CN102090336B - 一种杜衡组织培养的繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杜衡组织培养的繁殖方法，该方法包括以下步骤：（1）选取外植体并进行消毒；（2）将处理后的外植体切割后，进行愈伤组织诱导培养；（3）将步骤（2）中所得愈伤组织进行继代增殖培养；（4）对继代增殖培养后的愈伤组织进行分化诱导；（5）将经分化处理后的愈伤组织进行侧芽诱导培养；（6）对步骤（5）中得到的无根苗进行生根诱导。采用该繁殖方法对杜衡进行组织培养，增殖率为50-72倍，且繁殖速度快。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种杜衡(Asarum forbesiiMaxim.)组织培养的繁殖方法。
背景技术
杜衡(Asarum forbesiiMaxim.)，又称南细辛，马兜铃科（Aristolochiaceae）细辛属（Asarum L.）多年生草本植物，块茎的节间短，下端集生多数肉质根。叶一二枚，生于茎端。单花顶生。蒴果肉质，具多数黑褐色种子。生于阴湿有腐植质的林下或草丛中。是一种极具园林观赏价值的地被植物。此外，全草均可入药，为珍贵中药材之一。有散寒止咳、祛风止痛的功效。主要药物成分是黄樟醚（safrole）和少量的丁香浊酚（eugend）。杜衡不仅是一种很好的药用植物，还是国家二级保护动物——中华虎凤蝶（Luehdorfia chinensis Leech.）喜食的植物。在南京紫金山地区，中华虎凤蝶的寄主即为杜衡。由于杜衡具有很高的药用价值，近年来遭到过度采挖，数量越来越少，威胁了中华虎凤蝶的生存。因此，如何开发杜衡资源为中华虎凤蝶提供食源，是亟待解决的问题。
有关杜衡及其同属植物的组织培养，国内外鲜有报道。李洪林等通过嫩芽为外植体研究了杜衡的组织培养，得出了芽增殖、壮苗和生根培养基配方（杜衡的组织培养，植物生理学通讯，2004年第4期，454页）。王金平等采用叶柄为外植体研究了杜衡的组织培养（杜衡的组织培养研究，信阳师范学院学报，2000年第3期，310-312页）。周建中以茎尖为外植体，进行了杜衡离体繁殖的研究（杜衡离体繁殖的研究，生物学杂志，2002年第4期，16-18页）。以往研究均得到了杜衡的增殖培养基和生根培养基，但未从愈伤途径得出最佳的杜衡组织培养的激素组合，因此增殖率相对比较低。
郭忠仁等通过研究外源激素对杜衡叶柄愈伤组织诱导与分化的影响（外源激素对杜衡叶柄愈伤组织诱导与分化的影响，植物资源与环境学报，2010年19卷第1期，38-42页），得到了适宜的杜衡叶柄愈伤组织诱导和分化培养基。该方法虽然能够适当地提高愈伤组织的分化率和增殖系数，但对于继代增殖、侧芽诱导和生根过程仍有待研究。此外，未见有报道在高增殖率继代过程中解决无菌苗块茎褐化的问题。
发明内容
本发明的目的是为了提高杜衡组织培养的增殖率和增殖速度。
为了达到上述目的，本发明提供了一种杜衡组织培养的繁殖方法，包括如下步骤：
（1）外植体的选取与消毒：选取当年生叶柄作为外植体，冲洗干净后，进行消毒；
（2）愈伤组织的诱导：取步骤（1）中处理得到的外植体，切割为0.5-1.0cm长的小段，将叶柄接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为20-26℃，首先在黑暗中培养20-26小时，然后进行正常培养20-25天；所述正常培养条件为：光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Ix；所述诱导培养基为MS培养基并添加激素6-BA、NAA和2,4-D；所述诱导培养基中6-BA浓度为1.0mg/L，NAA浓度为0.3mg/L，2,4-D浓度为1.0mg/L；
（3）愈伤组织的继代增殖：将步骤（2）中得到的杜衡愈伤组织切割后接入继代增殖培养基中进行继代培养25-35天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Ix；所述继代增殖培养基为MS培养基并添加激素6-BA和NAA；所述继代增殖培养基中6-BA浓度为5.0mg/L，NAA浓度为0.2mg/L；
（4）愈伤组织的分化：取步骤（3）中继代增殖得到的杜衡愈伤组织，切割后接入分化培养基中培养15-20天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Ix；所述分化培养基为MS培养基并添加激素6-BA、IBA和NAA；所述分化培养基中6-BA浓度为3.0mg/L，IBA浓度为0.1mg/L，NAA浓度为0.3mg/L；
