CN111448991B - 一种利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法 - Google Patents

Abstract

一种利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法，以糯玉米的幼胚作为外植体，将外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，经过继代培养，得到胚性愈伤组织。本发明中的愈伤组织诱导培养基中添加了N6盐、AgNO₃、N6维生素、谷氨酰胺、MES、水解酪蛋白、2,4‑D、脯氨酸等，有效提高糯玉米自交系幼胚的胚性愈伤组织诱导率，获得的愈伤组织色泽淡黄、结构致密、生长旺盛，分化培养后，分化率为72％以上，获得再生植株，整个再生过程的培养时间约需4‑5个月，为糯玉米功能基因的研究奠定技术基础。

Description

一种利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法。

背景技术

糯玉米(Zea mays L.var.certain Kulesh)，又称蔬果玉米，属于鲜食玉米。随着人们对生活健康的追求，膳食结构也随之改变。糯玉米越来越受到消费者的青睐，目前逐渐成为种植业中最具竞争优势和发展潜力的新兴产业之一。

我国糯玉米品种食味品质育种研究已达到较高水平，从分子生物学水平解析糯玉米品质、性状等机制仍是科研人员亟待解决的问题。

建立一个高效的遗传转化体系是基因功能研究开展的前提条件，而建立良好的受体材料再生体系是植物遗传转化的基础，然而糯玉米的再生过程仍然面临着季节限制、诱导率过低等问题。

目前，已经能从玉米不同的外植体中诱导出胚性愈伤组织，如幼胚、成熟胚、茎尖、幼嫩叶段、丛生芽、腋芽、花药、幼嫩花序等，利用玉米幼苗的芽尖和根尖获得高效再生体系，克服了获得幼胚季节的限制。

尽管玉米不同部位的外植体诱导愈伤组织取得了一定的进展，但是玉米的基因型复杂、品系繁多，玉米幼胚、成熟胚、茎尖、幼嫩叶段的诱导率和成苗率仍然较低。

玉米的基因型直接影响愈伤组织诱导效果，研究发现，在同一培养基上不同基因型的愈伤组织诱导率有很大差异，导致愈伤组织状态也有差异，尤其是对于糯玉米，其自交系的诱导率明显低于杂交种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法，可在光照条件下获得胚性愈伤组织，有效提高糯玉米自交系幼胚的胚性愈伤组织诱导率，诱导率提高至50％以上，获得的愈伤组织色泽淡黄、结构致密、生长旺盛，分化培养后，分化率为72％以上，获得再生植株，整个再生过程的培养时间约需4-5个月，为糯玉米功能基因的研究奠定技术基础。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：

1)选取外植体

取授粉9-14天的糯玉米幼穗，除去包叶、消毒，挑取幼胚作为外植体；

2)诱导愈伤组织

将外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养7-10天后盾片膨大，及时去芽及根状体；诱导培养15天后挑选色泽淡黄、结构致密、生长旺盛的愈伤组织进行继代培养，每15-20天继代1次，继代2-3次获得胚性愈伤组织。

进一步，步骤2)中的诱导培养在植物组织培养室光照条件下进行。

优选地，步骤2)中，愈伤组织诱导培养基包括：N6盐4-4.5g/L、AgNO₃ 0.1-10mg/L、N6维生素1-1.2ml/L、谷氨酰胺0-300mg/L、MES 0-500mg/L、水解酪蛋白0-500mg/L、肌醇0-100mg/L、天冬氨酸0-200mg/L、2,4-D 1.5-2mg/L、脯氨酸700-1400mg/L、蔗糖30-35g/L和植物凝胶3-3.5g/L，pH＝5.8-6.0。

进一步，步骤2)中，所述愈伤组织诱导培养基包括：N6盐4-4.2g/L、AgNO₃ 0.85-1mg/L、N6维生素1-1.1ml/L、谷氨酰胺250-300mg/L、MES 400-500mg/L、水解酪蛋白400-500mg/L、2,4-D 1.5-2mg/L、脯氨酸700-1400mg/L、蔗糖30-32g/L和植物凝胶3-3.2g/L，pH＝5.8-5.85。

