CN104542290A - 一种桃愈伤组织长期继代保存的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桃愈伤组织长期继代保存的方法，该方法通过外植体选取与清洗消毒、再生培养、继代增殖培养、愈伤组织诱导、继代保存培养和不定芽分化诱导，实现愈伤组织的长期保存，采用本发明提供的方法简便，易操作，成本低，与现有技术相比茎段外植体不易褐化，分化率高的优点，茎段外植体再生率达到76.60％。叶片愈伤组织诱导率达到100.00％，长期保存的愈伤组织，分化率达到30.00％。

Description

一种桃愈伤组织长期继代保存的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体地指一种桃愈伤组织长期继代保存的方法。

背景技术

桃(Prunus persica L.)，属于蔷薇科、李属、桃亚属植物，起源于中国，已有4000年栽培历史，栽培面积与产量达到世界一半以上。由于桃果肉细腻多汁，风味芳香，营养丰富，易于消化吸收，是深受广大人民喜爱的水果之一。

桃的组织培养始于1933年，Tukey等首先进行桃胚的生长与果实生长和成熟关系的研究并开展了桃胚的离体培养。经过长期的研究，虽然桃组织培养工作已有广泛的发展，但目前外植体类型仍然主要集中在茎尖培养和胚培养，分化率和再生率不高。利用桃叶片作为外植体，通过无菌操作技术，接种于人工培养基上，诱导其分化出愈伤组织，以愈伤组织的形式对桃种质资源进行保存，节约人力、物力、土地，同时叶片外植体易获得，方法简便，培养效果好。

发明内容

本发明的目的在于，降低桃种质资源保存成本，应用本方法获得愈伤组织的几率高，培养效果好。将本发明愈伤组织诱导及分化方法用于桃种质资源保存中，可极大节省桃种质资源保存的人力和物力成本，同时为桃生物技术及分子遗传育种研究提供技术和理论依据。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种桃愈伤组织长期继代保存的方法，其步骤为：

1)选取桃当年生半木质化带腋芽茎段，用洗涤剂溶液浸泡30分钟，流水冲洗2小时进行表面除菌、消毒。

2)茎段外植体用75％的酒精浸泡1分钟，用无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞消毒8分钟，用无菌水冲洗3-5次后接种于茎段再生培养基上，外植体首先进行7天暗培养，后转到2000勒克斯光照强度下进行光照培养；

3)茎段外植体培养30天后，获得桃试管苗，切掉茎段基部，将试管苗转移到将继代培养基上进行继代增殖培养；

4)取继代30天左右，生长健壮的桃试管苗顶端2-4节完全展开叶片，沿垂直主脉方向将叶片切伤3-4下(不将叶片切断)，将切伤后的桃叶片接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导；

5)桃叶片愈伤组织诱导培养30天后，切取愈伤组织接种到愈伤组织继代增殖培养基上进行继代保存，每30天继代培养1次；

6)取继代培养10次的桃愈伤组织，转移到新鲜继代培养基上培养15d，挑取色泽鲜艳，质地紧密，淡黄色的桃愈伤组织，接种到愈伤组织不定芽诱导培养基上进行不定芽分化诱导。

上述步骤2)、3)、4)、5)、6)中培养基的组分及配比如下：

所述的茎段外植体离体再生培养基为：LP基本培养基，0.40mg/L6-BA，0.06mg/L IBA，1.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；

所述的桃试管苗继代增殖培养基为：LP基本培养基，0.40mg/L6-BA，0.06mg/L IBA，3.00mg/L腺嘌呤，1.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；

所述的桃叶片愈伤组织诱导培养基为：LP基本培养基，1.0mg/L6-BA，3.0mg/L2,4-D，0.5mg/L AgNO3，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；

所述的桃愈伤组织继代、保存培养基为：LP基本培养基，1.5mg/L2,4-D，0.4g/L水解酪蛋白，3.0g/L柠檬酸，30.0g/L蔗糖，5.8g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0，培养条件为持续暗培养；

所述的桃愈伤组织分化培养基为：SH基本培养基，3.0mg/L TDZ，0.3mg/L NAA水30.0g/L蔗糖，6.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0，培养条件为持续暗培养；

所述的茎段离体再生培养基、试管苗继代增殖培养基、叶片愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代、保存培养基、愈伤组织分化培养基均在121℃，0.1-0.15Mpa下高温高压灭菌15-20分钟。

为了便于对本发明的理解，申请人对上述各个步骤中所用的培养基，培养基中所用到的植物激素做如下定义：

培养基包括茎段离体再生培养基、试管苗继代增殖培养基、叶片愈伤组织诱导培养基、愈伤组织分化培养基、愈伤组织继代、保存培养基、愈伤组织分化培养基。本发明所使用基本培养基为LP基本培养基和SH基本培养基。。

本发明中，所述植物激素定义及简称如下：6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、维生素C(Vc)、2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)、水解酪蛋白(CH)、柠檬酸(CA)、苯基噻二唑基脲(TDZ)萘乙酸(NAA)，植物激素中的细胞分裂素包括6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和苯基噻二唑基脲(TDZ)。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和积极效果：

(1)本发明以愈伤组织的形式进行桃种质资源保存，外植体易获得，方法简便，易操作，成本低，种质资源保存数量大。

(2)与已有技术相比，本发明具有茎段外植体不易褐化，分化率高的优点，茎段外植体再生率达到76.60％。

(3)与已有技术相比，本发明具有叶片外植体及其诱导分化的愈伤组织不易褐化的特点，愈伤组织增殖效果好，叶片愈伤组织诱导率达到100.00％，长期保存的愈伤组织，分化率达到30.00％。

