CN105519442A

CN105519442A - 一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法

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Publication number: CN105519442A
Application number: CN201610066461.8A
Authority: CN
Inventors: 宋兴舜; 王瑞芳; 黄凤兰; 张健; 张秋艳; 孙丽娜
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2036-01-21
Also published as: CN105519442B

Abstract

本发明公开欧李愈伤组织再生体系的培植方法一种，包括以下步骤：(1)外植体最适消毒条件；(2)诱导愈伤组织最适植物生长调节剂(PGR)浓度配比；(3)愈伤组织最适增殖的PGR浓度配比；(4)愈伤组织分化生芽最适PGR浓度配比；(5)芽诱导生根阶段最适PGR浓度配比；(6)炼苗移栽。本发明繁殖速度快、繁殖系数大，具有分化程度低，再生能力强的特点。本发明可缩短繁殖过程、改良品质、节省空间、减少劳动力、可终年生产、不受自然条件限制等特点，同时也为欧李转基因研究提供基础。

Description

一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法

技术领域

本发明涉及一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法。

技术背景

自从1902年德国科学家Gottberlandt提出植物细胞的全能性理论后，细胞全能性研究逐渐成为生物学研究领域的热点，而培植在细胞全能性基础上的植物组织培养技术从此逐渐兴起和发展。近年来，植物组织培养技术(PlantTissueCulture)作为一种基本的实验技术和基础的研究手段，显示出巨大的应用潜力，被广泛应用于植物学、遗传学、育种学、栽培学、解剖学、病理学等各个领域之中。

植物组织培养技术是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工配制的环境里培养成完整的植株。组织培养技术是以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术，其包括器官培养、茎尖分生组织培养、愈伤组织培养、细胞培养和原生质体培养等。这项技术已在科研和生产上得到广泛应用，已成为举世瞩目的生物技术之一。该技术具有加速育种、缩短繁殖过程、改良品质、节省空间、减少劳动力、可终年生产、不受自然条件限制等特点，且组培苗的体积小，便于携带和资源交流，在推动农业现代化方面已有了巨大的经济效益、社会效益和生态效益，被认为是一项很有潜力的高新技术。

欧李(Prunushumilis)，蔷薇科樱桃属，多年生落叶灌木，多分枝。主要分布在的山西、山东、内蒙古、河北、辽宁等地。欧李植株矮小，花白中透粉，果鲜艳美丽，可开发盆景供观赏。其根系发达，根冠比高达9∶1，能够耐受极端环境、保持水土、改良土壤、治理荒漠化，是调节生态环境的优良树种。近几年，钙果种苗供不应求。通常果树苗木繁殖时，多采用嫁接、扦插、压条、分株等无性繁殖的方式，但是对于钙果不适应这些常规的繁殖方法。钙果结果几年后，它原来的枝条逐渐老化死掉，在近根部重新萌发新枝，所以嫁接树，不能保持接穗品种的连续生产。扦插、压条、分株等方法，成活率低、繁殖慢。由于试材基因型、外植体类型及其生理状态对植物生长调节剂敏感程度不同，外植体高效再生成苗也相应存在差异，

欧李是我国特色果树，欧李种植面积越来越大，科研人员对欧李的抗逆性研究越来越多，但受制于没有可同源转化体系的培植，使欧李抗逆关键基因的功能研究不能深入开展，因此，通过愈伤组织诱导培植的的欧李组织快繁体系，还将为欧李的抗逆研究奠定可同源转化的平台。

发明内容

本发明所解决的技术问题是克服一般的组织培养难，耗时长等难题，完成了复杂的条件摸索，提供了一种可以在短时间内通过愈伤组织获得大量的欧李愈伤组织再生体系的培植方法。本发明的技术方案是：一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法，包括以下步骤：

步骤(1)选取欧李生长状态优良的叶片，流水冲洗30分钟，无菌条件下，直接用体积百分比为75％乙醇对叶片表面消毒1分钟，将叶片平均分成9等份，再用质量百分比为1％NaClO对叶片分别灭菌1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟，然后采用无菌水分别涮洗7次，每次1分钟，将灭菌后的外植体接种到基础盐混合物培养基(MS)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的固体培养基上，放在每日光照18小时、黑暗6小时、温度25±1℃的培养室内进行培养，7天后统计外植体的污染率和死亡率，每组重复20个外植体，重复3次，合消毒时间为浓度为体积百分比为75％酒精4分钟和浓度为质量百分比1％次氯酸钠4分钟，统计获得欧李叶片污染率最低为0.08％和欧李叶片死亡率为39.54％；