（5）无菌苗的侧芽诱导：取步骤（4）中分化所得杜衡芽苗接入无激素MS培养基中培养15-20天后，接入侧芽诱导培养基中培养25-35天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Ix；所述侧芽诱导培养基为MS培养基并添加激素6-BA和IBA；所述侧芽诱导培养基中6-BA浓度为3.0mg/L，IBA浓度为0.2mg/L；
（6）根的诱导：将步骤（5）中经侧芽诱导后所得杜衡试管苗进行切割后，接入生根培养基中进行生根培养10-15天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Ix；所述切割后的试管苗每株均带有块茎；所述生根培养基为1/2 MS培养基并添加激素IBA；所述生根培养基中IBA浓度为3.0mg/L；
上述诱导培养基、继代增殖培养基、分化培养基、无激素MS培养基、侧芽诱导培养基、生根培养基中均含有琼脂6.0-7.0g/L（优选6.5g/L）、蔗糖25-35g/L（优选30g/L），且pH值为5.6-5.8。
对于本发明的进一步改进在于，步骤（1）中外植体的选取与消毒的具体过程为：选取当年生叶柄作为外植体，用清水冲洗干净，用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗干净，再用自来水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震荡漂洗30分钟，接着用自来水流水冲洗30分钟，84消毒液（稀释50倍）摇床上振荡消毒10分钟。流水冲洗20-30分钟后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50-60秒，立即倒入0.1%的升汞消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5分钟；
步骤（2）中最佳的正常培养时间为20天；步骤（3）中最佳继代增殖培养时间为25天；步骤（4）中最佳分化培养时间为15天；步骤（5）中的侧芽诱导培养基中还含有活性炭，所侧芽诱导培养基中活性炭浓度为1000mg/L，最佳侧芽诱导培养时间为25天；步骤（6）中的生根培养基中还含有活性炭，所述生根培养基中活性炭浓度为1000mg/L，最佳生根培养时间为10天。
本发明杜衡组织培养的繁殖方法具有以下优点：
1、继代增殖培养基相对愈伤组织的诱导培养基增加了6-BA的浓度，促进细胞分裂、诱导块茎形成，进而增大愈伤组织中细胞团的数量；同时去除了2,4-D，避免其干扰植物体内的激素平衡，破坏核酸与蛋白质代谢，从而导致无菌苗茎叶扭曲、变形变异；适当降低NAA浓度，以促进愈伤组织生长；
2、在对愈伤组织分化得到的杜衡芽苗进行侧芽诱导时，首先经过无激素培养基的过渡培养，消除外源激素对植物体内的影响，使内部激素达到平稳水平，有利于芽苗的健壮生长；经过无激素培养后，杜衡无根苗体内激素达到了相对低的水平，此时适当增加生长素的剂量，能够有效地促进腋芽的生长；同时添加适量的活性炭，吸附植株分泌出的有毒次生代谢物，使植株生长活力保持旺盛，起到遏制褐化的作用；
3、生根诱导时，添加IBA促进生根，同时添加适量的活性炭，有效地遏制褐化；
4、采用本发明的组织培养繁殖方法，最终增殖率为50-72倍；其中采用继代增殖培养基，增殖倍数为4倍；采用侧芽诱导培养基，侧芽诱导率为80%，平均诱导侧芽数为3.4；采用生根培养基，生根率为80%-90%，平均生根数为2.3。
具体实施方式
培养基筛选实施例
1、愈伤组织的继代增殖培养基的筛选：
选取经诱导培养后的愈伤组织切割成面积约为0.5cm2的小块，接入5种继代增殖培养基中进行继代培养25天，培养温度26℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000Ix。
试验发现相对于诱导培养基的激素添加量（6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+2,4-D 1.0mg/L），当继代培养基中去除2,4-D，维持NAA的浓度，同时6-BA浓度不增加或增加不大时（浓度为1.0-3.0mg/L），愈伤组织生长速度缓慢，基部开始褐化；当6-BA浓度增加至5.0mg/L时，愈伤组织生长加快，基部未见褐化出现，但缺点是在NAA浓度没有降低的条件下，愈伤组织比较疏松；当6-BA浓度增加至5.0mg/L，同时NAA浓度降低至0.2mg/L时，愈伤组织明显致密，呈现暗绿色。（参见表1）
