CN109729980A - 一种基于led光源的毛汉十二卷组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，该方法选用株型饱满的毛汉十二卷成熟叶片作为外植体，经初代培养后，选用红蓝LED光照进行诱导分化和继代培养，经生根培养和驯化移栽获得高质量、高成活率的毛汉十二卷组培幼苗。该方法可将增殖周期至28d，提高增殖倍数至6.4，获取的丛生芽数量多、质量好，玻璃化率降低至15.6%，获得的再生苗窗面大、矮化、健壮，植株根系粗壮健康，移栽成活率达100%。
Description
技术领域
本发明涉及植物繁育领域，具体地说涉及一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法。
背景技术
毛汉十二卷(学名：Haworthia maughanii)别名万象、象脚草，百合科瓦苇属多肉植物，喜温暖干燥和阳光充足环境。肉质叶从基部斜出，排成松散的莲座状，叶片半圆筒形，顶端截形，半透明，依品种的差异，有不同的花纹，叶色深绿、灰绿或红褐，表面粗糙。
十二卷属多肉为珍稀品种，由于生长速度慢，繁殖难，不能适应现在市场的需求，采用组培快繁技术进行十二卷属植物“美纹万象”的生产势在必行。目前关于十二卷属植物组培快繁的报道很多，其中多数集中在玉露系列，且多数采用植物花葶作为外植体进行组培快繁，虽然很容易获得再生芽，但从幼苗到开花需要的时间较长，不易取得外植体，无法满足市场的需求。
在植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，其表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，矮小肿胀、失绿；叶片皱缩脆弱易碎，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种现象被称为“玻璃化”。玻璃化的试管幼苗在植物快速繁育领域是严重影响繁殖率的技术障碍。其一方面受到培养基浓度、渗透压等影响，还有研究表明受到培养温度、幼苗与外界气体交换不畅等影响；另一方面玻璃化程度因不同部位组织形态特点而异，主要表现为主要观赏部位叶片水渍状，叶片徒长，窗面较小或无创面。目前克服玻璃化幼苗的主要手段是采用固体培养基，改变配方和相应浓度，或额外加入调节渗透压的配方，但这些方法因不同植物培养而异，在毛汉十二卷幼苗繁育上无法实现，激素浓度过低会导致增殖率低，激素浓度高会导致组培苗畸形或玻璃化，紧靠调整激素浓度很难达到理想的效果。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种基于LED红蓝光源显著降低玻璃化率，获取数量多、质量好丛生芽的毛汉十二卷组配方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)选用株型饱满的毛汉十二卷成熟叶片作为外植体；
(2)对外植体进行清洗、消毒，将带有基部组织的叶片剥离并接种于愈伤组织诱导培养基上先进行黑暗培养，然后经适宜光照培养后转入分化培养基；
(3)将光照培养后的愈伤组织接种至分化培养基上，利用红蓝LED常规光照培养20-50天获得小苗；
(4)将小苗丛生芽切下来转入增殖培养基，利用红蓝LED长时间光照培养获得再生苗；
(5)将再生苗转入生根培养基中进行生根培养，无光照，当根生长至3-4cm时，转入玻璃温室炼苗，然后冲洗掉培养基土培；
所述诱导培养基、分化培养基、增殖培养基、生根培养基的pH为5-6。优选地，前述培养基的pH为5.5，最适于毛汉十二卷快速组培。
进一步地，所述诱导培养基包括MS培养基、6-BA、KT、NAA、琼脂、蔗糖。其中，6-BA优选0.2-0.8mg/L，KT优选0.5mg/L，NAA优选0.01-0.05mg/L，琼脂优选7g/L，蔗糖优选30g/L。
进一步地，所述分化培养基包括MS培养基、KT、NAA、香蕉泥、琼脂、蔗糖。其中，KT优选0.1-0.5mg/L，NAA优选0.02mg/L，香蕉泥优选30g/L，琼脂优选7g/L，蔗糖优选30g/L。
进一步地，所述增殖培养基包括MS培养基、6-BA、B9、NAA、香蕉泥、琼脂、蔗糖。其中，6-BA优选0.2mg/L，B9优选2-4mg/L，NAA优选0.01mg/L，香蕉泥优选30g/L，琼脂优选7g/L，蔗糖优选30g/L。