又，步骤1)中，所述幼胚长度为0.8-1.2mm。

进一步，步骤1)中的消毒方法为：将除去包叶的幼穗置于70-75％酒精中浸泡10-20min进行消毒。

进一步，步骤2)之后，还包括以下步骤：

3)分化培养

将胚性愈伤组织转移至分化培养基中进行培养，每15-20天继代1次，直至获得分化再生苗；所述分化培养基包括：MS盐4.3g/L、MS维生素1ml/L、谷氨酰胺300mg/L、MES500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、2,4-D 1mg/L、6-BA 1-2mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH＝5.8；

4)生根培养及炼苗

将长至3-5cm的分化再生苗转移至生根培养基中进行培养，获得生根苗；生根苗的根长为2-3cm时，去掉培养瓶的封口膜炼苗，再洗净生根苗上的培养基、移栽。

优选地，本发明的糯玉米品种为糯玉米自交系SWL01。

本发明提供一种用于糯玉米幼胚组织培养的愈伤组织诱导培养基，其各成分及含量包括：N6盐4-4.2g/L、AgNO₃ 0.85-1mg/L、N6维生素1-1.1ml/L、谷氨酰胺250-300mg/L、MES 400-500mg/L、水解酪蛋白400-500mg/L、2,4-D 1.5-2mg/L、脯氨酸700-1400mg/L、蔗糖30-32g/L和植物凝胶3-3.2g/L，pH＝5.8-5.85。

本发明以糯玉米自交系的幼胚作为外植体进行诱导培养，根据糯玉米自交系幼胚的特点，配制了合适的愈伤组织诱导培养基，在该体系下，愈伤组织的诱导可在植物组织培养室的光照条件下进行，诱导出愈伤组织，并进一步得到胚性愈伤组织。

本发明的愈伤组织诱导培养基中添加的2,4-D是诱导单子叶植物在离体培养时由体细胞变成胚性细胞的重要激素，具有诱发玉米幼胚细胞分裂，引起细胞脱分化和无序增殖，形成愈伤组织的作用，然而，高浓度2,4-D对愈伤组织和外植体伤害极大，本发明中控制2,4-D的添加量为1.5-2mg/L，愈伤组织呈现鲜黄色，颗粒状，诱导率高，具有良好的胚性。

本发明提供的糯玉米幼胚组织培养体系，以不同激素及氨基酸组合作为基本培养基，探究了2,4-D与脯氨酸的添加组合对胚性愈伤组织的诱导率的影响；2,4-D与脯氨酸的配合浓度对胚性愈伤组织的诱导率有显著影响，较低浓度的2,4-D与高浓度脯氨酸组合时，利于提高胚性愈伤组织的诱导率，而与较低浓度的脯氨酸组合时，胚性愈伤组织的诱导率较低；较高浓度的2,4-D与较低浓度的脯氨酸组合时，玉米幼胚胚性愈伤组织的诱导率高于其与高浓度脯氨酸的配合，本发明控制2,4-D的添加量为1.5-2mg/L，脯氨酸700-1400mg/L。

本发明的愈伤组织诱导培养基中，AgNO₃能显著提高胚性愈伤组织的比率，Ag⁺是较好的乙烯活性抑制剂，通过与细胞膜上的乙烯受体蛋白竞争性结合，从而起到阻止或降低乙烯的作用，促进愈伤组织的诱导；AgNO₃还可以防止愈伤组织的褐化和玻璃化；添加的谷氨酰胺和水解酪蛋白作为氮源，MES作为质膜稳定剂；添加的天冬氨酸、肌醇能够有效促进愈作组织的形成，这些组分的配合对胚性愈伤组织诱导和分化具有一定的促进作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中，在一定添加量的N6盐、AgNO₃、N6维生素、谷氨酰胺、MES、水解酪蛋白等存在的情况下，低浓度的2,4-D和高浓度的脯氨酸相组合，有效的提高糯玉米SWL01幼胚胚性愈伤组织诱导率，胚性愈伤组织的数量多，诱导率在50％以上。

