CN110463607A

CN110463607A - 野生欧洲李叶片组织培养的方法

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Publication number: CN110463607A
Application number: CN201910846507.1A
Authority: CN
Inventors: 耿文娟; 陈曦; 颉刚刚; 欧阳丽婷; 赵世荣
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2019-09-09
Filing date: 2019-09-09
Publication date: 2019-11-19

Abstract

本发明涉及生物组织培养繁殖的方法，具体涉及野生欧洲李叶片组织培养的方法，包括第一步选取较嫩的野生欧洲李新梢，将其完整无损伤的叶片摘下清洗干净后放入无菌超净工作台备用；第二步将预处理完的叶片材料先用70％的酒精处理40s，然后用无菌水冲洗，再用0.1％的氯化汞溶液浸泡6min，然后用无菌水冲洗备用；第三步剪取消毒完的叶片，接种至含有培养基的瓶中，所属培养基配方为B5+7.5mg/L TDZ+2.5mg/L IBA；第四步接种完暗处理14d。本发明提供了一种野生欧洲李叶片组织培养的方法，培养过程死亡率低、诱导率高、愈伤组织状态好，为野生欧洲李的保护和繁育提供了一种新的保育措施和育苗技术规程。

Description

野生欧洲李叶片组织培养的方法

技术领域

本发明涉及生物组织培养繁殖的方法，具体涉及野生欧洲李叶片组织培养的方法。

背景技术

我国新疆西部天山为世界植物起源中心之一，具有丰富的野生植物种类，在该区域分布有大面积的野生果树资源，其中许多种类为栽培果树的起源种。这些资源对人类具有十分重要的利用价值，开展果树资源研究，探讨其起源和演化路径、开发果树新产品具有重要意义。

1980年施丽首次在新疆伊犁地区新源县交吾托海的天然植物中发现野欧洲李(Prunus domestica L.)。为确认野欧洲李的存在，从形态特征、细胞染色体以及在分布区内和附近有无黑刺李和樱桃李等方面进行了研究，结果证明：在伊犁地区天山野果林中确实分布有野欧洲李，且新疆伊犁地区天山野果林是欧洲李的惟一起源地。

野生欧洲李为灌木或小乔木，树高0.8～2.8m，树冠圆头形，树干深紫色或深灰色有光泽。多年生枝暗紫色或褐色，无刺。嫩枝黄绿色，无毛，无棱。叶片卵圆形，先端钝头或有急尖，基部楔形，长4～7cm，宽3～5cm。叶脉多为4～5对，呈弧形弯向顶端。叶缘锯齿、圆钝。叶面绿色或深绿色，无毛，叶背灰绿色，被短柔毛。叶柄长0.8～1cm。花2朵，花冠直径1.2～1.5cm，花白色，5瓣，花瓣圆形。花萼黄绿色，萼筒漏斗状，萼片与萼筒均无毛。花梗长1.2～1.5cm，无毛。果实卵圆形，少数椭圆形，平均单果重4.4g，果实纵径2.27cm，横径1.87cm，果顶圆凸。缝合线浅，两侧对称或较对称。果皮底色黄绿，全面着暗紫红色，具蓝灰色果粉，无斑点；果皮厚度中等，韧性强，剥离度中等。果肉黄绿色，肉质松软，汁液少，味浓酸，微涩，无香味；可溶性固形物17.7％，pH值3，无裂果。半离核，核椭圆形，核平均干重0.4g，纵径1.6cm，横径1.0cm，测径0.6～0.7cm，核面粗糙。种仁有浓郁的杏仁香味。

截止目前的调查，野生欧洲李仅分布于中国新疆新源县的交吾托海、阿勒马赛和它平行的数条山沟以及巩留县的伊力格代沟中，海拔1200～1300米。乔木层高2～4米，林冠郁闭度约0.3；灌木有野蔷薇、沙棘、锦鸡儿、小檗、兔儿条、树莓、啤酒花；草本层有芦苇、甘草等。野欧洲李都是分布在天然植物中，性喜温暖湿润，只有在温湿的阴坡或水边才能较好的生存，其抗性弱，分布区不稳定，分布面积也很小。

野生欧洲李的利用：李资源总酸含量建议分级标准认为：樱桃李、野生欧洲李总酸含量>2.0，百分比6.03，级别：极高。野生欧洲李因其果实太酸，当地称之为酸梅，与新疆南部栽培的椭圆形小酸梅为同一种，最适加工李干和李酱，也可药用，但野生分布的欧洲李目前尚未开发利用。