进一步地，所述生根培养基包括1/2MS培养基、IBA、琼脂、蔗糖。其中，IBA优选0.1-0.5mg/L，琼脂优选5g/L，蔗糖优选20g/L。
值得注意的是，上述培养基采用低浓度水平的NAA，可显著降低玻璃化的发生几率。当NAA浓度超过0.1mg/L时，玻璃化发生率显著上升，因此本发明所述培养基的NAA浓度均不高于0.05mg/L。
本发明选用培养基组分的英文缩写及释义如下：
6-BA，6-Benzylaminopurine(6-苄氨基腺嘌呤)，细胞分裂素的一种；
KT，Kinetin(激动素)，细胞分裂素的一种；
NAA，1-NaphthlceticAcid(α-萘乙酸)，植物生长调节剂的一种。
B9，Daminozide(丁酰肼)，植物生长延缓剂。
进一步地，所述外植体的清洗、消毒步骤为：先利用洗衣粉清洗，流水冲洗1-2h，将外植体转到无菌操作台上，先用无菌水冲洗2次，再用75％酒精消毒20秒，用无菌水冲洗1-2次，然后再用0.1％升汞消毒6min，再用无菌水冲洗6-8次。
进一步地，所述步骤(3)中红蓝LED常规光照培养是采用红光：蓝光＝1∶1，光照时间10小时/天，培养30-40天后获得小苗。
进一步地，所述步骤(4)中红蓝LED常规光照培养是采用红光：蓝光＝2∶1，光照时间16小时/天，培养30～40天后获得再生苗。
本发明获得的毛汉十二卷外植体愈伤组织生长良好，愈伤分化出的小苗品种好，植株健康。利用改良的LED灯光照方案缩短增殖周期至28d，提高增殖倍数至6.4，该方法获取的丛生芽数量多、质量好，玻璃化率降低至4.6％，获得的再生苗窗面大、矮化、健壮，植株根系粗壮健康，移栽成活率达100％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
本发明提供了一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，该方法具体步骤为：
1.外植体选择
选择株型饱满，健壮无病虫害的毛汉十二卷植株的成熟叶片为外植体。
2.初代培养：外植体的消毒及接种
将毛汉十二卷植株切根(保持植株完整)并洗净，经过洗衣粉清洗，流水冲洗1-2h，将外植体转到无菌操作台上，先用无菌水冲洗2次，再用75％酒精消毒20秒，用无菌水冲洗1-2次，然后再用0.1％升汞消毒6min，再用无菌水冲洗6-8次后，剥下叶片，叶片要带有基部组织，直接将叶片接于愈伤组织诱导培养基上，每玻璃瓶接1片。愈伤组织诱导培养基成分为MS培养基，6-BA(0.2mg/L)，KT(0.5mg/L)，NAA(0.01mg/L)，7g/L琼脂，30g/L蔗糖；培养基pH调至5.5。
将接完的外植体放在培养室进行黑暗培养，14d后转入光培养，光培养条件温度为25±2℃，光照时间为12h/d，培养25d后转入分化培养基。
3.诱导分化培养
将得到的愈伤组织再接入诱导分化培养基上，培养条件温度为25±2℃，红光：蓝光＝1∶1，光照时间为10h/d，培养35d后愈伤组织分化出小苗，小苗质量高。分化培养基配方为MS培养基，KT(0.1mg/L)，NAA(0.02mg/L)，香蕉泥30g/L，琼脂7g/L，蔗糖30g/L；培养基pH调至5.5。
4.继代培养
将丛生芽切下来转入增殖培养基，培养条件温度为25±2℃，红光：蓝光＝2∶1，光照时间为16h/d，增殖培养基配方为MS培养基，6-BA(0.2mg/L)，B9(2mg/L)，NAA(0.01mg/L)，香蕉泥30g/L，琼脂7g/L，蔗糖30g/L；培养基pH调至5.5。
5.生根培养
将再生苗转入生根培养基中进行生根培养，培养条件温度为25±2℃，暗培养。生根培养基配方为1/2MS培养基，IBA(0.1mg/L)，琼脂5g/L，蔗糖20g/L；培养基pH调至5.5。
6.驯化移栽
当根长至3-4cm时，将培养瓶转入玻璃温室，将瓶口打开炼苗，3d后将试管苗连根取出，清水冲洗掉培养基后，用0.1％高锰酸钾溶液浸泡30min，然后栽入营养土中，加透明盖闷养。
结果：采用本发明所提供的方法，提高了愈伤组织质量，缩短增殖周期至35d，提高增殖倍数至4.9，玻璃化率降低至4.6％，获得的再生苗窗面大、矮化、健壮，植株根系粗壮健康，移栽成活率达100％。
实施例2
本发明提供了一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，该方法具体步骤为：
