CN104137772A - 草莓茎尖组培脱毒的快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种“久香”草莓茎尖组培脱毒的快速繁殖方法，包括外植体消毒、茎尖组织脱毒培养、增殖培养、生根培养，和炼苗与移栽。本发明通过采用茎尖组培法繁殖“久香”草莓脱毒苗，可确保母体的全部优良性状稳定遗传，从而不受外界条件的影响，四季皆可进行；节约育苗用地，降低了生产成本；可在短时间内生产大量的优质试管苗，进行规模化生产，为市场提供量大质优的“久香”草莓种苗，满足市场需求。应用本发明获得的“久香”草莓脱毒苗长势强、抗病、大果率增加，产量可提高30%～50%。

Description

草莓茎尖组培脱毒的快速繁殖方法

技术领域

本发明属植物组织培养领域，涉及一种“久香”草莓茎尖组培脱毒的快速繁殖方法。 

背景技术

近年来，随着草莓连作年限的增加及“丰香”、“红颜”等易感病品种的推广，草莓炭疽病的发生在国内呈大幅上升趋势。一般感病苗定植到田间后，到下年3月份大约80%的植株会随着生长而死亡。在上海等南方地区草莓果实收获从当年12月至下年的5月份，长达六个月，大量收获期在2、3、4月初。这样以来，草莓种植户将会遭受巨大损失。因此，推广与“丰香”、“红颜”等草莓果实品质媲美的抗病草莓新品种已成为迫在眉睫的问题。 

“久香”草莓是上海市农业科学院2007年新近育成的第一个适合于设施栽培且综合性状优良的草莓品种。“久香”草莓以久能早生为母本、丰香为父本杂交，历经10年育成的优质抗病草莓新品种。于2007年11月通过上海市农作物品种审定委员会审定。该品种长势强、株形紧凑，果实圆锥形、较大，第I、II级序果平均单果重21.6g；果形指数1.37，果肉红色，髓心浅红色，无空洞；果肉细，质地脆硬；汁液中等，甜酸适度，香味浓。“久香”草莓与主栽品种“丰香”、“红颜”相比，在白粉病和灰霉病的抗性突出，产量要高出主栽品种10%，货架期较主栽品种延长7天。因此，“久香”草莓适宜于长江流域和冬暖草莓产区广泛种植。 

目前，生产上“久香”草莓主要是通过无性繁殖为种植者提供种苗，而长期使用无性繁殖种苗在快速繁殖过程中常常会感染多种病毒，引起品种种性退化，抗病力减弱，从而造成单位面积产量和果实品质下降等问题。一般会减产30～80%，给草莓种植者带来经济损失。且随着无性繁殖代数的增加，病毒感染的几率也大大提高，草莓感染病毒后的直接表现为叶片皱缩、畸形果率增加、品质下降、植株生长发育迟缓等不良现象。 

不同的草莓品种由于遗传背景的差异，在茎尖生长发育过程中内源激素水平明显不同，因而，在采用茎尖脱毒组培快速繁殖法获得草莓种苗的过程中，对外源激素种类和浓度的要求也因品种不同而表现出较大差异。在相同的培养条件下，草莓基因型（不同品种）对茎尖诱导分化、增殖、生根等起着决定性作用。以诱导分化为例，采用相同的 分化培养基，分化诱导的百分率以“久香”最高（100%），而其他品种分别为“红颜”50%、“章姬”42%、“甜查理”33%、“丰香”最低仅23%。 

由于草莓在生产应用中主要是通过走茎育苗进行无性繁殖的，严重的影响草莓新品种自身的优良特性，且走茎繁殖育苗周期长，制约了“久香”草莓的示范应用和品种推广工作。“久香”草莓的种苗快速繁殖技术体系的建立将会直接助推草莓新品种在生产中的推广。加速“久香”的示范推广，对不断优化和更新上海市草莓品种结构，稳定和提升农民经济效益将具有重要的显示意义。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种“久香”草莓茎尖组培脱毒的快速繁殖方法，以便进行规模化生产和繁殖满足市场需要，及以“久香”草莓组培为基础的其他学科的研究工作的需要。 

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。 

所述的“久香”草莓茎尖组培脱毒快速繁殖方法，包括外植体消毒、茎尖组培脱毒培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽，具体依照如下步骤进行： 

(1)外植体消毒：选取健壮无病的“久香”草莓母株匍匐茎上的顶芽大小约1.5±0.5厘米，蘸少量洗涤液用手轻轻搓洗2～3次，流水冲洗90～120分钟后，再在超净工作台上用75%的酒精漂洗，无菌水清洗后，用含0.5%次氯酸钠灭菌，无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水。 

