并获得蓝莓胚性愈伤组织钴⁶⁰半致死剂量为8Gy/min。

其次，蓝莓胚性愈伤组织钴⁶⁰辐射剂量确定和重复辐射。将胚性愈伤组织置于钴⁶⁰半致死剂量减半辐射1次，然后带回实验室继代于WPM+CPPU 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L+番茄汁10g/L培养基中复壮培养30-40天，再次置于以上同样剂量的钴⁶⁰辐射源中继续辐射，重复2-3次，以增加变异率，得到经过多次辐射的胚性愈伤组织；

步骤2、辐射后胚性愈伤组织材料的继代扩繁。

步骤1辐射诱变后，将材料带回实验室后，立刻配制新鲜的愈伤组织增殖培养基，进行继代增殖扩繁。为防止污染和褐变的交叉感染，接种操作时每瓶接种1块材料，继代增殖培养过程中进行暗培养，并及时去除褐变和死亡的部分；将生长缓慢的材料和生长旺盛材料分开培养，对于生长缓慢的愈伤组织材料添加双倍激素配比的增殖培养基，其成分包括：WPM+CPPU 1.0mg/L+ZT 1.0mg/L+番茄汁10g/L。将获得的经过扩繁的辐射愈伤组织，接种于胚状体再生培养基(WPM+TDZ 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+活性炭0.5g/L)，诱导成苗后切取茎段适当继代扩繁2-3次，得到M₀代组培苗。将健壮的蓝莓辐射诱变组培苗(M₀代)从组培瓶内取出，剪去粘有培养基的下端，扦插于添加生根营养液的苔藓和蛭石(体积比2：1)混合生根基质里，室内常规条件下，生根培养3-4周。

混合生根基质的配制方法：按体积比2∶1混合苔藓和蛭石后，再按10∶1的重量比例将苔藓-蛭石混合物与生根营养液混匀；生根营养液的配制方法：配制1L的WPM培养基，加水稀释至5L；继续添加IBA，使溶液中的IBA浓度为10mg/L，调节pH值到4.5；煮沸灭菌后冷却，即得到生根营养液。

步骤3、培育辐射后的蓝莓组培苗，并杂交获得以辐射后的苗为父母本的种子。

配制移栽基质：按照质量份数称取泥炭70份、珍珠岩10份、稻壳10份、黄心土8份、控释肥2份混拌均匀。将辐射诱变的蓝莓组培生根苗在适宜的环境条件下充分炼苗后，先培育穴盘苗后移栽上盆并移入苗圃进行正常管理，培育过程中根据分枝数量、枝条粗度和高度区分生长缓慢的辐射苗和生长较快的生根苗，培育1年后即可开花结果，分别收集枝数和粗度生长快和缓慢的蓝莓植株的种子。选择未辐射的目标品种苗与收获的两类种子苗分栽培行进行混植，并与外界进行组织隔离，花期隔离区内释放蜜蜂，让两类品种间自然杂交结果，其杂交种子为M₁代。收集杂交种子(M₁代)按照常规方法培育成苗。

步骤4,培育经辐射后的苗作为父母本的杂交种子，优选辐射杂交苗，通过组培快繁获得蓝莓辐射谱系。

收集辐射杂交种子，按常规方法播种、催芽，培育容器苗。对于生长缓慢和畸形的苗，加强栽培管理以利于成活，培育1-2年后定植于田间，并在其两旁定植正常父母本杂交苗作为对照，同时培育至开花结果。对辐射种质目标材料的鉴定，以正常父母本杂交植株为对照，根据辐射杂交后代生长发育及开花结果情况，对于果实品质、生育期和抗逆性等方面进行田间筛选鉴定，建立辐射谱系。对于连续多年观察后性状突出的辐射株系和材料，采集其幼嫩新梢按照常规方法进行组培快繁，并进行编号登记，建立M₂代蓝莓辐射育种谱系。

Claims (10)

1.一种提高蓝莓外植体辐射诱变率的方法，其特征在于，包括：

取蓝莓无菌培养苗，经愈伤组织培养和胚性愈伤组织诱导，在得到胚性愈伤组织后，进行以下操作：

(1)将胚性愈伤组织置于钴⁶⁰半致死剂量的减半剂量进行重复辐射，得到经过多次辐射的胚性愈伤组织；

(2)将经过辐射的胚性愈伤组织继代增殖扩繁，淘汰褐变死亡的部分，获得经过辐射诱变的材料；继续诱导胚性愈伤组织，让其再生成M₀代苗；

(3)培育经辐射诱变的蓝莓组培苗至开花结果，与未经辐射的目标品种进行自然杂交，收获杂交果实，获得以辐射为父母本的M₁代杂交种子；

(4)培育辐射杂交种子，获得辐射杂交苗；优选辐射杂交苗结果后的目标性状；取目标材料进行组培快繁，获得不同目标性状的M₂代蓝莓辐射谱系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：

