CN102106261A - 一种led条件下草莓脱毒组培方法 - Google Patents

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徐刚
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汪一婷
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Abstract

本发明属植物脱毒组培快繁技术领域，主要是一种LED条件下草莓脱毒组培方法，包括如下步骤：培养条件的选择、培养基的配制、外植体的选取与灭菌、诱导培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、移栽。本发明的优点是：使用LED作为组培光源，草莓诱导、增殖、壮苗和生根培养效果和组培苗质量与荧光灯无差异或培养效果好于荧光灯，组培苗成活率均大于90％，可使培养面积相对于使用荧光灯面积增大40％，可节电30～50％，降低了成本，提高了草莓脱毒组培工厂化生产的效率。

Description

一种LED条件下草莓脱毒组培方法
技术领域
本发明涉及植物脱毒组培快繁技术领域，尤其是一种LED条件下草莓脱毒组培方法。
背景技术
草莓(Fragaria anananssa Ducde)是蔷薇科草莓属宿根性多年生常绿草本植物。草莓具有栽培容易、当年结果、产量高、经济效益好等优点，各地发展很快。但是草莓是一种靠匍匐茎进行无性繁殖的作物，在生产上容易感染多种病毒病，染病的果子一年比一年小，畸形，品质差，叶子皱缩，生长缓慢，一般减产30％～80％，并逐年加重。对病毒病目前尚无有效药剂防治。培育无病毒母本苗，栽培无病毒种苗，是防治草莓病毒病的根本对策。利用草莓茎尖脱毒组培技术，可进行草莓无病毒苗规模化、工厂化生产。
在植物组培中，光是最重要的环境因子之一。光能消耗约占植物组培工厂运行费用的20％～40％，能耗问题一直是影响植物组培技术推广普及的重要限制因素。过去在植物组培生产中，通常使用荧光灯管作为人工光源，然而荧光灯管存在寿命短、发热量大以及发光效率不理想等缺点。
近年来，发光二极管(LED)光源的研究与开发为植物组培工厂的发展提供了良好的契机，使植物组培苗成本进一步降低成为可能。发光二极管(Light Emitting Diode，LED)是一种半导体固体发光器件，能直接发出红、黄、蓝、绿、青、橙、紫、白色的光。LED照明产品就是利用LED作为光源制造出来的照明器具，主要用于家用电器的显示器、广告看板或装饰灯，与植物组培常用的荧光灯相比，LED具有以下优点(1)高节能：直流驱动，超低功耗，相同照明效果比传统光源节能80％以上；(2)寿命长：使用寿命可达6万到10万小时，比传统光源寿命长10倍以上；(3)冷光源，发热量低，可降低培养室的降温成本；(4)可选择特定波长、光强可调；(5)可提高单位面积的利用率。
自20世纪80年代中期，发光二极管(LED)开始被用于对植物生长的研究当中。此后，随着光电技术的发展，特别是1993年蓝光二极管的问世，发光二极管在植物组织培养中得到应用。前人多以小规模试验来研究发光二极管(LED)作为植物组织培养的可行性，本发明拟以草莓脱毒组培规模化生产为目的，进行发光二极管(LED)光源在草莓脱毒组培生产中的应用研究，比较发光二极管(LED)光源与传统荧光灯管在草莓脱毒组培苗生产上的差异及应用可行性，这对降低植物组培生产成本、加速草莓脱毒组培苗在国内的普及推广具有很大的意义。
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种LED条件下草莓脱毒组培方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种LED条件下草莓脱毒组培方法，按如下步骤进行：
1)、培养条件的选择，以LED(发光二极管)作为组培光源，LED中的红光(630±20nm)与蓝光(460±20nm)的比例为2～5∶1～2，光照光强为1500～2000Lx，光照时间为12～16h/d，培养温度为25±2℃。
2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖、壮苗培养基用MS基本培养基；生根培养基用1/2MS基本培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH 5.6～5.8；
(2)诱导培养基：MS+BA 0.1～2.0mg/L+NAA 0.01～0.5mg/L；
(3)增殖培养基：MS+BA 0.1～2.0mg/L+NAA 0.01～0.5mg/L；
(4)壮苗培养基：MS+BA 0.1～1.0mg/L+NAA 0.01～0.25mg/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA 0.1～1.0mg/L。
3)、草莓茎尖脱毒组培培养：
(1)外植体的选取与灭菌：取温室栽培或大田栽培的性状纯正、生长健壮的草莓植株上的匍匐茎，经灭菌处理后作为茎尖脱毒培养用的外植体；
(2)茎尖脱毒培养：将灭菌处理后的匍匐茎顶芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.2～0.3mm大小的带1～2个叶原基的茎尖，接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天后，从茎尖诱导形成幼芽或丛生芽；
(3)增殖培养：将诱导形成的幼芽或丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼苗再增殖培养；
(4)壮苗培养：将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20～30天后，幼苗株高生长达3～5厘米；
(5)生根培养：将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成约5～7cm、苗基部长出5～10根细根；
(6)移栽：在隔离温室中，将生根组培苗移栽于基质中，培育1～2个月至成脱毒组培苗。
4)、病毒ELISA检测：
将常规栽培中发生的草莓病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗血清后，对脱毒组培苗进行病毒ELISA检测；或通过购买抗血清试剂盒或通过细胞制备的抗血清或委托其他单位对脱毒组培苗进行病毒ELISA检测。
所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于所述培养条件，以LED(发光二极管)作为组培光源，LED中的红光与蓝光的比例为3∶1，光照光强为2000Lx，光照时间为16h/d，培养温度为25±2℃。
所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于所述培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖、壮苗培养基用MS基本培养基；生根培养基用1/2MS基本培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH 5.6～5.8；