因此继代增殖培养基选用MS培养基，同时含有激素6-BA的浓度为5.0mg/L、NAA的浓度为0.2mg/L，继代增殖倍数能达到4倍。
表1 继代增殖培养基的筛选
| 培养基 | 30天增殖倍数（面积比） | 生长速度 | 生长状态 | 褐化程度 |
| MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L | 1.2 | 缓慢 | 疏松 | 较重 |
| MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L | 1.5 | 缓慢 | 疏松 | 较重 |
| MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L | 2.0 | 缓慢 | 疏松 | 中度 |
| MS+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.3mg/L | 4.0 | 较快 | 疏松 | 无 |
| MS+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.2mg/L | 4.0 | 较快 | 致密 | 无 |
2、侧芽诱导培养基的筛选
选取分化出不定芽的愈伤组织接入无激素的MS培养基上继续培养，培养温度26℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000Ix。20天后愈伤组织发育成块茎，切割，选取健壮的芽苗接入5种侧芽诱导培养基中进行侧芽诱导30天，培养温度26℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000Ix。
由表2可以看出：
1）NAA效果不如IBA，单独使用浓度为0.4mg/L的IBA效果优于单独使用浓度为0.4mg/L的NAA，侧芽数量增加，且有一定大小的块茎。
2）IBA浓度提高有利于侧芽诱导：在含有0.1mg/L IBA的培养基上培养，无根苗没有分化侧芽，只有由一个叶柄直立生长；而在增加IBA浓度后，在0.2mg/L水平上，平均侧芽诱导数为3.4，在0.4mg/L水平上，平均侧芽诱导数为2.2。
3）IBA浓度过高也会影响侧芽的生长：0.4mg/L水平诱导的侧芽数量明显小于0.2mg/L水平，同时生长状态不如0.2mg/L水平，块茎生长较小，侧芽生长不大且褐化严重。
表2 侧芽诱导培养基的筛选
| 培养基 | 诱导率 | 侧芽诱导数 | 生长状态 | 褐化程度 |
| MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.4mg/L | 80% | 1.8 | 矮小（＜1cm），无块茎，不易分割 | 严重 |
| MS+6-BA 3.0mg/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.3mg/L | 0 | 0 | 直立生长，叶柄长3cm | 无 |
| MS+6-BA 3.0mg/L+IBA 0.1mg/L | 0 | 0 | 直立生长，叶柄长4cm | 无 |
| MS+6-BA 3.0mg/L+IBA 0.2mg/L | 80% | 3.4 | 有块茎，侧芽叶柄分离角度大，较长（2cm左右）容易分割 | 轻度 |
| MS+6-BA 3.0mg/L+IBA 0.4mg/L | 80% | 2.2 | 矮小（＜1cm），有较小块茎，不易分割 | 严重 |
块茎大小直接影响生根效果，如果生长太小，分割后无根苗所带块茎必然很少，不利于块茎上分化不定根。因此侧芽诱导培养基选用MS培养基，同时含有激素6-BA的浓度为3.0mg/L、IBA的浓度为0.2mg/L，侧芽诱导率为80%，侧芽诱导数为3.4。
为了遏制该培养基产生的褐化，在培养基中添加活性炭进行遏制褐化的梯度试验：
1）培养基中活性炭浓度为125mg/L，侧芽诱导率为10%，且褐化严重，接种第8天时，培养基全部变成黑色；
2）培养基中活性炭浓度为500mg/L，侧芽诱导率为60%，轻度褐化，接种第8天时，培养基颜色大部分为白色；
3）培养基中活性炭浓度为1000mg/L，侧芽诱导率为80%，无褐化，诱导倍数3倍以上，即平均侧芽诱导数为3个以上；
