CN107347627A - 一种高效创建国兰有性多倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物多倍体育种技术领域，具体公开一种高效创建国兰有性多倍体的方法。所述方法通过选择高效发生2n配子资源进行杂交，对杂种种子进行培养形成中间繁殖体，对中间繁殖体进行观察，选择拟似多倍性中间繁殖体进行分化生产后代苗，采用形态学、流式细胞仪和根尖染色体压片对后代苗进行鉴定，获得兰花有性多倍体。本发明提供的方法将植物倍性优势和杂交优势有效结合，同时建立高效创建国兰有性多倍体技术体系，对提高我国国兰产业的核心竞争力和效益、尽快缩小我国兰花育种和国外的差距、促进花卉产业高效可持续发展具有十分重要意义。

Description

一种高效创建国兰有性多倍体的方法

技术领域

本发明属于植物多倍体育种技术领域，具体地涉及一种高效创建国兰有性多倍体的方法。

背景技术

国兰（Chinese Cymbidium）是指兰属植物中一部分产于东亚温带至热带地区的地生种类：包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰、春剑、套叶兰、莎叶兰、邱北冬蕙兰、峨嵋春蕙、兔耳兰、宽叶兰、落叶兰等。国兰香气宜人、株型秀美、花色雅致，是中国传统文化的物质载体，素有“花中君子”之称，在我国已有1000多年的栽培历史。随着国兰产业化发展和人们物质文化生活水平的不断提高，国兰开始走进寻常百姓家，受到越来越多消费者的喜爱，其市场前景十分广阔。

多倍体具有植株粗壮、叶片宽厚、花大而艳丽、内含物多、对次生代谢物的积累强以及抗逆性强等优点，还能够克服远缘杂交不亲和，增加物种的多样性，大大的提高了花卉的观赏性和经济价值。多倍体育种是兰花育种的重要方法。目前商业化的大花蕙兰、蝴蝶兰、石斛兰品种大多数都是多倍体品种。但目前产业化生产的国兰品种都是二倍体品种。为了培育国兰多倍体品种，已有研究者通过秋水仙素处理的方法获得墨兰、春兰、寒兰、春剑等无性多倍体的报道。但用秋水仙素诱导产生的多倍体存活率低，生长慢、难繁殖，较难在生产上直接利用。

利用2n配子途径创造多倍体可将植物倍性优势和杂交优势有效结合，快速育成能适应产业化要求、突破性的植物新品种。因此，研究通过2n配子途径创造国兰多倍体，建立高效创建国兰有性多倍体技术体系，对提高我国国兰产业的核心竞争力和效益、尽快缩小我国兰花育种和国外的差距、促进花卉产业高效可持续发展具有十分重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效创建国兰有性多倍体的方法。

一种高效创建国兰有性多倍体的方法，包括以下步骤：

S1. 亲本选择和杂交组合配置：选择高效发生2n配子的杂交兰或国兰做亲本，配置杂交组合，获得果实；

S2. 种子培养和中间繁殖体鉴定：对兰花种子进行无菌培养获得中间繁殖体（一般为根状茎），将单粒种子形成的中间繁殖体进行继代增殖培养，观察中间繁殖体形态、生长速度，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体；

S3. 植株再生和试管苗形态观察：对选到的中间繁殖体进行分化培养和生根壮苗培养，对形成的再生植株进行形态学观察，选择国兰株型、植株粗壮、叶色深、叶厚、根粗壮、根尖端圆钝的植株；

S4. 细胞学鉴定和有性多倍体的获得：对当选的植株进行流式细胞仪测定和根尖染色体数测定，染色体数为60条或以上的为多倍体。

优选地，S1亲本选择中母本为小香，父本为兔耳兰。

进一步地，S2包括以下步骤：

S21. 果实消毒、接种和初代培养：将杂交后150~270天左右的果实洗净，然后用75%乙醇消毒8~10分钟，无菌水冲洗3~5次，取其内部种子接种到固体培养基上培养；培养条件为温度26℃左右，暗培养；

S22. 中间繁殖体的增殖：将种子萌发后形成的中间繁殖体分开，将单个中间繁殖体或将其切成长度2~8mm小段，分别接种于继代培养基上培养；培养条件为温度26℃左右，每日光照8~12小时，光照强度500~1000lux；