由于野生欧洲李在自然状态下繁殖力较低、分布很少，以及环境改变和人为破坏，其数量急剧减少，有濒危趋势。分布地周围已变成矿场、道路、农家乐、牧场等。同时由于受到牲畜、病虫害等原因的影响，树势较弱、结果量少。各分布地的成龄株周围均有根蘖苗分布，但能生长成龄的根蘖苗数量很少，根蘖苗被牲畜啃食严重。部分野生欧洲李分布点已消亡，或仅残存几株枯桩。野生欧洲李种子自然繁殖能力较差，这将直接导致其多样性被破坏及资源的濒危。针对该资源目前的现状，需要从多方面进行对其资源的保护和繁育，以保证该物种不会灭绝，同时为该物种各类研究的开展创造条件。目前，对于野生欧洲李具体的保护对策和育苗方法较少，未有详细有效的保育措施和育苗技术规程。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的是提供一种死亡率低、诱导率高、愈伤组织状态好的野生欧洲李叶片组织培养的方法。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：

野生欧洲李叶片组织培养的方法，包括以下步骤：

第一步选取较嫩的野生欧洲李新梢，将其完整无损伤的叶片摘下清洗干净后放入无菌超净工作台备用；

第二步将预处理完的叶片材料先用70％的酒精处理40s，然后用无菌水冲洗，再用0.1％的氯化汞溶液浸泡6min，然后用无菌水冲洗备用；

第三步剪取消毒完的叶片，接种至含有培养基的瓶中，所属培养基配方为B5培养基(B5) +7.5mg/L噻苯隆(TDZ)+2.5mg/L吲哚丁酸(IBA)；

第四步接种完暗处理14d。

有益效果：

本发明提供了一种野生欧洲李叶片组织培养的方法，培养过程死亡率低、诱导率高、愈伤组织状态好，为野生欧洲李的保护和繁育提供了一种新的保育措施和育苗技术规程。

附图说明

无。

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施方式，用来对发明内容作进一步详细的解释。并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

一、材料与方法

1、试验材料与预处理

试验所用叶片材料采自伊犁新源县野生欧洲李原生分布地之一的交吾托海。于野生欧洲李生长季节剪取生长健壮、无病虫害的带叶新梢以湿纱布保湿后装泡沫箱带回实验室备用。选取较嫩的野生欧洲李新梢，将其完整无损伤的叶片全部摘下，放入500ml装水大烧杯，滴入少量稀释洗洁精溶液后浸泡20min，用清洁刷将叶片表层杂质刷洗干净，避免损伤叶片，然后用纱布封住烧杯口，在流动自来水下冲洗60min～90min，最后将预处理完的叶片放入灭过菌的超净工作台备用。

2、消毒时间的筛选

叶片消毒处理采用的消毒剂为70％的酒精和0.1％的氯化汞溶液。将预处理完的叶片材料先用70％的酒精处理30s、40s、50s、60s，然后用无菌水冲洗2～3遍，再用0.1％的氯化汞溶液浸泡5min、6min、7min，无菌水冲洗5～6遍。消毒时间的筛选总共有12个处理，每个处理接种10瓶叶片，每瓶接种3份大小为1cm²左右的叶片，其中采用的培养基配方为B5+7.5mg/L TDZ+2.5mg/L IBA，接种完暗处理14d。14d后统计污染率、死亡率。

3、暗处理时间的筛选

将预处理完的叶片先用70％酒精处理40s+0.1％的氯化汞溶液浸泡6min进行消毒处理，然后将叶片接种于B5+7.5mg/L TDZ+2.5mg/L IBA的培养基上，每瓶接种4份大小为1cm²左右的叶片，接种结束后开始进行暗处理诱导愈伤组织的形成，暗处理时间分为0d、7d、 14d、21d、28d共5个不同处理，每个处理接种10瓶。30d后分别统计愈伤组织诱导率、污染率、死亡率，并观察愈伤组织状态。

4、基础培养基筛选

试验所用基础培养基MS、B5、WPM、1/2MS培养基均来自Solarbio公司。按照配方进行配制，分别添加7.5mg/L TDZ+2.5mg/L IBA，将pH值调节在5.8，然后用高压灭菌锅灭菌处理。每种培养基配置10瓶，每瓶接种3份大小为1cm²左右的叶片。30d后统计愈伤组织数、污染数，计算愈伤组织诱导率、增殖倍数。