4）培养基中活性炭浓度为1500mg/L，侧芽诱导率为74%，无褐化，诱导倍数为1.3倍，即平均侧芽诱导数为1.3个；
5）培养基中活性炭浓度为2000mg/L，侧芽诱导率为70%，无褐化，诱导倍数1倍以下，即诱导出侧芽的无根苗侧芽个数只有1个。
由此可以看出，活性炭添加少，则起不到遏制褐化的作用；但活性炭浓度过高，又会吸附培养基中的激素，使激素效果发挥不出来，影响植物的生长。因此需选用最合适的浓度（1000mg/L），才能发挥活性炭的最佳效果。
3、生根培养基的筛选
将侧芽诱导得到的杜衡无根苗不定芽切割后，每株需带有一小块块茎，接入3种生根培养基（见表3）中进行生根培养基中进行生根培养，培养温度26℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000Ix。选取最佳的生根培养基，添加不同剂量的活性炭进行遏制褐化处理（见表4）。
试验结果表明，最佳的生根培养基为1/2MS培养基（即采用MS培养基中物质的一半剂量），IBA浓度为2.0mg/L，活性炭浓度为1000mg/L。
表3 生根培养基的筛选
| 培养基 | 开始生根时间 | 生根数 | 生根率 | 30天后根长 | 变异情况 |
| MS+IBA 1mg/L | 20天 | 1.3 | 83% | 2cm | 无 |
| MS+IBA 3mg/L | 10天 | 2.3 | 92% | 5cm | 无 |
| MS+IBA 5mg/L | 10天 | 1.3 | 85% | 3cm | 10%产生变异，呈气生根状，向上生长 |
表4 活性炭浓度筛选
| 活性炭浓度 | 褐化程度 | 开始生根时间 | 生根数 | 生根率 | 30天后根长 |
| 500 mg/L | 严重 | 18天 | 1.1 | 87% | 0.8cm |
| 1000 mg/L | 轻度 | 12天 | 2.6 | 95% | 5cm |
| 2000 mg/L | 轻度 | 20天 | 1.0 | 80% | 2cm |
方法实施例一
1、选取50株健壮无病虫害的杜衡野生苗移入温室进行盆栽培养，并将植株所有叶柄在地表处全部剪去。60天后，剪取新萌发的地上部分，去除叶片，以叶柄为外植体，每根长约4-5cm。共剪取叶柄100根。
2、将外植体用清水冲洗干净，用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗干净，再用自来水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震荡漂洗30分钟，接着用自来水流水冲洗30分钟，84消毒液（稀释50倍）摇床上振荡消毒10分钟。流水冲洗20-30分钟后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50-60秒，立即倒入0.1%的升汞消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5分钟。将消毒后的外植体切割为0.5-1.0cm长的小段，共切取叶柄段300段，接种于诱导培养基MS+6-BA 1.0mg/L +NAA 0.3 mg/L +2,4-D 1.0 mg/L中进行愈伤组织的诱导，控制培养温度在26℃，首先在黑暗中培养26小时，然后进行光照培养20天，光照时间16小时/天，光照强度为2000Ix。
3、外植体接于诱导培养基4天后开始出现细菌污染，污染率达40%，剩余未污染叶柄段180段。接种7天后，叶柄开始弯曲，10天后开始有外植体两端长出颗粒状愈伤，15天后诱导率达到90%，即162段。继续培养5天后，至愈伤组织面积约为1cm2，选取愈伤组织颗粒致密的150段外植体，切除未分化的叶柄，将愈伤组织一分为二（即面积约为0.5 cm2），接入继代增殖培养基MS+6-BA5.0mg/L +NAA 0.2 mg/L中进行继代培养，共接入300块愈伤组织，培养温度26℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000Ix。经过25天的继代增殖培养，愈伤组织面积约为2cm2，即增殖4倍。
4、将愈伤组织切割后，每块约0.5 cm2，共计1200块，接入分化培养基MS+6-BA 3.0mg/L +IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L进行培养，培养条件同上。15天后，愈伤组织上分化出2-4个数量不等的不定芽，共计3980个。
