CN103651111A

CN103651111A - 榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法

Info

Publication number: CN103651111A
Application number: CN201310688744.2A
Authority: CN
Inventors: 陈利萍; 李俊星; 饶琳莉
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-16
Also published as: CN103651111B

Abstract

本发明公开了一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法，填补了缺少芸薹属三基因组异源六倍体蔬菜种质的空白；本发明利用芸薹属蔬菜种质榨菜和紫甘蓝进行杂交，授粉后7天摘取子房，利用胚拯救获得成熟的种子，种子萌发后经过继代、扩繁获得大量的有性后代，经过杂种确定后，利用添加秋水仙素的液体培养基对单倍体进行加倍处理获得多基因组异源六倍体蔬菜种质。本发明可操作性强，简单实用，节省获得多基因组多倍体材料的时间，可以广泛应用于十字花科芸薹属蔬菜类种质的种间杂交的胚抢救，对于特殊植物新品种的培育和育种具有重要的意义。

Description

榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法

技术领域

本发明涉及榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法，涉及技术领域为人工合成多基因组多倍体新种质的方法。

背景技术

多倍体在植物中普遍存在，在植物的多样化过程中起着重要的作用。多倍体常使植株带来一些形态和生理上的变化，具有巨大性、代谢物增多、产量增加以及抗逆性加强等特点。鉴于其优良的特点，多倍体的创制具有重要的生产利用价值。目前对于多倍体植株的获得大都是通过人工合成的方法。人工合成多倍体新种质及其结构和功能演化的深入研究，是各国科学家竞相探索并研发应用的热点领域，也是我国具有竞争优势的基础性研究方向。随着人们对农产品要求的日益提高，利用自然界中已有的丰富遗传资源，通过各种远缘杂交获得多基因组多倍体，以及对多基因组多倍体的远缘杂种进行进一步利用，是培养“绿色、超级”农作物新种质的重要手段。因此多基因组多倍体材料具有重要的基础和应用价值。

我国对主要农作物多基因组多倍体超级新种质的创制技术及其育种应用有迫切的需求。其中十字花科芸薹属是重要农作物（油料作物的油菜、蔬菜类的白菜、甘蓝、芥菜等），重要模式植物（拟南芥、荠菜等）和重要野生资源（盐芥、高山南芥等）的宝库。多倍体和种间杂交对十字花科植物基因组进化、系统发育、物种合成与品种培育均具重要的影响和作用。其中芸薹属包含ABC全部三基因组六倍体AABBCC新复合种的获得，对于后续研究与未来技术发展具有重要的作用。但是种间的远缘杂交通常具有生殖障碍，进而很难获得多基因组多倍体材料，阻碍了人们对于种质创新、基因组进化以及系统发育的研究。因此创制一种多基因组多倍体的材料以及其采用的方法至关重要。

前期对于芸薹属多基因组多倍体的材料合成多集中于油料作物，如埃塞俄比亚芥菜与白菜型油菜杂交、芥菜型油菜与羽衣甘蓝杂交；同时也有关于油用芥菜与花椰菜杂交的报道，其虽然能够在自然条件下获得成熟的种子，但是获得真杂种的几率非常的低。在芥菜与花椰菜杂交的实验中，获得了793粒种子，但是其中只有四粒种子为真杂种，杂种率仅有0.5%。目前除了直接利用两种材料直接进行杂交之外，还有研究报道通过多个种间材料多年进行多次杂交获得三基因组多倍体材料，但是这种方法加大了育种时间、人力物力的消耗。然而目前，对于芸薹属食用蔬菜类种质的三基因组多倍体创制及研究还是空白，从而阻碍了人们对于多基因组多倍体蔬菜新种质的研究及生产实际应用。本发明中采用芸薹属中的蔬菜类种质榨菜（基因组：AABB）和紫甘蓝（基因组：CC）作为研究材料，榨菜作为我国的特有蔬菜，富含功能性成分芥子硫苷，具有膨大的瘤状茎，具有重要的食用价值；而紫甘蓝所具有的紫色性状在抗虫害、保健功能等方面具有优势，因此通过这两种材料合成多基因组多倍体蔬菜新种质在抗性、保健功能及食用价值上具有重要的意义。研究发现榨菜和甘蓝的自然杂交不能获得后代，对于榨菜与紫甘蓝种间杂交获得多基因组多倍体蔬菜新种质还未见报道，并且还没有一种方法能够快速、有效地合成芸薹属多基因组多倍体蔬菜新种质。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质，包含两杂交亲本榨菜和紫甘蓝全部的基因组DNA，其染色体DNA相对含量等于榨菜与紫甘蓝DNA相对含量之和，并同时具有榨菜和紫甘蓝的多态性扩增产物；并且其形态学与两杂交亲本相比较，表现出特有的植物学特征，表现为茎色为淡紫色、茎的着生方式为短缩茎，叶片呈卵圆形、较厚，表面无刺毛、无蜡质层，叶缘呈波状。