1.外植体选择
选择株型饱满，健壮无病虫害的毛汉十二卷植株的成熟叶片为外植体。
2.初代培养
外植体的消毒及接种
将毛汉十二卷植株切根(保持植株完整)并洗净，经过洗衣粉清洗，流水冲洗1-2h，将外植体转到无菌操作台上，先用无菌水冲洗2次，再用75％酒精消毒20秒，用无菌水冲洗1-2次，然后再用0.1％升汞消毒6min，再用无菌水冲洗6-8次后，剥下叶片，叶片要带有基部组织，直接将叶片接于愈伤组织诱导培养基上，每玻璃瓶接1片。愈伤组织诱导培养基成分为MS培养基，6-BA(0.8mg/L)，KT(0.5mg/L)，NAA(0.05mg/L)，7g/L琼脂，30g/L蔗糖；培养基pH调至5.5。
将接完的外植体放在培养室进行黑暗培养，14d后转入光培养，光培养条件温度为25±2℃，光照时间为12h/d，培养20-30d后转入分化培养基。
3.诱导分化培养
将得到的愈伤组织再接入诱导分化培养基上，培养条件温度为25±2℃，红光：蓝光＝1∶1，光照时间为10h/d，培养30-40d后愈伤组织分化出小苗，小苗质量高。分化培养基配方为MS培养基，KT(0.5mg/L)，NAA(0.02mg/L)，香蕉泥30g/L，琼脂7g/L，蔗糖30g/L；培养基pH调至5.5。
4.继代培养
将丛生芽切下来转入增殖培养基，培养条件温度为25±2℃，红光：蓝光＝2∶1，光照时间为16h/d，增殖培养基配方为MS培养基，6-BA(0.2mg/L)，B9(4mg/L)，NAA(0.01mg/L)，香蕉泥30g/L，琼脂7g/L，蔗糖30g/L；培养基pH调至5.5。
5.生根培养
将再生苗转入生根培养基中进行生根培养，培养条件温度为25±2℃，暗培养。生根培养基配方为1/2MS培养基，IBA(0.5mg/L)，琼脂5g/L，蔗糖20g/L；培养基pH调至5.5。
6.驯化移栽
当根长至3-4cm时，将培养瓶转入玻璃温室，将瓶口打开炼苗，3d后将试管苗连根取出，清水冲洗掉培养基后，用0.1％高锰酸钾溶液浸泡30min，然后栽入营养土中，加透明盖闷养。
结果：采用本发明所提供的方法，提高了愈伤组织质量，缩短增殖周期至28d，提高增殖倍数至6.4，玻璃化率降低至15.6％，获得的再生苗窗面大、矮化、健壮，植株根系粗壮健康，移栽成活率达95.6％。
实施例3
本发明提供了一种基于LED光源的美纹万象的组培快繁方法，该方法采用选择株型饱满，健壮无病虫害的美纹万象植株的成熟叶片为外植体，通过外植体无菌处理后，将外植体接种于初代培养愈伤诱导培养基上，置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养，诱导愈伤组织，在特定LED等照射下诱导分化出丛生芽，具体步骤为：
1.外植体选择
选择株型饱满，健壮无病虫害的毛汉十二卷植株的成熟叶片为外植体。
2.初代培养
外植体的消毒及接种
将毛汉十二卷植株切根(保持植株完整)并洗净，经过洗衣粉清洗，流水冲洗1-2h，将外植体转到无菌操作台上，先用无菌水冲洗2次，再用75％酒精消毒20秒，用无菌水冲洗1-2次，然后再用0.1％升汞消毒6min，再用无菌水冲洗6-8次后，剥下叶片，叶片要带有基部组织，直接将叶片接于愈伤组织诱导培养基上，每玻璃瓶接1片。愈伤组织诱导培养基成分为MS培养基，6-BA(0.5mg/L)，KT(0.5mg/L)，NAA(0.01-0.05mg/L)，7g/L琼脂，30g/L蔗糖；培养基pH调至5.5。
将接完的外植体放在培养室进行黑暗培养，14d后转入光培养，光培养条件温度为25±2℃，光照时间为12h/d，培养20-30d后转入分化培养基。
3.诱导分化培养
将得到的愈伤组织再接入诱导分化培养基上，培养条件温度为25±2℃，红光：蓝光＝1∶1，光照时间为10h/d，培养30-40d后愈伤组织分化出小苗，小苗质量高。分化培养基配方为MS培养基，KT(0.3mg/L)，NAA(0.02mg/L)，香蕉泥30g/L，琼脂7g/L，蔗糖30g/L；培养基pH调至5.5。
4.继代培养
将丛生芽切下来转入增殖培养基，培养条件温度为25±2℃，红光：蓝光＝2∶1，光照时间为16h/d，增殖培养基配方为MS培养基，6-BA(0.2mg/L)，B9(3mg/L)，NAA(0.01mg/L)，香蕉泥30g/L，琼脂7g/L，蔗糖30g/L；培养基pH调至5.5。
5.生根培养