步骤(2)：取欧李生长状态优良的叶片，将消毒后的完整叶片切成1cm²(立方厘米)，茎段切成2cm(厘米)长的小段，使叶片背面和茎段伤口处充分接触到添加正交设计的不同PGR(PGR-植物生长调节剂，NAA-萘乙酸，6-BA苄氨基嘌呤)浓度的MS培养基上，设置苄氨基嘌呤的浓度梯度是：0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L；NAA-萘乙酸的浓度梯度是：0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；pH值为5.6-5.8，加空白对照共17个梯度的培养基愈伤组织诱导培养基中进行培养，接种后的外植体放在温度为25±1℃，光照强度为2.0klx，光照时间为16小时/天的组织培养室中进行培养，15天后进行继代并统计愈伤组织诱导率，每个浓度梯度选取生长状态相近的30个外植体做重复试验，重复3次，添加植物生长调节剂浓度配比为：叶片诱导愈伤组织的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+1.0mg/L6-BA(6-BA-6-苄氨基嘌呤)+0.6mg/LNAA(NAA-萘乙酸)，且统计获得的愈伤组织诱导率达到95.31％；茎段诱导愈伤组织的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg6-BA-6-苄氨基嘌呤+0.8mg/NAA-萘乙酸，且统计获得的愈伤组织诱导率达到92.21％；

步骤(3)取生长状态良好的愈伤组织，接种到添加正交设计的不同PGR浓度的MS培养基上，促进愈伤组织生长，6-BA-6-苄氨基嘌呤的浓度梯度是：0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.25mg/L、1.5mg/L；2.4-天-2.4-二氯苯氧乙酸的浓度梯度是：0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；加空白对照共21个梯度的诱导培养基培养，诱导15个梯度后进行继代，并统计的愈伤组织的生长状况，每组重复50个愈伤组织，统计获得诱导愈伤组织增殖的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg/6-BA-6-苄氨基嘌呤+0.6mg/2.4-二氯苯氧乙酸；

步骤(4)将外植体上诱导产生的愈伤组织切成小块，转接到分化芽的MS培养基上，6-BA(6-BA-6-苄氨基嘌呤)的浓度梯度是：2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L；NAA(NAA-萘乙酸)的浓度梯度是：0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L；加空白对照共21个梯度的诱导培养基培养，诱导30天后进行继代，并统计的愈伤组织分化芽数量，每组重复40个愈伤组织，诱导愈伤组织生芽的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+5.0mg/苄氨基嘌呤+0.9mg/萘乙酸；

步骤(5)将愈伤组织诱导生芽获得欧李芽切下，竖直接种到添加正交设计的不同PGR浓度的MS和1/2MS培养基上，NAA(NAA-萘乙酸)的浓度梯度是：0mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7、0.9mg/L；IBA(IBA-吲哚丁酸)的浓度梯度是：0mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L；共24个梯度的诱导培养基培养，诱导30d后进行继代，并统计不同处理中芽的生根率，每个浓度梯度选取生长状态相近的30个幼芽做重复试验，芽诱导生根的培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg/萘乙酸；

步骤(6)待生根的无菌苗根长长到3-5cm即可炼苗、移栽。

本发明欧李(怀柔)离体组培快繁体系培植方法主要具有以下几方面的优点：

1、缩短繁殖过程：繁殖速度快、繁殖系数大：用快繁技术繁殖，可节约繁殖材料，只取原材料上的一小块组织就能在短期内生产出大量市场所需的优质苗木，每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株，既不损伤原材料又可获得较高的经济效益。本发选明取欧李生长状态优良的叶片和茎段，将消毒后的完整叶片切成1cm²(立方厘米)，茎段切成2cm长的小段，使叶片背面和茎段伤口处充分接触到添加正交设计而获得的最优化的不同植物生长调节剂(PGR)浓度配比的MS培养基上，通过继续的愈伤分化培养和生根培养，在短时间内即可获得大量的无菌组培苗。相较扦插等传统方法要快，且用时短。更为重要的是，以往见诸于报道的研究，包括相关的专利研究，仅是利用直接诱导的方法试图快繁，但欧李的抗逆性研究越来越多，但却受制于没有可同源转化体系的培植，使欧李抗逆关键基因的功能研究不能深入开展，传统的快繁衍技术不能解决可同源转化关键基因进而进行功能研究的问题。因此，本发明通过愈伤组织诱导培植的欧李组织快繁体系，将为欧李的抗逆研究奠定可同源转化的平台。