上述榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质的获取方法，包括如下步骤：

（1）芸薹属榨菜作为母本，芸薹属紫甘蓝作为父本进行有性杂交，授粉7天后摘取子房；所述授粉为连续两天重复授粉两次；

（2）将子房消毒并冲洗；

（3）将子房置于铺有用浓度为0.03g/mL的蔗糖溶液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，剖开子房一端后沿腹缝线撕开，将胚珠连同胚柄及与胚柄相连的子房壁组织一同切下并接种到发育培养基上；于25±2℃黑暗条件下培养24h，再光照条件下培养40天，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天；所述发育培养基由MS（Murashige&Skoog）、蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭和水组成，蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.0004g/mL、0.002g/mL，余量为水，pH为5.8

（4）将成熟种子摘下接种于发芽培养基上于25±2℃黑暗条件下培养；所述发芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤（6-BA）和水组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量为水，pH为5.8；

（5）在种子萌发后30天将幼苗先转移到继代培养基、扩繁培养基上继代扩繁,培养条件为温度为25±2℃、光照强度为80μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天；所述继代培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂和水组成，蔗糖、琼脂的质量含量分别为0.03g/mL、0.008g/mL，余量为水，pH为5.8；继代所采用的外植体为带2枚真叶的单芽茎段；所述扩繁培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA和水组成，蔗糖、琼脂、6-BA的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量为水，pH为5.8；扩繁所采用的外植体为附带腋芽的茎段；

（6）组培幼苗具有4片真叶时，对其幼嫩叶片进行RAPD（随机扩增的多态性DNA）多态性分析及流式细胞鉴定，获得榨菜与紫甘蓝种间真杂种；

（7）对鉴定为真杂种的幼苗进行加倍处理，加倍方法是利用添加秋水仙素的加倍液体培养基对单倍体茎段进行振荡培养，28℃，150rpm振荡培养两天；所述的加倍液体培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA、α-萘乙酸（NAA）和水组成，蔗糖、琼脂、6-BA、α-萘乙酸的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、2mg/L、0.1mg/L，余量为水，pH为5.8；秋水仙素终浓度为100mg/L；

（8）处理完毕后的外植体用无菌水冲洗干净后转移到不含秋水仙素的诱导芽培养基上培养诱导腋芽的产生，腋芽生长20天后切下转移到1/2MS培养基上生长，幼苗具有4片真叶时利用流式细胞术进行倍性的鉴定；所述诱导芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA和水组成，蔗糖、琼脂、6-BA的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量为水，pH为5.8

（9）将加倍成功的幼苗移到生根培养基上进行生根培养，将生根后的幼苗取出，移栽至装有基质的营养钵中炼苗，炼苗时，先在幼苗上覆盖薄膜并遮荫，在炼苗3天后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境；最终获得芸薹属三基因组异源六倍体蔬菜新种质；所述生根培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、NAA和水组成，蔗糖、琼脂、NAA的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.1mg/L，余量为水，pH为5.8。

本发明的有益效果是：本发明采用食用蔬菜种质榨菜与紫甘蓝作为杂交亲本材料，利用人工培养基对杂交胚珠进行培养使胚珠成熟为种子，种子萌发后再经过继代、扩繁及加倍，可在短期内获得大量的三基因组异源多倍体蔬菜新种质。该方法可操作性强，简单实用，节省获得多基因组多倍体材料的时间，可以广泛应用于十字花科芸薹属蔬菜类种质的种间杂交的胚抢救，对于特殊植物新品种的培育和育种具有重要的意义。

附图说明

图1是榨菜、紫甘蓝及杂种RAPD检测图，图中，a、b、c是引物1的扩增产物，d、e、f是引物2的扩增产物，g、h、i是引物3的扩增产物，j、k、l是引物4的扩增产物，m、n、o是引物5的扩增产物，模板分别为榨菜,紫甘蓝,杂种；