(2)茎尖组织脱毒培养：在无菌条件和解剖显微镜下逐层剥去顶芽外层叶片，用解剖刀切下带一个叶原基（长约0.2～0.3毫米）的生长点，立即接种于分化培养基上，暗培养后进行光培养，其中培养温度为24±1℃，光照强度为4000lx，光照时间为12小时。所述的分化培养基由MS基本培养基、白砂糖30克/升、琼脂8克/升，和植物生长激素0.01～0.4毫克/升组成，pH＝5.7～5.8。所述的植物生长激素为吲哚丁酸（IBA）0.01毫克/升，和6-卞基腺嘌呤（6-BA）0.1～0.4毫克/升；优选6-BA为0.15毫克/升，和IBA为0.01毫克/升。 

(3)增殖培养：4周后茎尖长出芽丛，待芽苗长至2±0.5厘米大小时将芽逐个切下分成单株，每瓶放5～6个芽，再转入增殖培养基中继续增殖，培养温度24±1℃，每28天可增殖1代，增殖6～7代后就可以获得大量无毒种苗。所述的增殖培养基由MS基本培养基、白砂糖30克/升、琼脂8克/升，和植物生长激素0.01～0.5毫克/升组成，pH＝5.7～5.8。 所述的植物生长激素为吲哚丁酸（IBA）0.01～0.03毫克/升，和6-卞基腺嘌呤（6-BA）0.1～0.3毫克/升，优选6-BA为0.2毫克/升，和IBA0.02毫克/升。 

(4)生根培养：将经过继代增殖培养的草莓芽苗由芽丛切下，转到生根培养基中促使其生根，在温度24±1℃条件下进行光照生根培养14～21天。所述的生根培养基由1/2MS基本培养基、白砂糖10克/升、琼脂8克/升，和植物生长激素0.01～0.02毫克/升组成，pH＝5.7～5.8。所述的植物生长激素为吲哚丁酸0.02毫克/升。 

(5)炼苗移栽：将生根后的草莓脱毒苗置于待生长条件下炼苗7天，移栽时将组培瓶盖打一条缝，进行自然条件驯化2天，接着完全揭开盖并添加10～15毫升的蒸馏水锻炼1天。然后用镊子将组培苗从瓶中取出，用水冲掉培养基，移栽到已经灭菌的栽培基质（椰糠:蛭石=5:1，V/V）中，用黑色遮光塑料进行遮阴驯化3～5天后，将草莓苗移到玻璃温室保持相对湿度75%进行炼苗。 

本发明采用茎尖组培脱毒快速繁殖“久香”草莓种苗的方法，不仅可以摆脱外界条件的影响，四季均可进行“久香”草莓的生产，节约了育苗占地，降低了生产成本。而且采用小于0.5毫米的草莓茎尖培养获得的无病毒植株保存了母体的全部优良性状，遗传性状稳定。 

本发明方法保留了“久香”草莓的植株活性，可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产，促进“久香”草莓新品种栽培面积快速增大，经济效益显著提升。应用本发明方法获得的“久香”草莓脱毒苗长势强、抗病、大果率增加，产量可提高30%～50%。 

本发明具有简单、快速、高效，易操作等优点，在“久香”草莓新品种种苗快速繁殖推广上具有很大的应用价值。 

附图说明

图1为取材用的“久香”草莓植株的匍匐茎图。 

图2为经剥离后的“久香”草莓茎尖在最佳茎尖诱导培养基中的培养图。 

图3为在最佳生长培养基中的增殖培养图。 

图4为组培苗在步骤(4)中处理后的生根情况图。 

图5为组培得到完整的植株图。 

图6为经炼苗驯化的移栽组培苗图。 

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实例。最后应当说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。 

实施例1外植体消毒和茎尖生长点剥离 

1、参看图1，选取健壮无病的“久香”草莓母株匍匐茎上顶芽大小约1.5厘米，蘸少量洗涤液用手轻轻搓洗2～3次，流水冲洗90～120分钟后，再在超净工作台上用75%的酒精漂洗10秒，无菌水清洗3遍后，用含0.5%次氯酸钠灭菌7分钟，无菌水冲洗6～7遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分。 

2、在无菌条件和解剖显微镜下逐层剥去顶芽外层的叶片，用解剖刀切下带一个叶原基（长约0.2～0.3毫米）的生长点（参看图2），立即接种于分化培养基（配方：MS+6-BA0.15毫克/升+IBA0.01毫克/升+白砂糖30g/L+琼脂8克/升，pH＝5.7～5.8）上，遮光培养3天后进行光培养。培养温度24±1℃，光照强度4000lx，光照时间12小时条件下培养4周。 

实施例2丛生芽的增殖培养和组培苗的生根、驯化与移栽 

1、四周后茎尖长出丛生芽，待芽苗长至2厘米大小时将芽逐个切下分成单株，每瓶放5～6个芽，再转入增殖培养基（配方：MS+6-BA0.2毫克/升+IBA0.02毫克/升+白砂糖30克/升+琼脂8克/升，pH＝5.7～5.8）中继续增殖，培养温度24±1℃，12小时/白天光照培养。增殖系数达到3，统计结果见下表1、表2，每28d增殖1代，增殖6～7代后获得大量无毒种苗，增殖结果参看图3。 

