CN103598097B - 无病毒吊瓜组培苗的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种无病毒吊瓜组培苗的培养方法，属于农业种植技术领域。解决了现有技术所存在的吊瓜组培苗未经过脱病毒处理，移植到田间后容易受病毒侵染的技术问题。它包括获得吊瓜组培苗、将吊瓜组培苗置于光照培养箱中变温培养8-12天、培养完成后取茎尖接种培养、转接种培养、得到脱病毒的植株增殖步骤。本发明获得了无病毒的吊瓜组培苗，该组培苗移植到田间后不易受病毒侵染，一致性好，组培苗生长旺盛、产量高，确保了吊瓜籽的产量和质量。

Description

无病毒吊瓜组培苗的培养方法

技术领域

本发明属于农业种植技术领域，涉及一种无病毒吊瓜组培苗的培养方法。

背景技术

吊瓜(Fructus Trichosanthis Kirilowii)是被子植物门(Angiospermae)、双子叶纲(Dicotyledones)、葫芦科(Cucurbitaceae)、瓜蒌属的多年生草本攀援植物，我国东部和长江及黄河流域等地均可栽种。吊瓜果实为白色与浅绿或深绿相间花纹,成熟后呈桔红色。吊瓜食用性开发主要集中在吊瓜籽上。吊瓜籽占吊瓜果实净重三分之一以上，一般情况下吊瓜果实中含种子75～210粒，亩产瓜子75～150公斤。现代医药学研究证明：吊瓜籽中脂肪酸占36.2%,其中65%为不饱和脂肪酸，蛋白质占5.46%，并含17种以上的氨基酸，经常食用具有保健作用。吊瓜籽炒熟后味道润绵、脆香特异、其外观褐色艳丽、籽仁饱满，被誉为“瓜子之王”。

食用吊瓜雌雄异株，目前主流的繁殖法有籽播苗繁殖法和生块根切断繁殖法两种，用籽播苗繁殖，繁殖率低后代分离严重，一致性差，不结果的雄株占总苗的70%以上，育苗成本高，且病毒病发病几率高（种传病毒）；用块根切断繁殖，由于受块根数量的限制，繁殖效率低，且费工费时，直接影响播种面积的扩大及优良品种的推广。人们经过多年的研究后，开发了吊瓜种苗的无性繁殖技术，该技术可以达到快速繁殖的目的，如中国发明专利公开了一种吊瓜组培苗育苗方法[申请号：200610161470.1]，但用该方法得到的吊瓜组培苗未进行脱病毒处理，组培苗中会存在病毒，目前关于吊瓜病毒病研究的结果显示：西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)是引起吊瓜病毒病主要的主要病源。经采摘的疑似感病毒的吊瓜样品，经检测得出侵染吊瓜的病毒均为马铃薯Y病毒属病毒(Potyvirus)，有常见的小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、木瓜环斑病毒(Papayaring spot virus,PRSV)和(Papaya leaf distortion mosaicvirus,PLDMV)等。带有上述这些病毒的组培苗移植到田间后容易造成病毒病流行，被病毒侵染的吊瓜在第一年症状表现不明显，但果实的产出不高，主要产量集中在第二年，第三年基本没有产量。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种无病毒吊瓜组培苗的培养方法；解决了现有技术所存在的吊瓜组培苗未经过脱病毒处理，移植到田间后容易受病毒侵染的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种无病毒吊瓜组培苗的培养方法，包括以下步骤：

步骤1，在实验室培养基中获得吊瓜组培苗；

步骤2，将吊瓜组培苗置于光照培养箱中，所述光照培养箱的温度每隔12小时在31℃-33℃和37℃-39℃两个温度区间进行交替变换，培养时间为8-12天；

步骤3，培养完成后，从光照培养箱中取出吊瓜组培苗，在解剖镜下剥取0.2-0.4mm的茎尖，接种于第一培养基上，将第一培养基放入培养室中培养；

步骤4，当茎尖转绿并膨大至1.8-2.2mm时，将茎尖转接至第二培养基上，并继续在培养室中培养；

步骤5，当茎尖培养成4-5cm的组培苗植株时，取组培苗植株叶子检测植株是否脱病毒，如已脱病毒，将此植株进行增殖，得到无病毒吊瓜组培苗。

在上述的无病毒吊瓜组培苗的培养方法中，在步骤3中，所述第一培养基为pH为5.6-6.0的MS+2.0mg·L-1BA+30.0mg·L-1蔗糖+0.6%琼脂培养基。