图2是榨菜染色体DNA相对含量分析图；

图3是紫甘蓝染色体DNA相对含量分析图；

图4是杂种染色体DNA相对含量分析图；

图5是异源六倍体蔬菜种质染色体DNA相对含量分析图；

图6是榨菜苗期植株形态学特征照片；

图7是紫甘蓝苗期植株形态学特征照片；

图8是异源六倍体蔬菜种质苗期植株形态学特征照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

材料：本实例以十字花科芸薹属紫甘蓝(Brassica oleracea)和榨菜(B.juncea)的多年自交纯系为材料。

步骤（1）：取材

以榨菜作为母本，紫甘蓝作为父本于4-5月进行蕾期人工授粉，连续涂抹2天，避免出现受精前杂交不亲和，随后取授粉后7d的子房，避免子房发生败育。同时自然状态下发育的子房作为对照，无法得到成熟的种子。

步骤（2）：材料消毒

将摘取的子房先用蒸馏水清洗干净，或浸泡在蒸馏水中，避免种荚失水干瘪。随后在超净工作台上，用75%的酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用5%的次氯酸钠溶液浸泡15分钟，其间摇动几次以彻底消毒。然后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗3遍。

步骤（3）：胚珠的剥离和接种

将冲洗后的子房置于铺有用浓度为0.03g/mL的蔗糖溶液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，用手术刀剖开一端，然后用两把镊子缓慢地将子房沿腹缝线撕开，这种操作方法简单易行，可有效地减少刀切，在避免对胚珠的操作损伤方面有显著效果。

步骤（4）：胚珠的接种

选取子房内呈淡绿色且有光泽的胚珠，将其与胚柄及与胚珠相连的子房壁组织一同切下，接种到发育培养基上，胚珠不直接接触培养基。发育培养基由MS、蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭组成，蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.0004g/mL、0.002g/mL，pH为5.8。接种后的胚珠先于25±2℃、黑暗条件下培养24小时，再光照条件下培养40天，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天。

步骤（5）：种子的成熟和萌发

种子成熟，统计胚珠发育成种子数，种子得率为3.33%。将成熟的种子接种于发芽培养基上，发芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA组成，蔗糖、琼脂、6-BA的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，pH为5.8，培养条件：温度为25±2℃，黑暗。待种子萌发后，幼苗成活率为50%。

步骤（5）：幼苗继代、扩繁和杂种检测

种子萌发长出真叶后生长30天利用带有2枚真叶的单芽茎段进行继代，继代培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂组成，蔗糖、琼脂的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL，pH为5.8；利用附带腋芽的茎段进行扩繁，扩繁培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA组成，蔗糖、琼脂、6-BA的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，pH为5.8。利用扩繁得到的幼苗进行杂种检测，组培幼苗具有4片真叶时，采用RAPD多态性扩增以及流式细胞进行检测（图1，图2，图3，图4，图5）。

步骤（6）：单倍体杂种加倍

将检测为单倍体真杂种的幼苗利用添加秋水仙素的液体培养基进行加倍。以杂种的茎段作为外植体，液体培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA、α-萘乙酸（NAA）组成，蔗糖、琼脂、6-BA、NAA的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL、2mg/L，0.1mg/L，pH为5.8；秋水仙素终浓度为100mg/L。在28℃，150rpm条件下振荡培养两天。处理12个外植体，处理完毕后的外植体用无菌水冲洗干净后转移到不含秋水仙素的培养基上培养诱导芽，诱芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA组成，蔗糖、琼脂、6-BA的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，pH为5.8。共获得11个腋芽，腋芽生长20天后切下转移到1/2MS培养基上生长，幼苗具有4片真叶时利用流式细胞术进行倍性的鉴定利用流式细胞术检测加倍效果，获得2株加倍成功的材料（图4，图5）。

步骤（7）：幼苗的生根和移栽

待长出4～5片叶子时转移至生根培养基上生根，生根培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、NAA组成，蔗糖、琼脂、NAA的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.1mg/L，pH为5.8。当生根后的幼苗的平均根长大于2厘米时，幼苗的根系已经足够健壮，此时将其从培养瓶中取出，轻轻冲洗掉根部的培养基并移栽至营养钵中，可在幼苗上方覆盖薄膜并适当遮荫以保持湿度，3天后开始逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境。