附图说明

图1为本发明的一个实施例茎段外植体接种当天示意图。

图2为本发明的一个实施例茎段外植体接种28天示意图。

图3为本发明的一个实施例叶片外植体接种当天示意图。

图4为本发明的一个实施叶片愈伤组织诱导示意图。

图5为本发明的一个实施例愈伤组织继代保存示意图。

图6为本发明的一个实施例愈伤组织分化产生不定芽示意图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：

一种桃愈伤组织长期继代保存的方法，其步骤是：(试验材料选择、培养基设计与接种培养)

1、试验材料来源及其处理：

本发明的试验材料为“春雪”桃，茎段外植体采自湖北省武汉市林业果树科学研究所实验基地。选取桃当年生半木质化带腋芽茎段，用洗涤剂溶液浸泡30分钟，流水冲洗2小时进行表面除菌、消毒。于超净工作台上，茎段外植体用75％的酒精浸泡1分钟，用无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞消毒8分钟，用无菌水冲洗3-5次后接种于茎段再生培养基上(见表1)。外植体首先进行7天暗培养，后转到2000勒克斯光照强度下进行光照培养(见图1)。

2、培养基制备及设计：

表1列出了本发明的最佳培养基组成成分及其用量。

表1本发明设计的茄子花药培养的最佳培养基

说明：LP基本培养基、SH基本培养基配制参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版。

3、培养条件：

培养室的温度设置为25±1℃，光照强度2000勒克斯。

4、愈伤组织诱导与培养：

取继代30天左右，生长健壮的桃试管苗顶端2-4节完全展开叶片，沿垂直主脉方向将叶片切伤3-4下(不将叶片切断)，将切伤后的桃叶片接种到愈伤组织诱导培养基上(见表1)进行愈伤组织诱导(见图3、图4)；

实施例2：

暗培养时间对愈伤组织继代保存的影响

由表2可以看出，暗培养时间对愈伤组织继代保存的影响差异较显著。从愈伤增殖倍数来看，暗培养时间与愈伤组织增殖倍数基本呈正相关。暗培养14天和暗培养21天的增殖倍数虽然低于暗培养0天或7天但是他们差异不显著。从愈伤组织的颜色和形态来看，愈伤组织褐变程度与暗培养时间呈负相关，但暗培养时间过长会使愈伤组织活性下降，且质地较松散，暗培养28天时，愈伤组织质量最好。综上考虑，愈伤组织继代保存适宜在暗培养状态下进行持续保存，且每28天更换一次新鲜培养基。

表2暗培养时间对愈伤组织继代保存的影响

说明：愈伤组织增殖倍数＝W2/(W1-W0)，在接种前称量装有培养基的三角瓶重量(W0)和接种愈伤后的重量(W1)，培养28天后，将愈伤组织从三角瓶中取出称重(W2)

实施例3：

植物激素对愈伤组织分化不定芽的影响

在植物组织培养中，TDZ是一种具有较强促进植物细胞分裂能力的生长调节剂，NAA是一种应用得比较广泛的生长素类生长调节剂，生长素与细胞分裂素混合使用对愈伤组织的分化能起调控作用。

本研究设置了TDZ与NAA的不同浓度组合共9个。从表3可以看出，随着TDZ浓度的增加，愈伤分化率呈上升趋势，但当TDZ浓度达到5.0mg/L时，不定芽玻璃化现象极严重，综合考虑，以3.0mg/L的TDZ与0.3mg/L的NAA组合效果最佳。

表3激素对愈伤组织分化的影响

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (2)

1.一种桃愈伤组织长期继代保存的方法，其步骤为：

1)选取桃当年生半木质化带腋芽茎段，用洗涤剂溶液浸泡30分钟，流水冲洗2小时进行表面除菌、消毒。

2)茎段外植体用75％的酒精浸泡1分钟，用无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞消毒8分钟，用无菌水冲洗3-5次后接种于茎段再生培养基上，外植体首先进行7天暗培养，后转到2000勒克斯光照强度下进行光照培养；

3)茎段外植体培养30天后，获得桃试管苗，切掉茎段基部，将试管苗转移到继代培养基上进行继代增殖培养；

4)取继代30天左右，生长健壮的桃试管苗顶端2-4节完全展开叶片，沿垂直主脉方向将叶片切伤3-4下(不将叶片切断)，将切伤后的桃叶片接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导；

5)桃叶片愈伤组织诱导培养30天后，切取愈伤组织接种到愈伤组织继代增殖培养基上进行继代保存，每30天继代培养1次；

6)取继代培养10次的桃愈伤组织，转移到新鲜继代培养基上培养15天，挑取色泽鲜艳，质地紧密，淡黄色的桃愈伤组织，接种到愈伤组织不定芽诱导培养基上进行不定芽分化诱导。

2.根据权利要求1所述的一种桃愈伤组织保存方法，其特征在于：

所述的茎段外植体离体再生培养基为：LP基本培养基，0.40mg/L 6-BA，0.06mg/L IBA，1.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；

所述的桃试管苗继代增殖培养为：LP基本培养基，0.40mg/L 6-BA，0.06mg/L IBA，3.00mg/L腺嘌呤，1.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；

所述的桃叶片愈伤组织诱导培养基为：LP基本培养基，1.0mg/L 6-BA，3.0mg/L 2,4-D，0.mg/L AgNO3，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；

所述的桃愈伤组织继代、保存培养基为：LP基本培养基，1.5mg/L 2,4-D，0.4g/L水解酪蛋白，3.0g/L柠檬酸，30.0g/L蔗糖，5.8g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0，培养条件为持续暗培养；

所述的桃愈伤组织分化培养基为：SH基本培养基，3.0mg/L TDZ，0.3mg/L NAA水30.0g/L蔗糖，6.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0，培养条件为持续暗培养。