CN101449658B

CN101449658B - 一种黄瓜高频率植株再生方法

Info

Publication number: CN101449658B
Application number: CN2007101930737A
Authority: CN
Inventors: 李建吾; 胡建斌; 秦智伟; 周秀艳
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2007-12-06
Filing date: 2007-12-06
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2027-12-06
Also published as: CN101449658A

Abstract

本发明公开了一种黄瓜高频率植株再生方法，由Flamingo-bill外植体的制备、不定芽的诱导和增值、生根、移栽等步骤组成。本发明在整个组织培养过程只使用了一种植物激素，且浓度较低，不容易诱导体细胞无性系产生，且节约了技术成本；技术环节少，且操作简单，提高了生产效率；从接种到完整植株形成只需要大约45d，大大缩短了植株再生的时间。

Description

一种黄瓜高频率植株再生方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，尤其涉及一种黄瓜高频率植株再生方法。

背景技术

黄瓜组织培养技术的研究起始于上个世纪七十年代(Cutts RHA.Plant Sci Lett，1975，4：189-193)，但真正取得有用结果的还是在近几年(陈继峰，上海农业学报，2007，23：114-118)。用于黄瓜组织培养的外植体的种类很多，如子叶、真叶、下胚轴、叶柄、茎尖、根、合子胚等，大多研究都能得到组织培养小苗。尽管黄瓜组织培养的成功经验很多，但在某些方面还存在着不少问题。首先，黄瓜组织培养具有很强的基因型特异性，植株再生频率低且不稳定，技术的重复性差(候爱菊，朱延明，杨爱馥，等.园艺学报，2003，30：101-103)；其次，由于黄瓜再生植株一般要经过愈伤组织的形成、不定芽分化、茎芽伸长和生根几个过程，因而已有的黄瓜植株再生体系，操作技术繁琐，植株再生周期长(Kuijpers AM，Bouman H，Klerk GJ.Plant Cell Tiss Org Cult，1996，1：81-83)；第三，多数研究者倾向通过体细胞胚途径获得黄瓜再生植株，但体细胞胚转化成正常植株的频率低，且无性系变异大，不利于培育遗传稳定、一致的再生植株(Lou H，Kako S.HortiScience，29：906-909)。这些不利因素在一定程度上限制了黄瓜生物工程育种的进展。随着生物工程技术的迅速发展，植株快速克隆技术和遗传转化技术将在黄瓜生物技术育种中得到广泛应用，这就需要建立一种操作简便、周期短、技术稳定的高效植株再生体系，但目前的黄瓜离体再生技术体系，并不能完全满足当前黄瓜生物技术研究的需要。因此，建立一种频率高、周期短、技术稳定，且适用于多个基因型的离体植株再生体系，是当前黄瓜组织培养研究的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄瓜高频率植株再生的方法，以满足黄瓜生物工程育种研究的需要。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种黄瓜高频率植株再生方法，由下述步骤组成：

a、选取黄瓜饱满、无病虫的种子，用0.1％氯化汞表面消毒，并接种到MS培养基上培养成苗，选取粗壮的幼苗切除一片子叶和生长点，制备Flamingo-bill外植体；所述的Flamingo-bill外植体为一种多组织成分的特殊外植体，它由子叶、下胚轴和根三部分组成；

b、将Flamingo-bill外植体接种到芽诱导培养基上，使其诱导出不定芽；外植体接种方式是将其根部斜插入培养基中，芽诱导培养基是MS培养基附加0.5～1.0mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)、0.5～1.0mg/L AgNO₃和30g/L Suc(蔗糖)；

c、将外植体连同不定芽转入增值培养基，使不定芽的数量扩大3倍，同时不定芽得以伸长；芽增值培养基为附加1.0～1.5mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L AgNO₃和30g/L Suc的MS培养基；

d、当芽长到1～2cm时从基部切离外植体，接种到生根培养基，使其生根长成完整植株；生根培养基为1/2MS培养基附加20g/L Suc；

e、将具有完整根系的植株移栽到营养土中，使其在自然条件下生长。

在步骤a中，0.1％氯化汞浸泡种子的时间为8～10min，消毒后用无菌水冲洗4～5次，并用无菌滤纸吸干种子表面水分。

在步骤a中，用于Flamingo-bill外植体制备的幼苗苗龄为2～3d，苗高3～4cm，下胚轴直径3～5mm。

在步骤a中，采用无菌手术刀片由上至下将一片子叶和生长点切除，切口深度为下胚轴直径的1/2，切口斜面长度为0.4～0.5cm。

MS培养基琼脂用量为0.7％，培养基灭菌方式为在121℃下灭菌18min，培养基的pH值为5.8。

所述培养条件为温度25±1℃，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光周期为12～14h/d。