5、将分化出不定芽的愈伤组织接入无激素的MS培养基上继续培养，培养条件同上。20天后愈伤组织发育为块茎，将芽苗进行切割，从3980个芽苗中选取健壮的3500株接入侧芽诱导培养基MS+6-BA 3.0mg/L+IBA 0.2 mg/L，培养条件同上。25天后，在无根苗基部，叶柄与块茎交界处发育出2-4个数量不等的不定芽，共计8100个，每个不定芽含两片带叶柄的幼叶。
6、将杜衡无根苗不定芽切割后，每株需带有一小块块茎，接入生根培养基中进行生根培养1/2 MS+IBA 3.0 mg/L，培养条件同上。10天后，在块茎周围长出2-3条不定根，生根苗共7290株，生根率为90%。至此，以最初100根叶柄外植体为基数，增殖率达到了72.9倍。
以上所有培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.6-5.8。
以上无激素继代培养基、侧芽诱导培养基及生根培养基中还含有浓度为1000mg/L的活性炭。
方法实施例二
1、选取50株健壮无病虫害的杜衡野生苗移入温室进行盆栽培养，并将植株所有叶柄在地表处全部剪去。60天后，剪取植株新萌发的地上部分，去除叶片，以叶柄为外植体，每根长约4-5cm。共剪取叶柄100根。
2、将外植体用清水冲洗干净，用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗干净，再用自来水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震荡漂洗30分钟，接着用自来水流水冲洗30分钟，84消毒液（稀释50倍）摇床上振荡消毒10分钟。流水冲洗20-30分钟后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50-60秒，立即倒入0.1%的升汞消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5分钟。将消毒后的外植体切割为0.5-1.0cm长的小段，共切取叶柄段300段，接种于诱导培养基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L中进行愈伤组织的诱导，控制培养温度在20℃,首先在黑暗中培养20小时，然后进行光照培养25天，光照时间10小时/天，光照强度为1600Ix。
3、外植体接于诱导培养基4天后开始出现细菌污染，污染率达45%，剩余未污染叶柄段165段。接种9天后，叶柄开始弯曲，13天后开始有外植体两端长出颗粒状愈伤，15天后诱导率达到70%，即116段。继续培养10天后，至愈伤组织面积约为1cm2，选取愈伤组织颗粒致密的100段外植体，切除未分化的叶柄，将愈伤组织一分为二（即面积约为0.5cm2），接入继代增殖培养基MS+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.2 mg/L中进行继代培养，共接入200块愈伤组织，培养温度26℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000Ix。经过35天的继代增殖培养，愈伤组织面积约为2cm2，即增殖4倍。
4、将愈伤组织切割后，每块约0.5 cm2，共计800块，接入分化培养基MS+6-BA 3.0mg/L +IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L进行培养，培养条件同上。18天后，愈伤组织上分化出2-4个数量不等的不定芽，共计2840个。
5、将分化出不定芽的愈伤组织接入无激素的MS培养基上继续培养，培养条件同上。20天后愈伤组织发育为块茎，将芽苗进行切割，从2840个芽苗中选取健壮的2700株接入侧芽诱导培养基MS+6-BA 3.0mg/L+IBA 0.2 mg/L，培养条件同上。25天后，在无根苗基部，叶柄与块茎交界处发育出2-4个数量不等的不定芽，共计6300个，每个不定芽含两片带叶柄的幼叶。
6、将杜衡无根苗不定芽切割后，每株需带有一小块块茎，接入生根培养基中进行生根培养1/2 MS+IBA 3.0 mg/L，培养条件同上。15天后，在块茎周围长出2-3条不定根，生根苗共5040株，生根率为80%。至此，以最初100根叶柄外植体为基数，增殖率达到了50.4倍。
以上所有培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.6-5.8。
以上无激素继代培养基、侧芽诱导培养基及生根培养基中还含有浓度为1000mg/L的活性炭。