5生长调节剂种类及浓度筛选

将不同种类和浓度的生长调节剂分别加入到配置好的B5基础培养基中，共14组不同生长调节剂浓度配比处理，每处理分别接种10瓶。具体生长调节剂配方见表4-1，30d后统计愈伤组织数、污染数，计算愈伤组织诱导率、增殖倍数。

表4-1不同生长调节剂配方表

注：6-BA为6-苄氨基嘌呤，NAA为萘乙酸。

二、试验结果

1、消毒时间对叶片组培污染率的影响

由表4-2可知，消毒不同时间后叶片污染率在6.67％～56.67％之间，随着消毒时间的增加，叶片污染率整体呈现降低趋势，但是叶片死亡率逐渐增大，叶片生长状态也开始变差。其中，70％酒精处理30s+0.1％氯化汞5min处理的叶片污染率最大达56.67％，70％酒精处理 40s+0.1％氯化汞6min、70％酒精处理60s+0.1％氯化汞6min处理的叶片污染率相对较低为 6.67％，后者死亡率为3.33％，褐化比较严重。而前者死亡率为0，叶片无褐化。70％酒精处理 50s+0.1％氯化汞7min、70％酒精处理60s+0.1％氯化汞7min处理的叶片虽然污染率虽然较低，但叶片因褐化严重死亡率分别高达13.33％和26.67％。此外，在12个不同消毒处理中， 70％酒精处理40s+0.1％氯化汞6min处理的叶片生长最好，其次为70％酒精处理40s+0.1％氯化汞5min处理的叶片长势较好，褐化较少；而70％酒精处理60s+0.1％氯化汞7min处理的叶片严重褐化，生长最差。综上所述，70％酒精处理40s+0.1％氯化汞6min处理的叶片污染率、死亡率相对较低，叶片长势较好，是适合野生欧洲李叶片组织培养的最佳消毒处理方法。

表4-2不同消毒时间对叶片组培污染率的影响

注：A：污染率低，无褐化；B：污染率低，少量褐化；C：污染率低，褐化比较严重；D：污染严重，无褐化；E：无污染，褐化严重。

2、暗处理时间对叶片愈伤组织诱导的影响

由表4-3可知，不同暗处理时间的叶片愈伤组织诱导率在46.50％～80.50％，其中暗处理 28d的叶片诱导率最大达80.50％，污染率也最低仅为9.50％，但愈伤组织状态生长较差，个别愈伤组织变褐死亡。暗处理14d的叶片愈伤组织诱导率较大为79.00％，污染率也相对较小为10.50％，愈伤组织状态最佳，愈伤组织生长较快且为淡黄绿色，叶脉膨大明显。暗处理 7d和暗处理21d的叶片愈伤组织诱导率相对较低，分别为56.50％和64.50％，愈伤组织生长状态较好，为淡绿色，叶片开始皱缩，叶脉开始膨大，但不明显。不经暗处理直接进行光照处理的对照组诱导率最低，仅为46.50％，死亡率最高为53.50％，愈伤组织为绿色，仅在伤口处形成少量愈伤组织，叶片未皱缩。综上所述，野生欧洲李叶片组织培养的最佳暗处理时间为14d后转到光照下培养，愈伤组织生长最佳。

表4-3暗处理时间对叶片愈伤组织诱导的影响

注：A：愈伤组织生长较快且为淡黄绿色，叶片皱缩严重，叶脉膨大明显；B：愈伤组织为淡绿色，叶片皱缩程度较高，叶脉膨大不明显；C：愈伤组织较少为淡绿色，叶片开始少量皱缩，叶脉开始膨大；D：愈伤组织为绿色，仅在伤口形成愈伤组织，叶片未皱缩或少量皱缩；E：愈伤组织较多但长势最差，无色或白色，部分愈伤组织变褐死亡。下同。

3基础培养基种类对叶片愈伤组织诱导和增殖的影响

由表4-4可知，不同基础培养基对叶片诱导愈伤组织的能力不同，诱导率在51.73％～ 75.56％之间。其中，B5培养基的叶片愈伤组织诱导率最高为75.56％，其次为WPM培养基中的叶片愈伤组织诱导率较高为64.44％，而1/2MS培养基诱导率最低为51.73％，叶片死亡率最高为48.27％。4种培养基对愈伤组织的增殖差别较大，B5培养基的叶片愈伤组织增殖倍数最大为3.59，明显大于其余三种培养基。WPM和MS培养基的叶片愈伤组织增殖倍数分别为1.82 和1.47，1/2MS培养基的叶片愈伤组织增殖倍数最小仅为1.12。此外，B5培养基中的叶片愈伤组织状态最好，愈伤组织量大色正，叶片皱缩严重，叶脉膨大明显。由此可知，最适合野生欧洲李叶片初代培养的培养基为B5培养基。