S23. 中间繁殖体形态观察：对中间繁殖体的繁殖速度、形态特征进行观察，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体。

更进一步地，所述的步骤S21中固体培养基配方1/2MS培养基+0.2～0.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+10～20%（v/v）椰子汁+30g/L糖+0.3～2g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶；

所述的步骤S22中固体培养基配方为1/2MS培养基+0.5～2 mg/l 6-BA+0.1～0.2mg/lNAA+0.2～0.5g/L 活性碳+30g/L糖+7.5g/L卡拉胶。

步骤S3中所述植株再生和试管苗形态观察包括如下步骤：

S31. 芽分化培养：将继代培养的中间繁殖体分开，接种于芽分化培养基上培养，培养条件为温度26℃左右，每日光照10小时，光照强度1000~2000lux；

S32. 生根壮苗培养：将高2~4cm从中间繁殖体上切下，接种到生根壮苗培养基上培养，培养条件为温度26℃左右，每日光照10小时，光照强度1000~2000lux；

S33. 试管苗观察：对试管苗及其形成过程进行观察，生长慢、形成过程时间长，粗壮、叶片厚，叶色深、根短粗壮、根尖部圆钝的试管苗为拟似多倍体，以形态正常的植株做对照；

更进一步地，步骤S31中所述的芽分化培养基配方为1/2MS培养基+1.5～2.0mg/L 6-BA+0.1～1mg/L NAA+30g/L糖+0～0.3g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。

步骤S33中所述的生根壮苗培养基配方为1/2MS培养基+0.1～0.2mg/l 6-BA+0.5～2mg/l NAA+20～40g/L糖+0.2～0.5g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。

步骤S4所述的细胞学鉴定和有性多倍体的获得包括以下步骤：

S41. 流式细胞仪鉴定：以试管苗叶片为材料，根尖细胞染色体为40的二倍体为对照，采用Partec-cyview85流式细胞仪确定当选拟似多倍体植株的倍性。

S42. 根尖细胞染色体鉴定：以幼嫩根尖为材料，采用压片法鉴定当选试管苗根尖细胞染色体数，染色体数为40时为二倍体，染色体为60或以上时为多倍体。

S43. 有性多倍体的获得：将确定为多倍体的试管苗进行移栽和栽培，即可获得有性多倍体。

本发明利用上述方法，在步骤S1中按照母本为小香，父本为兔耳兰进行杂交。结果显示多倍体发生率分别达到1.85%和3.45%，表明通过本发明的2n配子途径和一系列的国兰有性多倍体技术体系处理，能够高效获得国兰有性多倍体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明利用高效发生2n配子资源，提高了利用2n配子途径创建国兰有性多倍体的效率，为利用多倍体育种方法培育多倍体国兰新品种提供了可行的途径；（2）获得有性多倍体集倍性优势和杂交优势于一身，和无性多倍体相比具有生长速度快，生长势强等特点，可以直接作为新品种推广，这些新品种具有更强的市场竞争力，经济效益和社会效益都将十分明显。

附图说明

图1为本发明高效创建国兰有性多倍体的方法流程图。

图2为表1中HX-2组合有性多倍体的鉴定，其中，a. 四倍体HX-2-21（左）和二倍体HX-2（右）中间繁殖体；b. 四倍体HX-2-21（左）和二倍体HX-2（右）试管苗；c. 四倍体HX-2-21流式细胞图；d. 四倍体HX-2-21根尖染色体（2n=4x=80）e.二倍体HX-2流式细胞图；f. 二倍体HX-2根尖染色体（2n=2x=40）。

图3为表1中HX-3组合有性多倍体的鉴定，其中，a. 三倍体（左和中）和二倍体（右）中间繁殖体；b. 三倍体（左和中）和二倍体（右）试管苗；c. 三倍体流式细胞图；d. 三倍体根尖染色体（2n=3x=60）e. 二倍体流式细胞图；f. 二倍体根尖染色体（2n=2x=40）。