Claims (4)
1.一种杜衡组织培养的繁殖方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）外植体的选取与消毒：选取当年生叶柄作为外植体，冲洗干净后，进行消毒；
（2）愈伤组织的诱导：取步骤（1）中处理得到的外植体，切割为0.5-1.0cm长的小段，将叶柄接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为20-26℃，首先在黑暗中培养20-26小时，然后进行正常培养20-25天；所述正常培养条件为：光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；所述诱导培养基为MS培养基并添加激素6-BA、NAA和2,4-D；所述诱导培养基中6-BA浓度为1.0mg/L，NAA浓度为0.3mg/L，2,4-D浓度为1.0mg/L；
（3）愈伤组织的继代增殖：将步骤（2）中得到的杜衡愈伤组织切割后接入继代增殖培养基中进行继代培养25-35天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；所述继代增殖培养基为MS培养基并添加激素6-BA和NAA；所述继代增殖培养基中6-BA浓度为5.0mg/L，NAA浓度为0.2mg/L；
（4）愈伤组织的分化：取步骤（3）中继代增殖得到的杜衡愈伤组织，切割后接入分化培养基中培养15-20天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；所述分化培养基为MS培养基并添加激素6-BA、IBA和NAA；所述分化培养基中6-BA浓度为3.0mg/L，IBA浓度为0.1mg/L，NAA浓度为0.3mg/L；
（5）无菌苗的侧芽诱导：取步骤（4）中分化所得杜衡芽苗接入无激素MS培养基中培养15-20天后，接入侧芽诱导培养基中培养25-35天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；所述侧芽诱导培养基为MS培养基并添加激素6-BA和IBA；所述侧芽诱导培养基中6-BA浓度为3.0mg/L，IBA浓度为0.2mg/L；所述侧芽诱导培养基中还含有活性炭，所述侧芽诱导培养基中活性炭浓度为1000mg/L；
（6）根的诱导：将步骤（5）中经侧芽诱导后所得杜衡试管苗进行切割后，接入生根培养基中进行生根培养10-15天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；所述切割后的试管苗每株均带有块茎；所述生根培养基为1/2 MS培养基并添加激素IBA；所述生根培养基中IBA浓度为3.0mg/L；所述生根培养基中还含有活性炭，所述生根培养基中活性炭浓度为1000mg/L；
上述诱导培养基、继代增殖培养基、分化培养基、无激素MS培养基、侧芽诱导培养基、生根培养基中均含有琼脂6.0-7.0g/L、蔗糖25-35g/L，且pH值为5.6-5.8。
2.根据权利要求1所述杜衡组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述步骤（2）中的正常培养时间为20天；所述步骤（3）中的继代增殖培养时间为25天；所述步骤（4）中的分化培养时间为15天；所述步骤（5）中的侧芽诱导培养时间为25天；所述步骤（6）中的生根培养时间为10天。
3.根据权利要求1所述杜衡组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述步骤（1）中进行消毒过程为：将清洗干净的外植体置于稀释50倍的84消毒液中振荡消毒10分钟，流水冲洗20-30分钟后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50-60秒，立即置于0.1%的升汞中消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5分钟。
4.根据权利要求1所述杜衡组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述诱导培养基、继代增殖培养基、分化培养基、无激素MS培养基、侧芽诱导培养基、生根培养基中均含有琼脂6.5g/L、蔗糖30g/L。
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