表4-4不同基础培养基对叶片愈伤组织诱导和增殖的影响

4生长调节剂种类及浓度对叶片愈伤组织诱导和增殖的影响

由表4-5可知，不同生长调节剂浓度配比对叶片愈伤组织的诱导率和增殖倍数差异较大， 14份不同生长调节剂配比的培养基中叶片愈伤组织的诱导率在26.67％～86.67％之间，其中4 号和13号培养基的诱导率最大为86.67％；其次为12号培养基诱导率较大为83.33％；而8号培养基诱导率最小仅为26.67％，死亡率最高为73.33％。此外，4、5、11、12号培养基的愈伤组织生长状态相对较好，12号培养基对愈伤组织的增殖效果最好，增殖倍数高达10.95，其次为4号培养基增殖效果较好，增殖倍数为8.23。综合诱导率、增殖倍数及愈伤组织的生长状态可知，生长调节剂配比为7.5mg/L TDZ+2.5mg/L IBA的12号培养基愈伤组织诱导增殖效果最好。

表4-5不同生长调节剂种类及浓度对愈伤组织诱导和增殖的影响

三、分析

1、不同暗处理时间对叶片初代培养的影响

褐化是植物组织培养中最为常见的难题之一。植物褐化与其体内所含的酚类物质有直接关系，尤其是母本植物褐化现象更严重，而暗处理可以缓解或消除外植体产生褐化现象。在野生欧洲李叶片组织培养过程中，未经暗处理的叶片存在褐化现象，而经暗处理的叶片褐化现象较轻甚至没有褐化。愈伤组织的形成和光照有一定关系。野生欧洲李叶片在暗处理14d 后转到光照培养时诱导愈伤组织较多，愈伤组织生长状态也相对最好，褐化最轻。试验中还发现，除了暗处理可以改善叶片褐变，多次转接新鲜培养基也可以改善叶片的褐变现象。

2、不同生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响

在植物组织培养过程中，影响外植体生长的因素很多，其中生长调节剂的种类和浓度以及基础培养基的种类对其影响最大。生长调节剂种类和浓度对愈伤组织诱导、器官分化起着重要作用，是影响组织培养体系建立的重要因素。不同生长调节剂种类对植物组织培养的效果不同，即使同一种生长调节剂的不同浓度对愈伤组织的诱导和分化影响也不同。合理利用生长素与细胞分裂素的比例可以诱导不同器官的发生，适当的生长调节剂比例时有利于愈伤组织的诱导和分化。试验中发现，野生欧洲李叶片添加TDZ和IBA时对愈伤组织的诱导效果更明显，添加一定量的NAA和6-BA有利于芽的生长。

3、不同基础培养基对叶片愈伤组织诱导的影响

除了生长调节剂对植物组织培养影响较大外，基础培养基的选择也很重要。核果类果树组织培养中应用比较广泛的是MS培养基，但也有试验表明B5培养基更有利于核果类果树的组织培养。有部分研究表明盐浓度低的培养基比盐浓度高的培养基效果更好，尤其是N素对以叶片为主的外植体不定芽再生效果较好。欧洲李叶片在MS培养基上再生率显著低于含氮量等同于1/2MS总氮量的培养基。本试验比较了MS、B5、WPM等基本培养基对于野生欧洲李愈伤组织诱导的影响，发现B5培养基对野生欧洲李效果最好，外植体形成愈伤组织速度较快，出愈率最高，更适合野生欧洲李叶片愈伤组织诱导。MS效果次之，WPM最差，可能原因是B5 培养基含铵少的原因。

四、结论

适合野生欧洲李叶片组织培养的最佳消毒时间处理为：70％酒精处理40s+0.1％氯化汞6 min。叶片接种后以暗处理14d后转到光照培养箱培养为宜，此时叶片叶脉明显膨大易脱分化诱导形成愈伤组织。在选用的4种培养基中，以B5培养基作为基础培养基时叶片生长状态最佳。适合野生欧洲李叶片诱导愈伤组织的最佳生长调节剂配方为：B5+7.5mg/LTDZ+2.5 mg/L IBA。

Claims

1.野生欧洲李叶片组织培养的方法，包括以下步骤：

第三步剪取消毒完的叶片，接种至含有培养基的瓶中，所属培养基配方为B5培养基(B5)+7.5mg/L噻苯隆(TDZ)+2.5mg/L吲哚丁酸(IBA)；

第四步接种完暗处理14d。