步骤（8）：芸薹属三基因组异源六倍体蔬菜新种质的分子、细胞及形态特征

三基因组异源六倍体蔬菜种质包含两杂交亲本榨菜和紫甘蓝全部的基因组DNA，其染色体DNA相对含量等于榨菜与紫甘蓝DNA相对含量之和，并同时具有榨菜和紫甘蓝的DNA多态性扩增产物。并且其形态学与两杂交亲本相比较，表现出特有的植物学特征，表现为茎色为淡紫色、茎的着生方式为短缩茎，叶片呈卵圆形、较厚，表面无刺毛、无蜡质层，叶缘呈波状（图6，图7，图8，表1）。

表1：异源六倍体及其亲本的植物形态学比较

在实施例2-10中，本发明榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法的步骤与实施例1相同，不同之处见表2。

表2：授粉后不同天数子房抢救效果

实施例

授粉后不同天数

接种胚珠数（个）

成熟种子数（个）

成活幼苗（株）

实施例2	9	60	2	1
					实施例3	10	60	3	1
实施例4	13	60	3	3
					实施例5	14	60	4	1

实施例6：

在实施例6中，本发明榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法的步骤与实施例1相同，不同之处见表3。

表3：不同浓度秋水仙素的加倍效果

秋水仙素浓度（mg/L）	外植体数（个）	成活植株数	异源六倍体数
				200	12	10	2

最后需要说明的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质，其特征在于，三基因组异源六倍体蔬菜种质包含两杂交亲本榨菜和紫甘蓝全部的基因组DNA，其染色体DNA相对含量等于榨菜与紫甘蓝DNA相对含量之和，并同时具有榨菜和紫甘蓝的多态性扩增产物；并且其形态学与两杂交亲本相比较，表现出特有的植物学特征，表现为茎色为淡紫色、茎的着生方式为短缩茎，叶片呈卵圆形、较厚，表面无刺毛、无蜡质层，叶缘呈波状。

2.一种上述榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）将子房消毒并冲洗；

（3）将子房置于铺有用浓度为0.03 g/mL的蔗糖溶液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，剖开子房一端后沿腹缝线撕开，将胚珠连同胚柄及与胚柄相连的子房壁组织一同切下并接种到发育培养基上；于25±2°C黑暗条件下培养24h，再光照条件下培养40天，光照强度为40 μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天；所述发育培养基由MS（Murashige & Skoog）、蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭和水组成，蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.0004 g/mL、0.002g/mL，余量为水，pH为5.8

（4）将成熟种子摘下接种于发芽培养基上于25±2°C黑暗条件下培养；所述发芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤（6-BA）和水组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L，余量为水，pH为5.8；

（5）在种子萌发后30天将幼苗先转移到继代培养基、扩繁培养基上继代扩繁, 培养条件为温度为25 ± 2°C、光照强度为80 μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天；所述继代培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂和水组成，蔗糖、琼脂的质量含量分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL，余量为水，pH为5.8；继代所采用的外植体为带2枚真叶的单芽茎段；所述扩繁培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA和水组成，蔗糖、琼脂、6-BA 的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L，余量为水，pH为5.8；扩繁所采用的外植体为附带腋芽的茎段；

（7）对鉴定为真杂种的幼苗进行加倍处理，加倍方法是利用添加秋水仙素的加倍液体培养基对单倍体茎段进行振荡培养，28°C，150 rpm振荡培养两天；所述的加倍液体培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA、α-萘乙酸（NAA）和水组成，蔗糖、琼脂、6-BA、α-萘乙酸的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、2 mg/L、0.1 mg/L，余量为水，pH为5.8；秋水仙素终浓度为100 mg/L；

（8）处理完毕后的外植体用无菌水冲洗干净后转移到不含秋水仙素的诱导芽培养基上培养诱导腋芽的产生，腋芽生长20天后切下转移到1/2MS培养基上生长，幼苗具有4片真叶时利用流式细胞术进行倍性的鉴定；所述诱导芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA和水组成，蔗糖、琼脂、6-BA 的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L，余量为水，pH为5.8

（9）将加倍成功的幼苗移到生根培养基上进行生根培养，将生根后的幼苗取出，移栽至装有基质的营养钵中炼苗，炼苗时，先在幼苗上覆盖薄膜并遮荫，在炼苗3天后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境；最终获得芸薹属三基因组异源六倍体蔬菜新种质；所述生根培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、NAA和水组成，蔗糖、琼脂、NAA的质量体积比分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.1 mg/L，余量为水，pH为5.8。