本发明中获得的愈伤组织色泽淡黄、结构致密、生长旺盛，分化培养后，分化率为72％以上，获得再生植株，整个再生过程的培养时间约需4-5个月，为糯玉米功能基因的研究奠定技术基础。

附图说明

图1-3是本发明实施例中糯玉米幼胚愈伤组织诱导培养状态图，其中，图1为置于愈伤组诱导培养基的幼胚；图2为幼胚培养7天后长出芽及根状体的状态；图3为去除芽及根状体的状态。

图4是本发明实施例中糯玉米幼胚愈伤组织分化培养状态图。

图5是本发明实施例中糯玉米幼胚分化苗生根状态图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明中，所用的MS盐、MS维生素、N6盐和N6维生素分别购自PhytoTechnologyLaboratories^TM公司的M&S Basal Salt Mixture，M&S Vitamin SOL(1000×)，CHU’s N6Basal Salt Mixture和CHU’s N6 Vitamin SOL(1000×)。

实施例一种糯玉米幼胚的组织培养方法，包括以下步骤：

1)准备外植体

以糯玉米自交系SWL01为材料，取授粉9-14天的幼穗，剥去外层包叶(无虫眼、无蚜虫害)，剩两层在超净工作台上用75％酒精擦试，剥去最后一层包叶后置于75％酒精中浸泡15min取出，用无菌滤纸吸去75％酒精后备用；选取消毒好的玉米幼穗上的0.8-1.2mm幼胚作为外植体；

2)诱导愈伤组织

将选取的外植体接种至愈伤组织诱导培养基中，于植物组织培养室内进行光照培养，培养条件：温度26℃，光照强度2000lux，光照时间16h/天；接种后7天，盾片膨大，及时去除芽及根状体，参见图1-3。

15天后挑选色泽淡黄、结构致密、生长旺盛的愈伤组织，更换新鲜的愈伤组织诱导培养基，进行继代培养，每15-20天继代1次，继代2-3次获得胚性愈伤组织。

本实施例对比了不同激素浓度配比下，进行糯玉米幼胚愈伤组织诱导培养情况，分别以A-E为基本培养基，添加蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8，具体如下：

基本培养基A：N6盐4g/L、AgNO₃ 0.85mg/L、N6维生素1ml/L、半胱氨酸300mg/L；

基本培养基B：N6盐4g/L、AgNO₃ 0.85mg/L、N6维生素1ml/L、谷氨酰胺300mg/L、MES500mg/L、水解酪蛋白500mg/L；

基本培养基C：N6盐4g/L、AgNO₃ 0.85mg/L、N6维生素1ml/L、MES 500mg/L、水解酪蛋白500mg/L；

基本培养基D：N6盐4g/L、AgNO₃ 0.85mg/L、N6维生素1ml/L、肌醇100mg/L、水解酪蛋白500mg/L；

基本培养基E：N6盐4g/L、AgNO₃ 0.85mg/L、N6维生素1ml/L、天冬氨酸200mg/L、水解酪蛋白500mg/L。

以不同浓度2,4-D(1.5mg/L，2mg/L)和脯氨酸(700mg/L，1400mg/L)分别与基本培养基A-E组合进行愈伤组织诱导培养基的优化，每个组合接种幼胚100个，并计算不同愈伤组织诱导培养基诱导率，参见表1。

其中，诱导率＝胚性愈伤组织数/接种幼胚数(100)×100％

表1 诱导培养基组合及其胚性愈伤数

由表1可见，不同激素配比培养基的愈伤诱导率不同，添加低浓度的2,4-D时，随脯氨酸浓度的增加，胚性愈伤组织的诱导率从显著增加，如1.5mg/L2,4-D与700mg/L脯氨酸组合时，胚性愈伤组织的诱导率较低，与1400mg/L脯氨酸组合时，胚性愈伤组织的诱导率为成倍增加，变化显著，其中基本培养基B出愈率最高，且基本培养基B与1.5mg/L2,4-D和1400mg/L脯氨酸组合，胚性愈伤数量最多，诱导率为51％。