2、采用愈伤组织细胞培养，具有分化程度低，再生能力强的特点，传统的直接诱导根茎的方法，繁殖率低，成本高，且后代均一性不好。通过愈伤组织诱导，能保持原有品种的优良性状。对保质、保纯有着特殊作用。可获得大量的统一规格、高质量的苗木，苗木商品性好，成本低。

3、本发明中愈伤组织的诱导是发明中的关键，不同的材料、取材部位、环境因素均对影响成败。而这除需要必备的营养和一些刺激因素外，还需要有起诱导作用的物质，乃至培养基的强度，以往的快繁技术，往往不注意培养基本强度的变化，至始至终为一种强度。本发明中，创新性地改变培养基的强度，即不同的诱导阶段(尤其指愈伤诱导生根的培养基)，针对性地利用最优化的培养基强度，是本发明中通过愈伤组织诱导成株成功的关键。

4、6-BA，称作：6-苄氨基嘌呤，主要能促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进细胞增大增肥，促进茎、叶的伸长生长，打破顶端优势，促进侧芽生长，6-BA的使用浓度一般在0.5-2.0mg/L，在设计诱导愈伤组织实验中，设置的梯度是0.5、1.0、1.5、2.0mg/L，在促进愈伤组织分化芽时，6-BA的浓度升高，否则会抑制芽的生长。而在诱导根是则不添加，6-BA抑制根的生长。

NAA，称作：a-萘乙酸，是广谱型植物生长调节剂，是细胞生长素，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，使用浓度一般在0.1-1.0mg/L，本实验根据不同诱导阶段，设置相应的的浓度，以期获得较好的实验效果。

2.4-D，称作：2.4-二氯苯氧乙酸，属于苯氧类物质，是一种人工合成的植物激素具有与生长素相似的生理效应。2，4-D主要用于植物愈伤组织的诱导，并在实验中起到至关重要的作用，2，4-D因用量和浓度不同，起到抑制和促进作用，一般对于促进愈伤生长来说，高浓度抑制，低浓度促进生长。

IBA，是促进植物主根生长，提高发芽率，成活率的一种植物生长调节剂。在植物的生根方面具有良好的效果。

本发明可缩短繁殖过程、改良品质、节省空间、减少劳动力、可终年生产、不受自然条件限制等特点，同时也为欧李转基因研究提供基础。

本发明目的在于提供一种欧李组织快繁方法，以叶片和茎段为外植体，经过诱导培养，增殖培养，分化培养，生根培养，炼苗移栽等步骤获得欧李离体再生植株，培植欧李再生体系。适宜愈伤组织诱导培养基的筛选是欧李组织培养技术中的关键。本试验以欧李(怀柔)为材料，利用正交试验方法进行组织培养，深入研究外植体选择与消毒方法，筛选到最适宜的愈伤组织诱导培养基配比，最终培植欧李诱导愈伤的体系。

附图说明

图1本研究中欧李(怀柔)离体组培快繁体系培植方法的流程图

图2本研究中叶片诱导愈伤组织生长状况图

图3本研究中茎段诱导愈伤组织生长状况图

图4本研究中愈伤组织诱导芽生长状况图

图5本研究中根的生长状况图

图6本研究中欧李的黄色和绿色两种愈伤组织图

具体实时方式

一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法，包括以下步骤：

步骤(6)待生根的无菌苗根长长到3-5cm即可炼苗、移栽。

(一)外植体最适消毒条件的确定

选取欧李(怀柔)生长状态优良的叶片，流水冲洗30分钟，无菌条件下，直接用体积百分比为75％乙醇表面消毒1分钟，再用质量百分比为1％NaClO分别灭菌1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟，无菌水涮洗7次，每次约1分钟，将灭菌后的外植体接种到MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的固体培养基上，放在每日光照18小时、黑暗6小时、温度25±1℃的培养室内进行培养，7天后统计外植体的污染率和死亡率，每组重复20个外植体，重复3次