(1.1)确定蓝莓胚性愈伤组织的钴⁶⁰辐射半致死剂量

将蓝莓胚性愈伤组织置于不同剂量的钴⁶⁰辐射井内进行辐射，辐射后继代于愈伤组织增殖培养基中继代增殖培养，统计致死率，并将致死率45-55％的剂量确定为半致死剂量；

(1.2)蓝莓胚性愈伤组织钴⁶⁰的低剂量反复辐射

将胚性愈伤组织置于减半的半致死剂量钴⁶⁰辐射源中辐射1次，取出后继代于愈伤组织增殖培养基中复壮培养30-40天，再次置于相同剂量的钴⁶⁰辐射源中辐射；重复该操作2-3次，以增加变异率。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述钴⁶⁰辐射半致死剂量为8Gy/min，减半的半致死剂量为4Gy/min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在对胚性愈伤组织进行辐射前，必须先进行胚性愈伤诱导和组织切片鉴定；复壮培养时，培养容器采用250ml罐头瓶或马铃薯瓶，每瓶接种数量4-5块。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

(2.1)辐射诱变后的胚性愈伤组织增殖扩繁

对经过多次辐射组织，以新鲜的愈伤组织增殖培养基进行继代增殖扩繁；为防止污染和褐变的交叉感染，接种操作时每瓶接种1块材料，继代增殖培养过程中进行暗培养，及时去除褐变和死亡的愈伤组织；

(2.2)辐射诱变后的胚性愈伤组织的再生成苗

将步骤(2.1)中获得的经过扩繁的辐射愈伤组织，接种于胚状体再生培养基，诱导成苗后继代扩繁2-3次，得到M₀代组培苗；其中，胚状体再生培养基的成分为WPM+TDZ 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+活性炭0.5g/L；

(2.3)室内瓶外生根培养

取健壮的蓝莓辐射诱变组培苗M₀代，剪去粘有培养基的下端，扦插于混合生根基质里，室内继代培养条件下，生根培养3-4周；其中，

混合生根基质的配制方法：按体积比2∶1混合苔藓和蛭石后，再按10∶1的重量比例将苔藓-蛭石混合物与生根营养液混匀；

生根营养液的配制方法：配制1L的WPM培养基，加水稀释至5L；继续添加IBA，使溶液中的IBA浓度为10mg/L，调节pH值到4.5；煮沸灭菌后冷却，即得到生根营养液。

6.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织增殖培养基中包括WPM+CPPU 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L+番茄汁10g/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(2.1)的继代增殖培养过程中，将生长缓慢的材料和生长旺盛材料分开培养，对于生长缓慢的愈伤组织材料添加双倍激素配比的增殖培养基，其成分包括：WPM+CPPU 1.0mg/L+ZT 1.0mg/L+番茄汁10g/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：

(3.1)将辐射诱变的蓝莓组培生根苗在适宜的环境条件下充分炼苗后，移栽上盆并移入苗圃进行正常管理，培育1年后开花结果；培育过程中根据分枝数量、枝条粗度及高度区分生长缓慢和生长较快的辐射苗，分别收集生长较快和缓慢蓝莓植株的种子；

(3.2)选择未辐射的目标品种苗，与步骤(3.1)中收获的两类种子苗分栽培行进行混植；混植后与外界进行组织隔离，到开花结果时在隔离区内释放蜜蜂，让未辐射的目标品种与经辐射诱变的品种间自然杂交结果，其杂交种子为M₁代；

(3.3)分别收集两类M₁代杂交种子，并按照常规方法培育成苗。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.1)中移栽上盆时，所使用的移栽基质按下述方法制备：按照质量份数称取泥炭70份、珍珠岩10份、稻壳10份、黄心土8份、控释肥2份，混拌均匀，消毒后灌装至50孔或72孔的穴盘中，移栽前浇透水备用。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：

(4.1)辐射杂交种子按常规方法播种、催芽，培育容器苗；培育1-2年后定植于田间，并在其两旁定植未辐射相同父母本杂交苗作为对照，同时培育至开花结果；

(4.2)进行辐射种质目标材料的鉴定

以正常父母本杂交植株为对照，根据辐射杂交后代生长发育及开花结果情况，对于果实品质、生育期和抗逆性等方面进行田间筛选鉴定；

(4.3)建立辐射谱系

连续观察3-5年，根据果实大小、糖度、抗逆性、成熟期确认品质性状突出的辐射株系和材料，采集其幼嫩新梢按照常规方法进行组培快繁，并进行编号登记，建立M₂代蓝莓辐射育种谱系。