通过以上结果，确定愈伤组织诱导最适培养基为：N6盐4g/L、AgNO₃ 0.85mg/L、N6维生素1ml/L、谷氨酰胺300mg/L、MES 500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、2,4-D 1.5mg/L、脯氨酸1400mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH＝5.8。

3)愈伤组织的分化培养

将胚性愈伤组织转移至分化培养基，对愈伤组织进行分化培养，参见图4，培养条件：温度26℃，光照强度2000lux，光照时间16h/天，每15-20天更换新鲜的分化培养基继代1次，直至获得分化再生苗，参见图5。

以MS盐4.3g/L、MS维生素1ml/L、谷氨酰胺300mg/L、MES 500mg/L、水解酪蛋白500mg/L为基本培养基，分别选取2,4-D 1mg/L和不同浓度的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0mg/L、1mg/L、1.5mg/L、2mg/L的添加量组合进行考察，每个组合选择50个胚性愈伤组织。

分化培养结果发现，随着其中6-BA浓度的升高，愈伤组织的分化数减少，愈伤组织分化数量依次为10，36，13，5个，当6-BA浓度为1mg/L时，愈伤组织分化数最多为36个，分化率为72％，说明该培养基体系下，6-BA1mg/L最适合愈伤组织分化。

4)生根培养及炼苗

将长至3-5cm的分化再生苗转移至生根培养基中进行培养，培养条件：温度26℃，光照强度2000lux，光照时间16h/天，获得生根苗；其中，生根培养基为：1/2MS、IBA 1mg/L、活性炭1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH＝5.8。

生根苗的根长为2cm时，将培养瓶的封口膜去掉，开瓶保存5天后，取出组培苗洗净，移栽到土里，完成再生过程。

Claims (4)

1.一种利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：

1)选取外植体

取授粉9-14天的糯玉米幼穗，除去包叶、消毒，挑取幼胚作为外植体；

2)诱导愈伤组织

将外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养7-10天后盾片膨大，及时去芽及根状体；诱导培养15天后挑选色泽淡黄、结构致密、生长旺盛的愈伤组织进行继代培养，每15-20天继代1次，继代2-3次获得胚性愈伤组织；

3)分化培养

将胚性愈伤组织转移至分化培养基中进行培养，每15-20天继代1次，直至获得分化再生苗；

所述步骤2)中，愈伤组织诱导培养基，其各成分及含量为：

N6盐4g/L、AgNO₃ 0.85mg/L、N6维生素1ml/L、谷氨酰胺300mg/L、MES 500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、2,4-D 1.5mg/L、脯氨酸1400mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH＝5.8；

所述步骤2)中的诱导培养在植物组织培养室光照条件下进行，培养条件为：温度26℃，光照强度2000lux，光照时间16h/天；

所述步骤3)中，分化培养基的各成分及含量为：

MS盐4.3g/L、MS维生素1ml/L、谷氨酰胺300mg/L、MES 500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、2,4-D 1mg/L和6-BA 1mg/L；

所述糯玉米品种为糯玉米自交系SWL01。

2.根据权利要求1所述利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述幼胚长度为0.8-1.2mm。

3.根据权利要求1所述利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法，其特征在于，步骤1)中的消毒方法为：将除去包叶的幼穗置于70％-75％酒精中浸泡10-20min进行消毒。

4.根据权利要求1所述利用糯玉米幼胚诱导胚性愈伤组织的培养方法，其特征在于，还包括以下步骤：

4)生根培养及炼苗

将长至3-5cm的分化再生苗转移至生根培养基中进行培养，获得生根苗；生根苗的根长为2-3cm时，去掉培养瓶的封口膜炼苗，再洗净生根苗上的培养基、移栽。

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