(2)诱导培养基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；
(3)增殖培养基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L；
(4)壮苗培养基：MS+BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.5mg/L。
所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于所述的灭菌处理是将外植体用75％(体积比)酒精表面消毒30～45秒，无菌水冲洗3遍，然后用2％(体积比)次氯酸钠溶液振荡灭菌10～15分钟，无菌水洗3～5遍。
所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶2∶1配制而成。
本发明有益的效果是：
1、本发明中使用的LED中的红光(630±20nm)与蓝光(460±20nm)的比例为2～5∶1～2，草莓诱导、增殖、壮苗和生根培养效果和组培苗质量与荧光灯无差异或培养效果好于荧光灯；
2、草莓脱毒组培苗移栽1个月后计算幼苗成活率，所用光质及光照环境中生根的组培苗成活率均大于90％，符合组培苗移栽成活要求；
3、本发明中，使用LED灯具的培养架相对于荧光灯使用培养架可增加2层，在相同培养室空间条件下，使用LED灯具作为光源，可使培养面积相对于使用荧光灯面积增大40％；
4、本发明中，使用LED灯具，作为组培光源，可节电30～50％，降低了成本，提高了草莓脱毒组培工厂化生产的效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
BA：6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，美国进口国内分装，分析纯，纯度99.9％。
NAA：α-萘乙酸(1-Naphthylacetic acid)，美国进口国内分装，分析纯，纯度99.5％。
IBA：吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)，美国进口国内分装，分析纯，纯度98％。
实施例1：
一种LED条件下草莓脱毒组培方法，按如下步骤进行：
1)、培养条件的选择，以LED(发光二极管)作为组培光源，LED中的红光(630±20nm)与蓝光(460±20nm)的比例为2～5∶1～2，光照光强为1500～2000Lx，光照时间为12～16h/d，培养温度为25±2℃。
2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖、壮苗培养基用MS基本培养基；生根培养基用1/2MS基本培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH 5.6～5.8；
(2)诱导培养基：MS+BA0.1～2.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L；
(3)增殖培养基：MS+BA0.1～2.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L；
(4)壮苗培养基：MS+BA0.1～1.0mg/L+NAA0.01～0.25mg/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.1～1.0mg/L。
3)、草莓茎尖脱毒组培培养：
(1)外植体的选取与灭菌：取温室栽培或大田栽培的性状纯正、生长健壮的草莓植株上的匍匐茎，经灭菌处理后作为茎尖脱毒培养用的外植体；
(2)茎尖脱毒培养：将灭菌处理后的匍匐茎顶芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.2～0.3mm大小的带1～2个叶原基的茎尖，接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天后，从茎尖诱导形成幼芽或丛生芽；
(3)增殖培养：将诱导形成的幼芽或丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼苗再增殖培养；
(4)壮苗培养：将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20～30天后，幼苗株高生长达3～5厘米；
(5)生根培养：将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成约5～7cm、苗基部长出5～10根细根；
(6)移栽：在隔离温室中，将生根组培苗移栽于基质中，培育1～2个月至成脱毒组培苗。
4)、病毒ELISA检测：
将常规栽培中发生的草莓病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗血清后，对脱毒组培苗进行病毒ELISA检测；或通过购买抗血清试剂盒或通过细胞制备的抗血清或委托其他单位对脱毒组培苗进行病毒ELISA检测。
所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于所述培养条件，以LED(发光二极管)作为组培光源，LED中的红光与蓝光的比例为3∶1，光照光强为2000Lx，光照时间为16h/d，培养温度为25±2℃。
所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于所述培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖、壮苗培养基用MS基本培养基；生根培养基用1/2MS基本培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH 5.6～5.8；
(2)诱导培养基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；
(3)增殖培养基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L；
(4)壮苗培养基：MS+BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.5mg/L。
所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于所述的灭菌处理是将外植体用75％(体积比)酒精表面消毒30～45秒，无菌水冲洗3遍，然后用2％(体积比)次氯酸钠溶液振荡灭菌10～15分钟，无菌水洗3～5遍。
所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶2∶1配制而成。
实施例2：