具体实施方式

下面结合具体的实例和附图对本发明做进一步的阐述，但具体实例并不对本发明做任何的限定。以下实例中所述培养基、试剂等均为本领域的普通技术人员通过购买可以得到。

实施例1：墨兰有性多倍体资源的创建

2012年开始我们用本发明所述的方法进行墨兰有性多倍体资源创建，具体方法如下（流程如图1所示）：

S1. 亲本选配和杂交组合配置：选择2n雄配子发生率高的06-bs-45-32（2n雄配子发生率2.67）和06-bs-45-17（2n雄配子发生率3.92）为亲本材料，2012年2月20日分别以06-bs-45-32和06-bs-45-17为母本、06-bs-45-17为父本配制杂交组合，同年10月18日收获果实。

其中，2n雄配子发生率高的06-bs-45-32（2n雄配子发生率2.67）和06-bs-45-17（2n雄配子发生率3.92）的获得方法参见专利201310668763.9公开的内容。

S2. 种子培养和中间繁殖体鉴定：

S21. 果实消毒、接种和初代培养：将杂交后发育240天的果实用用解剖刀去掉果柄，修理果实顶部，蘸取洗洁精刷洗后用自来水冲洗5～6 min，晾干，在超净工作台上用75 %的酒精浸泡8～10 min，无菌水冲洗3～5次后，用无菌解剖刀切开取其内部种子接种到1/2MS+6-BA（6-苄基腺膘呤）0.5 mg·L^-1+NAA（萘乙酸）0.2 mg·L^-1+蔗糖30 g·L^-1 +卡拉胶7.5g·L^-1 +CW（椰子汁）100 ml·L^-1+AC（活性炭）0.5 g·L^-1的固体培养基上培养。培养条件为温度26℃左右，暗培养。

S22. 中间繁殖体的增殖和鉴定：将种子萌发后形成的中间繁殖体分开，将单个中间繁殖体或将其切成直径2～3 mm小块，分别接种于1/2MS+6-BA1.0 mg·L-1 + NAA0.2mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+卡拉胶7.5 g·L-1 + AC0.5 g·L-1 的固体培养基上培养。培养条件为温度26℃左右，每日光照12小时，光照强度1000lux。观察各种子形成的中间繁殖体形态、生长速度，发现在06-bs-45-32×06-bs-45-17组合中有2个种子萌发形成的根状茎粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢，在06-bs-45-17×06-bs-45-17的组合中有1个种子萌发形成的根状茎粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢（图2-a和图3-a）。

S3. 植株再生和试管苗形态观察：

S31.分化培养：将中间繁殖体分开，分别接种到1/2MS+ 6-BA 1.5～2.0 mg·L^-1 +NAA 0.2～0.5 mg·L^-1 +30 g·L^-1蔗糖+卡拉胶7.5 g·L^-1的固体培养基上进行芽分化培养。培养条件为温度26℃左右，每日光照12小时，光照强度2000lux。

S32. 生根壮苗：选取2 cm以上的芽或小苗，接种于：1/2MS+ 6-BA 0.1～0.2 mg·L^-1 + NAA 0.5～1.0 mg·L^-1 + 蔗糖20 -40 g·L^-1 +卡拉胶7.5g·L^-1 + AC 0.5 g·L^-1，的固体培养基上培养。培养条件为温度26℃左右，每日光照12小时，光照强度2000lux。

S33. 试管苗观察：对试管苗及其形成过程进行观察，发现粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的根状茎分化形成过程苗的时间长，其试管苗比其他试管苗更粗壮、叶片厚，叶色深、根短粗壮、根尖部圆钝，为拟似多倍体（图2-b和图3-b）；

S4. 细胞学鉴定和有性多倍体的获得：

S41. 流式细胞仪鉴定：以试管苗叶片为材料，按Partec-cyview85流式细胞仪操作步骤和流程测定对照（形态正常的试管苗）和拟似多倍体的倍性（图2-c,e和图3-c,e）。

S42. 根尖细胞染色体鉴定：以试管苗幼嫩根尖为材料，采用压片法鉴定拟似多倍体试管苗和对照根尖细胞染色体数，染色体数为40时为二倍体，染色体为60或以上时为多倍体（图2-d,f和图3-d,f）;

