CN102257965A - 以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法 - Google Patents

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耿丽丽
束长龙
张�杰
宋福平
黄大昉
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Abstract

本发明涉及以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，属于生物技术领域。本发明采用幼叶作为花生再生体系的外植体，在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上诱导出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸长培养基上促进不定芽伸长，再于含有NAA的生根培养基上培养生根，得到生根小苗，可以按常规方法移植栽培。本发明建立的再生体系，其芽诱导率高达40％左右，芽伸长率达79％。继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。

Description

以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法。
背景技术
花生是世界重要的油料作物之一，我国的花生产量居世界首位。一些生物及非生物胁迫都会影响花生的产量，尤其是地下害虫、真菌及细菌病害。尽管传统的杂交育种可以得到一些抗虫抗病的品系(Garcia et al.，2006)，但是花生栽培品种遗传多样性低(Kochert et al.，1991)，杂交育种周期长，育成的抗病性状通常与其他非预期的性状连锁，因此，目前通过分子育种手段培育花生品种，改良花生品质具有明显的优势。
再生体系的效率是基因转化成功与否的关键，植物再生体系就是利用细胞的全能性，通过组织培养途径或其他非组织培养途径，在外源激素的作用下经过器官发生或胚体细胞高效、稳定地得到再生植株。外植体的选择要求有较强的再生能力、对抗生素敏感、适宜外源基因的导入及整合。花生的组织培养开始于20世纪40年代，我国则起始于70年代，但再生效率很低。建立一个高效的花生再生体系，对改良花生品质、提高花生产量具有重要的意义。
发明内容
针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，该方法的芽诱导率能达到40％左右，芽伸长率达79％，继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。
以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，包括如下步骤：
(1)选取幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上光照培养出芽，TDZ的浓度为0-1mgl-1；NAA的浓度为0.5-2mgl-1，所述TDZ的浓度不高于NAA的浓度，且NAA的浓度与TDZ的浓度差值不大于1mgl-1；
(2)将产生的不定芽继代，转移到含有6-BA和NAA的伸长培养基上，诱导芽伸长至2cm；6-BA的浓度为4-8mgl-1，NAA的浓度为0.5-1mgl-1；
(3)将伸长的不定芽转到含有NAA的生根培养基上培养生根，NAA的浓度为0.5-1mgl-1；
(4)生根小苗按常规方法移植栽培。
所述芽诱导培养基为MS基础培养基。
所述芽诱导培养基的TDZ的浓度为0.5mgl-1；NAA的浓度为0.5mgl-1，步骤(1)培养时间为五周。
所述伸长培养基为MS基础培养基。
所述伸长培养基的6-BA的浓度为8mgl-1，NAA的浓度为0.5mgl-1，步骤(2)培养时间为两周。
所述生根培养基为MS基础培养基。
所述生根培养基的NAA的浓度为0.5mgl-1，步骤(3)培养时间为两周。
所述幼叶为完整胚的子叶在基本培养基上培养5天后长出的幼嫩叶片。
所述完整胚的子叶在培养前需对花生作无菌处理。
所述无菌处理的方法为：花生去壳，放置于75％乙醇中1min，弃乙醇，0.1％升汞中放置4min，灭菌水洗3次，放置于无菌纸上至晾干。
本发明采用幼叶作为花生再生体系的外植体，在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上诱导出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸长培养基上促进不定芽伸长，再于含有NAA的生根培养基上培养生根，得到生根小苗，可以按常规方法移植栽培。本发明建立的再生体系，其芽诱导率高达40％左右，芽伸长率达79％。继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。
附图说明
图1以幼叶为外植体的花生组织培养
A：幼叶外植体B：不定芽C：诱导芽D：芽伸长E：生根F：移栽及结实
具体实施方式
芽诱导培养基为MS基础培养基，TDZ(即噻苯隆)的浓度为0-1mgl-1；NAA(即萘乙酸)的浓度为0.5-2mgl-1
伸长培养基为MS基础培养基，6-BA(即6-苄氨基嘌呤)的浓度为4-8mgl-1，NAA的浓度为0.5-1mgl-1；
生根培养基为MS基础培养基，NAA的浓度为0.5-1mgl-1
MS基础培养基可以市售，也可按配方自行配制。
花生为市售的任一品种。
实施例1
1.以幼叶为外植体芽诱导培养基及伸长培养基的确定
1.花生去壳，放置于75％乙醇中1min，弃乙醇，0.1％升汞中放置4min，灭菌水洗3次，放置与无菌纸上至吹干；
2.用无菌的手术刀，将花生两个子叶分开，含有完整胚的子叶放置在基本培养基上，光照培养；
3.选取培养不同时间幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ、6-BA和NAA的芽诱导培养基上(表1)，光照培养，每种培养基放置35个左右外植体；
表1芽诱导培养基正交实验设计
Figure BDA0000072292060000031
a：从播种到剪取叶片的时间
4.选取培养5天幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上(表2)，光照培养，每种培养基放置35个左右外植体；
表2TDZ及NAA芽诱导培养基组合
Figure BDA0000072292060000032
Figure BDA0000072292060000041
5.5周后统计芽诱导率，
Figure BDA0000072292060000042
6.将诱导芽转移到含有不同浓度6-BA(4or8mgl-1)及NAA(0.5or1mgl-1)的培养基上，两周后统计伸长芽率，
Figure BDA0000072292060000043
2.以幼叶为外植体的花生再生体系
1.花生去壳，放置于75％乙醇中1min，弃乙醇，0.1％升汞中放置4min，灭菌水洗3次，放置与无菌纸上至晾干；
2.用无菌的手术刀，将花生两个子叶分开，含有完整胚的子叶放置在基本培养基上，光照培养5天；
3.选取幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上，光照培养5周；
4.将产生的不定芽继代，转移到含有6-BA和NAA的伸长培养基上，两周左右，诱导芽伸长至2cm；
5.将伸长的诱导芽转到含有0.5mgl-1NAA的生根培养基上，两周后生根；
6.将生根的小苗移栽，转移到含有营养土和蛭石混合基质(体积比为2/1)的花盆中，移到温室中培养。
结果
剪去叶缘的幼嫩叶子为外植体(图1中A)，正面朝上放置于芽诱导培养基上。根据外植体取样时间及3种激素6-BA、NAA和TDZ这4种因素设计了正交实验(表2)，共16种组合。4周后，外植体出现膨大的愈伤组织，5周后大部分膨大的组织褐化，并没有芽点产生。产生膨大的愈伤组织，而不产生诱导芽，应该是细胞分裂素与生长素的比例过高，导致细胞急剧分裂，形成非正常的膨大组织。因此，去掉一种细胞分裂素，仅留下TDZ，并降低浓度，与适量的NAA组合成16种培养基。2周后，在叶脉处有不定芽产生(图1中B)。5周左右，不定芽分化成明显可见的小芽(图1中C)。
在16种培养基组合中，放置于B、H、I、L、M和N组合(表3)的外植体能产生诱导芽。其中在含有0.5mgl-1TDZ和0.5mgl-1NAA的培养基上，芽诱导效率最高，可以达到40.9％(表3)，其他的诱导率都低于15％。
表3以幼叶为外植体最大芽诱导率的确定
Figure BDA0000072292060000051
将诱导的芽继代，转移到含有6-BA及NAA的伸长培养基上，两周左右，伸长率在20.0％～79.7％(表4)，当培养基中6-BA和NAA的浓度分别为8mgl-1和0.5mgl-1的时候，大部分的诱导芽都能够伸长(图1中D)，叶子伸展，苗发育良好。将伸长的苗转移到含有0.5mgl-1NAA的生根培养基上，两周左右生根(图1中E)。生长健壮的植株移栽后，在适当的光周期后能正常的开花并结实(图1中F)。
表4以花生幼叶为外植体伸长培养基的确定
Figure BDA0000072292060000052