本例中，以LED(发光二极管)作为组培光源，LED中的红光与蓝光的比例为3∶1，光照光强为2000Lx，光照时间为16h/d，培养温度为25±2℃。诱导培养基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；增殖培养基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L；壮苗培养基：MS+BA 0.1mg/L+NAA0.05mg/L；生根培养基：1/2MS+IBA 0.5mg/L。
其余步骤，工艺、条件均同于实施例1。
实施例3：
本例中，以LED(发光二极管)作为组培光源，LED中的红光与蓝光的比例为2∶1，光照光强为1500Lx，光照时间为16h/d，培养温度为25±2℃。诱导培养基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；增殖培养基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L；壮苗培养基：MS+BA 0.1mg/L+NAA0.05mg/L；生根培养基：1/2MS+IBA 0.5mg/L。
其余步骤，工艺、条件均同于实施例1。
实施例4：
本例中，以LED(发光二极管)作为组培光源，LED中的红光与蓝光的比例为5∶1，光照光强为1500Lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±2℃。诱导培养基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；增殖培养基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L；壮苗培养基：MS+BA 0.1mg/L+NAA0.05mg/L；生根培养基：1/2MS+IBA 0.5mg/L。
试验例：(病毒检测)
1、对照材料：从田间采集的草每病叶为材料。
2、处理材料：以实施例1、2或3获得的脱毒组培苗为材料。
3、将常规温室中发生的草莓病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗血清后，对脱毒组培苗进行病毒ELISA检测；或通过购买抗血清试剂盒或通过细胞制备的抗血清或委托其他单位对脱毒组培苗进行病毒ELISA检测。
4、检测结果如下表所示：
  处理   检测的结果
  对照   阳性
  脱毒组培苗   阴性
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于：按如下步骤进行：
1)、培养条件的选择，以LED作为组培光源，LED中的红光630±20nm与蓝光460±20nm的比例为2～5∶1～2，光照光强为1500～2000Lx，光照时间为12～16h/d，培养温度为25±2℃；
2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖、壮苗培养基用MS基本培养基；生根培养基用1/2MS基本培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH 5.6～5.8；
(2)诱导培养基：MS+BA0.1～2.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L；
(3)增殖培养基：MS+BA 0.1～2.0mg/L+NAA 0.01～0.5mg/L；
(4)壮苗培养基：MS+BA0.1～1.0mg/L+NAA0.01～0.25mg/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.1～1.0mg/L；
3)、草莓茎尖脱毒组培培养：
(1)外植体的选取与灭菌：取温室栽培或大田栽培的性状纯正、生长健壮的草莓植株上的匍匐茎，经灭菌处理后作为茎尖脱毒培养用的外植体；
(2)茎尖脱毒培养：将灭菌处理后的匍匐茎顶芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.2～0.3mm大小的带1～2个叶原基的茎尖，接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天后，从茎尖诱导形成幼芽或丛生芽；
(3)增殖培养：将诱导形成的幼芽或丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼苗再增殖培养；
(4)壮苗培养：将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20～30天后，幼苗株高生长达3～5厘米；
(5)生根培养：将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成约5～7cm、苗基部长出5～10根细根；
(6)移栽：在隔离温室中，将生根组培苗移栽于基质中，培育1～2个月至成脱毒组培苗；
4)、病毒ELISA检测：
将常规栽培中发生的草莓病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗血清后，对脱毒组培苗进行病毒ELISA检测；或通过购买抗血清试剂盒或通过细胞制备的抗血清或委托其他单位对脱毒组培苗进行病毒ELISA检测。
2.根据权利要求1所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于：所述培养条件，以LED作为组培光源，LED中的红光与蓝光的比例为3∶1，光照光强为2000Lx，光照时间为16h/d，培养温度为25±2℃。
3.根据权利要求1所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于：所述培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖、壮苗培养基用MS基本培养基；生根培养基用1/2MS
基本培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH 5.6～5.8；
(2)诱导培养基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；
(3)增殖培养基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L；
(4)壮苗培养基：MS+BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.5mg/L。
4.根据权利要求1所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于：所述的灭菌处理是将外植体用体积比为75％的酒精表面消毒30～45秒，无菌水冲洗3遍，然后用体积比为2％次氯酸钠溶液振荡灭菌10～15分钟，无菌水洗3～5遍。
5.根据权利要求1所述的LED条件下草莓脱毒组培方法，其特征在于：所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶2∶1配制而成。
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