在上述的无病毒吊瓜组培苗的培养方法中，在步骤4中，所述第二培养基为pH为5.6-6.0的MS+1.5mg·L-1BA+30.0mg·L-1蔗糖+0.6%琼脂培养基。

在上述的无病毒吊瓜组培苗的培养方法中，在步骤3中，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d。

在上述的无病毒吊瓜组培苗的培养方法中，在步骤4中，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d。

作为一种优选的方案，无病毒吊瓜组培苗的培养方法，包括以下步骤：

步骤1，在实验室培养基中获得吊瓜组培苗；

步骤2，将吊瓜组培苗置于光照培养箱中，所述光照培养箱的温度每隔12小时在32℃和38℃两个温度间进行交替变换，培养时间为10天；

步骤3，培养完成后，从光照培养箱中取出吊瓜组培苗，在解剖镜下剥取0.2-0.4mm的茎尖，接种于pH为5.8的MS+2.0mg·L-1BA+30.0mg·L-1蔗糖+0.6%琼脂的第一培养基上，将第一培养基放入培养室中培养，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d；

步骤4，当茎尖转绿并膨大至2mm时，将茎尖转接至pH为5.8的MS+1.5mg·L-1BA+30.0mg·L-1蔗糖+0.6%琼脂的第二培养基上，并继续在培养室中培养，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d；

步骤5，当茎尖培养成4-5cm的组培苗植株时，取组培苗植株叶子检测植株是否脱病毒，如已脱病毒，将此植株进行增殖，得到无病毒吊瓜组培苗。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

1、热处理结合茎尖培养结合的方法，脱除了单用茎尖培养或热处理难以脱除的病毒，提高了脱毒成功的几率；

2、采用变温的热处理脱毒法，提高了组培苗的存活率；

3、选取0.2-0.4mm的茎尖进行培养，成活率可达60%，脱毒率为100%，具有存活率高和脱毒率完全的效果；

4、获得了无病毒的吊瓜组培苗，利用无病毒组培苗进行组织培养，达到快速繁殖的目的，该组培苗移植到田间后不易受病毒侵染，一致性好，组培苗生长旺盛、产量高，确保了吊瓜籽的产量和质量。

具体实施方式

一种无病毒吊瓜组培苗的培养方法，包括以下步骤：

步骤1，在实验室培养基中获得吊瓜组培苗；

步骤2，将吊瓜组培苗置于光照培养箱中，所述光照培养箱的温度每隔12小时在31℃-33℃和37℃-39℃两个温度区间进行交替变换，培养时间为8-12天；

步骤3，培养完成后，从光照培养箱中取出吊瓜组培苗，在解剖镜下剥取0.2-0.4mm的茎尖，接种于pH为5.6-6.0的MS+2.0mg·L-1BA+30.0mg·L-1蔗糖+0.6%琼脂培养基上，将培养基放入培养室中培养，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d；

步骤4，当茎尖转绿并膨大至1.8-2.2mm时，将茎尖转接至pH为5.6-6.0的MS+1.5mg·L-1BA+30.0mg·L-1蔗糖+0.6%琼脂培养基上，并继续在培养室中培养，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d；

步骤5，当茎尖培养成4-5cm的组培苗植株时，取组培苗植株叶子检测植株是否脱病毒，如已脱病毒，将此植株进行增殖，得到无病毒吊瓜组培苗。

作为一种优选的方案，无病毒吊瓜组培苗的培养方法，包括以下步骤：

步骤1，在实验室培养基中获得吊瓜组培苗；

步骤2，将吊瓜组培苗置于光照培养箱中，所述光照培养箱的温度每隔12小时在32℃和38℃两个温度间进行交替变换，培养时间为10天；

步骤3，培养完成后，从光照培养箱中取出吊瓜组培苗，在解剖镜下剥取0.2-0.4mm的茎尖，接种于pH为5.8的MS+2.0mg·L-1BA+30.0mg·L-1蔗糖+0.6%琼脂培养基上，将培养基放入培养室中培养，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d；

步骤4，当茎尖转绿并膨大至2mm时，将茎尖转接至pH为5.8的MS+1.5mg·L-1BA+30.0mg·L-1蔗糖+0.6%琼脂培养基上，并继续在培养室中培养，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d；