本发明所用的Flamingo-bill外植体为一种多组织成分的特殊外植体，它由子叶、下胚轴和根三部分组成，实际上就是去掉了一片子叶和生长点的植株，其切口部位，即组织培养植株再生部位，为顶端分生组织所在区域，其细胞生长速度快、分化能力强，本发明所得到的再生植株就是由这些细胞发育而来的。Flamingo-bill外植体具有完整植株的特性，其接种方式相当于“移栽”，这样根就可以发挥物质吸收功能，通过下胚轴把激素和营养物质输送至顶端分生组织细胞，促使这些细胞快速生长、分化成苗。Flamingo-bill外植体这种吸收外源物质的方式优越于一般外植体的被动吸收。

本发明有以下优点：

1.整个组织培养过程只使用了一种植物激素，即6-BA，且浓度较低，即在0～1.5mg/L之间，不容易诱导体细胞无性系产生，且节约了技术成本。

2.植株再生过程只包括Flamingo-bill外植体的制备、不定芽的诱导和增值、生根、移栽4个技术环节，且操作简单，提高了生产效率。

3.一个Flamingo-bill外植体初代培养可产生3～5个再生植株，如果再继代培养一次，又可再生5～10个植株，植株再生频率略高于一般外植体。

4.Flamingo-bill外植体在芽诱导培养基上培养10～15d可诱导出不定芽，35～40d后可伸长到合适高度，在生根培养基上培养5～7d可再生不定根，形成完整植株。从接种到完整植株形成只需要大约45d，大大缩短了植株再生的时间。

附图说明

图1为第一片真叶刚露出的黄瓜幼苗的形状示意图；

图2为Flamingo-bill外植体的形状示意图；

图3为Flamingo-bill外植体斜切面长出不定芽的形状示意图；

图4为不定芽增值并伸长的形状示意图。

具体实施方式

实施例1：本发明的高频率黄瓜再生植株的方法，其步骤如下：

a.以自交系‘IL 69’为试验材料。自交系‘IL 69’是从津杂2号自交后代分离得到，具有生长势强、高抗霜霉病、果型长、有棱等特征。选取无病虫、饱满的黄瓜自交系‘IL69’种子，用0.1％氯化汞表面消毒8min，消毒后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后，接种到MS培养基，置于26℃恒温箱培养成苗。MS培养基琼脂用量为0.7％，培养基灭菌方式为在121℃下灭菌18min，培养基的pH值为5.8。选取粗壮、刚露出真叶的幼苗，幼苗苗龄为2d，苗高3cm，下胚轴直径3mm，如图1所示，用无菌的手术刀片从上至下切除一片子叶和生长点，切口深度为下胚轴直径的1/2，切口斜面长度为0.5cm，使余下的部分保持完好，即Flamingo-bill外植体，如图2所示。

b.制备好的Flamingo-bill外植体迅速以根部斜插入的方式接种到芽诱导培养基，芽诱导培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L AgNO₃+30g/L Suc，在26℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期14h/d条件下培养。11d在外植体斜切面后发现第一例不定芽，如图3所示。12d后换一次新鲜培养基，18d后不定芽数量达到4个。

c.将外植体连同不定芽从芽诱导培养基中移出，保护好其根部以免根折断，再斜插入到芽增值培养基中，芽增值培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/LAgNO₃+30g/L Suc，在25℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期14h/d条件下培养。并使根部完全在培养基中，调整外植体的位置以尽量使再生的芽向上生长。10d 后单个外植体产生芽的数量达到约10个，长度约1.5cm，如图4所示。

在本步骤中，芽培养到第10d时，统计芽长度和增值率，其中，增值率＝芽总数/外植体总数。具体数据见表1。

d.当芽苗伸长至2cm时，用刀将其从基部切下，接种到生根培养基中，生根培养基为1/2MS+20g/L Suc。温度和光照条件和步骤c一致。5d后芽基部开始部分愈伤组织化，7d后大部分植株有白色不定根生成，13d后，绝大部分植株已长成完整植株。

在本步骤中，统计15d后植株的生根率、平均根数和平均根长，其中，生根率＝生根株数/接种的株数。具体数据见表1。

e.将已生根的植株从培养基中移出，在自来水下洗去粘附在根上的琼脂后，移栽到营养土中，营养土的配方为体积比为1∶1的珍珠岩和泥炭土的混合基质，使其在自然阴凉处生长，并将底部凿有4个小孔的透明塑料杯倒扣在苗上，以保证一定的湿度，2d后去掉塑料杯。根据基质墒情，每天浇水1～2次。在本步骤中统计再生植株的成活率，成活率＝成活的株数/移栽的总株数。具体数据见表1。