Claims (10)

1.以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，包括如下步骤：
(1)选取幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上光照培养出芽，TDZ的浓度为0-1mgl-1；NAA的浓度为0.5-2mgl-1，所述TDZ的浓度不高于NAA的浓度，且NAA的浓度与TDZ的浓度差值不大于1mgl-1；
(2)将产生的不定芽继代，转移到含有6-BA和NAA的伸长培养基上，诱导芽伸长至2cm；6-BA的浓度为4-8mgl-1，NAA的浓度为0.5-1mgl-1；
(3)将伸长的不定芽转到含有NAA的生根培养基上培养生根，NAA的浓度为0.5-1mgl-1；
(4)生根小苗按常规方法移植栽培。
2.根据权利要求1所述的方法，所述芽诱导培养基为MS基础培养基。
3.根据权利要求2所述的方法，所述芽诱导培养基的TDZ的浓度为0.5mgl-1；NAA的浓度为0.5mgl-1，步骤(1)培养时间为五周。
4.根据权利要求1所述的方法，所述伸长培养基为MS基础培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，所述伸长培养基的6-BA的浓度为8mgl-1，NAA的浓度为0.5mgl-1，步骤(2)培养时间为两周。
6.根据权利要求1所述的方法，所述生根培养基为MS基础培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，所述生根培养基的NAA的浓度为0.5mgl-1，步骤(3)培养时间为两周。
8.根据权利要求1所述的方法，所述幼叶为完整胚的子叶在基本培养基上培养5天后长出的幼嫩叶片。
9.根据权利要求5所述的方法，所述完整胚的子叶在培养前需对花生作无菌处理。
10.根据权利要求9所述的方法，所述无菌处理的方法为将花生去壳，放置于75％乙醇中1min，弃乙醇，0.1％升汞中放置4min，灭菌水洗3次，放置于无菌纸上至晾干。
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