(二)诱导愈伤组织途径

取欧李生长状态优良的叶片，将消毒后的完整叶片切成1cm²(立方厘米)，茎段切成2cm长的小段，使叶片背面和茎段伤口处充分接触到添加正交设计的不同植物生长调节剂(PGR)浓度的基本盐培养基(MS)上，设置6-BA(6-BA-6-苄氨基嘌呤)的浓度梯度是：0.5、1.0、1.5、2.0mg/L；NAA(NAA-萘乙酸)的浓度梯度是：0.2、0.4、0.6、0.8mg/L；pH值为5.6-5.8，加空白对照共17个梯度的基础盐培养基(MS)愈伤组织诱导培养基中进行培养。接种后的外植体放在25±1℃，光照强度2.0klx，光照时间16h/d的条件下进行培养，15d后进行继代并统计愈伤组织诱导率，每组重复30个外植体，重复3次。

(三)愈伤组织最适增殖的PGR浓度配比

取生长状态良好的愈伤组织，接种到添加正交设计的不同PGR浓度的MS培养基上，促进愈伤组织生长，6-BA(6-BA-6-苄氨基嘌呤)的浓度梯度是：0.25、0.5、1.0、1.25、1.5mg/L；2.4-D(2.4-D-2.4-二氯苯氧乙酸)的浓度梯度是：0.2、0.4、0.6、0.8mg/L；加空白对照共21个梯度的诱导培养基培养。诱导15后进行继代，并统计的愈伤组织的生长状况，每组重复50个愈伤组织。

(四)愈伤组织分化生芽最适PGR浓度配比

从外植体上诱导产生的愈伤组织切成小块，转接到分化芽的MS培养基上，6-BA(6-BA-6-苄氨基嘌呤)的浓度梯度是：2.0、3.0、4.0、5.0mg/L；NAA(NAA-萘乙酸)的浓度梯度是：0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L；加空白对照共21个梯度的诱导培养基培养。诱导30天后进行继代，并统计的愈伤组织分化芽数量，每组重复40个愈伤组织。

(五)芽诱导生根阶段最适PGR浓度配比

将愈伤组织诱导生芽和促进腋芽生枝获得欧李芽切下，竖直接种到添加正交设计的不同PGR浓度的MS和1/2MS培养基上，NAA(NAA-萘乙酸)的浓度梯度是：0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L；IBA(IBA-吲哚丁酸)的浓度梯度是：0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L；共24个梯度的诱导培养基培养。诱导30天后进行继代，并统计不同处理中芽的生根率，每组重复30个幼芽。

(六)炼苗、移栽

待生根的无菌苗根长长到3-5cm即可炼苗、移栽。

如图1所示的欧李(怀柔)离体组培快繁体系培植方法的流程图，首先从欧李植株上剪取叶片和茎段作为外植体，对外植体进行流水冲洗，体积百分比为75％乙醇表面消毒，再用质量百分比为1％NaClO灭菌；获得的无菌外植体进行诱导愈伤组织培养，并得到诱导愈伤组织的最适植物生长调节剂的浓度配比；诱发分化芽和再生根，获得完整植株，炼苗移栽。

图2所示为以欧李的叶片为外植体诱导愈伤组织，其中1-1是接种到诱导愈伤组织的培养基上0天，1-2是接种到诱导愈伤组织的培养基上10天，明显的可以看到在叶片伤口处有小粒的愈伤组织形成，20天后叶片边缘长满愈伤组织(1-3)。图3、所示为以欧李的茎段为外植体诱导愈伤组织，其中2-1是接种到诱导愈伤组织的培养基上0天，2-2是接种到诱导愈伤组织的培养基上10天，明显的可以看到在茎段两端的伤口处有小粒的愈伤组织形成，2-3是20天后茎段边缘长满愈伤组织，形成大量的愈伤组织团。

图4所示为扩繁的愈伤组织块，在分化诱导培养基上诱导27天后，开始生长芽簇。

图5所示，将诱导获得的芽分离，接种到生根培养基上，10天茎段下端有幼小的根形成，继续诱导获得大量的根。

图6所示，在同等情况下诱导愈伤组织，最终发现获得的愈伤组织有黄色和绿色两种。

Claims

1.一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法，其特征是：包括以下步骤：

步骤(6)待生根的无菌苗根长长到3-5cm即可炼苗、移栽。

2.根据权利要求1所述的一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法，其特征是：植物生长调节剂为：6-BA：6-苄氨基嘌呤，NAA：NAA-萘乙酸，2.4-D：2.4-二氯苯氧乙酸，IBA：IBA-吲哚丁酸。