实施例2：在本实施例中，黄瓜材料为自交系‘IL69’，取材幼苗苗龄为3d，苗高4cm，下胚轴直径5mm。培养温度为24℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期12h/d。芽诱导培养基为MS+0.6mg/L 6-BA+0.6mg/L AgNO₃+30g/L Suc，芽增值培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.6mg/L AgNO₃+30g/L Suc。组织培养操作程序与方法与实施例1相同。

实施例3：在本实施例中，黄瓜材料为自交系‘IL69’，取材幼苗苗龄为2d，苗高3.5cm，下胚轴直径4mm。培养温度为25℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期13h/d。芽诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L AgNO₃+30g/L Suc，芽增值培养基为MS+1.2mg/L 6-BA+1.0mg/L AgNO₃+30g/L Suc。组织培养操作程序与方法与实施例1相同。

表1实施例1～3的植株再生情况

实施例4：以黄瓜自交系‘IL 103’为材料，自交系‘IL 103’是从津春4号自交后代分离得到，具有生长势较强、高抗霜霉病、果型中等、无棱、刺密等特征。取苗龄为2d、苗高3cm、下胚轴直径4mm幼苗为材料。培养温度为25℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期12h/d。芽诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/LAgNO₃+30g/L Suc，芽增值培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L AgNO₃+30g/L Suc。组织培养操作程序与方法与实施例1相同。试验结果见表2。

实施例5：试验材料为‘IL 103’。幼苗苗龄为3d，苗高4cm，下胚轴直径5mm。培养温度为24℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期13h/d。芽诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L AgNO₃+30g/L Suc，芽增值培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L AgNO₃+30g/L Suc。组织培养操作程序与方法与实施例1相同。试验结果见表2。

实施例6：试验材料为‘IL 103’。幼苗苗龄为2.5d，苗高3.5cm，下胚轴直径4.5mm。培养温度为26℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期14h/d。芽诱导培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.6mg/L AgNO₃+30g/L Suc，芽增值培养基为MS+1.2mg/L 6-BA+0.6mg/L AgNO₃+30g/L Suc。组织培养操作程序与方法与实施例1相同。试验结果见表2。

表2实施例4～6的植株再生情况

实施例7：以黄瓜材料为自交系‘IL67’为试验材料，自交系‘IL 67’是从园丰园6号自交后代分离得到，具有生长势强、生育期长、高抗霜霉病、果型短、无棱等特征。取苗龄为2d、苗高3cm、下胚轴直径4mm的幼苗为材料。培养温度为25℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期12h/d。芽诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L AgNO₃+30g/L Suc，芽增值培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L AgNO₃+30g/L Suc。组织培养操作程序与方法与实施例1相同。试验结果见表3。

实施例8：试验材料为‘IL 67’。幼苗苗龄为3d，苗高4cm，下胚轴直径5mm。培养温度为24℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期13h/d。芽诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L AgNO₃+30g/L Suc，芽增值培养基为MS+1.0mg/L 6-BA +0.5mg/LAgNO₃+30g/L Suc。组织培养操作程序与方法与实施例1相同。试验结果见表3。

实施例9：试验材料为‘IL 67’。取材幼苗苗龄为2.5d，苗高3.6cm，下胚轴直径4.3mm。培养温度为26℃、光强50μmol·m^-2·s^-1，光周期14h/d。芽诱导培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.8mg/L AgNO₃+30g/L Suc，芽增值培养基为MS+1.2mg/L 6-BA+0.8mg/L AgNO₃+30g/L Suc。组织培养操作程序与方法与实施例1相同。试验结果见表3。

表3实施例7～9的植株再生情况

Claims

1.一种黄瓜高频率植株再生方法，其特征在于由下述步骤组成：

c、将外植体连同不定芽转入增殖培养基，使不定芽的数量扩大3倍，同时不定芽得以伸长；芽增殖培养基为附加1.0～1.5mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L AgNO₃和30g/L Suc的MS培养基；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤a中，0.1％氯化汞浸泡种子的时间为8～10min，消毒后用无菌水冲洗4～5次，并用无菌滤纸吸干种子表面水分。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤a中，用于Flamingo-bill外植体制备的幼苗苗龄为2～3d，苗高3～4cm，下胚轴直径3～5mm。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤a中，采用无菌手术刀片由上至下将一片子叶和生长点切除，切口深度为下胚轴直径的1/2，切口斜面长度为0.4～0.5cm。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于：MS培养基琼脂用量为0.7％，培养基灭菌方式为在121℃下灭菌18min，培养基的pH值为5.8。

6.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于：所述培养条件为温度25±1℃，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光周期为12～14h/d。