将再生苗转入生根培养基中进行生根培养，培养条件温度为25±2℃，暗培养。生根培养基配方为1/2MS培养基，IBA(0.2mg/L)，琼脂5g/L，蔗糖20g/L；培养基pH调至5.5。
6.驯化移栽
当根长至3-4cm时，将培养瓶转入玻璃温室，将瓶口打开炼苗，3d后将试管苗连根取出，清水冲洗掉培养基后，用0.1％高锰酸钾溶液浸泡30min，然后栽入营养土中，加透明盖闷养。
结果：采用本发明所提供的方法，提高了愈伤组织质量，缩短增殖周期至31d，提高增殖倍数至5.6，玻璃化率降低至10.1％，获得的再生苗窗面大、矮化、健壮，植株根系粗壮健康，移栽成活率达95.6％。
对照试验
选用实施例1作为试验组，并以实施例1作为基础方案，设计不同的LED光照方案进行对照试验。利用实施例相同的培养基进行相同时间的初代培养、诱导分化培养、继代培养、生根培养，以获得4-5叶，根长3～4cm的再生苗截止计算增值周期和增值倍数，并统计组培过程玻璃化的发生率和生长状况，统计如下：
从以上表格可以看出，在组培的诱导分化和继代培养过程，利用红蓝光LED光照可显著降低玻璃化率，缩短增殖周期，提高增殖倍数，提高组培幼苗的质量。除此之外，白光培养获得的再生苗窗面小、有徒长现象，而红蓝光光照没有该现象。
除此之外，在继代培养缓解采用长时间红光为主的光照，对缩短增值周期，降低玻璃化率有显著改善。
Claims (8)
1.一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）选用株型饱满的毛汉十二卷成熟叶片作为外植体；
（2）对外植体进行清洗、消毒，将带有基部组织的叶片剥离并接种于愈伤组织诱导培养基上先进行黑暗培养，然后经适宜光照培养后转入分化培养基；
（3）将光照培养后的愈伤组织接种至分化培养基上，利用红蓝LED常规光照培养20-50天获得小苗；
（4）将小苗丛生芽切下来转入增殖培养基，利用红蓝LED长时间光照培养获得再生苗；
（5）将再生苗转入生根培养基中进行生根培养，无光照，当根生长至3-4cm时，转入玻璃温室炼苗，然后冲洗掉培养基土培；
所述诱导培养基、分化培养基、增殖培养基、生根培养基的pH为5-6。
2.根据权利要求1所述的一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，其特征在于：所述诱导培养基包括MS培养基、6-BA、KT、NAA、琼脂、蔗糖。
3.根据权利要求1所述的一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，其特征在于：所述分化培养基包括MS培养基、KT、NAA、香蕉泥、琼脂、蔗糖。
4.根据权利要求1所述的一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，其特征在于：所述增殖培养基包括MS培养基、6-BA、B9、NAA、香蕉泥、琼脂、蔗糖。
5.根据权利要求1所述的一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基包括1/2 MS培养基、IBA、琼脂、蔗糖。
6.根据权利要求1所述的一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，其特征在于，所述外植体的清洗、消毒步骤为：先利用洗衣粉清洗，流水冲洗1-2h，将外植体转到无菌操作台上，先用无菌水冲洗2次，再用75%酒精消毒20秒，用无菌水冲洗1-2次，然后再用0.1%升汞消毒6min，再用无菌水冲洗6-8次。
7.根据权利要求1所述的一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，其特征在于：所述步骤（3）中红蓝LED常规光照培养是采用红光：蓝光=1:1，光照时间10小时/天，培养30-40天后获得小苗。
8.根据权利要求1所述的一种基于LED光源的毛汉十二卷组培快繁方法，其特征在于：所述步骤（4）中红蓝LED常规光照培养是采用红光：蓝光=2:1，光照时间16小时/天，培养30~40天后获得再生苗。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190510 |
|
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