S43. 有性多倍体的获得：当多倍体小苗长至5～8 cm并具有2条以上根时即可进行炼苗。炼苗时，将培养瓶盖子旋松，放在温室中10～20 d或在室外无直射光的地方放置3～5 d后，取出试管苗洗净，用树皮和进口泥炭混合基质种植于育苗杯中，按国兰种植的管理方法进行栽培即可获得成品多倍体。

表1国兰有性多倍体发生率

*：（）内数据为该株系（品种）的2n雄配子发生率；06-bs-45-17和06-bs-45-32分别为小香×兔耳兰的高效发生2n雄配子杂交后代。

Claims (9)

1.一种高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 亲本选择和杂交组合配置：选择高效发生2n配子的杂交兰或国兰做亲本，配置杂交组合，获得果实；

S2. 种子培养和中间繁殖体鉴定：对兰花种子进行无菌培养获得中间繁殖体，将单粒种子形成的中间繁殖体进行继代增殖培养，观察中间繁殖体形态、生长速度，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体；

S3. 植株再生和试管苗形态观察：对选到的中间繁殖体进行分化培养和生根壮苗培养，对形成的再生植株进行形态学观察，选择国兰株型、植株粗壮、叶色深、叶厚、根粗壮、根尖端圆钝的植株；

S4. 细胞学鉴定和有性多倍体的获得：对当选的植株进行测定，染色体数为60条或以上的为多倍体。

2.根据权利要求1所述高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，步骤S1亲本选择中母本为小香，父本为兔耳兰。

3.根据权利要求1所述高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下步骤：

S21. 果实消毒、接种和初代培养：将杂交后150-270天的果实洗净，然后用75%乙醇消毒8~10分钟，无菌水冲洗3~5次，取其内部种子接种到固体培养基上培养；培养条件为温度26℃，暗培养；

S22. 中间繁殖体的增殖：将种子萌发后形成的中间繁殖体分开，将单个中间繁殖体或将其切成长度2~8 mm小段，分别接种于继代培养基上培养；培养条件为温度26℃，每日光照8~12小时，光照强度500~1000lux；

S23. 中间繁殖体形态观察：对中间繁殖体的繁殖速度、形态特征进行观察，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体。

4.根据权利要求3所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，S21所述固体培养基配方为：1/2MS培养基+0.2～0.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+10～20%（v/v）椰子汁+30g/L糖+0.3～2g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。

5.根据权利要求3所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，所述的步骤S22中增殖培养基配方为1/2MS培养基+0.5～2 mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+0.2～0.5g/L 活性碳+30g/L糖+7.5g/L卡拉胶。

6.根据权利要求1所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，S3所述植株再生和试管苗形态观察包括如下步骤：

S31. 芽分化培养：将继代培养的中间繁殖体分开，接种于芽分化培养基上培养，培养条件为温度26℃，每日光照10小时，光照强度1000~2000lux；

S32. 生根壮苗培养：将高2~4cm从中间繁殖体上切下，接种到生根壮苗培养基上培养，培养条件为温度26℃，每日光照10小时，光照强度1000~2000lux；

S33. 试管苗观察：对试管苗及其形成过程进行观察，生长慢、形成过程时间长，粗壮、叶片厚，叶色深、根短粗壮、根尖部圆钝的试管苗为拟似多倍体，以形态正常的植株做对照。

7.根据权利要求6所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，S31所述的芽分化培养基配方为：1/2MS培养基+1.5～2.0mg/L 6-BA+0.1～1mg/L NAA+30g/L糖+0～0.3g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。

8.根据权利要求6所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，步骤S32中生根壮苗培养基配方为：1/2MS培养基+0.1～0.2mg/L 6-BA+0.5～2mg/L NAA+20～40g/L糖+0.2～0.5g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。

9.根据权利要求1所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，S4包括以下步骤：

S41. 流式细胞仪鉴定：以试管苗叶片为材料，根尖细胞染色体为40的二倍体为对照，采用Partec-cyview85流式细胞仪确定当选拟似多倍体植株的倍性；

S42. 根尖细胞染色体鉴定：以幼嫩根尖为材料，采用压片法鉴定当选试管苗根尖细胞染色体数，染色体数为40时为二倍体，染色体为60或以上时为多倍体；

S43. 有性多倍体的获得：将确定为多倍体的试管苗进行移栽和栽培，即可获得有性多倍体。