步骤5，当茎尖培养成4-5cm的组培苗植株时，取组培苗植株叶子检测植株是否脱病毒，如已脱病毒，将此植株进行增殖，得到无病毒吊瓜组培苗。

下面结合试验数据进一步说明本发明的有益效果：

表1为热处理方法和时间对组培苗生长的影响。

表1

其中，恒温处理为现有技术中38℃恒温处理模式，变温处理为每隔12小时在32℃和38℃两个温度间进行交替变换模式。

由表1可知，组培苗的成活率受处理方式、处理时间而发生影响。恒温处理5d时，叶片已变黄绿色；恒温处理10d时，部分嫩叶已发黄；恒温处理15-20d，由于热处理时间的延长，组培苗组织受损程度加剧，部分组培苗因不耐持续高温处理而死亡，成活率由47.5%降到17.5%。变温处理5-10d后，组培苗均出现生长减缓的现象；变温处理15d时，部分嫩叶已发黄，变温处理20d，27.5%的植株死亡。

综上，由表1可以看出，变温热处理比恒温热处理组培苗的成活率要高，宜选择变温热处理5-15d，最佳为10天。

表2为变温热处理时间和茎尖大小对茎尖培养基脱毒效果的影响。

表2

其中，变温处理热处理为每隔12小时在32℃和38℃两个温度间进行交替变换。

由表2可以看出，热处理5d、10d和15d，剥取大于0.4mm的茎尖，脱毒率分别为18.2%，23.1%和40%，由此表明，热处理的时间越长，脱毒效果越明显。热处理同样时间，如15d时，剥取0.2-0.4mm的茎尖，脱毒率为100%，而剥取大于0.4mm的茎尖，脱毒率仅为40%，说明热处理时间相同时，茎尖越小，脱毒率越高，说明两者存在负相关。热处理15d剥取0.2-04mm的茎尖虽然脱毒率也为100%，但成活率仅为20%。

综上，要保证既有较高的成活率，又要获得较高的脱病毒苗，以热处理10d剥取0.2-0.4mm的茎尖效果最佳，成活率可达60%，脱毒率为100%。

本发明获得了无病毒的吊瓜组培苗，利用无病毒组培苗进行组织培养，达到快速繁殖的目的，该组培苗移植到田间后不易受病毒侵染，一致性好，组培苗生长旺盛、产量高，确保了吊瓜籽的产量和质量。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (4)

1.一种无病毒吊瓜组培苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，在实验室培养基中获得吊瓜组培苗；

步骤2，将吊瓜组培苗置于光照培养箱中，所述光照培养箱的温度每隔12小时在31℃-33℃和37℃-39℃两个温度区间进行交替变换，培养时间为8-12天；

步骤3，培养完成后，从光照培养箱中取出吊瓜组培苗，在解剖镜下剥取0.2-0.4mm的茎尖，接种于第一培养基上，将第一培养基放入培养室中培养；

步骤4，当茎尖转绿并膨大至1.8-2.2mm时，将茎尖转接至第二培养基上，并继续在培养室中培养；

步骤5，当茎尖培养成4-5cm的组培苗植株时，取组培苗植株叶子检测植株是否脱病毒，如已脱病毒，将此植株进行增殖，得到无病毒吊瓜组培苗；

在步骤3中，所述第一培养基为pH为5.6-6.0的MS+2.0 mg·L^-1BA+30.0 mg·L^-1蔗糖+0.6％琼脂培养基；

在步骤4中，所述第二培养基为pH为5.6-6.0的MS+1.5 mg·L^-1BA+30.0 mg·L^-1蔗糖+0.6％琼脂培养基。

2.根据权利要求1所述的无病毒吊瓜组培苗的培养方法，其特征在于，在步骤3中，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d。

3.根据权利要求1所述的无病毒吊瓜组培苗的培养方法，其特征在于，在步骤4中，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d。

4.根据权利要求1所述的无病毒吊瓜组培苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，在实验室培养基中获得吊瓜组培苗；

步骤2，将吊瓜组培苗置于光照培养箱中，所述光照培养箱的温度每隔12小时在32℃和38℃两个温度间进行交替变换，培养时间为10天；

步骤3，培养完成后，从光照培养箱中取出吊瓜组培苗，在解剖镜下剥取0.2-0.4mm的茎尖，接种于pH为5.8的MS+2.0 mg·L^-1BA+30.0 mg·L^-1蔗糖+0.6％琼脂的第一培养基上，将第一培养基放入培养室中培养，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d；

步骤4，当茎尖转绿并膨大至2mm时，将茎尖转接至pH为5.8的MS+1.5 mg·L^-1BA+30.0 mg·L^-1蔗糖+0.6％琼脂的第二培养基上，并继续在培养室中培养，所述培养室温度为23℃-27℃，相对湿度为60％-80％，光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-14h/d；

步骤5，当茎尖培养成4-5cm的组培苗植株时，取组培苗植株叶子检测植株是否脱病毒，如已脱病毒，将此植株进行增殖，得到无病毒吊瓜组培苗。