2、将经继代增殖培养的草莓芽苗由芽丛切下，转接到生根培养基（配方：1/2MS基本培养基+白砂糖10克/升+琼脂8克/升+吲哚丁酸0.02毫克/升，pH＝5.7～5.8）中温度24±1℃条件下进行光照培养，促使其生根，生根培养14～21天。生根率达100.0%，每株平均生根数达10个，生根情况参看图4，组织培养的繁殖系数约为3（统计结果见下表1、表2），图5为组培得到完整的植株图。 

3、将生根后的草莓脱毒苗置于待生长条件下炼苗7天，移栽时将组培瓶盖打一条缝，进行自然条件驯化2天，接着完全揭开盖并添加10～15毫升的蒸馏水锻炼1天。然后用镊子将组培苗从瓶中取出，用水冲掉培养基，移栽到灭过菌的栽培基质（椰糠:蛭石=5:1， V/V）中，用黑色遮光塑料进行遮阴驯化3天，3天后将草莓苗移到玻璃温室保持相对湿度75%进行炼苗，移栽后成活率可达85%以上（统计结果见下表1、表2）。图6为经炼苗驯化的移栽组培苗图。 

表1茎尖形成芽丛的情况 

重复次数	I	II	III
				茎尖(个)	50	50	50
每个茎尖形成丛芽数(个)	1	1	1
				每个茎尖成苗数(株)	1～2	1～2	1～2
每个茎尖平均成苗数(株)	1.56	1.28	1.86

表2生根培养的生根率 

重复次数	I	II	III
				丛芽数(个)	50	50	50
生根的丛芽数(个)	50	50	50
				生根率(%)	100	100	100
每个丛芽平均生根数(根)	100	100	100

由上述表1和表2可知，以“久香”草莓的茎尖为外植体进行组培脱毒快速繁殖，每个茎尖形成的丛芽数1个，每个茎尖平均成苗数2400株以上；丛芽生根率可达100%，每个丛芽的平均生根数为8-12条。 

附：MS基本培养基成分 

Claims (10)

1.一种“久香”草莓茎尖组培脱毒的快速繁殖方法，其特征在于，包括外植体消毒、茎尖组织脱毒培养、增殖培养、生根培养、炼苗与移栽；具体步骤如下：

(1)外植体消毒：选取健壮无病的“久香”草莓母株匍匐茎上的顶芽1.5±0.5厘米，蘸少量洗涤液用手轻轻搓洗2～3次，流水冲洗90～120分钟后，再在超净工作台上用75%的酒精漂洗，无菌水清洗后，用0.5%次氯酸钠灭菌，无菌水冲洗，最后用无菌滤纸吸干表面水分；

(2)茎尖组织脱毒培养：在无菌条件和解剖显微镜下逐层剥去顶芽外层叶片，用解剖刀切下带一个长约0.2～0.3毫米叶原基的生长点，立即接种于分化培养基上，暗培养后进行光培养；

(3)增殖培养：4周后茎尖长出芽丛，待芽苗长至2±0.5厘米大小时将芽逐个切下分成单株，每瓶放5～6个芽，再转入增殖培养基中继续增殖，每28天增殖1代，增殖6～7代后获得大量无毒种苗；

(4)生根培养：将经过继代增殖培养的草莓芽苗由芽丛切下，转到生根培养基中促使其生根，在温度24±1℃条件下进行光照生根培养14～21天；

(5)炼苗移栽：将生根后的草莓脱毒苗置于待生长条件下炼苗7天，开瓶后瓶底加水炼苗3～4天，用镊子把组培苗从培养瓶中取出，清水洗净根系附带的培养基，移栽在栽培基质中遮光处理3～5天后，将草莓苗移到玻璃温室保持相对湿度75%进行炼苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的分化培养基由MS基本培养基、白砂糖30克/升、琼脂8克/升，和植物生长激素0.01～0.4毫克/升组成，pH值为5.7～5.8。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的植物生长激素为吲哚丁酸0.01毫克/升，和6-卞基腺嘌呤0.1～0.4毫克/升。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的培养温度为24±1℃，光照强度4000lx，光照时间12小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的增殖培养基由MS基本培养基、白砂糖30克/升、琼脂8克/升，和植物生长激素0.01～0.5毫克/升组成，pH值为5.7～5.8。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的植物生长激素为吲哚丁酸0.01～0.03毫克/升，和6-卞基腺嘌呤0.1～0.3毫克/升。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的生根培养基由1/2MS基本培养基、白砂糖10克/升、琼脂8克/升和植物生长激素0.01～0.02毫克/升组成，pH值为5.7～5.8。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的植物生长激素为吲哚丁酸0.02毫克/升。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的栽培基质按椰糠:蛭石=5:1，V/V组成。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的将生根后的草莓脱毒苗置于待生长条件下炼苗7天，移栽时将组培瓶盖打一条缝，自然条件驯化2天，接着完全揭开瓶盖并添加10～15毫升蒸馏水锻炼1天。